CROMATOGRAFÍA

LÍQUIDA
AGOSTO 2019
OBJETIVO

 Reconocer los diferentes módulos en un HPLC y sus características.

 Fundamentos de separación cromatográfica.
 Columnas analíticas.
 Diferentes tipos de columnas
 Mantenimiento de columnas.
 Registros involucrados
  Cromatografía liquida:

DEFINICIONES
:
TIPOS DE
CROMATOGRAFIAS
LIQUIDAS
TIPOS DE
CROMATOGRAFIAS
SISTEMA DE HPLC

 Bomba: -Binaria , cuaternaria.

 Autosampler: Sistema de inyección de muestras. Según el loop que se emplee
los volúmenes de inyección varían desde 1uL a 500uL o más. Lo habitual es 1-
100 uL. Puede estar termostatizado o no.
 Inyección manual
 Compartimento de columna termostatizado o no.
 Detector
Tipo de detectores
TIPS DE USO
FM: SE DEBEN USAR DESGASEADAS
Y LIBRE DE PARTICULAS.

Desgasear: proceso de quitar gases

disueltos en un liquìdo o solvente.
Se puede realizar por Ultrasonicado
(15-20 minutos) o Filtración a vacío
por 0,22um- 0,45um .
 En los HPLC de KEMIA ,las bombas son cuaternarias, existen 4 canales para
colocar Fase Móvil. Cada Canal es para un DETERMINADO TIPO DE SOLVENTE.
 CANAL A: SOLVENTES ORGANICOS
 CANAL B: AGUA
 CANAL C: Buffers
 CANAL D: OTROS

 SE DEBEN RESPETAR ESTOS CANALES.

 BOMBA:
 Se debe lavar periódicamente (cada 1hr aprox) los sellos
de la bomba, Seal wash.
 Al encender la bomba se debe subir gradualmente el flujo
hasta el valor deseado. Ej.: para setear a un flujo de
1ml/min, primero debo setear ,0,3 ml/min ,una vez
alcanzado setear a 0,7 ml/min y luego setear a 1ml/min.
 En el caso de los equipos Agilent setear acceleration time
en 10 mL/min*min.

TIPS DE USOS
 Se puede usar de dos maneras diferentes:
 AUTOSAMPLER

SISTEMA DE
INYECCION
 Precauciones:
 NUNCA colocar viales ni retirar mientras que el Sistema esté
realizando el proceso de inyección.
 Verificar que los viales tengan septas ,sin perforación o sin
que se vea un orificio o esté parcialmente roto.
 Compartimento
Columnas:
 PRECAUCIONES:

 Al colocar una columna en el compartimento ,se debe conectar en primera

instancia el extremo que viene del INYECTOR.
 Se debe encender la bomba y colocar un recipiente en el otro extremo de la
columna. Dejar caer 10 gotas aprox ,apagar la bomba y conectar el otro
extremo.
 SIEMPRE verificar que las conexiones en los extremos de la columna estén
firmes y al encender la bomba ,no deben perder .
Si los conectores están correctamente colocados ,la contrapresión del sistema
debe aumentar hasta un valor determinado. En caso de tener perdidas la
contrapresión no aumenta.
DETECTORES

 DAD (DETECTOR ARREGLO DE DIODOS):

 RANGO ENTRE 200-1000 nm.

 con Referencia(resta de Background) o sin

Se puede usar
Referencia.
 Ancho de banda(nm): por defecto puede ser 2 ó 4 nm.

 Frecuencia de toma de datos: 0,5seg , 1 seg ,2 seg. A menor

frecuencia ,menos detalle y menor altura se obtienen del pico de interés.
 A mayor frecuencia mejor detalle del pico ,aumenta el ruido.
 MODOS DE SEPARACIÓN MÁS COMUNES en HPLC:
 -ADSORCIÓN: La separación de las moléculas se da por fenómeno de
ADSORCIÓN.Aquel Analito más afín por la fase estacionaria se retiene más.

 REPARTO: Existen dos Tipos

 A) LÍQUIDO –Líquido: ya en desuso por problemas de estabilidad y sangrado de
la columnas (Ej: Trietileglicol).
 B) Fase ligada químicamente a un soporte “inerte”: Los soportes más usados
son Siloxanos .También existen soportes como alúmina y polimérica.
 CARACTERISTICAS DEL MATERIAL DE SOPORTE:
 -POLIMERICAS: RESISTEN RANGOS MAS AMPLIOS DE PH.
 -Silanoles: son inertes químicamente, de alta pureza, tamaño de partícula
variado y reproducibles. Desventaja: a pesar de tener alta pureza presenta
incrustaciones de metales(ej.: Fe,Mn).

TIPOS DE COLUMNAS SEGÚN SU RELLENO
 Columnas de Fase reversa (C8,C18,Fenilo)
 -Los solventes empleados en las FM son: Agua,ACN,MeOH,Etanol, Buffers
acuosos, THF.
 - Solventes como Cloroformo, Hexano, Diclorometano,etc no son los mas
adecuados.
 Columnas de Fase Normal ( Sílice, Diol, Amino,Ciano)
 Las FM contienen mayoritariamente solventes apolares: Hexano,Cloroformo,
Diclorometano.
 Las columnas Amino y Ciano son usadas como fase normal o reversa
dependiendo de la FM.
 Las columnas de SILICE ,SON DAÑADAS IRREVERSIBLEMENTE POR PRESENCIA DE
AGUA como componente de una FM.
Especificaciones Columnas Hypersil BDS c18
 PRECAUCIONES CON LAS COLUMNAS ANALITICAS

 Se debe leer el certificado adjunto a la columna con el fin de conocer DATOS

RELEVANTES (ej.: rango pH, Temperaturas máximas, Presión Máxima,
restricciones).
 SE DEBE conocer y NUNCA superar la contrapresión MAXIMA permitida por el
fabricante.(400bar).
 AL FINALIZAR la secuencia ,se debe agregar una secuencia de LAVADO.
 EVITAR dejar las columnas analíticas con la FM ,en especial si contiene Buffers o
PAR IONICO.
 Cada vez que se usa una nueva columna se DEBE chequear su PERFORMANCE con
la metodología de verificación de columnas usando la mezcla de parabenos.
 Al alcanzar las 400hs de uso de debe realizar una limpieza profunda como indica el
instructivo de regeneración de columnas.
REGISTROS

 Se DEBE registrar al momento de realizar el análisis:

 A- LOGBOOK de uso del equipo correspondiente.
 B- LOGBOOK de uso de columna (en formato Excel ubicado en
w:/EQUIPOS/Columnas HPLC.
 C- Nro. de columna en el equipo.
 D- Tiempo de retención y Relación Área/concentración del std1
 E- LOGBOOK de registro de Fases Móviles