Tecnología de Fermentación Departamento de Ingeniería Bioquímica

Abril, 2020 Segundo parcial

Nombre: ______________________________________________ Código: ____________________

En la Universidad Icesi todos estamos comprometidos en reafirmar el valor de la HONESTIDAD en todos nuestros actos. Por lo
tanto, me comprometo a no dar ni recibir ayuda, no comparar las respuestas con mis compañeros, no utilizar chancucos en este ni
en ningún trabajo académico.

Firma: _________________________________

Reconozco que la deshonestidad de cualquiera de mis compañeros en una prueba académica va contra los principios de mi
Universidad y por lo tanto, atenta contra su buen nombre y afecta el trabajo serio de todos nosotros, por lo tanto, estoy dispuesto a
informar al profesor o a otra autoridad de la Facultad acerca de cualquier anomalía en esta prueba.

Firma: _________________________________

Reglas del juego:

 Usted deberá trabajar colaborativamente con su compañero. Sobre el archivo en pdf subrayar la información
relevante que identifique.
 Se les recomienda una adecuada lectura y comprensión de la misma.
 La solución del parcial debe presentarla en un archivo de Excel.
 No se resolverá ninguna duda durante el examen, así que, si algo no le queda claro, y usted requiere hacer algún
tipo de supuesto, ESCRIBALO y de una breve explicación de la razón por la cual lo supone.
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Información importante:
% nitrógeno Tiempo muerto para las
en la pectona: fermentaciones; 10 horas.
15 %
Densidad del Composición elemental de la Asuma valor de cenizas en
glicerol crudo: biomasa: biomasa. 4%
0,877 g/ml Carbono: 46 % p/p
Hidrogeno: 6 % p/p
Oxígeno: 28 % p/p
Nitrógeno: 6 % p/p
Nota: Coloque las unidades en todos los casos, sino el punto se califica como cero.
1. La levadura oleaginosa Trichosporon oleaginosus se cultivó en glicerol crudo (proveniente de una
empresa productora de biodiesel) como sustrato para la producción de lípidos en un fermentador de 15 L.
En las fermentaciones por lotes se investigó el impacto de la relación carbono/nitrógeno (C/N) (p/p), a
saber: 20, 30, 45 y 60, en la producción de lípidos de la cepa.
Se inoculó una asada de colonia de T. oleaginosus, conservada en una placa de agar de extracto de malta,
en un medio liquido de YPD esterilizado de 1 L (20 g/l de glucosa, 20 g/l de peptona y 10 g/l de extracto
de levadura). El medio inoculado se incubó a 30 °C, 180 rpm durante 24 h en un agitador de incubación.
Después de 24 h de incubación, el precultivo se utilizó para inocular los fermentadores finales.
La fermentación batch se llevó a cabo en un tanque de agitación de 15 L de fermentador (volumen de
trabajo: 10 L, Biogenie,) equipado con accesorios y un sistema de control lógico programable (PLC) para
el control de oxígeno disuelto (DO), pH, antiespumante, la velocidad del impulsor, la tasa de aireación y la
temperatura. El software permitió el control automático del punto de ajuste y la integración de todos los
parámetros a través de PLC. Antes de cada ciclo de esterilización, el electrodo polarográfico de pH (Mettler
Toledo) se calibraba utilizando tampones de pH 4 y 7 (VWR, Canadá). La sonda de oxígeno fue calibrada
a cero con una solución de 5% de Na2SO3 y 100% con agua saturada de aire. Posteriormente, los

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fermentadores se cargaron con un medio nutritivo de fermentación (relación C/N (p/p) de 20, 30, 45 y 60)
y se esterilizaron. Luego la sonda DO se recalibró a cero esparciendo gas N2 y una saturación del 100%
esparciendo aire a una velocidad de agitación de 500 rpm. A partir de entonces, un volumen de 1 L fue
transferida al medio en el reactor y las fermentaciones comenzaron.
Durante la fermentación, la DO se mantuvo por encima del 35% de saturación mediante el ajuste de la
velocidad de agitación (300-500 rpm) y la velocidad del flujo de aire (0,2-2 L/min). La temperatura se
mantuvo a 30 °C haciendo circular agua a través de la camisa del fermentador. El pH de la fermentación se
controló automáticamente a 5 ± 0,1 a través de bombas peristálticas controladas por ordenador mediante la
adición de agentes de control de pH: 4M NaOH/ 4M H2SO4. Las variaciones de volumen por estas adiciones
y por antiespumante son despreciables.
Las muestras (150 m) se retiraron con un intervalo de tiempo presentado en las tablas a continuación durante
la fermentación en condiciones de esterilización para el análisis de las muestras. Perdidas de volumen de
medio por evaporación fueron constante a una velocidad de 30 ml/h.
Preparación del medio de cultivo.
La solución de glicerol crudo fue esterilizada a 121 °C durante 15 minutos antes de ser utilizada como
fuente de carbono. Se supone que el metanol se evaporó durante el proceso de esterilización. El medio de
fermentación (por L) contenía 2,7 g KH2PO4, 0,95 g Na2HPO4, 1,616 g NH4Cl, 0,1 g EDTA, 0,2 g MgSO4-
7H2O, 0,4 g peptona, 0,04 g CaCl2-2H2O, 0,0055 g FeSO4-7H2O, 0,001 g ZnSO4-7H2O, 0,00076 g MnSO4-
H2O, y solución de glicerol crudo esterilizado. La cantidad de glicerina cruda añadida al contenido del
fermentador se determinó según la relación C/N (p/p) utilizada.
El nitrógeno del medio se añadió en forma de peptona y NH4Cl. Según la composición del glicerol crudo 1
L de solución de glicerol crudo contenía 235,8 g de jabón (este aporta ácidos grasos libres como fuente de
carbono) y 132,4 g de glicerol, lo que aportaba 235,8 (g de jabón) × 0,75 (g de carbono/g de jabón) +132,4
(g de glicerol) × 0,39 (g de carbono/g de glicerol) = 228,49 g de carbono por l de solución de glicerol crudo.
Como el metanol se evaporó, no se tuvo en cuenta la fuente de carbono debida al metanol. Las proporciones
C/N investigadas (w/; w) fueron 20, 30, 45 y 60.
Por lo tanto, se esterilizaron 45 mL (30 mL después de la esterilización), 67 mL (45 mL después de la
esterilización), 101 mL (67,5 mL después de la esterilización) y 133 mL (90 mL después de la
esterilización) de solución de glicerol crudo y luego se añadieron al medio por litro para lograr la relación
C/N (p/p) de 20, 30, 45 y 60, respectivamente. La concentración de carbono orgánico del medio de glicerol
se determinó con el analizador TOC para comprobar el cálculo. Los resultados analizados fueron similares
a los calculados, que fueron 10,53 g, 15,62 g, 23,07 g y 29,91 g con el análisis y 10,28 g, 15,30 g, 22,84 g
y 29,69 g con el cálculo para los medios preparados a partir de 45 mL, 67 mL, 101 mL y 133 mL de solución
de glicerol bruto (no esterilizada), respectivamente.
A continuación, los datos obtenidos para biomasa, sustrato y producto en el tiempo.

Concentración de bomasa (g/L)

Tiempo C/N 20 C/N 30 C/N 45 C/N 60
0 0,1 0,1 0,1 0,1
5 1 1 3,5 1,5
10 3 5,6 6 4,8
18 4 11 10 9,2
25 5 17,5 17,5 14,5
30 8 17,5 20 15,5

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38 8,9 21,5 20,4 17,4

45 10,1 21,8 20,7 18,1
50 11 22 22 18,5
58 13 23 23,4 19
62 14 18 23 18,6
68 13 16 22,7 18,3

Concentración de sustrato (glicerol) (g/L)

Tiempo C/N 20 C/N 30 C/N 45 C/N 60
0 6 10 14,8 18
5 5,5 9,8 14 17,6
10 5 8 12,5 16,5
18 4,5 7,5 10 15
25 3,8 7 8,4 12,5
30 2,8 5,5 7,5 10,2
38 2 3,8 6,8 8,5
45 1,7 2,8 4 7,5
50 1,6 2,8 3,2 7
58 1,5 1,8 3 6,6
62 1 1 2,8 6,4
68 0,1 0,1 2,6 5,6

Concentración de lipidos (g/L)

Tiempo C/N 20 C/N 30 C/N 45 C/N 60
13 4 4
17 2,1 5,4 5 4
23 2,1 4,4 5,4 5,3
30 1,8 6 7,6 6,5
34 3 7 8,2 7
43 3,3 9 9,6 8
48 3,1 10 11 9
55 3,1 11 12,2 10
63 3 9 11 9,6

Resuelva:
(a) Calcule la cantidad de nitrógeno (N) en las fermentaciones y calcule la cantidad en volumen de glicerol
necesario agregar a cada experimento para cumplir las relaciones C/N. (5,62 puntos)
(b) Calcule la productividad máxima de biomasa (biomasa/L.h) y de lípidos (lípidos/L.h) para cada relación
C/N. Justifique. (5,62 puntos)
(c) Calcule las respectivas velocidades netas de formación de biomasa, de producto y de consumo de
glicerol para cada relación C/N evaluada. Muestre los valores tabulados de forma que se pueda revisar la
formula aplicada en cada columna. (6,62 puntos)

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(d) Calcule los respectivos valores de μmax para cada ensayo. (5,62 puntos)
(e) Calcule y grafique los respectivos valores de μ, qs, y qp a lo largo de la fermentación. (5,62 puntos)
(f) Las relaciones C/N evaluadas sugieren que el C fue limitante en todos los ensayos. Con los datos de
biomasa obtenidos y con las cantidades de nutrientes empleadas en las fermentaciones, demuestre esta
condición de limitación. ¿Cuál es el valor de f que debe usarse para que el Yxs estimado corresponda con
el real? (7,62 puntos) Una gráfica con los valores medidos de ácidos grasos libres medidos a lo largo de
las fermentaciones puede serle útil.

(g) Escriba la ecuación estequiometria correspondiente colocando como coeficiente las respectivas
velocidades específicas. (5,62 puntos)
(h) Qué alternativas de estrategias de fermentación sugiere usted para aumentar la productividad de biomasa
y de lípidos. En la gráfica de abajo se pueden identificar algunas, mas no son las únicas opciones. Sea lo
más claro y completo posible en su respuesta. Justifique. (2,66 puntos)

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2. Complete las siguientes afirmaciones e indique verdadero (V) o falso (F) según corresponda (5 puntos)
(a). Los cultivos de lote alimentado (CLA) pueden ser controlados con sistemas sin y con retroalimentación
______(V)/________ (F)
(b) La estrategia de alimentación en un CLA más eficaz para evitar la formación de subproductos no
deseados e incrementar la biomasa es ____________________________________. (1 punto)
(c) El método de alimentación lineal de un CLA solo puede ser una función incremental en el tiempo.
_________(V)/_______(F). (1 punto)
(d). Tanto en los cultivos batch como en los fed-batch se puede hacer control de las velocidades especificas
a través del transporte de la cantidad de sustrato limitante ______(V)/________ (F) (1 punto)
(e) El metabolismo de la levadura S. cerevisiae es un ejemplo particular donde estas células son capaces de
catabolizar __________________, _______________________, a diferentes valores de
______________________________________ y _________________________________. (1 punto)