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Martha Hernández, Carol Carvajal, Margarita Márquez, Roxana Báez, Humberto Morris, Ramón Santos, María
de los Ángeles Chávez
Obtención de Preparados Enzimáticos a Partir de Tallos de Piña (Ananas Comosus) con Potencialidades de
uso en la Biotecnología y la Medicina.
Revista CENIC. Ciencias Biológicas, vol. 36, 2005
Centro Nacional de Investigaciones Científicas
Cuba

Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=181220525089

Revista CENIC. Ciencias Biológicas,

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Cuba

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Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 36, No. Especial, 2005

Obtención de Preparados Enzimáticos a Partir de

Tallos de Piña (Ananas Comosus) con
Potencialidades de uso en la Biotecnología y la
Medicina.
Martha Hernández, 1 Carol Carvajal, 1 Margarita Márquez, 2
Roxana Báez, 3
Humberto
Morris, 4 Ramón Santos, 1 María de los Ángeles Chávez.2
1
Laboratorio de Ingeniería Metabólica. Centro de Bioplantas. Universidad de Ciego de Ávila. Carretera a Morón
km 9. Ciego de Ávila. Cuba. Teléfono: 053-33 224016, Fax: 053-33 266340. Email: mhernandez@bioplantas.cu.
2
Centro de Estudios de Proteínas. Facultad de Biología. Universidad de La Habana. Ciudad de La Habana.
Cuba.
3
Facultad de Ciencias Médicas de Ciego de Ávila. Ciego de Avila. Cuba
4
Centro de Estudios de Biotecnología Industrial, Universidad de Oriente, Santiago de Cuba. Cuba.

RESUMEN: El aislamiento y purificación de productos naturales a partir de plantas es una vertiente muy
importante de la biotecnología moderna. La bromelina (EC 3.4.22.32) es una proteasa aislada de plantas de
piña que se ha empleado tradicionalmente en la industria alimenticia. La enzima también se ha usado en la
industria farmacéutica. En la actualidad existe un renovado interés por ella, desde que fue descrita su actividad
antitumoral y antimetastizante frente a algunos tumores. En este estudio, se obtuvo extracto crudo de bromelina
a través de un procedimiento de extracción novedoso. Los rendimientos de la tecnología fueron de 20.8 g de
producto/kg de tallos, con una actividad específica de 1.36 U/mg. Tiene pH óptimo 7 para la hidrólisis de
hemoglobina durante 20 minutos. El producto aislado es muy estable en un rango de pH de 3-9 y temperaturas
de hasta 50°C durante cuatro horas. El extracto crudo se utilizó en la industria biotecnológica para obtener un
hidrolizado proteico de Clorella vulgaris, con un rendimiento (g de hidrolizado/100 g de biomasa) de 30%. La
preparación enzimática fue purificada. Se determinó la secuencia amino terminal de la mayor fracción obtenida.
Se realizó un estudio toxicológico y farmacológico del producto parcialmente purificado por cromatografía de
intercambio iónico en carboximetil celulosa-52 (CMC-52). La dosis letal media a dosis única fue 216.35 mg/kg y
a dosis repetida 105.91 mg/kg. La proteasa, comparada con el citostático 5-Fluoracilo, mostró una marcada
actividad antitumoral frente a los tumores trasplantables de ratón: leucemia P-388, carcinoma pulmonar de
Lewis, tumor ascítico de Ehrlich, sarcoma-37 y adenocarcinoma mamario-755. Frente a este último se demostró
por primera vez la actividad antitumoral de la bromelina.

ABSTRACT: The isolation and purification of natural products from plants is a line very important in modern
biotechnology. Bromelian (EC 3.4.22.32) is a proteinase isolated from pineapple plants (Ananas comosus),
which has been traditionally employed in food industry. This enzyme has been also used in pharmaceutical
industry. In recent years there has been renewed interest for this protease after its high anti-metastatic and
antitumoral activity was reported. In this study, bromelain crude extract was obtained through a novel
experimental procedure. The yields of technology were 20.8 g of product/stems kg, with a specific activity of 1.36
U/mg. An optimal pH of 7 was obtained for haemoglobin hydrolysis during 20 min. The isolated product was very
stable in the pH range from 3 to 9 and till 50° C for 4 hours. Crude extract was used in biotechnological industry
to obtain protein hydrolyzed from Clorella vulgaris, with a yield (hydrolyzed g/100 g biomass) of 30%. Enzymatic
preparation was purified. The amino terminal sequence for major fraction obtained was determined. The
enzymatic product partially purified by ion exchange chromatography in Carboxymethyl Cellulose (CMC-52), was
submitted to toxicological and pharmacological studies. The lethal media doses (LD50) was 216.35 mg/kg in
toxicity study (unique dose). For the administration during 30 days of the enzyme the LD50 was 105.91 mg/kg.
Bromelain was compared with citostatic 5-Fluouracil and showed high anti-tumoral activity in 5 of the 6 tumors
studied: leukemia p-388, Lewis pulmonary carcinoma, Ehrlich ascitic tumor, sarcoma-37 and mammary
adenocarcinoma-755. This study is the first report for the latter tumor.

Palabras claves: proteasas, bromelina, actividad antitumoral, hidrolizados de proteínas

Keywords: bromelain, protease, antitumoral activity, protein hydrolyzed
Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 36, No. Especial, 2005

INTRODUCCIÓN
Las enzimas proteolíticas catalizan la hidrólisis de los enlaces peptídicos de proteínas. Además de intervenir en
la digestión alimentaria en vertebrados participan en variados procesos fisiológicos, al estar involucradas en
todo el ciclo de vida de las proteínas. Tienen otras funciones claves como la de facilitar el transporte de
sistemas voluminosos en el organismo (1). A pesar del importante papel de la proteólisis en los procesos
fisiológicos, la función de las peptidasas puede ser dañina para la célula si no se expresa en el lugar y momento
adecuado, por eso los procesos proteolíticos están sometidos a un complejo sistema de regulación. El
desbalance de la actividad enzimática normal puede influir en el desarrollo y progresión de enfermedades
humanas como cáncer y metástasis, enfermedad de Alzheimeir's, pancreatitis, inflamación, desórdenes
musculares y otros traumas (2).
En términos económicos, las proteasas representan casi las dos terceras partes de las enzimas que se
comercializan en el mercado mundial (3). La mayor parte de estas provienen de fuentes microbianas, pero
varias proteasas vegetales como papaína, bromelina y ficina, son irreemplazables en un gran número de
procesos. Las cisteino proteasas (EC 3.4.22) están ampliamente distribuidas entre los organismos vivos. La
clase cisteino papaino proteasas agrupa los miembros más estudiados, la integran la papaína, otras proteasas
de plantas (quimopapaina, caricaina, bromelina, actinidina, ficina, aleuraina) y catepsinas lisosomales B, H, L, S,
C y K (2). La bromelina (EC 3.4.22.32) ha sido aislada de órganos de plantas de la familia Bromeliaceae. Se
extrajo por vez primera, del jugo de la piña, a finales del siglo XIX y se introdujo como suplemento terapéutico a
mediados del XX (4).
La mayor y más antigua aplicación de la bromelina es como ablandador de carnes (5). Es efectiva en la
producción de hidrolizados a escala industrial (6) y se ha demostrado que es un complemento alimenticio
efectivo (7). Para esta enzima se han descrito varias acciones farmacológicas: aumenta la absorción de otros
medicamentos, contribuye a eliminar tejidos necrosados, se utiliza como antinflamatorio, digestivo y en la
formulación de vacunas (8; 9; 10). En estudios recientes se demostró que puede inducir la diferenciación de
células tumorales y atenuar el crecimiento del tumor. Este hecho ha despertado el interés de varios
investigadores, que han demostrado su posible actividad antitumoral y antimetastizante (11; 12; 13).
Relacionado con estos hallazgos, se ha informado su posible influencia sobre células del sistema inmune (14;
15). Se ha demostrado que la terapia combinada de proteasas reduce marcadamente los efectos adversos
causados por la quimioterapia y la radioterapia (16).
La producción mundial de piña (Ananas comosus (L.) Merr) ascendió en el año 2000 a más de 13 millones de
toneladas, de ellos 19 mil t se cosecharon en Cuba (17). Una vez demolidas las plantaciones, los tallos se
consideran contaminantes de los suelos. La obtención de proteasas como la bromelina representa una
alternativa atractiva de aprovechamiento de esos residuos. Las técnicas desarrolladas hasta la fecha para
extraer la enzima son complejas y requieren de condiciones de extracción que permitan conservar la integridad
biológica de la molécula. La bromelina tiene un amplio espectro de aplicaciones ya establecidas. Sin embargo,
los estudios realizados en los últimos cinco años que informan sobre su actividad antitumoral, la han convertido
en una de las cisteino proteasas más estudiadas actualmente para profundizar en sus potencialidades
terapéuticas. Estos resultados han renovado el interés por el desarrollo de nuevos métodos de aislamiento,
purificación y caracterización de la bromelina que posibiliten implementar estas novedosas aplicaciones en la
esfera de la Biomedicina.
Esta investigación se realizó con el objetivo de evaluar un nuevo procedimiento de obtención de preparados
proteolíticos a partir de tallos de piña, así como demostrar algunos de sus usos como agente hidrolítico y como
antitumoral.

MATERIALES Y MÉTODOS
El tratamiento estadístico se realizó con el empleo del utilitario ‘Statistical Package for Social Sciences’ (SPSS,
versión 8.0 para Windows).
Materiales
Se utilizaron tallos de plantas adultas de piña (Ananas comosus (L.) Merr) cv. Española roja, después de su
tercera cosecha para la obtención de la enzima En los experimentos se utilizaron reactivos de grado analítico
SIGMA. La proteína aislada se comparó con bromelina pura (B5144).
Procedimiento de Extracción
Se utilizó un procedimiento novedoso (18). El material vegetal (0.5 kg de tallo/lote) lavado y cortado en
pequeños fragmentos se homogeneizó con tampón de extracción que contenía agua acidulada y sulfuro de
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sodio en una proporción 1:1.5 (m/v). A los productos se les determinó concentración de proteínas y actividad
enzimática. El extracto crudo se llevó a sequedad por liofilización.
Caracterización del Extracto Crudo de Tallos
Concentración de Proteínas: Se cuantificó por el método 19 y se expresó en mg/mL o mg/kg de masa fresca,
referidos a una curva patrón de albúmina de suero bovino.
Actividad Enzimática: Se determinó por el método 20 y se expresó en U/mL o U/kg de masa fresca. Se
empleó como sustrato hemoglobina desnaturalizada al 2%, pH 6.8. Una unidad (U) es la cantidad de
enzima que cataliza la formación de 1(mol de tirosina por minutos a 37°C y pH 6.8. La actividad
específica se calculó como el cociente de la actividad enzimática entre la concentración de proteínas).
Caracterización Cinética: Se realizó un ensayo a diferentes tiempos hasta 30 minutos para garantizar la
determinación de la velocidad inicial ([E]=0.02-1 mg/mL; [S]=2%; pH 6.8; T=37°C) y a
concentraciones de enzima de 0.025 a 0.6 mg/mL durante 20 min. El estudio de la velocidad en función
del pH se realizó desde pH 2 hasta pH 10 a [E]=0.1 mg/mL; [S]=2%; T=37°C y tiempo de ensayo de
20 min. En el caso de la temperatura se procedió de igual forma pero a pH 6.8 y a temperaturas de 5 a
70°C.
Evaluación de la Aplicabilidad del Extracto Crudo de Bromelina en Procesos de Hidrólisis
Obtención y Tratamiento de la Biomasa: Se utilizó la cepa de Chlorella vulgaris 87-1 (21). Una parte
de la biomasa (0.5 kg) se despigmentó con etanol.
Caracterización Química de la Biomasa Autotrófica de Clorella vulgaris: El contenido de cenizas y
proteína bruta se determinó por el método de microKjeldhal (22). Los ácidos nucleicos totales se
cuantificaron por el método 23. Se determinó la humedad (22), se expresaron los resultados referidos al
contenido de masa seca.
Determinación de la Actividad Específica a los Preparados Proteolíticos: Se compararon enzimas
comerciales con bromelina y un preparado de Bacillus subtilis. Se ajustó el pH de la hemoglobina
(según la enzima) y se determinó la actividad proteolítica: (pH 2) pepsina, (pH 7) papaina y bromelina,
(pH 7.5) pancreatina y tripsina, (pH 8.5) el crudo de B. subtilis.
Estudio del Efecto del Tratamiento de la Biomasa en la Hidrólisis Enzimática: Suspensiones al 10% de
Clorella vulgaris tratada con etanol, se hidrolizaron con bromelina (6.9 U/g, pH 7, 37°C) por 5 h. Se
estimó el contenido de N-amínico (24).
Influencia de la Naturaleza de la Enzima en la Hidrólisis de Proteínas Celulares: Suspensiones al 10% de
biomasa extraída con etanol se hidrolizaron con 20 U de enzima/g (4 h a 37°C). Se determinó el contenido de
N-amínico como se describió.
Composición Bioquímica de los Hidrolizados Proteicos: Se determinó el rendimiento, pH y propiedades
organolépticas del hidrolizado. La composición aminoacídica se estudió en un analizador Alpha Plus, LKB.
Purificación de Bromelina de Tallo
Purificación por Cromatografía de Filtración en Geles de Sephadex G-100: La columna (1.6x90 cm) se
equilibró con NaAc 0.005 mol/L, pH 5 (10 cm/h). Se purificó extracto crudo de tallo y extracto previamente
purificado por intercambio iónico.
Cromatografía de Intercambio Iónico en CMC-52: El extracto crudo dializado (NaAc, 0.005 mol/L, pH 5) se
purificó en un sistema "semibatch". Se utilizaron 2 g de CMC/10 mL de extracto. La columna (1.5x5 cm) se
eluyó por etapas con NaAc (0.3, 0.5 y 1 mol/L, pH 5, 20 cm/h). En el resto de las purificaciones (20 lotes) se
eluyó con NaAc 0.5 mol/L. Para purificar mayores volúmenes de extracto (100 mL) se usó el mismo sistema y
una columna de 2.5x17 cm. Se colectaron fracciones de 2 mL.
Cromatografía Líquida de Alta Resolución en Fase Reversa (RP-HPLC): Extracto crudo y bromelina
purificada por CFG (2.5.1), CII (2.5.2) o la combinación de ambos, se analizaron por HPLC (LKB-Pharmacia),
columna 100 RP-18 (4x250 mm). Se utilizó un gradiente 0-80% de acetonitrilo-ácido trifluoroacético 0.1%,
velocidad de flujo: 0.5 mL/min por 65 min.
Análisis Electroforéticos: Las electroforesis (SDS-PAGE) se realizaron por el método 25. Las electroforesis bi-
dimensionales se desarrollaron como se describe en 26. Se utilizó como patrón gliceraldehido 3 fosfato
deshidrogenasa (GAPDH, MM 36 000 Da).
Determinación de la Secuencia Amino Terminal de Bromelina de Tallo: El pico activo de la purificación por
intercambio iónico y filtración en gel de extracto crudo se aplicó a la columna RP-18. A las fracciones eluidas
con similares tiempos de retención a la bromelina SIGMA se les determinó la secuencia aminoacídica parcial
(secuenciador Beckman LF 3000).
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Evaluación de la Aplicabilidad del Preparado Semipurificado en la Terapéutica

Se usaron ratones de 7 a 8 semanas de edad y peso entre 20 y 25 g, provenientes del Centro Nacional para
Animales de Laboratorio, mantenidos en adaptación 7 días (27).
Estudios de Toxicidad de la Bromelina a Dosis Única y Repetidas: Se empleó el método 28. Se usaron
ratones BDF-1 (diez por grupo). A cinco de los grupos, se le administraron por vía intraperitoneal (IP) dosis
únicas de bromelina (400, 300, 200, 100 y 50 mg/kg) disuelta en agua estéril. Un sexto se utilizó como control
de solvente, el último grupo (control negativo) no recibió tratamiento. Para el estudio a dosis repetidas se
aplicaron 200, 100, 75, 50 y 25 mg de bromelina/kg diarios por un mes, vía IP.
Actividad Antitumoral: Se trasplantaron las líneas de tumores murinos: leucemia P-388 por vía IP,
sarcoma (S-37) y tumor ascítico de Ehrlich (TAE) por vía IP; carcinoma pulmonar de Lewis (CPL) por vía
intramuscular (IM); melanoma (M-B16F10) y adenocarcinoma mamario (ADC-755) por vía subcutánea (SC) (un
millón de células/ratón). La evaluación de la actividad antitumoral se hizo por el cálculo del índice de aumento
de sobrevida (A.S%= [(Sobrevida promedio de los ratones tratados-Sobrevida promedio de los
controles/Sobrevida promedio de los controles)]·100). A tres grupos se les administró 5, 12.5 y 25 mg de
bromelina/kg. El cuarto grupo se trató con 5-Fluouracilo (5-Fu, 20 mg/kg). Al quinto se le administró solución
salina fisiológica (SSF). Se realizaron tres ciclos de cinco administraciones. Se evaluó la actividad
antimetastizante sobre el CPL. Se usaron dosis de 12.5, 25 y 50 mg/kg. Se empleó un grupo control negativo y
otro se trató con 5-Fu. Se extrajeron los pulmones de los animales sacrificados por dislocación cervical a los 21
días. Se contaron las macrometástasis.

RESULTADOS Y DISCUSION
Extracción de Bromelina a partir de tallos de piña
Los procedimientos utilizados para obtener enzimas proteolíticas son costosos y complejos, lo que dificulta su
producción a escala industrial. Por el método evaluado se usa un agente protector de los grupos SH del centro
activo de la enzima (sulfuro de sodio Na2S, 1-3 mmol/L) que combina una buena capacidad reductora con un
bajo costo y el empleo de un rango de valores de pH ácido (2-4) durante la extracción. En la tabla 1 aparecen
los rendimientos de la extracción.

Tabla 1. Rendimientos de la tecnología de extracción de bromelina.

Tallos
Masa fresca (kg) 0.5 a
Masa del extracto liofilizado (kg) 0.010 c
Rendimientos (g de producto/kg de masa fresca) 20.8 c
Actividad enzimática (U/mL) 6.6 a
Actividad enzimática (U/kg de masa fresca) 5357.9 a
Concentración de proteínas (mg/mL) 4.8 a
Rendimiento (g de prot./kg de masa fresca) 3.9 a
Proteínas (%) 18.8 a
Actividad específica (U/mg de proteínas) 1.36 a
* Medias con letras iguales para cada parámetro no difieren (Kruskal-Wallis, Student-Newman-Keuls, p< 0.05).

La presencia de bromelina en extractos de diferentes órganos de plantas de piña se conoce y se han informado
varios procedimientos para su extracción (4), que se caracterizan por el uso de solventes orgánicos,
precipitación por salado o fraccionamiento por cambios de temperatura. De los métodos publicados el de mayor
similitud al usado en el presente estudio fue patentado en Rusia (29). Realizaron la extracción con una solución
de bicarbonato de amonio (0.03-0.06 mol/L) a pH cercano al óptimo de actividad (pH 8) y sin utilizar agentes
protectores del centro activo. El procedimiento aquí evaluado posibilitó alcanzar rendimientos de hasta 20.7 g
de extracto/kg de tallos y 3.9 g de proteínas/kg de tallos. La comparación en términos de rendimientos con otras
tecnologías descritas no siempre es posible, ya que todos los autores de patentes no informan los mismos
parámetros. Sin embargo, estos valores son superiores a los informados (4, 29) para la extracción con
solventes orgánicos (2 a 5 g de extracto/kg de masa fresca). Los valores de actividad enzimática obtenidos
(6.6 U/mL, 6000 U/kg de tallo) fueron superiores a los logrados en todos los procedimientos descritos por otros
autores. Los valores de actividad específica (1.36 U/mg de proteínas) son comparables a los citados en la
literatura: 1-1.2 U/mg de proteínas (29).
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La tecnología utilizada aquí es sencilla y económica, sólo se requiere, en cantidades mínimas, de un ácido
(H2SO4) y una sal (Na2S) para preparar una solución que protege los grupos –SH del centro activo de la enzima.
Se han descrito muchos agentes reductores que garantizan la protección de estos grupos, tales como β-
mercaptoetanol, ditiotreitol, entre otros (3), los que generalmente se adicionan a los ensayos de actividad y son
caros, el sulfuro de sodio es económico y se puede utilizar durante la extracción garantizando la activación de
todo el extracto.
Caracterización del Extracto Crudo de Tallos
La caracterización química y funcional del extracto crudo de tallos permitió comprobar la presencia de un
preparado activo y estable, cuyas características más importantes se resumen en la tabla 2.
Con relación al pH óptimo de esta enzima algunos autores refieren que frente a proteínas naturales las mayores
velocidades de reacción se logran a pH neutro (4), resultados que coinciden con los obtenidos en estos
estudios. El producto es más estable en el rango de pH de 3 a 9. El valor de la constante de inactivación
(k=0.001·min-1) demuestra la alta estabilidad del preparado en ese rango. A pH 9 al cabo de 1 hora se observa un
10% de pérdidas de actividad. La enzima es menos estable a valores de pH 2 y 10. La velocidad de la mayoría
de las reacciones químicas aumenta con el incremento de la temperatura. El valor de temperatura óptima en
este caso depende de las condiciones experimentales. Del estudio de la variación de la actividad con la
temperatura, se obtuvieron los mejores resultados cuando la reacción ocurrió a 37°C. Al incubar el extracto
enzimático a diferentes temperaturas se observó que es estable hasta 50°C (log %A Esp = 2–0.001·t), mientras
que a 60°C y 70°C en el transcurso de 1 h pierde el 30 y el 50% de la actividad. Cuando se midió la variación de
la actividad del preparado crudo incubado hasta 40 horas, se comprobó que a 70°C pierde hasta el 90% de la
actividad en 1 h, mientras que a 50°C es activa hasta las 4 horas y a 40°C conserva la actividad durante 40
horas. Los extractos liofilizados conservados a -20°C mantuvieron el 82% de la actividad, lo que resulta
satisfactorio teniendo en cuenta que se han informado pérdidas de hasta el 40% durante ese tiempo (30).

Tabla 2. Caracterización química y funcional del extracto crudo de bromelina de tallos. Se utilizó como sustrato
Hb al 2%. (ET = error estándar).

CARACTERIZACIÓN QUÍMICA ESTUDIO FUNCIONAL

Actividad enzimática± ET: 6.6±0.31 U/mL Temperatura óptima: 37 oC
6 000.00±28 U/kg de tallos Estabilidad térmica:
40 °C es activa durante 40 h
50 °C es activa hasta 30 h
Concentración de proteínas± ET: 4.8±0.07 mg/mL 60 °C es activa hasta 4 h
3.91±0.14 g/kg de tallos 70 °C pierde 90% de actividad en 1 h
Actividad específica± ET: pH óptimo: 7
1.36±0.12 U/mg
Estabilidad en función del pH:
Estable a pH de 3-9
Masa molar: Filtración en gel→ 24 650 Da A pH 3, 4, 5 la actividad no varía en 24 h
Electroforesis→ 24 500 Da A pH 2 pierde el 92 % AE a las 24 h
La estabilidad en el tiempo de 9 lotes liofilizados conservados a –20 °C fue del 82%.

Aplicabilidad del Extracto Crudo de Bromelina en Procesos de Hidrólisis

Caracterización Química de la Biomasa: El contenido proteico de la biomasa de Chlorella vulgaris extraída
con etanol resultó ligeramente inferior al de la biomasa no tratada, pero los valores superiores al 40% indican
que la mayor parte de la biomasa algal está constituida por proteína bruta. El análisis en Sephadex G-100 y
estudios electroforéticos del extracto acuoso de biomasa algal permitió comprobar la heterogeneidad de las
proteínas presentes. Se observó la presencia de seis fracciones mayoritarias con masas molares entre 12 500 y
70 000 Da (31). Las proteínas y los carbohidratos son mayoritarios, además se observó la presencia de ácidos
nucleicos y minerales.
Influencia de la Naturaleza de la Enzima en la Hidrólisis de Proteínas Celulares
En la figura 1 aparecen las concentraciones de N-amínico y el grado de hidrólisis de los productos obtenidos con
las diferentes enzimas evaluadas. Sólo se observaron diferencias significativas entre estos parámetros al utilizar
pepsina. En el resto de los preparados se alcanzaron valores superiores al 1.5 y 17% respectivamente.
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A b b b B
20 b b 1.2 a

GH (%)/mg de proteína
1
15
0.8
10
0.6 c b
5 a
b b b b b 0.4
a
0 0.2 d e e
N-amínico (%) Grado de hidrólisis (%) 0
pepsina papaina tripsina peps ina papaina trips ina pancreatina bro melina B. Subtilis
pancreatina bromelina B. Subtilis

Figura 1. Contenido de N-amínico y grado de hidrólisis (A) en los hidrolizados proteicos de Clorella vulgaris con
diferentes proteasas (20 U/g de biomasa tratada con etanol) y eficiencia de la hidrólisis enzimática
(B). Medias con letras iguales no difieren (Kruskal-Wallis, Student-Newman-Keuls, p< 0.05).

Composición Bioquímica de los Hidrolizados Proteicos de Clorella vulgaris con Bromelina

En la tabla 3 aparece la composición bioquímica y aminoacídica del hidrolizado. Se obtuvo un polvo homogéneo,
higroscópico, de color beige, olor perceptible a peptonas y sabor neutral. El rendimiento de los lotes fue de un 30%
(g de hidrolizado/100 g de biomasa). Se comprobó la presencia de todos los aminoácidos esenciales para la
nutrición humana (44.7% del total), cuyos valores se compararon con los informados para la proteína de
referencia de la FAO. (39%, FAO, 2002). Desde una perspectiva clínica, las nuevas tecnologías de obtención de
hidrolizados proteicos con bromelina a partir de fuentes no convencionales de proteínas podrían aportar
soluciones a problemas de la terapéutica nutricional. La composición del hidrolizado de Chlorella vulgaris sugiere
atribuir a este producto efectos bioestimulantes (32) y puede ser utilizado como base nutritiva para la formulación
de medios de cultivo, destinados a propósitos generales y al cultivo de mohos y levaduras.

Tabla 3. Composición bioquímica de hidrolizados proteicos de Clorella vulgaris con bromelina. Valores promedio
de tres lotes. Los aminoácidos esenciales aparecen sombreados y comparados con los valores informados para
la proteína FAO (17)
.
Pérdidas por desecación (%) ± ET 5.18 ± 0.30
Nitrógeno total (%) 7.88 ± 0.74
Nitrógeno amínico (%) 1.40 ± 0.20
N-amínico/N-total (%) 17.50 ± 4.00
Aminoácidos libres (%) 3.30 ± 1.30
Carbohidratos totales (%) 22.90 ± 4.10
Lípidos totales (%) 0.20 ± 0.03
Minerales (cenizas totales) (%) 14.00 ± 1.43
Cloruros (% NaCl) 5.49 ± 0.86
Aporte calórico (cal/100 g) 275.58 ±13.40
Aminoácidos (%)
Ile Leu Lis Met Phe Thr Val Trp Tir Ala Arg Asp Cis Glu Gli His Pro Ser
P. 3.8 11. 6.9 1.5 4.3 4.3 8.0 0.7 1.7 11. 5.7 10. 0.3 14. 5.2 1.5 5.1 3.2
algal 7 2 6 3
P. 5.4 9.5 8.1 2.8 5.2 1.6 6.7
FAO

Procedimientos de Purificación
La purificación se realizó con el objetivo de comprobar la presencia de bromelina como pico mayoritario en el
extracto y seleccionar un preparado semipurificado para su uso potencial en Biomedicina.
Purificación por Cromatografía de Filtración en Gel
En la tabla 4 se resumen los principales parámetros de la purificación de extracto crudo de bromelina por
filtración en gel. El rendimiento obtenido fue alto (87.81%) y el grado de pureza satisfactorio (3), pero la
presencia de más de un pico con actividad proteolítica (dentro del mismo pico de proteínas), demostró la
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necesidad de ensayar otros métodos para lograr mayor separación. La principal desventaja de este método
reside en la baja capacidad de procesamiento de muestras.
Tabla 4. Rendimientos de la purificación de extracto crudo de bromelina por filtración en gel.

Etapas Vol CP P. Total AE AE Total A. Esp Rend G.P

(mL) (mg/mL) (mg) (U/mL) (U) (U/mg) (%)
Extracto 3 20.35 61.05 14.65 43.95 0.72 100.0 1.0
Sep-G100 24 0.74 17.78 1.61 38.59 2.17 87.81 3.0

Cromatografía de Intercambio Iónico en CMC-52

En la figura 2 aparece un cromatograma de las purificaciones y en la tabla 5 los rendimientos correspondientes.
Se colectó un pico mayoritario 2.34 veces más puro que el extracto de partida, con rendimientos en términos de
actividad del orden del 40%. Este proceso es muy ventajoso para purificar proteínas en etapas tempranas e
intermedias, por su alta capacidad de procesamiento de muestra y posibilidades de ser utilizado en sistemas
"batch" y "semi-batch" fácilmente escalables, lo que determinó su selección para los estudios de actividad
antitumoral.

3 1

2.5
0.75
2

AE (U/mL)
A 280 nm

1.5 0.5

1
0.25
0.5

0 0
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Número de fracciones
Abs 280 nm Act. Enzimática (U/mL)

Figura 2. Purificación en CMC-52 de extracto crudo de bromelina. Aproximadamente 500 mg de proteínas se

fijaron en "batch" a la columna (2.5x17 cm) eluida con NaAc 0.5 mol/L, pH 5. Se colectaron las
fracciones con actividad del pico 1.

Tabla 5. Rendimientos de la purificación del extracto crudo de bromelina por cromatografía de intercambio
iónico en CMC-52, (sistema “semi batch”).

Etapas Vol CP P. Total AE AE Total A. Esp Rend G.P

(mL) (mg/mL) (mg) (U/mL) (U) (U/mg) (%)
Extracto 100 4.42 442.0 1.81 180.4 0.41 100 1
CMC-52 24 3.86 92.6 3.60 86.4 0.94 47.7 2.34

Combinación de Técnicas de Purificación

La combinación de intercambio iónico y filtración en gel permitió aislar un pico mayoritario de bromelina, que se
recromatografió en RP-HPLC para determinar la secuencia amino terminal de la proteína aislada. Los picos
colectados en las diferentes purificaciones se utilizaron en estudios de caracterización y verificación del grado
de pureza de la proteasa. En la tabla 6 aparecen los rendimientos de la purificación.

Tabla 6. Rendimientos de la purificación por CII en CMC-52 del extracto crudo de bromelina previamente
purificado por filtración en gel.

Etapas Vol CP P. Total AE AE Total A. Esp Rend G.P

(mL) (mg/mL) (mg) (U/mL) (U) (U/mg) (%)
Extracto 3 20.35 61.05 14.65 43.95 0.72 100.0 1.00
Sep-G100 24 0.74 17.78 1.60 38.41 2.15 87.31 3.01
CMC-52 10 1.02 10.20 1.81 18.06 1.78 41.15 2.47
Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 36, No. Especial, 2005

Cromatografía Líquida de Alta Resolución en Fase Reversa (RP-HPLC)

El análisis de los cromatogramas RP-HPLC (resultados no mostrados) permitió comparar los tiempos de
retención (tR) del patrón SIGMA (tR=40.203 min) con el de los preparados enzimáticos. Cuando a la columna
RP-18 se aplicó extracto crudo, se observaron gran cantidad de contaminantes proteicos, el pico mayoritario se
obtuvo a un tR = 40.400 min y representa el 27.6% del extracto. El grado de pureza aumentó con los diferentes
procedimientos de purificación. La bromelina purificada por intercambio iónico en CMC-52 representa el 93.23%
del preparado (tR = 40.162 min,). Se observó una mayor pureza de la enzima al combinar los métodos
cromatográficos, alcanzándose un 95.31% (tR = 40.240 min) para las purificadas por filtración en gel e
intercambio iónico. Los picos de mayor pureza se colectaron para determinar la secuencia aminoacídica parcial
de la enzima aislada.
Análisis Electroforéticos
Se observó una banda mayoritaria con similar movilidad electroforética a la del patrón (figura 3), cercana a los
25 000 Da. Las electroforésis demuestran el avance en el grado de purificación desde el extracto hasta los
productos semipurificados. Se realizaron estudios de focalización isoeléctrica y electroforesis 2D (resultados no
mostrados). El pico de mayor pureza mostró una banda única en la zona de pH básico. El punto isoeléctrico (pI)
fue de 9.55, valor que coincide con los más actuales informados para la bromelina de tallo (30).

1 2 3 4 5

M . M olar
(Da)

67 000
45 000

25 000

17 800

Figura 3. Electroforesis en geles de poliacrilamida SDS-PAGE. (1) Patrón de masa molar, (2) 20 µg de
bromelina patrón, (3) 40 µg de extracto crudo, (4) 10 µg del pico de Sephadex G-100, (5) 15 µg del
pico de CMC-52.

Secuencia Amino Terminal de la Bromelina de Tallo: Una comparación entre los aminoácidos del extremo
amino terminal de la secuencia original (33) para la bromelina de tallos, con la secuencia parcial obtenida
permite comprobar la homología entre las moléculas y verificar que la enzima aislada es bromelina de tallo (EC
3.4.22.32)
Bromelina de tallo VPQSIDWRDYGAVTSVKNQNPCGACW
Proteína aislada VPQSIDWRDYGAVTSVKNQNPCGAC

Aplicabilidad del Preparado Semipurificado en la Terapéutica como Antitumoral

Estudios de Toxicidad de la Bromelina
En la tabla 7 aparecen los resultados de los estudios de toxicidad. La administración a dosis única produjo
mortalidad en las dosis superiores. No resultó significativa la pérdida de peso de los tratados con respecto a los
controles. Una vez establecida la toxicidad aguda de la bromelina, se administró diariamente durante 30 días.
La muerte ocurrió luego de siete administraciones de la dosis superior y después de 18 días de tratamiento en
las dosis menores.

Tabla 7. Mortalidad observada con bromelina administrada por vía IP en ratones BDF-1 a dosis única y
repetidas.
Toxicidad a dosis única Toxicidad a dosis repetidas
DL50 = 216.35 mg/kg DL50 = 105.91 mg/kg
Límite superior = 302.26 mg/kg Límite superior = 153.33 mg/kg
Límite inferior = 154.86 mg/kg Límite inferior = 73.13 mg/kg
Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 36, No. Especial, 2005

Actividad Antitumoral
Uno de los aspectos más actuales y novedosos en los estudios de aplicación de la bromelina es la
demostración de su capacidad antitumoral. Se ha informado que esta actividad es mayor en preparados
semipurificados (34). El producto obtenido por intercambio iónico es heterógeneo en actividades proteolíticas y
con una actividad específica alta y comparable con la de otros preparados utilizados en la terapeútica (30). Se
evaluaron distintas dosis de bromelina frente a cada tumor, en la tabla 8 sólo aparecen los mejores resultados
para cada estudio. La bromelina mostró actividad antitumoral frente a todos los tumores evaluados excepto en
el melanoma B16 F10.

Tabla 8. Actividad antitumoral de bromelina frente a líneas de tumores murinos.

Dosis de Sobrevida (días) Índice de sobreviva (%)

Tumor Bromelina* Control Control Mejor Control Mejor
Positivo 5- negativo dosis Positivo 5- dosis
Fu Bromelina Fu Bromelina
Leucemia P-388 5.0 19.30 a 11.12 b 18.80 a 73.56 a 69.06 b
Carcinoma pulmonar de Lewis 12.5 35.70 a 27.90 b 35.50 a 27.95 a 27.24 a
Adenocarcinoma mamario -755 5.0 23.50 a 16.00 b 24.40 a 46.87 b 52.50 a
Tumor ascítico de Ehrlich 12.5 29.40 b 10.60 c 34.50 a 177.35 b 225.47 a
Sarcoma-37 25.0 39.30 a 14.20 c 35.31 b 176.75 a 153.60 b
Melanoma B-16 F10 12.5 23.20 a 19.80 b 21.11 b 17.17 a 6.61 b
* Se ensayaron dosis de 5, 12.5 y 25 mg/kg de bromelina, sólo aparecen los resultados de la mejor dosis en
cada experimento. Dentro de cada tumor medias con letras iguales no difieren para sobrevida (Kruskal-Wallis,
Student-Newman-Keuls, p< 0.05) y (Mann-Whitney, p< 0.05) para Índice de Sobrevida.

El incremento de la sobrevida en el carcinoma pulmonar de Lewis sobrepasó el 25% para una dosis de
12.5 mg/kg. Al evaluar este modelo Batkin et al., (11) observaron una actividad antitumoral semejante a la de
este estudio. Cuando se empleó adenocarcinoma 755 para el ensayo “in vivo” de la actividad antitumoral, la
mayor sobrevida (52.50%) se logró con la dosis de 5 mg/kg. Estos son los primeros resultados encontrados de
la actividad antitumoral indirecta de bromelina frente al mismo. Para el tumor ascítico de Ehrlich (TAE; variante
de tumor mamario espontáneo), los animales tratados con bromelina registraron un incremento muy significativo
de la sobrevida, que se favoreció en los animales que rechazaron el tumor primario. En el tratamiento frente al
sarcoma 37, los resultados fueron muy similares a los observados para el TAE.
Las evidencias de la participación del sistema inmune en la resistencia frente a la progresión y diseminación del
cáncer, da esperanzas de que su manipulación llegue a ser una forma válida de tratamiento (12). Cuando se
iniciaron estos estudios mucho se especulaba sobre el posible uso de proteasas de plantas como antitumoral.
Con el descubrimiento de nuevas catepsinas humanas, sus mecanismos de regulación y su implicación en la
progresión del cáncer (2), se han formulado nuevas hipótesis para explicar la actividad antitumoral de
proteasas como la bromelina. Resultados muy recientes de estudios clínicos y preclínicos recomiendan el uso
de bromelina como medicamento complementario en el tratamiento de tumores (16). Teniendo en cuenta la
actividad antitumoral mostrada por el preparado de bromelina frente a cinco de las líneas tumorales estudiadas,
la profundización en estos estudios permitiría proponer el uso clínico de la proteasa. Este trabajo es una
contribución importante en la explicación de la actividad antitumoral de la bromelina y las implicaciones para el
uso de las cisteino proteasas exógenas de plantas como tratamiento complementario de enfermedades
tumorales.

CONCLUSIONES
1. Las condiciones de extracción, en las que se utilizan protectores del centro activo de la enzima, a un pH
cercano al fisiológico de la planta, permitieron la obtención de un preparado crudo de bromelina de tallo de
piña con altos rendimientos de proteína y actividad enzimática.
2. La caracterización del extracto crudo de tallos permitió comprobar la presencia de un producto muy activo y
estable, con un valor de pH óptimo 7 frente a hemoglobina, buena estabilidad en un rango amplio de pH y
temperaturas de hasta 50°C.
3. Se demostró la aplicabilidad del extracto crudo de bromelina en la obtención de un hidrolizado proteico de
Clorella vulgaris, alga que tiene un alto valor nutricional pero muy baja digestibilidad.
Revista CENIC Ciencias Biológicas, Vol. 36, No. Especial, 2005

4. La combinación de cromatografía de intercambio iónico, exclusión en gel y cromatografía en fase reversa

(RP-HPLC) permitió identificar una proteína mayoritaria desde el extracto crudo de tallo hasta el producto
más purificado, que caracterizada en términos de masa molar, punto isoeléctrico y secuencia N-terminal se
demostró que es bromelina de tallo.
5. De acuerdo a los resultados del tamizaje farmacológico el producto semipurificado comparado con el
citostático 5-Fluouracilo mostró una marcada actividad antitumoral frente a los tumores trasplantables de
ratón: leucemia P-388, carcinoma pulmonar de Lewis, sarcoma-37, tumor ascítico de Ehrlich y
adenocarcinoma mamario-755; frente a este último se demostró por primera vez la actividad antitumoral de
la bromelina.

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