Escrito de Tesis - Fatima Sarahi Serrano Villa

Secretaría de Educación Pública
i
INTRODUCCIÓN
TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICO

Instituto Tecnológico de Veracruz
Efecto de cepas de Trichoderma y quitosano en el control de

cepas de Fusarium aisladas de cultivos de maíz y tomate.
Tesis
Que para obtener el grado de:
Maestra en Ciencias en Ingeniería Bioquímica
Presenta:
IBQ Fatima Sarahi Serrano Villa
Asesores:
Dr. Mario Ramírez Lepe
Dra. Patricia G. Mendoza García
H. Veracruz Ver. Diciembre 2016
ii
INTRODUCCIÓN
INTRODUCCIÓN
Las especies del género Fusarium se caracterizan por ser hongos filamentosos que
se desarrollan en ambientes húmedos y son responsables de enfermedades en gran
variedad de cultivos a nivel mundial durante el desarrollo del cultivo y en el
tratamiento postcosecha, identificándose oficialmente alrededor de 80 especies al
2006 (Leslie & Summerell, 2006b).
En México, la presencia de especies de éste hongo genera pérdidas económicas
importantes en sus cultivos de mayor valor comercial, tal es el caso del maíz grano
en que Fusarium que van desde un
Algunas especies producen micotoxinas, tal es el caso de Fusarium moniliforme que
produce Fumonisina B1 al encontrarse presente en cereales como el maíz. El maíz
es el cultivo de mayor importancia económica en México, dado que un producto
derivado del maíz es la tortilla y es base en la alimentación del mexicano, la
presencia de este hongo en los granos de maíz incrementa las probabilidades de
exposición y consumo de micotoxinas (SAGARPA, 2011a)
Por otra parte, Fusarium oxysporum genera enfermedades en diversos cultivos
dentro de los que se incluyen el frijol y el jitomate causando pudrición en la raíz,
amarillamiento y marchitez de las hojas y de la planta. El frijol y el tomate son el
segundo y octavo cultivos de mayor importancia económica en el país de modo que
la prevención y control de estas enfermedades es esencial para el desarrollo de
estos cultivos (SAGARPA, 2010).
Algunos métodos de control químico emplean formulaciones a base de cobre, sin
embargo dado que la pudrición se da principalmente en la raíz, no se posible
erradicar la enfermedad (SAGARPA, 2011b). Para ello el control biológico se emplea
a nivel preventivo mediante aplicaciones de agentes antagónicos como hongos del
género Trichoderma, el cual es un hongo filamentoso con gran presencia en suelo y
cosmopolita que combina múltiples mecanismos de acción tales como la
competencia por espacio y nutrientes, la producción de antibióticos y el
micoparasitismo mecanismo que conjuga la producción de enzimas hidrolíticas
iii
INTRODUCCIÓN
(quitinasas, proteasas, β-1,3-glucanasas), la formación de cuerpos apresorios y

penetración de las hifas de otros hongos (Druzhinina et al., 2011).
El quitosano es un polímero derivado de la quitina muy abundante en la naturaleza y
de carácter renovable, biodegradable, no tóxico (Jeon, Shahidi, & Kim, 2012) con
actividad biológica sobre bacterias, levaduras y hongos (Tikhonov et al., 2006)
quienes muestran una sensibilidad variable a los efectos del mismo atribuida a la
composición de ácidos grasos de su membrana (Xing et al., 2015). Uno de los
métodos de obtención de quitosano es mediante la hidrólisis enzimática de la quitina
mediante quitinasas y quitosanasas producidas por hongos, entre ellos, Trichoderma
(Lin, Chenb, & Peng, 2009; Stoilova, Koseva, Petrova, Manolova, & Rashkov, 2001).
Algunos estudios sugieren que tratamientos con quitosano mejoran las propiedades
antifúngicas del agente de control biológico sobre Fusarium y otros fitopatógenos,
además de promover los mecanismos de defensa de la planta e incrementar la
composición de compuestos fenólicos en los frutos (El-Mohamedy & Abdel-Kareem,
2014) así como la sobreexpresión de los genes que codifican para estas enzimas en
plantas de trigo mejoran la resistencia de la planta a hongos fitopatógenos (Rana,
Loerz, Schaeffer, & Becker, 2012)
Por lo anterior se plantea la siguiente pregunta, ¿existe un efecto sinérgico entre
Trichoderma y quitosano sobre Fusarium?, teniendo el presente trabajo como
objetivo general “evaluar el efecto sinérgico del quitosano y Trichoderma sobre
Fusarium así como los niveles de expresión de quitosanasas durante la interacción.
Y como objetivos específicos evaluar la tolerancia a quitosano de cepas de
Trichoderma y Fusarium aisladas de diferentes regiones de México, determinar la
composición de ácidos grasos de la membrana celular de las cepas de Trichoderma
y Fusarium con baja y alta tolerancia al quitosano, evaluar si tiene relación con la
misma, realizar ensayos de confrontación en presencia de quitosano y evaluar si
existe un efecto sinérgico entre Trichoderma y quitosano para inhibir el crecimiento
de Fusarium así como cuantificar los niveles de expresión de los genes de quitinasas
y quitosanasas de Trichoderma en presencia de quitosano y Fusarium sp.
iv
CONTENIDO
INTRODUCCIÓN...........................................................................................................II
ANTECEDENTES..........................................................................................................2
1.1 Fusarium...........................................................................................................2
1.1.1. Situación de la fusariosis en México......................................................2
1.1.1.1. Fusariosis en maíz..................................................................................3
1.1.1.2. Fusariosis en tomate rojo.......................................................................4
1.1.2. Métodos de control de Fusarium............................................................5
1.2. Trichoderma......................................................................................................5
1.3. Quitosano..........................................................................................................7
1.3.1. Efecto del quitosano en plantas.............................................................8
1.3.2. Efecto antifúngico del quitosano sobre Fusarium spp...........................8
1.3.3. Efecto del quitosano sobre agentes de control biológico.......................8
1.3.4. Quitosano mejora las propiedades antifúngicas de Trichoderma..........9
1.3.5. Degradación biológica de la quitina y el quitosano................................9
1.4. Quitosanasas..................................................................................................10
JUSTIFICACIÓN............................................................................................................9
HIPÓTESIS....................................................................................................................9
OBJETIVOS.................................................................................................................11
2.1 OBJETIVO GENERAL....................................................................................11
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS..........................................................................11
METODOLOGÍA..........................................................................................................11
3.1. Recolección de muestras...............................................................................11
v
3.2. Aislamiento de cepas de Fusarium a partir de muestras de suelo................11
3.3. Aislamiento a partir de plantas con síntomas de enfermedad.......................12
3.4. Identificación morfológica...............................................................................12
3.4.1. Caracterización microscópica...............................................................12
3.4.2. Caracterización macroscópica.............................................................13
3.5. Identificación molecular..................................................................................13
3.5.1. Extracción de DNA...............................................................................15
3.5.2. PCR de punto final................................................................................15
3.6. Efecto del quitosano sobre el crecimiento de cepas de Trichoderma y

Fusarium 16
3.7. Determinación de la concentración letal media (CL 50)...................................17
3.8. Efecto del quitosano sobre el crecimiento miceliar de Trichoderma y

Fusarium. 18
3.9. Determinación de actividad enzimática..........................................................18
3.10. Determinación de sinergismo...............................................................19
3.10.1. Determinación del efecto de cepas de Trichoderma sobre Fusarium

spp. 20
3.11. Determinación de la composición de ácidos grasos de la membrana

plasmática..............................................................................................................21
3.12. Cuantificación de los niveles de expresión de quitosanasas por qRT-

PCR. 21
RESULTADOS Y DISCUSIÓN....................................................................................21
4.1 Sitios de muestreo..........................................................................................21
4.2 Aislamientos....................................................................................................21
4.2.1 Cepa CAC8...........................................................................................23
4.2.2 Cepa RSM52A......................................................................................24
vi
4.2.3 Cepa RSM53A......................................................................................25
4.2.4 Cepa RSM53B......................................................................................26
4.2.5 Cepa RSM210......................................................................................27
4.2.6 Cepa RSM100......................................................................................28
4.2.7 Cepa ECMA2........................................................................................29
4.2.8 Cepa ECMC4........................................................................................30
4.2.9 Cepa ECM8..........................................................................................30
4.2.10 Cepa ECSP16M...................................................................................31
4.2.11 Cepa ECSP18M...................................................................................32
4.2.12 Fragmento amplificado con los primes ITS1 e ITS4 para la cepa
ECSP6M. 33
ECSP18M..............................................................................................................34
ECSP29M..............................................................................................................34
4.2.15 Fragmento amplificado con los primes ITS1 e ITS4 para la cepa 52A.
34
4.3 Efecto del quitosano sobre el crecimiento de Trichoderma a partir de

esporas. 36
4.4 Efecto del quitosano sobre el crecimiento de Fusarium y determinación de

concentración letal media a partir de esporas......................................................41
4.5 Efecto del quitosano sobre el crecimiento miceliar de Trichoderma..............44
4.6 Efecto del quitosano sobre el crecimiento miceliar de Fusarium...................45
4.7 Determinación del efecto de Trichoderma y quitosano en el control invitro de

Fusarium. 48
4.8 Degradación de quitosano..............................................................................50
vii
CONCLUSIONES........................................................................................................21
BIBLIOGRAFÍA............................................................................................................VI
viii
ANTECEDENTES
1.1 Fusarium
El género Fusarium fue descrito en 1809 por Link como hongos que poseen esporas
en forma de canoa o banana como una característica definitiva para las especies que
lo integren, sin embargo se habían denominado más de 1000 especies a nivel
mundial hasta que en la década de los 30’s Wollenweber y Reinking redujeron esta
clasificación a 65 especies (Gagkaeva, 2008). En la actualidad existen más de 80
especies identificadas (Leslie & Summerell, 2006b), a su vez, la mayoría de las
especies de éste género tienen como teleomorfo a Gibberella, mientras que el
complejo que comprende Fusarium solani y Fusarium decemcellulare son
teleomorfos de Haematonectria y Albonectria respectivamente (Gagkaeva, 2008).
Leslie y Summerell (2006b) en correspondencia con la American Phytopathological
Society afirman que alrededor de 81 de los 101 cultivos importantes a nivel mundial
tienen al menos una enfermedad asociada a este género, ya sea durante el
crecimiento del cultivo o en el tratamiento post-cosecha (Desjardins, 2006).
Algunos de los integrantes de éste género producen metabolitos secundarios que
además de estar asociados a enfermedades en plantas, se relacionan con defectos
de crecimiento en humanos y animales así como con cáncer. Dentro de estos
metabolitos podemos encontrar micotoxinas como los tricoticenos, las zeralenonas y
las fumonisinas producidas por Fusarium tricintum y F. poae, F. graminearum y F.
moniliforme, respectivamente, en cereales como el trigo y el maíz (Desjardins, 2006;
FAO, 2003; Requena, Saume, & León, 2005).
1.1.1. Situación de la fusariosis en México.
En México hay reportes de enfermedades por Fusarium en diversos cultivos, tales

como la fusariosis de la fresa en Michoacan y Guanajuato ocasionada por Fusarium
2
ANTECEDENTES
oxysporum f. sp. fragariae (SAGARPA, 2012c), el declinamiento del esparrago por F.

oxysporum, F. moniliforme, y F. solani (Quilambaqui-J., 2005), la pudrición de la raíz
en plantas de algodón en el estado de Baja California debido al uso de residuos
agrícolas de cosecha sin representar daños graves (SAGARPA, 2015d), pudrición de
tallo y raíz de agave y piña por F. moniliforme, F. oxysporum y F. solani (SAGARPA,
2011a), fusariosis de la espiga en trigo por F. graminearum Schwabe (Ireta-M., J., &
L.-Gilchrist, S., 1994), la pudrición de la raíz del frijol (con más de 10 especies
involucradas y destacando F. solani) (Sánchez-García et al., 2006), a partir del 2010
se implementaron actividades de vigilancia epidemiológica hacia la fusariosis de la
piña causada por Fusarium guttiforme Nirenberg y O´Donell 1998 debido a que ha
generado pérdidas de 30 al 90% en países de Sudamérica, que en situación
favorable, al 2015 se declaró ausente en el país (SAGARPA, 2015c). Así mismo en
plátano, otro cultivo con alerta de vigilancia epidemiológica es el plátano por F.
oxysporum f. sp. cubense sin presentarse brotes de la enfermedad hasta la
actualidad.
1.1.1.1. Fusariosis en maíz

El maíz es el cultivo de mayor importancia tanto cultural como económica a nivel
nacional, según datos del servicio de información agroalimentaria y pesquera (SIAP),
siendo que los productos derivados del mismo son dirigidos a la alimentación
humana con un consumo per cápita de 328 g/día (Morales-Rodríguez et al., 2007) y
hacia otros insumos. En los últimos 5 años se han sembrado alrededor de 7500
millones de hectáreas con un valor de más de 72 mil millones de pesos. Puebla
ocupa el séptimo lugar en rendimiento (toneladas cosechadas respecto a las áreas
sembradas) a nivel nacional en la producción de maíz forrajero con una superficie de
4 471 hectáreas con un valor de 113,463.73 miles de pesos, en tanto que el grano de
maíz, tuvo un valor de 3 361 300 mil pesos de al 2016 (SIAP, 2016).
Este cultivo presenta diversas enfermedades desde las plántulas, hasta la planta
adulta afectando raíces, tallos, mazorcas y granos, que son causadas entre otros,
por hongos del género Fusarium (Figueroa-Rivera et al., 2010). Una de las más
3
ANTECEDENTES
graves, la pudrición de la mazorca reduce considerablemente el rendimiento del

cultivo y afecta las cualidades físicas, fisiológicas y fitosanitarias de la semilla. Los
reportes de la pudrición de la mazorca a nivel mundial señalan a F. proliferatum, F.
verticillioides (conocido también como F. moniliforme) y F. subglutinans como
principales agentes causales de la misma. Éstos patógenos son capaces de
prevalecer en el suelo, en restos de plantas infectadas y en el interior de semillas
aparentemente sanas pudiendo afectar el embrión y el interior de pericarpio sin
síntomas visibles (Morales-Rodríguez et al., 2007)
Datos de la SAGARPA (2011a) señalan a Fusarium moniliforme como el agente
causal de las enfermedades de mayor importancia económica en cultivos de maíz en
el país, siendo los más afectados los estados de Puebla, Tlaxcala y México; sin
embargo, se ha identificado una biodiversidad superior de especies de Fusarium
asociadas a la pudrición de la mazorca en la región de Valles Altos a la que
pertenece Puebla que los informados en otros cultivos de maíz a nivel mundial; en
ésta región se ubicaron las especies F. solani, F. chlamydosporum, F. napiforme, F.
poae, y F. pseudonygamai, mediante el análisis filogenético de la región del
espaciador interno de la transcripción (ITS) y secuencias parciales de la subunidad
grande ribosomal; (Morales-Rodríguez et al., 2007).
García-Aguirre y Martínez Flores en 2010 analizan las especies de Fusarium
presentes en maíz blanco nacional y maíz criollo blanco recién cosechado en
municipios de la región de Ciudad Serdán, Puebla, encontrando a Fusarium
oxysporum, F. subglutinans, F. moniliforme, F. graminearum, F. anthophilum, F.
poae, F. tricinctum, F. sporotrichioides y F. proliferatum.
1.1.1.2. Fusariosis en tomate rojo

El jitomate es el octavo cultivo de mayor importancia económica en México al 2015
(SIAP, 2016) Una de las enfermedades más comunes en el tomate, la marchitez
vascular, es ocasionada por Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, se presenta con
caída de las hojas superiores, seguida de la amarilles de las hojas inferiores y muerte
de la planta mostrando oscurecimiento de los vasos internos del tallo (SAGARPA,
4
ANTECEDENTES
2010), disminuyendo así en un 60% el rendimiento del cultivo y afectando la calidad

del producto (Ascencio-Álvarez et al., 2008)
1.1.2. Métodos de control de Fusarium.

El control químico se emplea mediante el tratamiento de las semillas con fungicidas
tales como el captan, benomil del grupo de los bezimidazoles que impide la síntesis
de DNA de los patógenos, sin embargo este método de control pierde efectividad al
promover el desarrollo de especies fitopatógenas resistentes a los fungicidas. Una de
las alternativas más económicas para combatir a las enfermedades por Fusarium es
la generación de especies con resistencia genética (SAGARPA, 2012b) denominado
control genético. Por otra parte se emplea el control biológico, como componente
esencial de la agricultura sostenible. Uno de los hongos ampliamente usados para
éste método de control son los del género Hypocrea/Trichoderma, gracias a su
habilidad para antagonizar y parasitar (micoparasitismo) a los hongos fitopatógenos
como Fusarium, además de colonizar las raíces e inducir las respuestas de defensa
de la planta, se incluye como componente mayoritario de las preparaciones
comerciales de biofungicidas (Infante, Martínez, González, & Reyes, 2009; Kim &
Knudsen, 2013). En maíz se usa en el tratamiento de las semillas (López et al., 2010)
1.2. Trichoderma
Las especies del género Hypocrea/Trichoderma, denominado así a causa de
presentar pleomorfismo, es decir, que pueden existir en dos estados morfológica y
fisiológicamente diferentes, se caracterizan por ser hongos saprófitos, endófitos
(capaces de colonizar los tejidos de las plantas sin ocasionarles lesiones),
cosmopolitas (con gran presencia en la microbiota del suelo) y oportunistas (con gran
adaptabilidad a diferentes sustratos), lo cual permite su empleo como como agente
de control biológico de hongos fitopatógenos (Druzhinina et al., 2011; El-Mohamedy
& Abdel-Kareem, 2014). Dicho control lo lleva a cabo a través de diferentes
mecanismos tales como la antibiosis (producción de compuestos volátiles y no
5
ANTECEDENTES
volátiles inhibitorios del crecimiento microbiano), la competencia por espacio y

nutrientes, y el más complejo de los procesos, el micoparasitismo.
Durante el micoparasitismo, conocido como una simbiosis antagónica entre
microorganismos, las especies de Trichoderma crecen quimiotrópicamente hacia el
hospedante, lo reconocen con una alta especificidad a través de interacciones
lecitina-carbohidratos y se adhieren por asociación de un azúcar presente en
Trichoderma a la lecitina presente en la pared del hospedante, mediante estructuras
tipo papila, y enrollan las hifas del contrario e incluso en ocasiones lo penetran
(Infante et al., 2009). Este mecanismo involucra la producción y secreción conjugada
de enzimas líticas de la pared celular. Los principales genes involucrados en dicho
proceso son el ech42 (chit42), prb1 and lam1.3(xbg1.3-110) que codifican para una
endoquitinasa, proteinasa y β-1,3.glucanasa respectivamente (Steyaert, Stewart,
Jaspers, Carpenter, & Ridgway, 2004).
Las enzimas purificadas de Trichoderma harzianum presentan una actividad
quitinolítica y glucanolítica de hasta 100 veces mayor que las producidas por plantas
además de cubrir un amplio espectro de fitopatógenos (Rana et al., 2012).
Las enzimas de diferentes especies de Trichoderma empleadas en conjunto o en
combinación con proteínas PR de plantas, fungicidas comerciales, toxinas que
afectan la membrana celular, o bacterias empleadas en el biocontrol presentan un
efecto sinérgico en su actividad antifúngica (Steyaert et al., 2004).
Por otra parte, Trichoderma es capaz de inducir los mecanismos de defensa
fisiológicos y bioquímicos de la planta, entre ellos la producción de compuestos
relacionados con la resistencia, la detoxificación de toxinas secretadas por
patógenos y la desactivación de sus enzimas durante el proceso de infección.
Además de esto, favorece la absorción de nutrientes (entre ellos la solubilización de
fosfatos) y favorece el desarrollo radical aumentando la resistencia de la planta al
estrés (Infante et al., 2009)
6
ANTECEDENTES
1.3. Quitosano
El quitosano es un heteropolímero derivado de la desacetilación de la quitina,
conformado por unidades de glucosamina y N-acetilglucosamina unidas entre sí
mediante enlaces β-(1,4). Tanto la quitina como el quitosano, se encuentran de forma
natural en algunos microorganismos en donde fungen como componente de la pared
celular (Baker, Specht, Donlin, & Lodge, 2007) Este polímero se caracteriza por ser
biodegradable, no tóxico para los animales, y dado que la quitina se genera como
subproducto de la industria del procesamiento de productos del mar, se garantiza
una fuente renovable de este compuesto (Jeon et al., 2012) (Xu, Zhao, Han, & Du)
(Devlieghere, Vermeulen, & Debevere, 2004). Existen dos métodos de obtención de
quitosano: 1)mediante hidrolisis química o 2) enzimática de la quitina (Muzzarelli et
al., 2006) por acción quitinasas y quitosanasas producidas por hongos como
Trichoderma (da-Silva & Honorato), otras enzimas empleadas en la hidrolisis del
quitosano son lisosimas, celulasas, hemicelulasas, proteasas y lipasas (Lin et al.,
2009; Liu, Tian, Meng, & Xu, 2007).
El quitosano y sus derivados poseen propiedades antifúngicas (Guo et al., 2006) que
pueden variar en función del peso molecular (Guo et al., 2008), el grado de
desacetilación y el pH de la solución y el microorganismo objetivo (Tikhonov et al.,
2006). Éste efecto se presenta en los diferentes estados de desarrollo de los hongos
mediante la inhibición del crecimiento miceliar, la germinación de esporas y la
esporulación y factores de virulencia (Lin et al., 2009; Xu et al., 2007).
Uno de los mecanismos asociado al quitosano de alto peso molecular (HMW) sugiere
que la adsorción del heteropolímero sobre la pared celular conduce a la
desorganización de la membrana y a la fuga celular gracias a la interacción entre las
cargas negativas de los lípidos de membrana y los grupos amino del quitosano
cargados positivamente a pH ácido (Tikhonov et al.)
Otro mecanismo propuesto en relación al quitosano de bajo peso molecular (LMW)
señala la interferencia con RNAm y la síntesis de proteínas encargadas del
mantenimiento de la membrana celular así como enzimas involucradas en la síntesis
de ergosterol (Jaime et al., 2012).
7
ANTECEDENTES
Algunos autores como Liu et al., (Liu et al.) y Xing et al., (Xing et al.) señalan que los
hongos presentan diferencias en la sensibilidad al quitosano in vivo. Palma-Guerrero
et al., (2010) propuso que la fluidez de la membrana, conferida por la proporción de
ácidos grasos saturados y poliinsaturados que la componen, puede ser un factor
determinante en éste fenómeno.
1.3.1. Efecto del quitosano en plantas.

Otra característica importante del quitosano es su habilidad de activar los
mecanismos de defensa de las plantas, ya sea en las hojas, semillas o frutos,
mediante la producción de peróxido de hidrógeno, la acumulación de lignina, la
síntesis de fitoalexinas, pisatina, la activación de la transcripción de genes que
codifican para enzimas líticas de la pared celular de hongos fitopatógenos tales como
β-1,3-glucanasas y quitinasas (Xu et al., 2007) (Rodríguez-Pedroso et al., 2009) que
consecuentemente pueden liberar oligomeros de quitosano producto de la hidrolisis
de la quitina presente en la pared celular de los mismos (El-Mohamedy & Abdel-
Kareem, 2014).
1.3.2. Efecto antifúngico del quitosano sobre Fusarium spp

Tratamientos con quitosano en tomate proporcionan un control efectivo de hongos
fitopatógenos (entre ellos Fusarium oxysporum) en condiciones post-cosecha (Liu et
al., 2007) así como en campo (El-Mohamedy & Abdel-Kareem, 2014) además de
estimular la actividad enzimática de polifenoloxidasa (PPO) y peroxidasa (POD) y
mejora la cantidad compuestos fenólicos en cuya síntesis participa la enzima
fenilalanina amonio liasa PAL (Tikhonov et al. 2006).
1.3.3. Efecto del quitosano sobre agentes de control biológico.

En un estudio donde se analizaron diversos hongos fitopatógenos (entre ellos
Fusarium oxysporum f. sp. radicis licopersici) así como hongos etomopatógenos y
endófitos, se encontró que los primeros presentan una sensibilidad distinta a
quitosano frente a los agentes de control biológico, además de promover la
8
ANTECEDENTES
conidiación en Bauberia bassiana, un hongo entomopatógeno, a concentraciones en

que se veía afectado el crecimiento del micelio (Palma-Guerrero, Jansson, Salinas, &
Llorca, 2008; Javier Palma-Guerrero et al., 2010). Posteriormente un estudio del
transcriptoma de Pochonia clamydosporia mostró que el quitosano promueve la
producción de proteasas y enzimas relacionadas con la degradación de
carbohidratos (Palma-Guerreroa et al., 2010), cabe resaltar que las proteasas, en
especial la VCP1, son las principales enzimas asociadas con la patogenicidad de
éste hongo nematófago (Larriba, Martín-Nieto, & Lopez-Llorca, 2012). Por otra parte
El quitosano se ha empleado en combinación con bacterias endofíticas tales como
Bacillus pumillus (Benhamou, Kloepper, & Tuzun, 1998) para promover las
respuestas de defensa en plantas de tomate ante la infección por Fusarium
oxysporum f sp radicis lycopersici (Forl).
1.3.4. Quitosano mejora las propiedades antifúngicas de Trichoderma

Neven et al., (2007) evalúan la tolerancia a quitosano por parte de Trichoderma
harzianum en un rango de concentraciones de 0.38 a 4.5 mg/ml encontrando que las
colonias que sobrevivieron a concentraciones de hasta 4.5 mg/ml mejoraron su
eficiencia sobre el crecimiento in vitro de Fusarium oxysporum f. sp. sesami.
1.3.5. Degradación biológica de la quitina y el quitosano.

En la figura 1 se muestran las rutas enzimáticas potenciales para la degradación de
la quitina y el quitosano. Éste modelo es análogo al complejo de celulasas fúngicas.
Los pasos enzimáticos confirmados por los autores se muestran con líneas continuas
mientras que los hipotéticos con líneas discontínuas. Se puede observar que en este
proceso las quitosanasas son el punto inicial para la degradación del quitosano,
siendo Trichoderma un productor potencial de quitosansas, es importante evaluar su
rol en la tolerancia a diferentes concentraciones de quitosano.
9
ANTECEDENTES
Poly-[β-(1,4)-N-acetilglucosamina]
cristalino
Hidrolisis Desacetilación
Endo-quitinasa
(licuefacción)
Endo-quitinasa
(sacarificación) Exo-
quitobiohidrolasa
Endo-
quitosanasa
Exo-N,N-diacetil-
quitobiohidrolasa
Exo-
glucosaminidasa
N-acetilgucosaminidasa
(N,N’-diacetilquitobiosa)
Quitobiosa
Exo-N,N-acetil-
glucosaminidasa
GlcNAc= N-Acetilglucosamina
GlcN= Glucosamina
Ac= fracción acetil
Figura 1. Rutas enzimáticas potenciales para la degradación del quitosano.

Adaptado de Davis&Eveleigh (1984).
1.4. Quitosanasas
La quitosanas son enzimas presentes en diferentes microorganismos que hidrolizan
los enlaces β-(1,4) del quitosano. En ciertas etapas autolíticas de los hongos tienen
la función de debilitar o provocar la lisis de la pared celular de las hifas (Rodríguez-
Pedroso et al., 2009). Se ha demostrado que las quitosanasas provenientes de
10
ANTECEDENTES
diferentes microorganismos presentan actividad antifúngica (Saito et al., 2009). Por

otra parte Ike et al., (2007) y Da-Silva et al., (2012) mostraron que los aislamientos
de Trichoderma (T. harzianum, T. koningii, T. viride, T. ressei k y T. polysporum)
presentan diferencias en su capacidad para producir quitosanasas.
Trichoderma es empleado para la producción de quitosanasas a nivel industrial sobre
medio solido creciendo en presencia de quitosano como inductor (da-Silva &
Honorato, 2012), a su vez, estas enzimas son empleadas en la producción de
quitoligosacáridos de quitina y quitosano (Lin et al., 2009).
Rana et al., (2012) modificaron genéticamente a Triticum aestivum L. mediante la
inserción de los genes HarChit y HarCho que codifican para una quitinasa y
quitosanas provenientes de Trichoderma harzianum encontrando que la
sobreexpresión de estos genes conducía a la resistencia de la planta a
enfermedades por hongos.
11
JUSTIFICACIÓN
Las especies del género Fusarium afectan un gran número de cultivos a nivel
nacional, dentro de los cuales se encuentran el maíz y el tomate, siendo los agentes
causales de las mayores pérdidas económicas en éstos cultivos. Puebla es uno de
los estados más afectados a causa de las enfermedades que provoca Fusarium
moniliforme en maíz y en donde se presentan con gran frecuencia afecciones en
cultivos de tomate. Dado el grado de daño que ocasionan las especies de éste
género en cultivos de gran importancia económica y cultural, y a que los métodos de
control químico y biológico llegan a ser insuficientes en el control del fitopatógeno,
algunos estudios han empleado tratamientos de Trichoderma en combinación con
quitosano, así como la modificación de especies vegetales con genes de
quitosanasas de Trichoderma para mejorar la eficiencia del control del fitopatógeno.
Por todo lo anterior es importante evaluar la posibilidad de que exista un efecto
sinérgico entre las especies de Trichoderma y el biopolímero en relación a su
capacidad de producir quitosanasas, que permita la selección de especies del
antagónico y puedan aplicarse en combinación con programas de control de la
fusariosis en un futuro.
9
HIPÓTESIS
La habilidad de producir quitosanasas en presencia de quitosano, así como las

características de la membrana celular de cepas de Trichoderma le permitirán tener
un efecto sinérgico al combinarse con el biopolímero para el control de Fusarium spp
aisladas de maíz y tomate del estado de Puebla.
9
OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GENERAL

Evaluar el efecto del quitosano y Trichoderma para el control de Fusarium.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Aislar e identificar morfológica y molecularmente cepas de Fusarium de
cultivos de maíz y tomate del estado de Puebla.
 Evaluar la tolerancia a quitosano de cepas de Trichoderma y los aislamientos
de Fusarium
 Determinar si existe un efecto sinérgico en la combinación de los tratamientos
para el control del fitopatógeno mediante ensayos de confrontación in vitro.
 Determinar la composición de ácidos grasos de la membrana celular de las
cepas de Trichoderma y Fusarium con baja y alta tolerancia al quitosano y
evaluar si tiene relación con su resistencia.
 Cuantificar los niveles de expresión de los genes de quitosanasas de
Trichoderma y Fusarium en presencia de quitosano.
11
METODOLOGÍA
3.1. Recolección de muestras

Recolectar 100 gramos de muestras de suelo, en una profundidad de 5 a 25 cm en la
periferia de las planta, en bolsas de plástico y conservarlas a 4°C para su traslado al
laboratorio y hasta su utilización. Se debe recolectar 25 muestras de suelo cada 2
hectáreas seccionando el terreno en diagonales o en forma de zig-zag dependiendo
de las características del terreno (Leslie & Summerell, 2006b).
A su vez se recolectan plantas que presenten amarillamiento o marchitez en las

hojas así como daño visible en tallo o marchitez total de la planta, se depositan en
bolsas de plástico y se almacenan a 4°C para su traslado al laboratorio y
procesamiento (Rodríguez, Ramos, & Vicente, 2013).
3.2. Aislamiento de cepas de Fusarium a partir de muestras de suelo

Secar el suelo en flujo laminar a 25 °C durante 24 horas, pesar 1 gramo de suelo y
diluirlo en agar-agua (WA) al 0.5% (peso en volumen) realizar diluciones decimales e
inocular 25 microlitros de la dilución 10 -2 y 10-3 en placas con agar verde de malaquita
(MGA) por duplicado extendiendo con la varilla de vidrio para la absorción del inóculo
en el medio y la separación de las colonias e incubar a 25°C durante 5 días o hasta
el desarrollo de colonias separadas (Leslie & Summerell, 2006b).
La composición basal del medio de aislamiento agar verde de malaquita (MGA) por
litro de agua es 15 gramos de peptona, 1 gramo de fosfato de potasio monobásico
(KH2PO4), 0.5 gramos de sulfato de magnesio heptahidratado, 2.5 gramos de oxalato
de verde de malaquita, 20 gramos de agar, este medio es autoclavado a 121°C por
15 minutos y posteriormente se agregan 20 mililitros de solución de estreptomicina y
12 mililitros de solución stock de cloranfenicol.
11
METODOLOGÍA
La solución stock de estreptomicina contiene 5 gr del antibiótico en 100 ml agua

destilada y la de cloranfenicol contiene 1 gramo de cloranfenicol en 100 mililitros de
agua.
Las colonias obtenidas son transferidas a tubos con 1 ml de caldo papa dextrosa
(infusión de papa 350 gramos por litro de agua destilada y dextrosa al 2%)
autoclavado a 121°C durante 15 minutos. Se realiza una observación microscópica
en búsqueda esporas fusiformes. Dichas cepas se subcultivan en agar papa dextrosa
(Difco ®) para identificación de las características morfológicas macroscópicas. Así
mismo se realiza la recolección de esporas con agua destilada para su conservación
a -70°C con glicerol como crioprotector a una concentración final de 30% v/v.
3.3. Aislamiento a partir de plantas con síntomas de enfermedad

Se cortan secciones de 0.5 cm del área con síntoma, y tanto los granos de maíz
como las muestras de planta se desinfectan con hipoclorito de sodio al 1%, y se
colocan 5 piezas por placa Petri con agar verde de malaquita y se incuban a 25 +1°C
durante 5 días monitoreando la aparición de colonias y realizando subcultivos en
PDB y se realiza una observación microscópica para identificación de las conidias en
forma de canoa, se realizan cultivos monospóricos para la purificación de las cepas y
se conservan por congelamiento profundo en glicerol (Leslie & Summerell, 2006b;
Rodríguez et al., 2013)
3.4. Identificación morfológica

3.4.1. Caracterización microscópica
Para la producción de conidios los cultivos puros se inoculan en medio Spezieller

Nährstoffarmer (SNA) compuesto por 1 gramo de fosfato de potasio monobásico, 1
gramo de nitrato de potasio, 0.5 gramos de sulfato de magnesio heptahidratado, 0.5
gramos de cloruro de potasio, 0.2 gramos de glucosa, 0.2 gramos de sucrosa y 20
gramos de agar por litro de agua destilada. A los 7 días de crecimiento se realiza un
frotis seco con una tinción de azul de metileno. Estas preparaciones se observan en
12
METODOLOGÍA
un microscopio de campo claro marca MEIJI, con el aumento de 100X adicionando

aceite de inmersión. Se realiza la búsqueda de macroconidios, microconidios,
clamidosporas y fiálides.
En la figura 3.1 se muestran algunas características morfológicas de las esporas que
se han usado como guía para la identificación de los aislamientos. De la figura A a la
D se muestran las formas típicas de las macroconidias, ya sea el macroconidio recto
(B), con curvatura dorsiventral (C) o con el lado dorsal más curvado que el ventral
(D). También se muestra la forma del ápice romo (E), papilato (F), enganchado (G) y
afilado (H). La célula basal o pie en forma de pie (I), forma de pie alargado (J),
claramente marcada (K), apenas marcada (L). Microconidio oval (M-O), reniforme o
riñón (P), ovoide (Q), piriforme (R), napiforme (s), globosa (T) y fusiforme (tipo huso o
en forma de cigarro). Así como la morfología de las fialides en monofialide larga (U),
monofialide corta (V), polifialide corta (W), polifialide larga (X), microconidios en
cadena corta (Y) y microconidios en cadena larga (Z).
3.4.2. Caracterización macroscópica

Para la identificación macroscópica cada cepa se inoculó en placas Petri de 9x15
mm con agar papa dextrosa (PDA) cuya composición es igual a la de PDB
adicionando 15 gramos de agar por litro de medio. A los 7 días de crecimiento se
tomaron fotos del anverso y reverso, determinando la coloración del micelio así como
de algún pigmento en el agar.
3.5. Identificación molecular
Para identificar los aislamientos se realiza la propagación del cultivo puro en PDB, se
recupera el material genético por medio de una extracción de DNA bajo el método de
fenol:cloroformo (Rodríguez et al., 2013), se purifica por GeneClean (Cuervo-Parra,
2011), y se realiza PCR de punto final amplificando el gen de las ITS usando los
primers universales ITS1 e ITS4 (White, Bruns, Lee, & Taylor 1990). Los productos
de PCR son purificados, liofilizados y enviados a secuenciar al IBT. Las secuencias
obtenidas se analizan con el software Chromas 2.4.4 (www.technelysium.com.au)
para ser convertidas en formato fasta.
13
METODOLOGÍA
Fig. 3.1. Caracteres morfológicos de esporas utilizados en la identificación de

especies de Fusarium, adaptado de Leslie & Summerell (2006).
14
METODOLOGÍA
Posteriormente se introducen en BLAST para realizar alineamientos y encontrar las

homologías con las secuencias reportadas en la base de datos del Centro Nacional
de Información sobre Biotecnología (NCBI), GeneBank. Y se realizan los respectivos
cladogramas mediante el software en línea ClustalOmega
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/).
3.5.1. Extracción de DNA

Se realiza la ruptura del micelio por criofractura moliendo el micelio en un mortero
con pistilo estéril apoyado de la adición de nitrógeno. Se realiza la extracción por el
método de fenol cloroformo de acuerdo con OIRSA (Rodríguez et al., 2013), se
verifica la extracción mediante electroforesis en gel de agarosa (Cuervo-Parra, 2011).
Se purifica por el método de GeneClean (Contreras et al., 1998). Se calcula la
concentración del DNA midiendo la absorbancia a 260 nm en un espectrofotómetro
BioRad Smartspect® 3000, sabiendo que una unidad de densidad óptica
corresponde a 50 μg de ADN/ml. El cociente entre las densidades ópticas medidas a
260 y 280 nm indica la pureza de la muestra. Para una preparación de ADN este
valor debe ser de aproximadamente de 1.65 a 1.9. Un valor menor indica posible
contaminación con proteínas, en tal situación repetir el procedimiento GeneClean.
3.5.2. PCR de punto final

Para la identificación de las especies de fusarium se emplearan los primers
universales ITS1 (5’–TCC GTA GGT GAA CCT GCG C-3’) e ITS4 (5'-GGA AGT AAA
AGT CGT AAC AAG G -3') de acuerdo con el método de White (White, Bruns, Lee, &
Taylor 1990). Las reacciones se llevaran a cabo en un termociclador Bio Rad Modelo
Gene CyclerTM serie No. 11453. Se empleó la enzima Taq DNA polimerasa
(Invitrogen) 5 Unidades por μl, junto con el tampón 10x PCR Buffer minus Mg, una
solución de MgCl 50 mM y los dNTPs a una concentración de 10mM, siendo
suministrados por el proveedor de la enzima, la mezcla de reacción se muestra en la
tabla 3.1. Los parámetros del termociclador son: para la desnaturalización inicial 5
minutos a 94°C (1 ciclo), seguida de 30 ciclos a 94°C por 1.5 min, alineamiento 2
15
METODOLOGÍA
minutos a 53°C, extensión durante 3 minutos a 72 °C, seguida de desnaturalización

durante 30 segundos a 94 °C y la extensión final (1 ciclo) por 5 minutos a 72°C.
Tabla 3.1 Mezcla de reacción para PCR de punto final.
Solución Volumen Concentración final

10X PCR Buffer minus Mg 10 µl 1x
10 mM dNTP mixture 2 µl 0.2 mM cada uno
50 mM MgCl 3 µl 1.5 mM
5 µl (2.5 µl cada
Mezcla de primers 2.5 pmoles cada uno
uno)
Taq DNA polimerasa 0.5 µl 2.5 unidades
Agua libre de nucleasas 77.5 µl -
DNA templado 2 µl En función de la muestra
Los fragmentos de DNA obtenidos son purificados mediante el protocolo de

GeneClean y enviados a secuenciación al Instituto de Biotecnología del Instituto
Politécnico Nacional.
3.6. Efecto del quitosano sobre el crecimiento de cepas de Trichoderma y

Fusarium
Se inicia con la activación de las cepas mediante la siembra consecutiva en PDB
(Caldo Papa Dextrosa). Se recolectan las esporas con Triton 100x al 0.01% y se
inoculan 1x106 esporas por mililitro con una concentración de quitosano de 0, 1 y 2
mg/ml de medio para Trichoderma y para Fusarium 0, 0.1, 0.5, 1.0 y 2.0 mg/ml,
ajustando a un volumen final de 200 µl en pozos por triplicado sobre una microplaca
para Elisa de 96 pozos. Se mide la absorbancia cada 12 horas a una longitud de
onda de 490 nm en un lector de microplacas Benchman de BioRad. El quitosano se
prepara de acuerdo con Palma-Guerrero et al., (2008) a una concentración de 7
mg/ml. Las cepas de Trichoderma utilizadas en este trabajo (tabla 3.2) pertenecen a
la colección del Doctor Vladimir Sánchez López.
16
METODOLOGÍA
Para determinar el efecto del quitosano en el crecimiento de ambos hongos, se

emplea como parámetro el porcentaje de crecimiento en relación al testigo (%C) de
acuerdo con la ecuación 3.6.1 en donde A Q es la DO alcanzada por la cepa
creciendo en presencia de quitosano mientras que A PDB es la DO alcanzada en medio
PDB, ambos al tercer día después de la inoculación.
%C=
( )AQ
A PDB
x 100 Ec 3.6.1
3.7. Determinación de la concentración letal media (CL50).

Con base en el cálculo del porcentaje de crecimiento, se realiza una regresión Probit
mediante el software statgrafics® data analisys solutions de Statpoint technologies
Inc y se determina la CL50 como la concentración necesaria de quitosano para inhibir
el crecimiento del hongo en un 50%.
Tabla 3.2 Cepas de Trichoderma empleadas en este trabajo.
Cepa Especie Cepa Especie Cepa Especie

VSL3 Trichoderma sp VSL37 Trichoderma sp VSL67 Trichoderma sp
Trichoderma sp T. Trichoderma sp
VSL5 VSL45 VSL70
novaezelandiae
VSL6 T. polysporum VSL46 Trichoderma sp VSL76 Trichoderma sp
VSL10 Trichoderma sp VSL47 Trichoderma sp VSL78 T. koningiopsis

Trichoderma sp T. Trichoderma sp
VSL20 VSL49 VSL80
novaezelandiae

VSL31 T. koningiopsis VSL58 Trichoderma sp VSL10 T. afroharzianum
17
METODOLOGÍA
4
Trichoderma sp Trichoderma sp VSL11 Trichoderma sp
VSL34 VSL60
9
VSL35 Trichoderma sp VSL66 Trichoderma sp 9N T. harzianum
3.8. Efecto del quitosano sobre el crecimiento miceliar de Trichoderma y

Fusarium.
Se inocularon placas por duplicado de medio PDA adicionado con quitosano pH 5.6 a
concentraciones de 0, 0.5, 1.0 y 2.0 mg/ml con discos de 0.5 cm de diámetro a 1.5
cm del borde de la placa. Se marcó el área de crecimiento cada 24 horas deteniendo
el seguimiento cuando el micelio en la placa testigo (0 mg/ml) llegó al borde de la
placa. Se tomó una fotografía del fondo de la placa al término de la cinética y se
determinó el área ocupada mediante el software ImageJ.
La inhibición del crecimiento por el quitosano se expresa mediante el %reducción de

crecimiento, calculado mediante la ecuación:
%𝑅𝐶=((𝐴𝑡−𝐴𝑞)/𝐴𝑡)𝑥100
Donde At es el área de crecimiento en el testigo y Aq es el área de crecimiento en el

tratamiento con quitosano. El porcentaje de crecimiento (%C) en cada concentración
con respecto al testigo (PDA sin quitosano) se calcula mediante la ecuación:
%𝐶= (𝐴𝑞/𝐴𝑡)100
Donde At y Aq tienen el mismo significado que para el %RC.
3.9. Determinación de actividad enzimática.

Se recolectan esporas de las cepas 8 a 10 días de crecimiento en PDA con Triton X-
100 al 0.01%. Se inoculan tubos que contienen 10 ml de sustrato inductor (medio
18
METODOLOGÍA
mínimo con glucosa 2% o quitosano al 1%) con 1x10 6 esporas ml-1 de acuerdo con
Torres-Palacios y Ramírez-Lepe (2016). Se colectan muestras de 1.0 ml cada 12
horas durante 7 días. Las muestras son centrifugadas a 14000 rpm durante 5 min, se
recolecta el sobrenadante y son preservadas en refrigeración. La determinación de
concentración de proteína se realiza por el método de Bradford.
La actividad quitosanasa se determina usando como sustrato quitosano coloidal, el
cual se prepara disolviendo de 1 gramo de polvo de quitosano (quitosano de bajo
peso molecular de cáscara de camarón con grado de desacetilación < 75%, SIGMA-
ALDRICH grado práctico) en 75 ml de agua desionizada a 4° adicionando 0.57 ml de
ácido acético en agitación constante durante media hora, el pH se ajusta a 5.6 con
NaOH 1 M y se lleva a 100 ml con agua desionizada (Kurakake et al., 2000).
La mezcla de reacción consiste en 0.5 ml de sustrato (concentración final 0.5%), 0.2
ml de buffer de acetato de sodio 0.25 M pH 5.6 y 0.3 ml de enzima. Dicha mezcla se
incuba a 50°C durante 60 minutos. Terminada la incubación se agregan 0.15 ml de
reactivo de DNS, se centrifuga 5 minutos a 14000 rpm para precipitar el quitosano
insoluble, se transfieren 0.25 ml del sobrenadante a un tubo nuevo y se incuban a
100 °C en un baño de agua hirviendo durante 5 minutos, seguido de inmersión en
agua fría durante otros 5 minutos. Finalmente se vierten 0.2 ml de la muestra en
placas para ELISA de 96 pozos y se leen a 570 nm en un lector para microplacas
Benchmarck de BIORAD.
3.10. Determinación de sinergismo

Para determinar si existe un efecto sinérgico entre las cepas de Trichoderma y
quitosano para el control in vitro de Fusarium spp. se llevará a cabo la estrategia
experimental mostrada en la tabla 3.3, en donde el 0 significa la ausencia del factor,
1 la presencia del mismo, a el efecto de quitosano sobre Fusarium, b el efecto de
Trichoderma sobre Fusarium y ab el efecto de la interacción de ambos factores.
Tabla 3.3. Estrategia experimental para determinar el efecto sinérgico.

Fusarium Quitosano Trichoderma Simbología
19
METODOLOGÍA
1 mg/ml
1 0 0 t
1 1 0 a
1 0 1 b
1 1 1 ab
Posteriormente se aplicará la ecuación 3.7.1, en donde el efecto sinérgico está

representado por Es, Eobs simboliza la eficacia observada (ecuación 3.7.4) en la
combinación de Trichoderma y quitosano y Eexp la eficacia esperada. Los resultados
de esta ecuación se interpretaran como sigue: si Es es mayor que 1, entonces existe
sinergismo, si Es es menor a 1 existe represión y si Es es igual a 1 existe aditividad
de los factores (Rahman et al., 2014).
Eobs
Es= Ec 3.7.1
Eexp
El efecto de quitosano sobre Fusarium se determinará mediante la inoculación de las

cepas de fusarium en agar en medio PDA a una concentración de 2 mg/ml y 0 mg/ml
para el testigo., se medirá el crecimiento radial cada 12 horas hasta que el testigo
toque los bordes de la placa, se calculara la tasa promedio de crecimiento y se
calculará el porcentaje de reducción de crecimiento Rc, mediante la ecuación 3.7.2.
(
Rc= 1−
CA
CT)x 100 Ec 3.7.2
3.10.1. Determinación del efecto de cepas de Trichoderma sobre

Fusarium spp.
El efecto de Trichoderma se obtiene a partir del índice de biocontrol (BCI) mediante
ensayos de confrontación entre las cepas de Trichoderma y Fusarium seleccionadas
a partir de los ensayos de tolerancia a quitosano.
De acuerdo con Cuervo-Parra 2011, se parte de cepas de ambos hongos con 3 días
de crecimiento en PDA. Se inocula placas Petri con PDA con discos de 6 mm de
20
METODOLOGÍA
diámetro en puntos equidistantes. Se incuban en oscuridad a 25°C, se mide el

crecimiento radial bajo el método de Palma-Guerrero et al., (2008) y se calcula la
tasa promedio de crecimiento a los 5 días. Posteriormente se calcula el índice de
biocontrol por medio de la ecuación 3.7.3, en donde T F es la tasa de crecimiento de
Fusarium y TT es la tasa de crecimiento de Trichoderma:
TF
BCI= x 100 Ec 3.7.3
TT
Por su parte la eficacia observada se calcula a partir de la ecuación 3.7.4, en donde

BCIq es el porcentaje de inhibición de la combinación de los tratamientos, que se ha
de determinar empleando el mismo método que para el BCI pero a una
concentración de quitosano de 2 mg/ml.
(Rc +BCI −BCIq)
Eficacia esperada= Ec. 3.7.4
100
3.11. Determinación de la composición de ácidos grasos de la membrana

plasmática.
Este procedimiento se realizará empleando un cromatógrafo de gases e seguirá el
procedimiento determinado por Xing et al., (2015) empleando como estándares acido
palmítico (C18:0), ácido esteárico (C18:0), ácido oleico (C18:1), ácido linoleico
(C18:2) y ácido linolenico (C18:3). Para las condiciones de operación se iniciará con
un calentamiento a 140 °C manteniéndola dicha temperatura durante 5 minutos,
seguida del incremento hasta 230 °C a una razón de 4°C/min, para después
incrementar únicamente a razón de 1 °C/min hasta llegar a la temperatura de 240°C
y se mantendrá durante 6 minutos., posteriormente se aplicaran los metil esteres al
inyector y detector de ionización de llama a 250 °C teniendo como gas acarreador
helio a 290 kPa.
21
METODOLOGÍA
3.12. Cuantificación de los niveles de expresión de quitosanasas por qRT-

PCR.
Se empleará PCR en tiempo real cuantitativa para analizar los niveles de expresión
de los genes ECH42, CHIT33 y BGCSN que codifican para una endoquitinasa y una
exoquitinasa y una quitosanasa de Trichoderma y el gen CSN1 que perteneciente a
una quitosanasa de Fusarium teniendo como housekeeping al gen de la actina. Se
empleará el kit Power SYBR® Green RNA-to-CT™ 1-Step.
Para la obtención de RNA total se inoculara un disco de Trichoderma y Fusarium spp

en puntos equidistantes sobre una membrana de PVDF de 0.22 micrometros,
dispuesta sobre de una placa con agar-agua (0.2% de agar en agua
volumen/volumen) a una concentración de 2.0 mg/ml, se incubaran a 25°C durante 3
días, se raspara la membrana en la zona de confrontación, se colectará en un tubo
Eppendor.
Tabla 3.4. Primers para qRT-PCR.
Gen Primer Secuencia

Quitosanasa de 5’- GTGGCCAGAGCGAGACT -3’
HarChoF
Trichoderma
Quitosanasa de
HarChoR 5’- TCACCCCAGATACCATAGAA-3’
Trichoderma
Quitosanasa de
CSN1F 5’ GCGAAGCATCTCGGCTATTGTAGT 3’
Fusarium
Quitosanasa de
CSN1R 5’-TCAAGTTGTGAACCGCTACTCGTC- 3’
Fusarium
Gliceraldehído-3-
fosfato GapdF 5’- CAGGTCGCCAAGAAGGTCATCATT-3’
deshidrogenasa de
Trichoderma
Gliceraldehído-3-
fosfato
GapdR 5’- AAGCGTTGGAGATGACATTGGCAC-3’
deshidrogenasa de
Trichoderma
22
METODOLOGÍA
Factor de elongación 5’- GGCTTTCACCGACTACCCTCCTCT-3’

EF1AF
1-ɑ de Fusarium
Factor de elongación EF1AR 5’-ACT TCTCGACGGCCTTGATGACAC-3’
1-ɑ de Fusarium
A continuación se procederá a extraer el RNA total mediante el Kit TRIZOL ® RNA

isolation kit, iniciando con la adición de Max Bacterial Enhacement Reagent a 95°C,
pipetear arriba y abajo para ruptura del micelio, incubar a 95°C por 4 minutos,
agregar 1 ml de Trizol ® Reagent al lisado e incubar a temperatura ambiente por 5
minutos. Separar las fases mediante adición de 0.2 ml de cloroformo frio, incubar a
temperatura del cuarto de 2 a 3 minutos y centrifugar por 15 minutos a 12000 g y
4°C.
Tabla 3.4. Reacciones para qRT-PCR
Component Volume
2X SYBR® Green RT-PCR Reaction Mix 25 µL
Direct Primer (10 µM) 1,5 µL
Reverse Primer (10 µM) 1,5 µL
iScript Reverse Transcriptase for One-Step RT-
1,0 µL
PCR
RNA templado (conc < 100 ngµL-1) X µL
Nuclease-free Water to 50 µL
Volumen total 50 µL
Se procede a la precipitación de RNA mediante la adición de colorless, isopropanol

frío, centrifugación y separación de sobrenadante, se re-suspende el pellet en etanol
al 75% frío, se centrifuga a7.500 g y 4°C, se seca al aire y se re-suspende en una de
RNAse free water por pipeteo, se incuba por 10 minutos a 60 °C.
Una vez extraido el RNA se preparan las reaciones para RT-PCR como se muestra
en la tabla 3.4, se ejecuta el experimento en el equipo Applied BioSystems
23
METODOLOGÍA
StepOneTM Real- Time PCR System Thermal Cycling Block y se interpretan los
resultados.
24
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1 Sitios de muestreo

Se seleccionaron municipios del estado de Puebla en donde los propietarios
reportaron presencia problemas de pudrición de raíz y tallo para los cultivos de
tomate y de mazorca para los cultivos de maíz.
Tabla 4.1 Descripción de los sitios de muestreo

Nombre del rancho Condicione Dimensione
Clave Modulo Cultivo
o propietario s s (ha)
Tomate Malla
OM-3 Oscar Moro 3 1
variedad Cid sombra
Tomate Malla
RSM-1 Rancho San Marcos 1 1
variedad Cid sombra
Tomate
RSM-5 Rancho San Marcos 5 Invernadero 1
variedad Cid
Tomate
RSM-6 Rancho San Marcos 6 Invernadero 1
variedad Cid
Campo
EC-MA Emilio Carranza - Maíz blanco 2
abierto
Campo
EC-MC Emilio Carranza - Maíz blanco 2
abierto
Campo
EC-SP Emilio Carranza - Maíz blanco 2
abierto
Consorcio Agricola Tomate
CAC-3 3 Invernadero 2
Crutalroch variedad Cic
La recolección de las muestras se llevó a cabo de acuerdo al punto 3.1 en cada

punto de muestreo, almacenadas a 4°C y llevadas al laboratorio en bolsas de
polipropileno.
4.2 Aislamientos
De los sitios anteriores se obtuvieron muestras de suelo y materia vegetal las
cuales fueron tratadas de acuerdo con el punto 3.2 y 3.4, empleándose en un primer
21
caso como medio de aislamiento agar papa dextrosa (PDA) suplementado con
ampicilina kanamicina y posteriormente agar verde de malaquita (MGA).
Tabla 4.2 Ubicación de los sitios de muestreo
Clave Localidad Municipio Coordenadas
Tepanco de 18.550505, -97.522205; 18.551443, -
Magdalena
OM-3 López, 97.522013; 18.551624, -97.523893;
Cuayucatepec
Puebla 18.550742, -97.524127
San Marcos 18.409050, -97.350704; 18.409465, -
RSM- Tehuacán,
Necoxtla, 97.349896; 18.410212, -97.350360;
1 Puebla
Puebla 18.409779, -97.351130
San Marcos 18.408593, -97.349128; 18.408206, -
RSM- Tehuacán,
Necoxtla, 97.349880; 18.407333, -97.349925;
5 Puebla
Puebla 18.407274, -97.349209
San Marcos 18.408164, -97.349962; 18.407847, -
RSM- Tehuacán,
Necoxtla, 97.350454; 18.407304, -97.350427;
6 Puebla
Puebla 18.407335, -97.350011
San 18.350642, -97.270346; 18.349456, -
EC- San Francisco
Francisco 97.269016; 18.348772, -97.269632;
MA Altepexi
Altepexi 18.350007, -97.271006
San 18.349580, -97.262501, 18.350374, -
EC- San Francisco
Francisco 97.263435; 18.350865, -97.263088,
MC Altepexi
Altepexi 18.349994, -97.262137
San 18.362933, -97.280040; 18.362773, -
San Francisco
EC-SP Francisco 97.277153; 18.361075, -97.275375;
Altepexi
Altepexi 18.359820, -97.276796.
San 18.931528, -97.761175; 18.931226, -
San Salvador
CAC-3 Salvador 97.760301; 18.930389, -
Huixcolotla
Huixcolotla 97.760666;18.930718, -97.761534
Dado que no es un medio selectivo, se obtuvo crecimiento de numerosas

colonias en cada placa que se subcultivaron después de su aparición, lográndose
200 aislamientos entre todos los cultivos numerándose indistintamente a su origen y
en numeración no consecutiva. Tras la realización de la observación microscópica se
descartaron aquellos pertenecientes los géneros Penicillium, Aspergillus, Curvularia,
y aquellos que no presentaran esporas fusiformes. A continuación se muestran
fotografías de la identificación morfológica de los aislamientos de Fusarium, ya sea
macroscópica o microscópica. Cabe mencionar que debido a que no se cuenta con
un sistema de medición, la identificación microscópica no se basa en claves
22
taxonómicas sino en similitudes que muestra con las especies reportadas por
Leslie&Sumerelle (2006).
4.2.1 Cepa CAC8
En la figuras A y B se muestra la morfología macroscópica creciendo sobre
PDA frontal y reverso respectivamente en donde el micelio es de color beige,
mientras que hay una pigmentación en el agar ligeramente marrón. De las figuras C
a la N se observa la morfología microscópica mostrando macroconidias de 5 septos
con el lado dorsal más curvado que el ventral (G) mes y microconidias sin septos (J),
con 2 (H) y 3 septos (H, K y L) con forma fusiforme, posee monofialides sencillas, y
clamidosporas dobles y de cadena presentando características similares a las de la
especie F. acuminatum mostradas por Leslie&Sumerell (2006).
Figura 4.1. Cepa CAC8, obtenida de muestras de suelo. En la figura 4.1.A-B se

muestra la morfología macroscópica en anverso (A) y reverso (B) a los 7 días de
23
crecimiento sobre PDA. A su vez se muestra el tipo de clamidosporas presentes (C,

D y M), fialides (C, D y E), los macroconidios (G) micro y mesoconidios (H-L).
4.2.2 Cepa RSM52A

En la figura 4.2.A-B se muestra la morfología macroscópica de la cepa RSM52A a los
7 días de crecimiento sobre PDA mostrando un micelio de color blanco y la
pigmentación del medio en violeta claro. Con la observación microscópica se
observaron macroconidias de alrededor de 0.1422 mm de longitud, con 3 septos, con
ápice enganchado, y con forma de pie apenas marcado. Igualmente se encontraron
clamidosporas en cadena corta con apariencia rugosa. Dicha morfología
corresponde con la descrita por Leslie & Summerell (2006) para Fusarium
oxysporum.
24
Figura 4.2. Morfología macroscópica de la cepa RSM52A, obtenida de muestras de

suelo. Con crecimiento de 7 días sobre PDA en la parte frontal (A) y (B) reverso de la
placa, en las figuras C y D se muestra la morfología microscópica.
Tras realizarse la homología en el BLAST, se encontró un 99% de identidad con esta

especie; sin embargo, tras realizar un alineamiento múltiple con la generación
cladograma mediante Clustal Omega, se observa que tiene un anclamiento
independiente de las secuencias de F. oxysporum alimentadas al software.
4.2.3 Cepa RSM53A

Ésta cepa mostró un crecimiento ligeramente más lento que el resto de los
aislamientos, el micelio tiene una apariencia algodonosa de color blanca y sin
pigmentación del agar, así mismo presenta abundantes microconidios de forma oval
sin septos en su mayoría y en ocasiones con dos septos, el conidióforo es sencillo,
largo y con cabeza falsa, se percibieron pocas macroconidias con el lado dorsal mas
curvado que el ventral.
25
Figura 4.3. Cepa RSM53A, obtenida de muestras de suelo. En las figuras A y B se

observa su morfología macroscópica en medio PDA a los 7 días de crecimiento, y de
las figuras C a la E la morfología microscópica.
4.2.4 Cepa RSM53B
Esta cepa fue aislada de muestras suelo de cultivos de tomate, muestra
características macroscópicas similares a las de la cepa RSM53A, sin embargo tiene
una morfología microscópica diferente. Primeramente presenta macroconidias
abundantes en su mayoría rectas de 3 septos con ápice afilado y pie apenas
marcado. En las figuras D-F se observa que el número de microconidios es menor,
son de forma oval de 0 a 1 septo; mientras que en la figura C se puede ver que hay
monofialides largas y no se encontraron clamidosporas.
26
Figura 4.3. Cepa RSM53B, en las figuras A y B se observa su morfología

macroscópica a los 7 días de crecimiento en PDA mientras que en las figuras C-F la
morfología microscópica en aumento 100X.
4.2.5 Cepa RSM210

Esta cepa presentó un crecimiento menor al 30% de la placa a los 7 días, así mismo
el micelio tenía una apariencia algodonosa con una coloración ligeramente naranja,
sin pigmentación del agar. Tras la observación microscópica se encontraron
abundantes microconidios fusiformes sin septos visibles, monofialides con cabeza
falsa y escasas macroconidias, lo cual dificultó su descripción, sin embargo la casi
ausencia de las mismas puede ser un criterio de identificación.
27
Figura 4.4. Cepa RSM210, obtenida de muestras de suelo del módulo 1. Al crecer en
PDA presenta un micelio de apariencia algodonosa y de lento crecimiento (B) sin
pigmentación del agar (A). Así como abundantes microconidias, monofialides de
cabeza falsa y escasas macroconidias (C-F).
4.2.6 Cepa RSM100
La cepa RSM100, obtenida de muestras de suelo de cultivos de tomate en donde no

había presencia de planta sino únicamente se encontraba el suelo preparado para la
siembra; tuvo un rápido crecimiento en PDA con abundante micelio aéreo con ligera
coloración naranja y sin pigmentación del agar. La observación microscópica permitió
identificar que las macroconidias presentan forma dorsiventral con tres septos, ápice
28
de gancho y afilado, monofialides largas, ausencia de microconidios, múltiples

clamidosporas de cadena y micelio septado.
Figura 4.5. Cepa RSM100, obtenida de muestras de suelo de RSM módulo 6.

Morofología macroscópica (A-B) a los 7 días de crecimiento en PDA y morfología
microscópica (C-E) en aumento 100X.
4.2.7 Cepa ECMA2
La cepa ECMA2 (figura 4.6), se encontró en cultivos de maíz en donde la planta
presentaba un crecimiento de alrededor de 40cm de altura, en las figuras A y B
(reverso de la placa) se aprecia que el crecimiento miceliar en PDA es de
ligeramente de color naranja, de crecimiento rápido y sin pigmentación del agar en
los primeros días de crecimiento sin embargo después de los 7 días muestra una
pigmentación azul que termina en púrpura. De las figuras C a la F se aprecia la
29
morfología microscópica encontrándose abundantes microconidias de forma

fusiforme sin septos, macroconidias de forma dorsiventral con tres septos, de ápice
de gancho y afilado y con pie alargado claramente marcado, además de conidióforos
largos en monofialide.
Figura 4.6. Cepa ECMA2, obtenida de muestras de suelo de EC-MC. Morfología

macroscópica (A y B). Morfología microscópica (C-F).
4.2.8 Cepa ECMC4

Esta cepa tiene como características morfológicas macroscópicas micelio aéreo
abundante, lanoso, con pigmentación del medio PDA en color marrón. Tras la
observación microscópica se perciben abundantes macroconidias con el lado dorsal
más curvado que el ventral de 5 septos, conidióforos largos en
monofialide, .microconidios fusiformes con de dos a tres septos y en mínima cantidad
globosos.
30
Figura 4.7. Cepa ECMC4, obtenida de muestras de suelo de cultivos de maíz con
plantas de 35 cm de altura promedio. Se muestra la morfología macroscópica en
PDA a los 4 días de crecimiento (A-B) y la morfología microscópica (C-E) en
aumento de 100X y tinción con azul de bromofenol.
4.2.9 Cepa ECM8

Las características macroscópicas de esta cepa son muy similares a las de la cepa
ECMA2, sin embargo el micelio es más espeso, la observación microscópica revela
macroconidas de tres septos, con el lado dorsal más curvado que el ventral, de ápice
romo y pie apenas marcado. Presenta microconidas de forma oval y de riñon de 0 a
1 septos, así como monofialides de conidióforo largo.
31
Figura 4.8. Cepa ECM8, obtenida de muestras de suelo de EC-MC, pigmenta en

púrpura al envejecer en medio PDA, posible especie Fusarium verticillioides.
4.2.10 Cepa ECSP16M

La cepa ECSP16M tiene micelio bajo de color naranja claro que pigmenta el medio
en a los 4 días en color naranja y después de los 7 días de color azul que se torna a
púrpura. Sus macroconidas tienen el lado dorsal más curvado que el ventral, de
ápice enganchado y de pie claramente marcado. Los microconidios son de forma
oval y de riñon de 0 a 1 septo, monofialide de conidióforo largo sin cadenas de
microconidios y de micelio no septado.
32
Figura 4.8. Cepa ECSP16M, obtenida de muestras de suelo de EC-SP, pigmenta en

púrpura al envejecer en medio PDA, especie Fusarium solani
4.2.11 Cepa ECSP18M

Al momento del aislamiento de la cepa ECSP18M, se percibió mediante la
identificación morfológica que se trataba posiblemente de la especie Fusarium
verticillioides, debido a la presencia de esporas fusiformes, sin embargo, tras la
identificación molecular, se encontró un 99% de identidad con Clonostachys
rosea/Gliocladium roseaum al igual que con Fusarium verticillioides, nuevamente se
realizó una observación microscópica (figura 4.9), encontrándose estructuras en
forma verticilliada y con esporas más redondeadas en los extremos, lo cual
concuerda con la morfología de C. roseaum en su forma verticilada y que es usado
como un agente de control biológico. Tras la realización del cladograma mediente
Clustal omega, se encuentra que forma un anclado con esta última especie.
33
Figura 4.8. Morfología macroscópica frontal (A) de la Cepa ECSP18M, en PDA a los
10 días de crecimiento y (B) al reverso de la placa, en las figuras C, D y F se muestra
la forma verticilada, en la figura B se muestran esporas fusiformes, septadas y no
septadas multinucleadas y con los extremos redondeados.
Bajo las condiciones descritas en el punto 3.5.2, se logró una amplificación

exitosa de la región ITS 16M, 18M, 29M y 52A. Así mismo se obtuvo un fragmento de
535 pb para la cepa 16 M, para la cepa 18M se amplificó un fragmento de 511, de la
cepa 29M se obtuvo un fragmento de 521 pb y en el caso de la 52A se obtuvo un
fragmento de 526 pb. Las secuencias obtenidas se muestran a continuación.
4.2.12 Fragmento amplificado con los primes ITS1 e ITS4 para la cepa ECSP6M.
CGGATCACTCATCAACCCTGTGACATACCTATAACGTTGCCTCGGCGGGAACAG
ACGGCCCCGTAACACGGGCCGCCCCCGCCAGAGGACCCCCTAACTCTGTTTCT
ATAATGTTTCTTCTGAGTAAACAAGCAAATAAATTAAAACTTTCAACAACGGATCT
CTTGGCTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATT
34
GCATAATTCAGTGAATCATCTAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTC
TGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTACAACCCTCAGGCCCCCGGGCCTGG
CGTTGGGGATCGGCGGAAGCCCCCTGCGGGCACAACGCCGTCCCCCAAATACA
GTGGCGGTCCCGCCGCAACTTCCATTGCGTAGTAGCTAACACCTCGCAACTGGA
GAGCGGCGCGGCCACGCCGTAAAACACCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGAATC
AGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAGCGGGAGGAAAT
ECSP18M.
CGGGGTTCACTCCAACCCCTGTGACATACCAATTGTTGCCTCGGCGGATCAGCC
CGCTCCCGGTAAAACGGGACGGCCCGCCAGAGGACCCCTAAACTCTGTTTCTAT
ATGTAACTTCTGAGTAAAACCATAAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTT
GGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCAAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCA
GAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGG
CGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCCCAGCTTGGTGTTGGG
ACTCGCGAGTCAAATCGCGTTCCCCAAATTGATTGGCGGTCACGTCGAGCTTCC
ATAGCGTAGTAGTAAAACCCTCGTTACTGGTAATCGTCGCGGCCACGCCGTTAA
ACCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAA
GCATATCAATAAGCGGGGAA
ECSP29M.
GCGGCATACTCCCATACCCCTGGGGACTACCATTTGTGTGCCTCGSCGGATCAG
CCCGCTCCCGGYMAAACGGGACGGCCCGCCTGASGACCCCTAAACTCTGTTTC
TATATGTAACTTCTGAGTAAAACCGTAAATAAATCAAAACTCTCATCAACGGATCT
CTTGGTTCTGGAATCGATGAACAACGCACCAAAATGCGATAAGTWATGTGAATT
GCATAATTCATTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCGGTATTC
TGGCCGGCATGCCTGTTCGAGCGTCMTTTCAACCCTCAAGCCCAGCTTGGTGTT
GGGACTCGCGAGTCGAATCGCGTTCCCCAAATTGATTGGCGGGCACTTCCAGCT
TCCATAGCGTATCAGTAAAACCCTCGTTACTGGTAATCGTCTGGGCCACRCCGTT
AAACCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTT
AAGCATATCAATAGGCGGAGGAACGGAGGAA
4.2.15 Fragmento amplificado con los primes ITS1 e ITS4 para la cepa 52A.
GCCGRGAGTCACACCTATCCTCTGTGGACATACCTTTATGTTGCCTCGGCGGAT
CAGCCCGCGCCCCATAAAACGGGACGGCCCGCCGCAGGAACCACAAAACTCTG
ATTTTAGTGTAACTTCTGAGTCTAAAAAACAAATAAATCAAAACTTTCAACAACGG
35
ATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCAAAATGCGATAAGTAATGTGA
ATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTA
TTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCCCCCGGGTTT
GGTGTTGGGGATCGGGCTGTACTCCAGCCCGGCCCCGAAATCTAGTGGCGGTC
TCGCTGCAGCCTCCATTGCGTAGTAGCTAACACCTCGCAACTGGAACGCGGCG
CGGCCAAGCCGTTAAACCCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGA
ATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA
Así mismo el cladograma construido con las secuencias de estos fragmentos y de

aquellas con las que se encontró relación durante la realización del alineamiento en
el BLAST del NCBI se presenta en la figura 4.
Figura 4.9. Cladograma realizado mediante Clustal omega tras el alineamiento de

secuencias obtenidas en BLAST que tuvieron similitud con los datos alimentados de
las cepas aisladas. Las cepas aisladas en este trabajo están enmarcadas en rojo.
36
4.3 Efecto del quitosano sobre el crecimiento de Trichoderma a partir de

esporas.
Se encontró que las cepas de Trichoderma presentan diferencias en su

capacidad para desarrollarse en un medio con quitosano. Las cepas VSL57, VSL47,
VSL80, VSL30, VSL23, VSL50, VSL19, VSL37 y VSL119 (Figura 4.3.1 y tabla 4.3.1)
tuvieron un crecimiento superior en el medio con quitosano a una concentración de
1mg/ml, al que se presentó en el testigo en el cual se está usando un medio
enriquecido, esto puede deberse a que el quitosano incremente la producción de
enzimas que degradan carbohidratos, tal como sucede con Pochonia clamydosporia
de acuerdo con Palma-Guerrero et al.,(2010b) que en consecuencia, le permita un
mejor aprovechamiento de los nutrientes, y, al mismo tiempo, tengan la capacidad de
usar al quitosano como fuente de carbono tal como reporta Zavala-González et al.,
(2016).
500.0
Porcentaje de crecimiento (%C)
450.0
400.0
350.0
300.0
250.0
200.0
150.0
100.0
50.0
0.0
VSL57 VSL47 VSL80 VSL30 VSL23 VSL50 VSL19 VSL37 VSL119 VSL29 VSL48
Cepa de Trichoderma
37
Figura 4.3.1. Porcentaje de crecimiento en relación al testigo de cepas con un %C

superior o igual a 100. Este comportamiento se desarrolló a una concentración de
quitosano de 1mg/ml.
En el caso de las cepas VSL29 y VSL48 tuvieron un crecimiento de 101.18 +
1.23 % y de 95.50 + 16.86% respectivamente a una concentración de quitosano de
1mg/ml, observando que a esta concentración el quitosano no tuvo efecto sobre su
crecimiento. Así mismo, se observa que las cepas VSL3, VSL31, VSL60 y VSL58
tuvieron un crecimiento superior al 80%, siendo que a pesar de la presencia del
quitosano, fueron capaces de desarrollarse en este medio.
100.0
90.0
80.0
70.0
60.0
50.0
40.0
30.0
20.0
10.0
0.0
VSL3 VSL31 VSL10 VSL60 VSL58 VSL35 VSL76 VSL81 VSL6 VSL70 VSL104
Cepa de Trichoderma
Figura 4.3.2 Cepas de Trichoderma con un valor de 100>%C>50 a una

concentración de quitosano de 1mg/ml.
En la figura 4.3.2 se muestra el comportamiento de cepas VSL 35, VSL76,

VSL81, VSL6, VSL70 Y VSL104, tuvieron un crecimiento entre un 30 y 50% por
debajo del testigo, con lo cual se está presentando un efecto fungistático por parte
38
del quitosano hacia éstas cepas de Trichoderma (Espinel-Ingroff, A. & Cantón, E.

2012).
40.0
35.0
30.0
25.0
20.0
15.0
10.0
5.0
0.0
VSL34 VSL5 VSL79 VSL45 VSL49 VSL46 VSL55 VSL88 VSL20 VSL86
Cepa de Trichoderma
Figura 4.3.3 Cepas de Trichoderma con un valor de %C<50 a una concentración de

quitosano de 1mg/ml.
Las cepas de Trichoderma que se presentan en la figura 4.3.3 muestran una

reducción del crecimiento mayor al 50%, y en el caso de la cepa VSL20 y VSL86, la
reducción del crecimiento es muy próximo al 100% considerando el error. Dado que
éstas cepas son susceptibles a 1 mg/ml, no es recomendable que sean empleadas a
esta concentración en combinación con quitosano para el control biológico de
Fusarium dado que se ve afectado el crecimiento del agente antagonista y podría no
ser un método eficiente.
El resumen de los valores del porcentaje de crecimiento de las cepas de

Trichoderma a una concentración de 1mg/ml presentados en las gráficas anteriores
están contenidos en la tabla 4.3.1 así como las imágenes del desarrollo del micelio
39
en la microplaca, con lo cual se confirma el comportamiento que se percibió a través

de la medición de la DO.
Tabla 4.3.1 Efecto del quitosano sobre el crecimiento de cepas de Trichoderma a
1mg/ml.
Cepa Porcentaje de crecimiento (%C)

VSL3 90.33 + 5.61
VSL5 37.57 + 6.79
VSL6 72.95 + 2.13
VSL10 86.51 + 7.79
VSL19 130.13 + 3.88
VSL20 2.38 + 1.57
VSL23 141 + 10.11
VSL29 101.18 + 1.23
VSL30 218.01 + 5.88
VSL31 88.01 + 6.98
VSL34 37.69 + 8.71
VSL35 77.60 + 2.63
VSL37 129.55 + 2.11
VSL45 24.57 + 7.29
VSL46 14.54 + 4.61
VSL47 298.21 + 10.43
VSL48 95.50 + 16.86
VSL49 20.33 + 6.48
VSL50 136.85 + 8.3
VSL55 13.33 + 4.08
VSL57 439.75 + 15.1
VSL58 84.43 + 5.39
VSL60 85.67 + 11.16
VSL70 71.87 + 4.3
VSL76 77.04 + 2.41
40
VSL78 0 +12.69
VSL79 32.25 + 2.41
VSL80 288.66 + 15.38
VSL81 73.26 + 6.83
VSL86 0 + 6.89
VSL88 8.42 + 5.1
VSL104 49.83 + 10.63
VSL119 122 + 5.6
Figura 4.3.4 Crecimiento de cepas de Trichoderma en PDB y quitosano a una

concentración de 1 mg/ml.
41
4.4 Efecto del quitosano sobre el crecimiento de Fusarium y determinación de

concentración letal media a partir de esporas.
El seguimiento del crecimiento de la cepa ECSP16 M en concentraciones de 0 a 1

mg/ml (figura 4.4.1) permitió observar que a 0.1 mg/ml el quitosano realiza una
reducción de crecimiento del 32.34 + 1.11%, mientras que a 0.1 mg/ml el efecto del
quitosano es menor, permitiendo un porcentaje de crecimiento (%C) del 85.82 +
3.99%. A las concentraciones de 0.2 y 0.4 mg/ml el %C se encuentra alrededor del
70%, mientras que a partir de concentraciones de 0.6 mg/ml la reducción del
crecimiento es de más del 90% ejerciendo en éste punto una acción fungicida.
3.0
2.5
Absorbancia a 450 nm
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
Tiempo en días
0 0.01 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
4.4.1 Cinética de crecimiento de la cepa ECSP16M (Fusarium solani) hasta las 72

horas de crecimiento en medio PDB adicionado con quitosano a concentraciones de
0 a 1mg/ml monioreando mediante la medida de la densidad óptica.
42
Tabla 4.4.1 Porcentajes de crecimiento de la cepa ECSP16M a diferentes

concentraciones de quitosano.
Concentración Concentración
%C %C
(mg/ml) (mg/ml
0.0 100 + 1.46 0.4 73.82 + 0.88
0.01 67.66 + 1.11 0.6 9.32 + 3.27
0.1 85.82 + 3.99 0.8 7.34 + 1.69
0.2 74.45 + 3.69 1.0 6.48 + 1.03
En la figura 4.4.2 se muestra la cinética de crecimiento de la cepa ECSP18M, en

donde se puede observar que en las concentraciones de 0.01 a 0.2 mg/ml, el
quitosano inhibe el crecimiento de la cepa en menos de un 30%. Y la concentración
letal medio (CL50) se encuentra en torno a los 0.4 mg/ml, presentándose en este
punto un efecto fungistático. A concentraciones de 0.6 mg/ml en adelante se percibe
un efecto fungicida con una reducción del crecimiento de más del 90%, y a la
concentración mínima inhibitoria (MIC) puede estar en torno a 1.0 mg/ml de
quitosano.
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
Tiempo en días
0 0.01 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
43
4.4.2 Cinética de crecimiento de la cepa ECSP18M (Fusarium solani) creciendo en

concentraciones de quitosano de 0 a 1mg/ml.
%C %C
(mg/ml) (mg/ml
0.0 100.0 + 3.34 0.6 5.62 + 5.64
0.1 87.05 + 0.49 0.8 4.49 + 0.72
0.2 74.65 + 0.72 1.0 2.74 + 1.13
0.4 53.89 + 0.49 - -
Para el caso de la cepa ECMA29M, se observa que a concentraciones menores a

0.2 mg/ml hay una inhibición de alrededor del 20%, sin embargo a una concentración
de 0.4 mg/ml se está ejerciendo un efecto fungistático, mientras que a
concentraciones de 0.8 en adelante se ejerce un efecto fungicida. Bajo estas
condiciones la concentración letal media se encuentra entre 0.2 y 0.4 mg/ml de
quitosano.
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
Tiempo en días
0 0.01 0.1 0.2

0.4 0.6 0.8 1.0
44
4.4.3 Cinética de crecimiento de la cepa ECMA29 M (Fusarium verticillioides)

creciendo en concentraciones de quitosano de 0 a 1mg/ml.
%C %C
(mg/ml) (mg/ml
0.0 100.00 + 3.68 0.4 32.70 + 0.70
0.01 98.36 + 4.76 0.6 15.71 + 3.82
0.1 90.39 + 4.94 0.8 7.91 + 0.42
0.2 78.09 + 1.71 1.0 10.13 + 0.44
Con estos resultados se puede observar que la concentración letal media que evite la
germinación de las esporas de las cepas de Fusarium seleccionadas para este
ensayo se encuentra en torno a 0.4 mg/ml de quitosano.
4.5 Efecto del quitosano sobre el crecimiento miceliar de Trichoderma.

Para éste experimento se seleccionaron dos cepas de Trichoderma, la cepa 9N
identificada como T. harzianum que resultó sensible a concentraciones altas de
quitosano y la cepa VSL80, que no se ha identificado hasta el momento pero resultó
ser tolerante a concentraciones de 2 mg/ml de quitosano en el ensayo en
microplacas.
(a) (b) (c) (d)
45
Figura 4.5.1 Efecto del quitosano sobre T. harzianum 9N (a-b) y Trichoderma sp

VSL80 (c-d) a concentraciones de 0 (a y c) y 1 mg/ml (b y d) a 4 días de crecimiento.
Se encontró que el quitosano disminuye la velocidad de crecimiento de la cepa 9N
así como la producción de esporas, mientras que en el caso de la cepa VSL80, la
velocidad de crecimiento no se ve afectada en gran medida a la concentración de 1.0
mg/ml de quitosano y aparentemente incrementa la esporulación del hongo reflejado
en el color verde más intenso respecto al testigo.
4.6 Efecto del quitosano sobre el crecimiento miceliar de Fusarium
En éste caso se seleccionaron las cepas RSM52A identificada como Fusarium

oxysporum por parte de los aislamientos de tomate rojo, y la cepa ECSP16M de los
aislamientos obtenidos de cultivos de maíz identificada como Fusarium solani.
Tabla 4.6.1. Valores de porcentaje de reducción de crecimiento (%RC) y porcentaje

de crecimiento miceliar (%C) de la cepa RSM52A (Fusarium oxysporum) en
concentraciones de 0 a 2 mg/ml de quitosano.
Crecimiento en cm2 para cada concentración de quitosano

Día
0.0 mg/ml 0.5 mg/ml 1.0 mg/ml 2.0 mg/ml
0 0+0 0+0 0+0 0+0
2 3.4 + 1.1 2.0 + 0.3 1.4 + 0.4 1.2 + 0.3
3 9.2 + 1.9 6.2 + 1.7 4.5 + 1.0 2.9 + 0.5
4 23.2 + 0.2 17.7 + 7.4 11.7 + 1.4 6.0 + 1.7
5 44.9 + 0.4 28.1 + 3.6 20.4 + 3.1 11.6 + 1.4
6 58.9 + 0.7 38.4 + 3.1 30.1 + 4.8 18.1 + 0.2
%RC 0.0 34.8 48.9 69.2
%C 100.0 65.2 51.1 30.8
46
El efecto del quitosano ejercido sobre la cepa RSM52A resultó ser fungistático para
la mayoría de las concentraciones empleadas en este experimento, teniendo una
máxima reducción de crecimiento a 2 mg/ml de quitosano alcanzando apenas un
30.8% de crecimiento. Mientras que a las concentraciondes de 0.5 y 1.0 mg/ml el
porcentaje de crecimiento fue del 65.2 y 51.1%.
70
60
50
Área en cm2
40
30
20
10
0
0 1 2 3 4 5 6 7
Tiempo en dias
0 mg/ml 0.5 mg/ml 1.0 mg/ml 2.0 mg/ml

Figura 4.6.1 Cinética de crecimiento de la cepa RSM52A (Fusarium oxysporum) en
medio PDA adicionado con quitosano a concentraciones de 0 a 2 mg/ml.
Dado que Fusarium oxysporum continua creciendo en presencia de quitosano

después que el testigo cubre por completo la placa, pero a una velocidad menor que
en ausencia del polímero, y en conjunto con los resultados obtenidos podría decirse
que, al menos, en medio agar papa dextrosa (PDA), no se está registrando ningún
efecto fungicida por parte del quitosano hacia éste hongo, solamente está retrasando
su crecimiento. Así mismo continuará desarrollándose hasta que se agoten los
nutrientes del medio.
47
60
50
40
Área en cm2
30
20
10
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Tiempo en días
Figura 4.6.1 Cinética de crecimiento de la cepa ECSP16M (Fusarium solani) en

medio PDA adicionado con quitosano a concentraciones de 0 a 2 mg/ml.
Fusarium solani ECSP16M en el tratamiento de 0.5 mg/ml no presentó diferencia

significativa con respecto al testigo, mientras que en el resto de los tratamientos de
nueva cuenta prevaleció el efecto fungistático.
A su vez se ha encontrado tanto para Fusarium como para Trichoderma que existe
una relación directa en cuanto a la inhibición del crecimiento miceliar con respecto a
la concentración de quitosano, es decir, que a mayor concentración de quitosano,
menor tasa de crecimiento, esto en un medio complejo de nutrientes tratándose, en
este caso, de PDA tal como sucede con los experimentos reportados por Palma-
Guerrero et al. (2008) quienes evalúan concentraciones de 0 y 2 mg/ml de quitosano
48
y como sucede con los experimentos de Nawar et al. (2005) que evalúan
concentraciones de hasta 6.0 mg/ml.
Tabla 4.6.1. Valores de porcentaje de reducción de crecimiento (%RC) y porcentaje

de crecimiento miceliar (%C) de la cepa ECSP16M (Fusarium solani) en
concentraciones de 0 a 2 mg/ml de quitosano.
Día 0 mg/ml 0.5 mg/ml 1.0 mg/ml 2.0 mg/ml
0 0.0 + 0.00 0.0 + 0.0 0.0 + 0.00 0.0 + 0.00

2 5.37 + 0.20 4.91 + 0.64 1.56 + 0.22 1.08 + 0.02
3 15.08 + 0.58 14.30 + 1.20 4.00 + 0.23 2.46 + 0.10
4 23.97 + 1.63 24.12 + 1.16 8.13 + 0.68 3.74 + 0.07
5 28.61 + 3.04 29.72 + 2.86 11.99 + 1.07 5.79 + 0.05
6 33.75 + 3.91 34.93 + 2.77 19.48 + 1.13 8.70 + 0.11
7 42.32 + 4.97 41.57 + 1.40 23.13 + 0.26 11.82 + 0.18
9 56.89 + 3.20 52.60 + 1.68 35.19 + 2.26 19.16 + 0.68
%RC 0.0 7.5 38.1 66.3
%C 100.0 92.5 61.9 33.7
4.7 Determinación del efecto de Trichoderma y quitosano en el control invitro

de Fusarium.
Por una parte se tiene registrado el efecto del quitosano sobre el crecimiento miceliar
de Fusarium, en la figura 4.7.1 éste efecto se presenta como el testigo para hacer
una comparación con el efecto de Trichoderma sobre el crecimiento miceliar de
Fusarium así como el efecto de la interacción de estos componentes modificando las
concentraciones del biopolímero.
En la figura 4.7.1, Fo se refiere a Fusarium oxysporum y Fs a Fusarium solani. Allí se
puede observar que Fusarium solani fue más sensible a quitosano que F.
49
oxysporum y por el contrario, esta última fue más sensible al efecto inhibitorio por
parte de Trichoderma que F. solani en ausencia de quitosano.
En la misma gráfica también se puede ver que las cepas VSL80 y 9N a
concentraciones de 0.0 mg/ml tienen un comportamiento similar en el control de
ambas especies de Fusarium, del mismo modo, al usarse en combinación con
quitosano incrementaba el índice de biocontrol (IBC) en relación directa con la
concentración de quitosano.
100.0
90.0
80.0
70.0
Índice de Biocontrol (IBC)
60.0
50.0
40.0
30.0
20.0
10.0
0.0
Figura 4.7.1 Índice de biocontrol (IBC) de Fusarium por parte de quitosano (testigo),
por parte de Trichoderma (a 0.0 mg/ml), y por combinación de ambos. Fo se refiere a
Fusarium oxysporum y Fs a Fusarium solani.
Tabla 4.7.1 Índice de biocontrol (%IBC) de Fusarium por parte de quitosano (testigo),
por parte de Trichoderma (a 0.0 mg/ml), y por combinación de ambos.
Índice de biocontrol (%IBC)
Cepa
Fo (testigo) 0.0 34.8 48.9 69.2
Fo vs VSL80 64.5 64.9 62.8 80.0
50
Fo vs 9N 56.4 57.1 52.6 71.1

Fs (testigo) 0.0 1.8 45.3 72.1
Fs vs VSL80 49.9 51.6 73.3 88.1
Fs vs 9N 47.2 44.9 49.5 70.3
Sin embargo, VSL80, (tolerante a altas concentraciones de quitosano) tuvo un IBC

superior que 9N. Cabe mencionar que para la combinación de T. harzianum con
quitosano, conforme se incrementaba la concentración del biopolímero, predominaba
el efecto del quitosano sobre el de Trichoderma. Contrario a lo sucedido con la cepa
VSL80, dada su naturaleza tolerante, el efecto de Trichoderma se potencializó
conforme se incrementaba la concentración de quitosano.
(a) (b) (c) (d)
Figura 4.7.2 Confrontación en placa dual de Fusarium oxysporum con Trichoderma

harzianum 9N (a-b) y Trichoderma VSL80 (c-d) en medio PDA adicionado con
quitosano a concentraciones de 0.0 mg/ml (a y c) y de 1.0 mg/ml (b y d).
4.8 Degradación de quitosano.
Para medir la habilidad de Fusarium y Trichoderma de degradar el quitosano, se

realizó la determinación de actividad quitosanasa a 9 cepas de Trichoderma y a 4
cepas de Fusarium. Se definió una unidad de actividad quitosanasa como los
51
micromoles de azúcares reductores liberados en 1 minuto a 55°C. Y la actividad

quitosanasa específica en UI en relación a la cantidad de proteína presente en el
medio de inducción.
5
4.5
4
3.5
UI/mg de proteína
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Tiempo en días
VSL3 9N VSL10 VSL14 VSL23

VSL57 VSL67 VSL80 VSL81
Figura 4.8.1. Cinética de actividad quitosanasa específica para las cepas de

Trichoderma.
Tabla 4.8.1 Cinética de actividad quitosanasa de Trichoderma expresada en UI

Unidades de actividad enzimática (UI)
Cepa/Día
0 1 2 3 7
VSL3 0.0 + 0 0.011 + 0.0013 0.014 + 0.0006 0.013 + 0.0015 0.015 + 0.0001
9N 0.0 + 0 0.009 + 0.0004 0.010 + 0.0004 0.009 + 0.0004 0.016 + 0.0013
VSL10 0.0 + 0 0.010 + 0.0006 0.012 + 0.001 0.014 + 0.0007 0.022 + 0.0004
VSL14 0.0 + 0 0.011 + 0.0003 0.010 + 0.0002 0.009 + 0.0001 0.010 + 0.0003
VSL23 0.0 + 0 0.010 + 0.0003 0.015 + 0.0001 0.016 + 0.0007 0.011 + 0.0004
VSL57 0.0 + 0 0.009 + 0.0004 0.010 + 0.0006 0.011 + 0.001 0.014 + 0.0003
52
VSL67 0.0 + 0 0.009 + 0.0001 0.009 + 0.0001 0.011 + 0.0001 0.010 + 0.0008
VSL80 0.0 + 0 0.010 + 0.0007 0.014 + 0.0009 0.014 + 0.001 0.017 + 0.0006
VSL81 0 + 0.0004 0.010 + 0.0007 0.014 + 0.0009 0.014 + 0.001 0.017+ 0.006
En la tabla como en la gráfica se observa que la cantidad de proteína influenció de

manera directa el comportamiento de la actividad enzimática. Para el caso de las
cepas de Fusarium no se presentan los datos dado que la actividad enzimática fue
demasiado pequeña que entraba dentro del margen de error del experimento, por lo
cual se concluye que Fusarium no presentó actividad enzimática inducible a las
concentraciones de 0.2 mg/ml y 10 mg/ml teniendo como sustrato quitosano coloidal.
3
Máxima actividad quitosanasa específica
2.5
2
(UI/mg de proteína)
1.5
0.5
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Crecimiento de Trichoderma a 2.0 mg/ml de quitosano (%C)
Figura 4.8.2 Relación entre la máxima actividad quitosanasa específica y la

tolerancia de Trichoderma a concentraciones de 2 mg/ml de quitosano.
Haciendo una comparación de la máxima actividad quitosanasa específica y la

tolerancia que las cepas presentan a quitosano (figura 4.8.2) se puede observar que
existe una tendencia a que entre mayor sea la torelancia a quitosano, mayor es la
53
actividad quitosanasa específica. Esto puede significar que la tolerancia de estas

cepas al quitosano está relacionada con su capacidad para degradarlo y utilizarlo
como nutriente, de acuerdo con Zavala-Gonzales et al. (2016).
54
CONCLUSIONES
Las cepas de Trichoderma presentan una capacidad variable para crecer a diferentes
concentraciones de quitosano, resultando ser las más tolerantes la cepa VSL80 y
VSL81, y las más sencibles la cepa 9N y VSL20.
La concentración de quitosano afecta de forma inversamente proporcional la tasa de

crecimiento para las cepas de Fusarium, en donde a mayor concentración menor
tasa de crecimiento.
El efecto predominante del quitosano sobre el crecimiento miceliar de Fusarium y

Trichoderma fue fungistático. Mientras que para la germinación de esporas logró ser
fungicida a concentraciones de 1.0 mg/ml para las cepas de Fusarium.
Es posible utilizar cepas de Trichoderma en conjunto con quitosano para el control in

vitro de Fusarium e incrementar de ésta forma el IBC del fitopatógeno.
No se presentó actividad quitosanasa inducible en las cepas de Fusarium, por lo que

se asume que la tolerancia a ciertas concentraciones de quitosano no es debida a su
capacidad para degradarlo y usarlo como nutriente.
Por el contrario, en algunas cepas de Trichoderma, se observó que su tolerancia a

quitosano está relacionada con su capacidad de degradar el quitosano y usarlo como
nutriente.
21
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x
vi

Escrito de Tesis - Fatima Sarahi Serrano Villa

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TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICO

Efecto de cepas de Trichoderma y quitosano en el control de

Que para obtener el grado de:

Maestra en Ciencias en Ingeniería Bioquímica

IBQ Fatima Sarahi Serrano Villa

H. Veracruz Ver. Diciembre 2016

(quitinasas, proteasas, β-1,3-glucanasas), la formación de cuerpos apresorios y

1.1.1. Situación de la fusariosis en México......................................................2

1.1.1.1. Fusariosis en maíz..................................................................................3

1.1.1.2. Fusariosis en tomate rojo.......................................................................4

1.1.2. Métodos de control de Fusarium............................................................5

1.3.1. Efecto del quitosano en plantas.............................................................8

1.3.2. Efecto antifúngico del quitosano sobre Fusarium spp...........................8

1.3.3. Efecto del quitosano sobre agentes de control biológico.......................8

1.3.4. Quitosano mejora las propiedades antifúngicas de Trichoderma..........9

1.3.5. Degradación biológica de la quitina y el quitosano................................9

2.1 OBJETIVO GENERAL....................................................................................11

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS..........................................................................11

3.1. Recolección de muestras...............................................................................11

3.3. Aislamiento a partir de plantas con síntomas de enfermedad.......................12

3.4. Identificación morfológica...............................................................................12

3.4.1. Caracterización microscópica...............................................................12

3.4.2. Caracterización macroscópica.............................................................13

3.5. Identificación molecular..................................................................................13

3.5.1. Extracción de DNA...............................................................................15

3.5.2. PCR de punto final................................................................................15

3.6. Efecto del quitosano sobre el crecimiento de cepas de Trichoderma y

3.7. Determinación de la concentración letal media (CL 50)...................................17

3.8. Efecto del quitosano sobre el crecimiento miceliar de Trichoderma y

3.9. Determinación de actividad enzimática..........................................................18

3.10. Determinación de sinergismo...............................................................19

3.10.1. Determinación del efecto de cepas de Trichoderma sobre Fusarium

3.11. Determinación de la composición de ácidos grasos de la membrana

3.12. Cuantificación de los niveles de expresión de quitosanasas por qRT-

4.1 Sitios de muestreo..........................................................................................21

4.2.1 Cepa CAC8...........................................................................................23

4.2.2 Cepa RSM52A......................................................................................24

4.2.4 Cepa RSM53B......................................................................................26

4.2.5 Cepa RSM210......................................................................................27

4.2.6 Cepa RSM100......................................................................................28

4.2.7 Cepa ECMA2........................................................................................29

4.2.8 Cepa ECMC4........................................................................................30

4.2.9 Cepa ECM8..........................................................................................30

4.2.10 Cepa ECSP16M...................................................................................31

4.2.11 Cepa ECSP18M...................................................................................32

4.3 Efecto del quitosano sobre el crecimiento de Trichoderma a partir de

4.4 Efecto del quitosano sobre el crecimiento de Fusarium y determinación de

4.5 Efecto del quitosano sobre el crecimiento miceliar de Trichoderma..............44

4.6 Efecto del quitosano sobre el crecimiento miceliar de Fusarium...................45

4.7 Determinación del efecto de Trichoderma y quitosano en el control invitro de

4.8 Degradación de quitosano..............................................................................50

1.1.1. Situación de la fusariosis en México.

En México hay reportes de enfermedades por Fusarium en diversos cultivos, tales

oxysporum f. sp. fragariae (SAGARPA, 2012c), el declinamiento del esparrago por F.

1.1.1.1. Fusariosis en maíz

graves, la pudrición de la mazorca reduce considerablemente el rendimiento del

1.1.1.2. Fusariosis en tomate rojo

2010), disminuyendo así en un 60% el rendimiento del cultivo y afectando la calidad

1.1.2. Métodos de control de Fusarium.

volátiles inhibitorios del crecimiento microbiano), la competencia por espacio y

1.3.1. Efecto del quitosano en plantas.

1.3.2. Efecto antifúngico del quitosano sobre Fusarium spp