Proyecto Tesis. Henry Panduro Cerrón

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VICERRECTOR DE INVESTIGACIÓN
OFICINA DE INVESTIGACIÓN
UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA
REGISTRO DE TESIS PARA LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO UNIVERSITARIO
I. DATOS GENERALES DE PREGRADO
Universidad : Universidad Nacional Agraria de la Selva
Facultad : Facultad de Agronomía
Título de Tesis : Antagonismo de cepas de Trichoderma spp Pers.

contra fitopatógenos de frutos y su potencial en la
promoción del crecimiento de plantones de cacao
(Theobroma cacao L.)
Autor : Bach. Henry Panduro Cerrón
Asesor de Tesis : Ing. Oscar Cabezas Huayllas
Escuela Profesional : Agronomía
Programa de Investigación : Cultivos Tropicales / Fitosanidad
Línea (s) de Investigación : Desarrollar ensayos de eficacia de pesticidas en

el control de fitopatógenos e insectos plagas
Eje temático de investigación : Control de enfermedades en plantas
Lugar de Ejecución : Laboratorio e invernadero de fitopatología de la

Facultad de Agronomía – UNAS
Duración : 6 meses
Fecha de Inicio : Mayo 2021
Término : Octubre 2021
Financiamiento :
FEDU :
Propio : Si
Otros :
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UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA

FACULTAD DE AGRONOMÍA
PROYECTO DE TÉSIS
ANTAGONISMO DE CEPAS DE Trichoderma spp Pers.

CONTRA FITOPATÓGENOS DE FRUTOS Y SU POTENCIAL EN
LA PROMOCIÓN DEL CRECIMIENTO DE PLANTONES DE
CACAO (Theobroma cacao L.)
Ejecutor : Bach. Henry Panduro Cerrón
Asesor : Ing. Oscar Cabezas Huayllas
Lugar de
Ejecución : Laboratorio e Invernadero de Fitopatología de la Facultad de
Agronomía - UNAS
Duración : 6 meses
Inicio : Mayo 2021
Culminación : Octubre 2021
TINGO MARÍA – PERÚ
2021
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ÍNDICE GENERAL
I. INTRODUCCION...........................................................................................6
1.1. Hipótesis planteada para el proyecto:.....................................................7
1.2. Objetivo general.......................................................................................8
1.2.1. Objetivos específicos....................................................................
II. REVISIÓN DE LITERATURA.........................................................................9
2.1. Generalidades sobre el cacao.................................................................9
2.1.1. Origen y distribución.....................................................................
2.1.2. Importancia socio-económica del cacao.......................................
2.1.3. Taxonomía..................................................................................
2.1.4. Requerimientos ambientales......................................................
2.1.5. Principales enfermedades del Cacao.........................................
2.2. Phytophthora sp.....................................................................................11
2.2.1. Distribución geográfica................................................................
2.2.2. Clasificación taxonómica............................................................
2.2.3. Morfología...................................................................................
2.2.4. Biología de Phytophthora sp.......................................................
2.3. Moniliophthora roreri..............................................................................13
2.3.2. Taxonomía..................................................................................
2.3.3. Biología de Moniliophthora roreri................................................
2.4. Moniliophthora perniciosa......................................................................14
2.4.3. Biología de Moniliophthora perniciosa........................................
2.5. El hongo antagonista Trichoderma spp.................................................16
2.5.2. Características morfológicas.......................................................
2.5.3. Mecanismos de acción de Trichoderma spp..............................
2.5.3.1. Competencia................................................................
2.5.3.2. Antibiosis......................................................................
2.5.3.3. Micoparasitismo...........................................................
-3-
2.5.3.4. Promotor de crecimiento de las plantas......................

2.5.3.5. Inductor de Resistencia en Plantas.............................
2.5.4. Biocontrol de Trichoderma spp. sobre fitopatógenos de
cacao....………………………………………………………………21
2.5.5. Promoción de crecimiento en plantones de cacao.....................
III. MATERIALES Y MÉTODOS........................................................................27
3.1. Ubicación...............................................................................................27
3.1.1. Lugar de ejecución......................................................................
3.2. Materiales y equipos..............................................................................27
3.2.1. Equipos.......................................................................................
3.2.2. Materiales....................................................................................
3.2.3. Insumos.......................................................................................
3.2.4. Material Biológico........................................................................
3.3. Efecto antagónico in vitro de las cepas de Trichoderma spp. frente a
Phythophtora sp., Moniliophthora roreri y Moniliophthora perniciosa...29
3.3.1. Componentes en estudio............................................................
3.3.2. Tratamientos en estudio.............................................................
3.3.3. Diseño experimental...................................................................
3.3.3.1. Características del experimento..................................
3.3.3.2. Croquis de los tratamientos.........................................
3.3.4. Metodología................................................................................
3.3.4.1. Preparación de medios de cultivo................................
3.3.4.2. Aislamiento de las cepas de Trichoderma spp............
3.3.4.3. Aislamiento de Phythophtora sp..................................
3.3.4.4. Aislamiento de Moniliophthora roreri...........................
3.3.4.5. Aislamiento de Moniliophthora perniciosa...................
3.3.4.6. Enfrentamiento de Trichoderma spp., vs.
patógenos del cacao (Moniliophthora roreri,
Moniliophthora perniciosa, Phytophthora sp.).............
3.3.4.7. Interacción hifal de Trichoderma spp., vs.
patógenos del cacao (Moniliophthora roreri,
Moniliophthora perniciosa, Phytophthora sp.).............
-4-
3.3.4.8. Determinación de la concentración de conidias de

las cepas de Trichoderma spp.....................................
3.3.5. Parámetros a evaluar..................................................................
3.3.5.1. Ritmo de crecimiento micelial de las cepas de
Trichoderma spp. y cepas patógenas..........................
3.3.5.2. Crecimiento de las cepas de Trichoderma spp., vs
fitopatógenos................................................................
3.3.5.3. Tiempo de Contacto Antagonista-Patógeno................
3.3.5.4. Porcentaje de inhibición de crecimiento radial de
los patógenos...............................................................
3.3.5.5. Porcentaje de aceleración de crecimiento radial
de Trichoderma spp.....................................................
3.3.5.6. Competencia por el sustrato........................................
3.3.5.7. Invasión de las cepas de Trichoderma sobre los
patógenos....................................................................
3.3.5.8. Tipos de Interacción hifal.............................................
3.4. Influencia de cepas de Trichoderma spp. sobre el crecimiento de
plantones de cacao................................................................................39
3.4.1. Componentes en estudio............................................................
3.4.2. Tratamientos en estudio.............................................................
3.4.3. Diseño experimental...................................................................
3.4.3.1. Características del experimento..................................
3.4.3.2. Croquis de los tratamientos.........................................
3.4.4. Metodología................................................................................
3.4.4.1. Preparación de medios de cultivo................................
3.4.4.2. Aislamiento de las cepas de Trichoderma spp............
3.4.4.3. Producción de aislamiento de Trichoderma spp.........
3.4.4.4. Determinación de la concentración de conidias de
las cepas de Trichoderma spp.....................................
3.4.4.5. Preparación del sustrato..............................................
3.4.4.6. Esterilización del sustrato............................................
3.4.4.7. Uso y llenado de tubetes.............................................
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3.4.4.8. Infestación del sustrato con cepas de

Trichoderma.................................................................
3.4.4.9. Selección y pre-germinación de semilla de cacao......
3.4.4.10. Siembra de semillas de cacao.....................................
3.4.4.11. Manejo agronómico de plantones de cacao en
invernadero..................................................................
3.4.5. Parámetros a evaluar..................................................................
3.4.5.1. Altura planta.................................................................
3.4.5.2. Número de hojas..........................................................
3.4.5.3. Diámetro de tallo..........................................................
3.4.5.4. Longitud radicular.........................................................
3.4.5.5. Volumen radicular........................................................
3.4.5.6. Peso fresco total, de la raíz y parte aérea...................
3.4.5.7. Peso seco total, de la raíz y parte aérea.....................
IV. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES............................................................50
V. PRESUPUESTO..........................................................................................51
VI. BIBLIOGRAFÍA............................................................................................53
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I. INTRODUCCION
El cacao (Theobroma cacao L.), es un cultivo prioritario en Perú por su

importancia económica, social y ambiental. En el año 2019, la producción de
cacao en Perú alcanzó a 135,9 mil toneladas, en una superficie cosechada de
130,3 mil hectáreas, lo que generó alrededor de 11 millones de jornales,
beneficiando de manera directa a más de 90 mil familias, e indirecta a 450,000
mil personas en las zonas de producción que se encuentran principalmente en
la selva peruana. Es importante destacar que, el Perú es el segundo país
productor de cacao orgánico (REDAGRICOLA. 2020).
El cultivo de cacao es afectado por enfermedades que causan pérdidas

económicas significativas, siendo la pudrición parda, moniliasis y escoba de
bruja causado por Phytophthora sp. Bary, Moniliophthora roreri (Cif & Par)
Evans et al. y Moniliophthora perniciosa (Stahel) Aime respectivamente, los
principales patógenos del cacao, capaces de causar pérdidas completas de
rendimiento, con una reducción anual en la producción de cacao estimada en
más de 700 000 toneladas de almendras (BAILEY et al., 2008).
Nuestros agricultores para el control de estas enfermedades hacen uso

de productos químicos que causan impactos negativos en el medio ambiente y
cada vez es menos eficaz. Es por eso que se está optando por el control
biológico y una gran alternativa es el uso de especies de Trichoderma spp.
Persoon, ya que son principalmente objeto de estudio por su capacidad para
controlar enfermedades (HOLMES et al., 2004.; BAILEY et al., 2008).
El biocontrol haciendo uso de cepas de Trichoderma spp. es útil para

combatir hongos fitopatógenos, puesto que las cepas compiten por el espacio y
los nutrientes, cambian las condiciones ambientales, estimulan el crecimiento
de las plantas y sus mecanismos de defensa o producen antibiótico, las cepas
además pueden realizar el biocontrol directamente mediante micoparasitismo.
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Ambos mecanismos pueden actuar en forma coordinada y su importancia en el

biocontrol dependerá de la cepa de Trichoderma. (BENÍTEZ et al., 2004).
El uso de Trichoderma spp. reduciría las posibilidades de utilización de

insumos contaminantes como plaguicidas, reduciendo los costos de producción
e incrementarían la rentabilidad del cultivo, contribuyendo de esta manera a la
sostenibilidad del cultivo en beneficio de los agricultores. Debido a la
importancia que tienen estos microorganismos en el control de enfermedades,
se desarrolló el presente trabajo de investigación en el laboratorio e
invernadero de fitopatología de la Facultad de Agronomía de la Universidad
Nacional Agraria de la Selva; con la siguiente hipótesis y objetivos:
I.1. Hipótesis planteada para el proyecto:
H0: Existe efecto de una de las cepas de Trichoderma spp. como

antagonista frente a una de las cepas patógenas de cacao
(Moniliophthora roreri, Moniliophthora perniciosa y Phytophthora)
y/o en la capacidad de promover el crecimiento de plantones de
cacao (Theobroma cacao L.).
H1: No existe efecto de una de las cepas de Trichoderma spp.

como antagonista frente a una de las cepas patógenas de
cacao (Moniliophthora roreri, Moniliophthora perniciosa y
Phytophthora sp.) y/o en la capacidad de promover el
crecimiento de plantones de cacao (Theobroma cacao L.).
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I.2. Objetivo general
Evaluar el antagonismo de cepas de Trichoderma spp.

contra fitopatógenos de frutos y su potencial en la promoción del crecimiento de
plantones de cacao (Theobroma cacao L.)
I.2.1. Objetivos específicos
1. Determinar los efectos antagónicos de cinco cepas de

Trichoderma spp. frente a Moniliophthora roreri, Moniliophthora perniciosa y
Phytophthora sp. a nivel in vitro.
2. Determinar la eficiencia de cinco cepas de Trichoderma spp.

como promotores del crecimiento de plantones de cacao (Theobroma cacao L.)
bajo dos condiciones de invernadero.
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II. REVISIÓN DE LITERATURA
II.1. Generalidades sobre el cacao
II.1.1. Origen y distribución
Estudios más recientes confirman que la región alta del

Amazonas, una zona que comprende territorios de Perú, Colombia y Ecuador
es el lugar donde se encuentra la mayor diversidad genética del cacao, por lo
tanto se considera su centro de origen (LANUAD et al., 2000).
II.1.2. Importancia socio-económica del cacao
El cacao es un cultivo estrictamente tropical, pero se elabora y

consume más en regiones templadas, principalmente como bebida estimulante
y como alimento energético (chocolate) por su contenido de teobromina y
trazas de cafeína (LEÓN, 2000).
En el año 2019, la producción de cacao en Perú alcanzó a 135,9

mil toneladas, en una superficie cosechada de 130,3 mil hectáreas, lo que
generó alrededor de 11 millones de jornales, beneficiando de manera directa a
más de 90 mil familias, e indirecta a 450,000 mil personas en las zonas de
producción que se encuentran principalmente en la selva peruana. Es
importante destacar que, el Perú es el segundo país productor de cacao
orgánico. Entre las regiones que se han convertido en importantes centros de
producción de cacao destacan San Martín con 48,4 mil toneladas, principal
productor regional (35,6% participación), le sigue Junín con 25,5 mil toneladas
(18,8%), Ucayali con 17 mil toneladas (12,5%), asimismo Huánuco y Cusco con
13 mil y 10 mil toneladas, respectivamente. Estas 5 regiones representan
alrededor del 84% de la producción total del país. Toda esta labor involucra a
unas 100 mil familias, principalmente de agricultura familiar se dedican a su
cultivo en 16 de las 24 regiones del país (REDAGRICOLA. 2020).
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II.1.3. Taxonomía
La clasificación taxonómica según (CRUZ y LINA, 2007) es la

siguiente:
Reino : Plantae
División : Ansgiospermas
Clase : Dicotiledóneas
Orden : Malvales
Familia : Sterculiaceae
Género : Theobroma
Especie : cacao L.
II.1.4. Requerimientos ambientales
Es una planta que prospera bien bajo sombra; sin embargo

necesita condiciones especiales de luminosidad, temperatura y provisión de
agua (ARÉVALO et al., 2004). Los factores climáticos más importantes para el
desarrollo del cacao son la temperatura y la lluvia, y le siguen en importancia el
viento, la luz, la radiación solar y la humedad relativa (ENRÍQUEZ y SALAZAR,
1987). El cacao se desarrolla bajo temperaturas medias anuales de 21 ºC, los
rangos óptimos de agua oscilan entre 1500 y 2500 mm en las zonas bajas
cálidas y entre 1200 y 1500 mm en las zonas frescas o los valles altos
(SÁNCHEZ y DUBÓN, 1994).
II.1.5. Principales enfermedades del Cacao
La pudrición parda (causado por Phytophthora spp.), moniliasis

(Moniliophthora roreri) y escoba de bruja (Moniliophthora perniciosa), son los
principales patógenos del cacao, capaces de causar pérdidas completas de
rendimiento, con una reducción anual en la producción de cacao estimada en
más de 700 000 toneladas de almendras, correspondiendo a más de 700
millones de dólares US (BAILEY et al., 2008) citado por (VIENA, 2013).
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II.2. Phytophthora sp.
II.2.1. Distribución geográfica
El género Phytophthora se encuentra distribuido en todo el

mundo; considerada la principal enfermedad del cacao en un 80% de los países
(CATIE, 2008). En cacao se han reportado siete especies patógenas: P.
palmivora, P. megakarya, P. capsici, P. citrophthora, P. nicotianae var.
Parasítica, P. megasperma y P. arecae. La especie con mayor incidencia y
más ampliamente diseminada en el mundo es P. palmivora responsable de
20% a 30% de pérdidas anuales de la producción mundial de grano y
aproximadamente 10% de muerte de árboles (GUEST, 2007).
II.2.2. Clasificación taxonómica
Según (KAOSARI et al., 1978) las especies de Phytophthora

causantes de la mazorca negra en cacao se encuentran agrupadas de la
siguiente manera:
Reino : Chromista
División : Oomycota
Clase : Oomycetes
Orden : Peronosporales
Familia : Pythiaceae
Género : Phytophthora
Especie : Phytophthora spp.
II.2.3. Morfología
La especie con mayor importancia en sur América es P.

palmivora, presenta las siguientes características: las hifas de esta especie son
completamente uniformes, pocas veces sobrepasan los 5 µm de diámetro. A
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menudo, esta especie produce clamidiosporas con diámetro entre 30-35 µm en

abundancia y en las primeras fases de desarrollo. Los esporangióforos son
estrechos, simpoidales simples y con paredes muy bien definidas. Los
esporangios se forman fácilmente sobre medio de cultivo, estos son elipsoides
u ovoides con un tamaño de 35 - 60 µm x 20 - 40 µm y puede llegar hasta 90 x
45 µm. Presenta anteridios anfígenos, esféricas u ovales con un tamaño de 14
x 15 µm. Las oosporas casi llenan el oogonio, tienen una pared de 2 µm.
(STAMPS, 1998) Citado por (JAIMES y ARANZAZU, 2010).
II.2.4. Biología de Phytophthora sp
Phytophthora palmivora y P. megakarya tienen dos tipos de

reproducción asexual y sexual, que producen cuatro tipos de esporas
diferentes que pueden causar infección directa o indirectamente: esporangios,
zoosporas, clamidosporas y oosporas
Los esporangios son capaces de germinar directamente sobre la

superficie de la planta o en el suelo. Este tipo de germinación ocurre en
presencia de temperaturas cercanas o superiores a los 25 °C. La baja
temperatura (15 a 20 °C) favorece la ruptura del esporangio, liberación y
germinación de las zoosporas, lo cual incrementa el nivel de inóculo, ya que
cada esporangio tiene de 20 a 30 zoosporas que constituyen un mayor número
de unidades infectivas o propágulos, mientras que la germinación directa del
esporangio constituye un solo propágulo del patógeno (DENNIS y KONAM,
1994)
Las zoosporas son atraídas por señales de la planta hacia los

potenciales sitios de infección y, en un tiempo aproximadas de 20 a 30 minutos,
encuentran su hospedero y se enquistan. Se ha demostrado que la penetración
de P. palmivora ocurre principalmente a través de los estomas (IWARO et al.
1997). La germinación ocurre rápidamente después del enquistamiento y los
tubos germinativos penetran la epidermis de los tejidos; esto ocurre en un
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periodo aproximado de 48 horas (ATTARD et al. 2008). La colonización del

tejido del hospedante progresa y, en tejidos susceptibles, la esporulación
ocurre dentro de tres a cinco días en condiciones de ambiente favorable.
Durante la reproducción sexual se forman las oosporas por

acoplamiento de dos tipos de estructuras especializadas, llamadas anteridio
(estructura reproductiva masculina) y oogonio (estructura reproductiva
femenina), de compatibilidad complementaria (A1 y A2) (GUEST 2007). Las
oosporas germinan desarrollando micelio o produciendo esporangios. El
Phytophthora es un parásito facultativo y requiere de estructuras de
supervivencia como clamidosporas y oosporas que le permitan sobrevivir en
ausencia de hospederos (WIDMER 2010).
II.3. Moniliophthora roreri
Es el agente causal de la enfermedad conocida en Latinoamérica

como moniliasis, vaina helada, enfermedad de Quevedo o podredumbre-
acuosa, es una de las más importantes y con una capacidad de afectar la
producción entre un 40 y 50% del cultivo de cacao (EVANS, 2002). La
moniliasis se encuentra distribuida en 11 países de Latinoamérica. En el Perú
(HERNÁNDEZ et al., 1990) reportaron la presencia del hongo en el
departamento del Amazonas. Para 1999, cerca del total de plantaciones de
cacao en el Perú, estaban afectadas por M. roreri (PHILLIPSMORA y
WILKINSON, 2007).
II.3.2. Taxonomía
Según (EVANS et al., 2003), pertenece a:
Reino : Fungí
División : Deutoromycota
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Clase : Hyphomycetes
Orden : Moniliales
Familia : Tricholomataceae
Género : Moniliophthora
Especie : M. roreri.
II.3.3. Biología de Moniliophthora roreri
El inóculo está constituido por conidias que se producen

abundantemente dentro y sobre la superficie de los frutos. Las conidias de
Moniliophthora roreri, son de forma globosas cuando están maduras y cuando
son jóvenes son oblongas e hialinas, agrupándose en cadenas simples
(EVANS et al., 1978). La germinación de las esporas es mayor a temperaturas
de 22°C que a 35°C, con una humedad relativa de 80%; así mismo la
capacidad de germinación de estas "In vitro", bajo temperatura promedio de
23°C varía con la edad del micelio. Sin embargo las conidias germinan en
contacto con agua pura o en macerados diversos según (EVANS et al., 1981).
La germinación se inicia a las dos horas y se completa entre 6 y 7 horas
después. La mejor temperatura para la germinación de esporas es a 23°C, la
emisión del tubo germinativo se inicia a las 2 horas después de la incubación,
alcanzando un máximo de germinación después de 8 a 12 horas de la
inoculación (JARAMILLO y ARANZAZU, 1983).
(BARROS, 1977) citado por (SOBERANIS, 1999), señala que bajo

condiciones de laboratorio Moniliophthora roreri, crece y esporula fácilmente en
medios de cultivos naturales y artificiales, con un amplio rango de pH (3.5 y
8.0), también se encontró que el desarrollo micelial requiere de pH 5.0 a 6.5 y 7
para la fructificación o formación de conidias.
II.4. Moniliophthora perniciosa

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Es el agente causal de la enfermedad conocido como “Escoba de

bruja” está presente en Suramérica, algunos países del Caribe y al sur del
canal de Panamá, donde ha causado pérdidas en la producción de cacao con
reducciones en el rendimiento del 50 al 90% (MEINHARDT et al., 2008), por lo
que constituye una amenaza potencial para el cultivo del cacao y hospedantes
alternos.
Según (MEINHARDT et al., 2008), es la siguiente:
Reino : Fungí
División : Basidiomycota
Clase : Agaricomycetes
Orden : Agaricales
Familia : Marasmiaceae
Género : Moniliophthora
Especie : M. perniciosa.
II.4.3. Biología de Moniliophthora perniciosa
M. perniciosa, presenta un píleo de color rojo carmesí,

generalmente frágil, conforme madura pierde su color; en el centro sobresale
una mancha conspicua de color rojo oscuro, con líneas radiales del mismo
color, campanulada, a menudo con un margen cóncavo y convexo, pero con el
centro umbilicado o convexo (2-25 mm), generalmente de 5-15 mm de
diámetro; arrugado o flácido cuando se deshidrata y turgente cuando hay
humedad (CABl, 2018). Los cuerpos fructíferos (basidiocarpos) no sólo se
desarrollan en tejido vegetal vivo, también pueden hacerlo en ramas, frutos y
hojas muertas (PORRAS y SÁNCHEZ, 1991).
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M. perniciosa es un patógeno hemibiotrófico, con distinta

morfología de micelio y comportamiento en las fases biotrófica (parasítica) y
necrotrófica (saprofítica) (GRIFFITH et al., 1994). Las características del
crecimiento micelial varían dependiendo del tipo de tejido colonizado y las
condiciones del cultivo in vitro (EVANS, 1981). En cultivo in vitro, el micelio es
de tipo toruloso cuando al medio de cultivo se adicionan trozos del tejido de
cacao obtenidos por cultivo de tejidos; sin embargo, cuando el tejido se
avejenta y muere, el hábito de crecimiento del hongo cambia, presenta un
rápido crecimiento y es de tipo filiforme. Por lo anterior, el tipo de tejido del
hospedante (vivo o muerto), condiciona el hábito parasítico o saprofítico de M.
perniciosa (EVANS y BARRETO, 1996).
II.5. El hongo antagonista Trichoderma spp.
El género Trichoderma es un hongo cosmopolita, saprófitos del suelo y la

madera, de crecimiento muy rápido. Se presentan naturalmente en diferentes
ambientes, especialmente en aquellos que contienen materia orgánica o
desechos vegetales en descomposición. El potencial de este hongo radica en
el amplio espectro como antagonista para controlar fitopatógenos que afectan
cultivos de interés comercial como maíz, cebolla, tomate, fríjol, trigo, etc.
(MICHEL et al., 2008).
El género Trichoderma, según (PAPAVIZAS, 1985) se encuentra

clasificado en:
División : Ascomycota
Clase : Sordariomycetes
Orden : Hypocreales
Familia : Hypocreacea
Género : Trichoderma (Estado anamórfico)

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Hypocrea (Estado telemórfico)
II.5.2. Características morfológicas
Trichoderma generalmente es cultivada en laboratorio sobre

medio PDA (Potato Dextrosa Agar), en este medio forman colonias
morfológicamente distintas, comenzando con una forma lisa, generalmente al
quinto día forma micelio algodonoso color blanco verdoso, la esporulación
presenta fotosensibilidad. La formación de un micelio compacto por lo general
toma 7 días. La temperatura óptima de crecimiento fluctúa entre 25 – 30 C o
(HARMAN and KUBICEK, 1998). Según (RIFAI, 1969), las características
generales para todas las cepas o razas de Trichoderma spp., son las
siguientes:
a) Colonia
Las especies del género Trichoderma pueden formar colonias

flojas o compactas, pudiendo presentarse numerosas variaciones entre éstos
dos extremos; ocasionalmente se presentan estas dos características sobre
una misma colonia. La compactación de las colonias se debe posiblemente o
está relacionada con la estructura de los conidióforos. El color de las colonias
se debe a la pigmentación de las fialosporas, así como, a la cantidad de
esporas producidas; algunos aislamientos pueden producir cristales o secretar
pigmentos que decolora el medio, el pH del medio influye en la coloración de
las colonias de Trichoderma spp., puede mostrar una coloración diferente, que
varía de amarillo a amarillento o verde oscuro. Algunas colonias presentan
desprendimiento de olores.
b) Micelio
El micelio se encuentra constituido por hifas hialinas,

septadas de paredes lisas y con abundante ramificación.
c) Clamidospora
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Las clamidosporas están presentes en muchas especies, las

mismas que pueden ir intercaladas, ocasionalmente terminales o sobre una
ramificación lateral de una hifa corta, es globosa o elipsoidal, incolora y de
pared lisa.
d) Conidióforo
Los conidióforos poseen una estructura compleja,

caracterizada por su abundante ramificación, cónicos o piramidales. Sobre las
ramificaciones principales de los conidióforos se producen ramificaciones
principales laterales cortas, individuales o en grupos de tres, otros se colocan
hacia fuera, alejado de las ramificaciones laterales cortas. El ápice de cada
rama termina en una fiálides, excepto en Trichoderma hamatum y Trichoderma
polysporum.
e) Fiálides
Son estructuras que se parecen a un frasco, a una pera, por

lo general reducida en su base, con una hinchazón en la parte media, luego
atenuado bruscamente cerca del ápice en un cono angosto y con cuello
subcilíndrico. Las fiálides se disponen en grupos irregulares de hasta cinco
alrededor del extremo de las penúltimas células de las ramificaciones o pueden
originarse a lo largo de las mismas, en forma individual, alternadamente o en
pares opuestos. Generalmente las fiálides terminales son ligeramente más
largas que las originales bajo ellas.
f) Esporas
Las esporas son fialosporas producidas individualmente o

sucesivamente acumuladas en el ápice de las fiálides, conformando una
cabeza de esporas, cuyo diámetro es inferior a 15 micras, rápidamente pueden
estar en cadenas cortas; ovoides, elípticas, cilíndricas o casi oblongas, a veces
con apariencia angular, ocasionalmente trucada en su base.
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II.5.3. Mecanismos de acción de Trichoderma
La actividad antagónica de las especies de Trichoderma involucra

mecanismos de acción directos como micoparasitismo, antibiosis, competencia
por nutrientes. Además muestran mecanismos de acción de forma indirecta
como, promueven mecanismos de defensa fisiológicos y bioquímicos en la
planta para inducir resistencia sistémica a enfermedades, mejoran el
crecimiento y desarrollo de plantas (GHAZANFAR et al., 2018), incrementan la
tolerancia de la planta a estrés por sequía o salinidad y solubilizan elementos
nutritivos que en su forma original no son accesibles para las plantas
(KASHYAP et al., 2017). (CHET y BAKER, 1980) citados por (RODRÍGUEZ,
2002) descubrieron que la mínima cantidad efectiva de Trichoderma es de 106
ufc/g de suelo.
II.5.3.1. Competencia
Un factor esencial para que exista competencia, es la

escasez o limitación de un requerimiento (espacio y/o nutrientes). La
competencia por nutrientes de Trichoderma, es principalmente por carbono,
nitrato de hierro. Trichoderma posee una gran capacidad de movilizar y tomar
nutrientes del suelo en comparación con otros organismos. De forma general,
entre las cualidades que favorecen la competencia de este antagonista, se
encuentra la alta velocidad de crecimiento que posee gran parte de sus
aislamientos. (MARTÍNEZ et al, 2013).
La competencia evaluada bajo condiciones in vitro

(cultivo dual), se ejerce principalmente por espacio. En ella intervienen la
velocidad de crecimiento de las cepas del antagonista y factores externos como
tipo de sustrato, pH y temperatura, entre otros (MARTÍNEZ et al, 2013). Bajo
condiciones in vivo, la competencia de Trichoderma en la rizosfera se relaciona
con la capacidad de colonización de la raíz y el espacio adyacente. En ella
influyen de forma importante factores como tipo de suelo, pH, temperatura y
humedad (HJELJORD & TRONSMO, 1998). Un buen antagonista es capaz de
superar el efecto fungistático que resulta de la presencia de diferentes
- 20 -
metabolitos producidos por otras especies, incluyendo plantas, y sobrevive bajo

condiciones adversas o competitivas (BENÍTEZ, 2004).
II.5.3.2. Antibiosis
La antibiosis es el fenómeno mediante el cual un hongo

antagonista inhibe o destruye a un organismo a través de la producción de
pequeñas moléculas toxicas, volátiles y de enzimas líticas (BAKER y GRIFFIN,
1995). Las cuales disuelven o dañan polímeros estructurales, como quitina y β-
1-3-glucanos de la pared celular en la mayoría de los hongos fitopatógeno,
produciendo un efecto adverso sobre su desarrollo y diferenciación (GOLDMAN
et al., 1994). La antibiosis en Trichoderma spp., puede efectuarse por
producción de enzimas hidrolíticas y por metabolitos secundarios, volátiles o no
(JENSEN y WOLFFHECHEL, 1995). Entre estos compuestos, se encuentran el
ácido harzianico, alameticinas, tricholinas, 6-penthylpirona, massoilactona,
viridina, gliovirina, glisoperonas, ácido heptéldico y otros que están siendo
descritos (HOWELL, 1998).
II.5.3.3. Micoparasitismo
(FERNÁNDEZ 2001), manifiesta que el micoparasitismo

se trata de la acción directa de un hongo parasitando a otro, donde el patógeno
es utilizado como alimento por su antagonista. (ELAD et al., 1982),
demostraron que Trichoderma spp. producen celulasas, glucanasas y
quitinasas que degradan "in vitro" la celulosa de las paredes celulares de
Oomycetes y la quitina β -1 ,3 glucanos de las paredes celulares de los hongos
pertenecientes a la división Deuteromycota.
Las especies de Trichoderma durante el proceso de

micoparasitismo crecen quimiotrópicamente hacia el hospedante (crecimiento
quimiotrófico), se adhieren a las hifas del mismo, se enrollándolas alrededor de
esta (adhesión y este enrollamiento) y las penetran en ocasiones (actividad
- 21 -
lítica). La degradación de las paredes celulares del hospedante se observa en

los estados tardíos del proceso parasítico, que conlleva al debilitamiento casi
total del fitopatógeno (INFANTE et al., 2009).
II.5.3.4. Promotor de crecimiento de las plantas
Otro de los mecanismos de antagonismo producidos por

Trichoderma se basa en la promoción del crecimiento de la planta (BAILEY y
LUMSDEN, 1998). Diversos aislados de esta especie la estimulan el
crecimiento vegetal debido a que son capaces de sintetizar determinados
compuestos con carácter hormonal (BROTMAN et al., 2008). Estos aislados
producen además diferentes ácidos orgánicos que disminuyen el pH,
solubilizando el fosforo del medio, así como otros nutrientes, mejorando el
desarrollo de la planta. Además, las enzimas hidrolíticas producidas por estos
hongos movilizan la materia orgánica del medio, mejorando igualmente la
absorción de compuestos más simples por parte de la planta, y en definitiva su
estado nutricional (VERMA et al., 2007).
(CANDELERO et al., 2015), menciona que Trichoderma
ha presentado una formación de sideróforos quelatantes que permiten la
disponibilidad de elementos hacia la planta como lo son: Ca, Fe 2O3, MnO2, Cu
y Zn, al igual que las hormonas reguladoras de crecimiento.
II.5.3.5. Inductor de Resistencia en Plantas
Numerosos autores han revelado que las asociaciones

de Trichoderma con la planta, así como algunos de los compuestos producidos
por el hongo, favorecen la inducción de mecanismos de resistencia en la
planta. La presencia del hongo y los elicitores que producen son capaces de
activar mecanismos de defensa en plantas (BAILEY y LUMSDEN, 1998),
reprogramando la expresión de diferentes genes de la planta y activando
diferentes rutas enzimáticas (SHORESH et al., 2005).
- 22 -
Esta resistencia inducida no es específica de un

determinado tipo de planta y puede ser localizada o sistémica, capacitándola
para ejercer una respuesta mayor y más rápida ante el ataque de patógenos
(CONRATH et al., 2002). Esta respuesta incluye la secreción de peroxidasas,
la síntesis de fitoalexinas (HOWELL et al., 2000), la biosíntesis de compuestos
terpénicos (HOWELL, 2006) o el aumento de los niveles de ácido salicílico y
ácido jasmónico (SHORESH et al., 2005; SEGARRA et al., 2009).
II.5.4. Biocontrol de Trichoderma spp. sobre fitopatógenos de

cacao
Se demostró que especies de Trichoderma inhiben el crecimiento

de Phytophthora spp., tanto en condiciones in vitro como in vivo. En este
sentido, se aislaron cepas de Trichoderma asperellum Samuels, Lieckfeldt &
Nirenberg (TCHAMENI et al. 2011), Trichoderma martiale Samuels (HANADA
et al. 2008) y Trichoderma viride Pers. (MPIKA et al. 2009) de la rizosfera de T.
cacao con potencial para el control de diferentes especies de Phytophthora.
(HANADA et al. 2008) informaron que T. martiale causó reducción de la
enfermedad ocasionada por P. megakarya en frutos de cacao en condiciones
in situ, con resultados similares a los obtenidos con la aplicación de fungicidas.
T. martiale colonizó y permaneció en la superficie del fruto de cacao por más
de 80 días y estableció una asociación endofítica con el cultivo que pudo ser
evidenciada en las plantas tres meses posteriores a la inoculación.
En Cuba, en la Estación de Investigaciones de Cacao en Baracoa,

Guantánamo, se emplearon cepas de Trichoderma sp. para el control biológico
de P. palmivora en plantaciones de T. cacao. Se destaca, la aplicación de
Trichoderma cepa G-6, cuya aplicación disminuyó la incidencia de la
enfermedad en condiciones de campo y las pérdidas económicas en el cultivo
del 12% a 2% (MATOS et al. 2010). Estos resultados confirman que la
aplicación de productos con cepas de Trichoderma permiten mitigar los efectos
- 23 -
deletéreos ocasionados por P. palmivora en Theobroma cacao y sus

potencialidades de uso en el cultivo.
Las especies del genero Trichoderma que se encuentran

comercializadas para el control biológico, promotor de crecimiento y
biofertilizante son: Trichoderma viride Pers., Trichoderma polysporum (Link)
Rifai y Trichoderma harzianum Rifai. Las especies T. virens y T. harzianum son
con mayor uso para el control antagónico de M. roreri, Phytophthora spp., y M.
perniciosa en sistemas agroforestales-cacaotales (Theobroma cacao L.) con
resultados óptimos al efecto inhibidor para estas enfermedades. (LÓPEZ et al.,
2017).
(VILLAMIL et al. 2012), reporta que cepas de Trichoderma

presentaron 70% a 100% de antagonismo como agentes para el biocontrol de
Moniliophthora roreri aislados de frutos de cacao y de la rizosfera. En pruebas
in vitro T. virens y T. harzianum nativas aisladas del agrosistemas-cacaotal
mostraron ser promisorios agentes antagónicos contra M. roreri, la especie T.
harzianum produce y secreta ácido nonanoico (pelargónico) en un medio de
cultivo líquido. El ácido nonanoico fue muy inhibitorio para la germinación de
esporas y el crecimiento micelial de patógenos del cacao, principalmente
Crinipellis perniciosa y Moniliophthora roreri (ANEJA et al., 2005; KRAUSS y
SOBERANIS, 2001).
T. harzianum actúa de forma antagónica frente a su patógeno,

mediante un enfrentamiento dual, en el cual las hifas de T. harzianum se
desarrollan sobre las de M. roreri causando deformaciones morfológicas y
desorganización en la estructura de su pared celular, debido la secreción de
sustancias antifúngicas (enzimas y antibióticos). Esto evidencia una interacción
parasitaria del T. harzianum sobre el fitopatógeno (CUERVO-PARRA et al.
2011).
- 24 -
T. stromaticum presenta una actividad micoparasítica en M.

perniciosa, debido a que coloniza el tejido necrótico y evita la producción de
basidiocarpos mediante la actividad hidrolítica de proteínas secretadas al
medio, las cuales generan la ruptura de la pared celular del huésped patógeno
(LOPES et al. 2009). El T. hamatum y el T. asperellum (así como otras de las
especies aisladas de Trichoderma sp.) indican una alta efectividad, porque
inducen una respuesta de resistencia en el árbol de cacao a las enfermedades
(BAILEY et al. 2008; GALARZA et al. 2015).
(SUAREZ y CABRALES. 2008), pudo establecer que durante los

8 días de evaluación in vitro, se ejerció un efecto antagónico e hiperparásitico
por parte de las cepas de Trichoderma sp., frente las cepas de M. roreri, sólo
tres de las seis cepas de Trichoderma sp., mostraron un alto efecto antagónico
frente a M. roreri, tanto en forma micelial como metabólica; Las cepas del
hongo antagónico fueron identificadas como Trichoderma asperellum y
Trichoderma longibrachiatum.
(TONDJE, 2007) se utilizarón placas precolonizadas y ensayos de

mazorcas de cacao desprendidas para seleccionar aislados de hongos,
en busca de micoparasitismo en P. megakarya. De más de 200 aislamientos
evaluados, solo los aislamientos 659-7, PR10, PR11 y PR12 de Trichoderma
asperellum fueron capaces de presentar micoparasitismo necrotrófico en
ambos ensayos. Ensayos adicionales de micoparasitismo in vitro demostraron
que T. asperellum 659-7, PR10, PR11, PR12 eran micoparásitos
en Phytophthora capsici , Phytophthora citrophthora y Phytophthora
palmivora.
Los aislamientos utilizados en el estudio fueron los aislamientos

T2 y T4 de T. asperellum, los aislamientos T15 y T16 de T. longibrachiatum y
los aislamientos T1 y Tv de T. virens. T1, T2, T4 y Tv colonizaron
completamente y destruyeron el micelio de Phytophthora tropicalis y
Phytophthora palmivora en ensayos en placa precolonizadas. Los seis
- 25 -
aislamientos redujeron P. tropicalis, pero ninguno redujo el crecimiento de P.

palmivora en ensayos de placa dual. El aislado Tv de T. virens fue el único
aislado que se observó enrollado alrededor del micelio de P. tropicalis e
interrumpió la formación de esporangios de P. palmivora. (SRIWATI et al.
2015).
II.5.5. Promoción de crecimiento en plantones de cacao
Se tuvo como objetivo, determinar la influencia de cepas de

Trichoderma sp endófito en el crecimiento de plantones de cacao (Theobroma
cacao L.) en invernadero, usando el clon de cacao IMC-67. En la investigación,
se realizaron tres inoculaciones con cepas de Trichoderma sp vía drench, la
primera el día de la siembra, la segunda a los 45 días después de la siembra
(dds), y la tercera fue a los 90 dds, usando una suspensión de 1x10 6 ufc/gr de
suelo. De acuerdo a los resultados obtenidos en plantones de 4 meses, se
concluye que: el Tratamiento 4, correspondiente a la cepa endófito
Trichoderma.-126, influenció de manera positiva en el crecimiento y desarrollo
vegetativo de los plantones de cacao en invernadero, ya que esta cepa tuvo un
comportamiento como promotor del crecimiento y desarrollo vegetativo,
permitió obtener estadísticamente plantas con mayor altura, mayor diámetro de
tallo, mayor área foliar y mayor longitud radicular Asimismo el aislamiento
endófito T-22 estadísticamente presentó plantas similares al T4, en la variable,
diámetro de tallo, siendo superior en número total de hojas y mayor biomasa.
(PICHIS, 2013).
(TRIGOZO, 2012), con el objetivo de determinar la influencia de

especies de Trichoderma endófito (TE) sobre el crecimiento e inducción de
resistencia al estrés hídrico en cacao (Theobroma cacao L.) se evaluaron 12
aislamientos de TE provenientes de cacao nativo. Para la colonización
endofítica de las plántulas de cacao se empleó dos métodos de inoculación,
M1: semilla, y M2: infestación en suelo concentración de 1 x 10 7 ufc.gs-1. Así
mismo, los valores más altos en plántulas de 32 días, para tasa de crecimiento
- 26 -
(TC), diámetro de tallo (DT), longitud de raíz (LR), número de hojas (NH), peso
seco aéreo (PS-A) y peso seco radicular (PS-R) se dieron con el M1; altura de
planta (AP), altura hipocotilo (AH) y altura epicotilo (AE) con el M2; siendo, los
aislamientos TE-17, TE-72, TE-39 y TE-126 generaron mayor tasa de
crecimiento a comparación del control. Sin embargo, TE-81 generó mayor
altura de planta, hipocotilo, epicotilo y número de hojas, TE-72 generó mayor
diámetro de tallo y TE-22 mayor longitud de raíz. Sin embargo, para el peso
seco de raíz (PS-R) y parte aérea (PS-A) de las plantas, TE-22 y TE-81
resultaron mejores, a comparación del control.
La colonización endofítica de plantas de cacao por T.

stromaticum no resultó en promoción del crecimiento de las plantas ni indujo
resistencia contra M. perniciosa en plántulas que habían sido tratadas 30 días
antes de la aplicación del patógeno. Este estudio indica que la resistencia
inducida y la promoción del crecimiento no son responsables de la actividad
de T. stromaticum en el biocontrol del patógeno de la escoba de bruja (DE
SOUZA et al., 2008)
(TCHAMENI et al., 2017), este trabajo tuvo como uno de los

objetivos evaluar la capacidad de cuatro aislados diferentes de Trichoderma
asperellum para mejorar el crecimiento del cacao. En experimentos en
macetas, T. asperellum (PR10, PR11, PR12 y PR659-7) a una concentración de
1x106 conidias.ml-1 y una inoculación al momento de la siembra de la semilla,
aumentó significativamente el número de hojas, la altura de la planta, los brotes
y la materia seca de las raíces. De manera similar, también aumentaron la tasa
de clorofila, la absorción de P y las actividades de fosfatasa ácida
- 27 -
III. MATERIALES Y MÉTODOS
III.1. Ubicación
1.
2.
3.
3.1
- 28 -
III.1.1. Lugar de ejecución
La presente tesis, se realizara en el laboratorio e invernadero de

fitopatología de la Facultad de Agronomía de la Universidad Nacional Agraria
de la Selva, del distrito de Rupa Rupa, provincia de Leoncio Prado, región
Huánuco.
III.2. Materiales y equipos
III.2.1. Equipos
- Cámara de flujo laminar

- Autoclaves
- Refrigerador
- Estufas
- Microscopio
- Incubadoras
- Balanza digital
- Cocina eléctrica
III.2.2. Materiales
a) Laboratorio
- Placas petri
- Vaso de precipitación.
- Piseta
- Asa de siembra en aro
- Lámina Porta y cubre objeto
- Algodón
- Vernier digital
- Saca bocado de 5 mm
- Estilete
- Bisturí
- 29 -
- Guantes
- Mascarillas
- Marcadores indelebles
- Mechero de alcohol
b) Invernadero
- Tubetes T-400
- Bandejas portatubete
- Tierra agrícola franco cernida
- Compost
- Palana
- Azadón
- Carretilla
- Regla milimétrica
- Cuaderno de campo
- Cámara fotográfica
III.2.3. Insumos
- Medio de cultivo PDA (Papa-Dextrosa-Agar)

- Medio de cultivo Jugo V-8
- Alcohol etanol de 96º
- Hipoclorito de sodio
- Agua destilada
- Agua destilada estéril.
III.2.4. Material Biológico
- Productos comerciales de hongos de Trichoderma spp.

- Aislamiento local de Trichoderma sp.
- Aislamiento de Phytophthora sp.
- Cepa de Moniliophthora roreri.
- 30 -
- Cepa de Moniliophthora perniciosa.

- Semillas de cacao
III.3. Efecto antagónico in vitro de las cepas de Trichoderma spp. frente a

Phythophtora sp., Moniliophthora roreri y Moniliophthora perniciosa
III.3.1. Componentes en estudio
a) Cepas de Trichoderma spp.
Cuadro 1. Información de las cepas de Trichoderma spp. en estudio
N NOMBRE
ESPECIE PROCEDENCIA FORMULACION
° COMERCIAL
1 Trichomax T. viride Trujillo, Perú Impreg. en maíz
2 Tricho-D T. harzianum Villavicencio, Colombia Polvo mojable
3 T34 Biocontrol T. asperellum Barcelona, España Polvo mojable
4 Trichosil 50 WP T. harzianum Bangkok, Tailandia Polvo mojable
5 Aislamiento local T. harzianum Tingo María, Perú Impreg. en arroz
b) Fitopatógeno del cultivo de cacao
 Phytophthora sp.
 Moniliophthora roreri
 Moniliophthora perniciosa
c) Medio de cultivo:
Papa Dextrosa Agar (PDA) y el medio a base de jugo V-8

agar clarificado, dispuestos en placas petri de 9 cm de
diámetro.
III.3.2. Tratamientos en estudio
Los tratamientos en estudio será la combinación de cada uno de

los factores, en total se tendrá 23 tratamientos (Cuadro 2).
- 31 -
Cuadro 2. Tratamientos en estudio.
Clave Tratamientos
T1 T34 Biocontrol® (T. asperellum) vs Phytophthora sp.
T2 T34 Biocontrol® (T. asperellum) vs Moniliophthora roreri
III.3.3. T3 T34 Biocontrol® (T. asperellum) vs Moniliophthora perniciosa Di
T4 T34 Biocontrol® (T. asperellum) - Testigo 1
se
T5 Trichomax® (T. viride) vs Phytophthora sp.
T6 Trichomax® (T. viride) vs Moniliophthora roreri ño
T7 Trichomax® (T. viride) vs Moniliophthora perniciosa
T8 Trichomax® (T. viride) - Testigo 2
T9 Trichosil® (T. harzianum) vs Phytophthora sp.
T10 Trichosil® (T. harzianum) vs Moniliophthora roreri
T11 Trichosil® (T. harzianum) vs Moniliophthora perniciosa
T12 Trichosil® (T. harzianum) - Testigo 3
T13 Tricho D® (T. harzianum) vs Phytophthora sp.
T14 Tricho D® (T. harzianum) vs Moniliophthora roreri
T15 Tricho D® (T. harzianum) vs Moniliophthora perniciosa
T16 Tricho D® (T. harzianum) - Testigo 4
T17 Aislamiento Local (T. harzianum) vs Phytophthora sp.
T18 Aislamiento Local (T. harzianum) vs Moniliophthora roreri
T19 Aislamiento Local (T. harzianum) vs Moniliophthora
perniciosa
T20 Aislamiento Local (T. harzianum) - Testigo 5
T21 Phytophthora sp. - Testigo 6
T22 Moniliophthora roreri - Testigo 7
T23 Moniliophthora perniciosa - Testigo 8
experimental
Se empleará el diseño Completamente al Azar (DCA) con conformando

23 tratamientos (incluido ocho testigos), con un numero de 10 repeticiones, formando
un total de 230 unidades experimentales (cada unidad experimental representa
una placa petri de 9 cm de diámetro). El comportamiento de los tratamientos
se someterá al análisis de varianza y se realizará la prueba de Duncan, con
una confianza de 5 %.
Cuadro 3. Cuadro de análisis de varianza del diseño experimental.

Análisis de varianza GL GL
Tratamientos t-1 22
Error experimental t (ri – 1) 207
- 32 -
Total t*ri – 1 229

Se plantea el siguiente modelo aditivo lineal:
Y ij = μ+ τ i + ε ij
Dónde:
Yij = Es el efecto antagónico obtenida en la j-esima repetición, sujeta
a la aplicación del i-ésima tratamiento
µ = Efecto de la media general.
Ƭi = Efecto del i-ésimo tratamiento
Ɛij = Efecto aleatorio del error experimental obtenida en la j-ésima

repetición a la cual se le aplicó la i-ésima tratamiento
Para:
i = 1, 2, 3, 4,… 23 tratamiento
j = 1, 2, 3, 4,…10 repeticiones.
III.3.3.1. Características del experimento.
Cuadro 4. Características generales del experimento (DCA)
Descripción Indicador
Repeticiones 10
Tratamientos 23
N° de unidades experimentales 230
Área de la unidad experimental 63.62 cm2
Placas por repetición 1 de 9 cm de diámetro c/u
Número de placas petri a evaluar 230
III.3.3.2. Croquis de los tratamientos
Los tratamientos en estudio son 23, conformado por 15

interacciones y 8 testigos sin confrontación (donde se inoculara las cinco cepas
de Trichoderma spp, Phythophtora sp., Moniliophthora roreri y Moniliophthora
- 33 -
perniciosa cada uno en sus placas petri respectivamente) con un número de 10

repeticiones, donde harán un total de 230 unidades experimentales y se
presentará de forma aleatoria (Figura 1).
TRATAMIENTOS
R1 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 . T23
.
.
T1 T3 T6 .
REPETICIONES
R2 T2 T4 T5 T7 T23
.
.
R3 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 . T23
. .
. . . . . . . .
. .
. . . . . . . . .
. . . . . . . . . .
.
R10 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 . T23
.
.
Figura 1. Croquis experimental
III.3.4. Metodología
III.3.4.1. Preparación de medios de cultivo
Para el desarrollo de las pruebas se prepararán medios

de cultivo como: Papa Dextrosa Agar (PDA) según (FRENCH y HERBERT,
1982).y el medio a base de jugo V-8 agar clarificado según (PICHIS, 2013)
III.3.4.2. Aislamiento de las cepas de Trichoderma spp.
El aislamiento local proporcionado por el Laboratorio de

Fitopatología se replicarán en placas de petri con medio PDA; empleándose la
técnica propuesto por FRENCH (1982) citado por (MERCEDES L. I. 2009)
El aislamiento de Trichoderma spp. de los productos

comerciales T34 Biocontrol® (Trichoderma asperellum), Trichomax®
(Trichoderma viride), Trichosil® (Trichoderma harzianum), Tricho D®
- 34 -
(Trichoderma harzianum), se realizará utilizando 0.1g del producto comercial en

un medio artificial de PDA (Papa Dextrosa Agar).
Las placas sembradas, se incubarán a temperatura

ambiente, una vez que el hongo coloniza toda la placa petri, se procederá al
reaislamiento en placas petri con PDA. A partir de cultivos puros se utilizará en
pruebas de eficiencia in vitro. Las placas petri con evidencia de contaminación
por bacterias u otros hongos serán desechadas.
III.3.4.3. Aislamiento de Phythophtora sp.
Se colectarán mazorcas de cacao que presentan

síntomas típicos de infección provocado por Phythophtora sp., los cuales serán
trasladados al laboratorio de fitopatología de la UNAS, para su aislamiento. Se
emplearan muestras de tejido vegetal de la región de transición entre tejido
enfermo y sano, las cuales se sembrarán en placas petri con medio de cultivo
jugo agar V8 empleando la metodología establecida por (MATOS et al. 2011).
A partir de estos cultivos se reaislarán para obtener cultivos puros.
III.3.4.4. Aislamiento de Moniliophthora roreri
Se obtendrán de mazorcas de cacao infectadas con

“Moniliasis”, los cuales serán trasladados al laboratorio de fitopatología de la
UNAS. Para el aislamiento de Moniliophthora roreri se empleará la metodología
establecida por (MERCEDES, 2009), donde se utilizará un medio de cultivo
PDA. A partir de estos cultivos se reaislarán para obtener cultivos puros.
III.3.4.5. Aislamiento de Moniliophthora perniciosa
Se colectarán escobas vegetativas verdes, síntomas

típicos de infección provocado por Moniliophthora perniciosa los cuales serán
trasladados al laboratorio de fitopatología de la UNAS, para el aislamiento de
- 35 -
Moniliophthora roreri se empleará la metodología establecida

por (NIRENBERG, 1976) citado por (PÁRRAGA, 2017).
III.3.4.6. Enfrentamiento de Trichoderma spp., vs patógenos

del cacao (Moniliophthora roreri, Moniliophthora
perniciosa, Phytophthora sp.)
Las pruebas de enfrentamiento se realizarán empleando

la técnica de siembra duales (HOWELL, 2003) en placas petri de 9 cm de
diámetro. Discos de 5 mm de diámetro con micelio de M. roreri, M. perniciosa y
Phytophthora sp; serán colocados en un extremo a 1.5 cm del borde de las
placas petri con PDA. . Las placas inoculadas se incubarán durante 7 días para
M. roreri, 1 día, para M. perniciosa y 2 días para Phytophthora sp; para
establecer la colonia. Posteriormente la colonia de las cepas patógenas serán
confrontada con el micoparásito, para lo cual, discos de 5mm de diámetro de
las cepas de Trichoderma con micelio de 4 días de crecimiento serán
colocados en el extremo opuesto de la placa petri.
Como testigos se sembrará individualmente en placas

petri separadas, un inóculo de cada aislado de Trichoderma spp (T4, T8, T12 y
T16) y un inoculo de cada cepa patógena (T21, T22 y T23). Todas las placas petri
se incubarán, hasta que el crecimiento del antagonista o del patógeno cubriera
toda la superficie del medio de cultivo. Se rotularán las placas petri de acuerdo
a cada una de los tratamientos, incluyendo la fecha, todo este proceso se
realizará en la cámara de flujo laminar dentro de la cual además habrá un
mechero prendido.
III.3.4.7. Interacción hifal de Trichoderma spp., vs patógenos

del cacao (Moniliophthora roreri, Moniliophthora
perniciosa, Phytophthora sp.)
- 36 -
Para establecer el tipo de interacción hifal de las

siembra duales, se tomarán tres muestras de la zona de interacción de
Trichoderma spp frente a las cepas patógenas por cada réplica y se colocarán
en portaobjetos sobre una gota de lactofenol. Las observaciones se realizarán
en microscopio óptico binocular a aumento 400x. (PÉREZ et al., 2020)
III.3.4.8. Determinación de la concentración de conidias de

las cepas de Trichoderma spp.
De las placas que contenían cada uno de los

aislamientos puros se extraerán 3 rodajas de 5 mm de diámetro y se colocarán
sobre 100 g de sustrato arroz estéril en bolsas de polipropileno. Cada bolsa
será incubada a temperatura ambiente por 10 días bajo luz artificial. Después
de los 10 días de incubación, se extraerán de cada bolsa 1 g de sustrato
colocándolos en 9 ml de ADE (agua destilada estéril), a partir del cual se
realizarán diluciones seriadas. La cuantificación de la concentración de
conidias se realizará empleando una cámara de contaje de Levi, que tiene un
rayado Neubaver, para ello se siguió la metodología descrita por (FRENCH,
1981) citado por (PISCO, 2012).
III.3.5. Parámetros a evaluar
III.3.5.1. Ritmo de crecimiento micelial de las cepas de

Trichoderma spp. y cepas patógenas
Se evaluarán las placas petri de los testigos de las

cepas de Trichoderma spp. (T4, T8, T12 y T16) y de las cepas patógenas (T21,
T22 y T23). Las mediciones se realizarán siguiendo la metodología descrita por
(FRENCH y HEBERT, 1982) (Figura 2). Esta metodología consiste en dibujar
en la cara posterior de la placa petri, una cruz indicando cuatro radios
equidistantes a partir del centro, a los cuales se les nombrarán con números (1,
2, 3 y 4) enumerando cada radio a favor de las manecillas del reloj, y sobre los
que se medirá el avance o crecimiento del hongo a intervalos de tiempo
- 37 -
iguales. El centro de la cruz se nombrará con una letra mayúscula para cada
replica, el cual representa el punto de inoculación del hongo a evaluar. Las
mediciones se dejarán de realizar en cada placa, cuando el crecimiento del
hongo alcanza el borde del plato petri, en al menos uno de los cuatro radios. La
toma de datos del crecimiento radial se realizará cada 12 horas, utilizando una
regla milimetrada. La variable que se medirá es el incremento radial promedio
de la colonia del patógeno y antagonista expresado en mm h -1 y se calculará
dividiendo el crecimiento total en milímetros entre el tiempo transcurrido en
horas.
Figura 2. Metodología de medición del radio de crecimiento (FRENCH y

HEBERT, 1982)
III.3.5.2. Crecimiento de las cepas de Trichoderma spp., vs

fitopatógenos
Los datos de competencia de los aislados de

Trichoderma spp se obtendrán midiendo con una regla estandarizada en
milímetros el avance del radio de crecimiento micelial de las colonias de
Trichoderma spp., y sus respectivas colonias patógenas confrontadas, para
obtener una medida de radio de crecimiento en mm/h. Las evaluaciones se
realizarán cada 24 horas (PÁRRAGA y ZAMBRANO, 2012).
III.3.5.3. Tiempo de contacto antagonista-patógeno

- 38 -
Es el lapso de tiempo (número de días) en el cual la

colonia del hongo antagonista y el hongo patógeno entran en contacto (CALVO
et al., 2012) citado por (MEJIA y ALVARADO, 2016)
III.3.5.4. Porcentaje de inhibición de crecimiento radial de los

patógenos
Se determinará el porcentaje de inhibición de las cepas

patógenas en base al crecimiento radial del micelio de los controles de los
patógenos con respecto a los enfrentamientos entre Trichoderma spp., y los
patógenos, usando la siguiente formula (MARTÍNEZ et al., 2008) citado por
(SANCHEZ, 2009):
PICR = [(R 1- R2) / R1] x 100
Donde:
R1 = Crecimiento radial del testigo del patógeno
(mm).
R2 = Crecimiento radial del patógeno frente a
Trichoderma spp (mm).
III.3.5.5. Porcentaje de aceleración de crecimiento radial de

Trichoderma spp.
Para determinar si Trichoderma spp. presenta un

incremento en su crecimiento cuando esta frente a los patógenos en relación a
su testigo, se empleará la siguiente formula (SANCHEZ, 2009):
PACRT = [(R 1- R2) / R1] x 100
Donde:
R1 = Crecimiento radial del testigo de Trichoderma
spp. (mm).
- 39 -
R2 = Crecimiento radial del Trichoderma spp. frente

al patógeno (mm).
III.3.5.6. Competencia por el sustrato
Se evaluará de acuerdo a la escala de (BELL et al.,

1982) citado por (MEJIA y ALVARADO, 2016), es el espacio que ocupa en el
sustrato el hongo antagonista y/o patógeno en enfrentamiento dual, incluyendo
el medio de cultivo y la colonia del hongo adversario (Cuadro 5).
Cuadro 5. Grado de antagonismo de agentes de control biológico respecto a la

competencia por sustrato, propuesta por (BELL et al., 1982).
Grado
Capacidad antagónica (Competencia)
antagónico
1 Antagonista ocupa completamente la superficie del medio de
cultivo cubriendo totalmente al patógeno.
Antagonista llega a sobrepasar las dos terceras partes de la
2
superficie del medio de cultivo.
Antagonista y el patógeno colonizan cada uno aproximadamente
3 la mitad de la superficie del medio y ninguno parece dominar al
otro.
Patógeno sobrepasa al crecimiento del antagonista colonizando
4
dos terceras partes de la caja Petri.
5 Patógeno llega a cubrir totalmente el plato Petri.
III.3.5.7. Invasión de las cepas de Trichoderma spp sobre los

patógenos
Se medirá con una regla estandarizada en milímetros, la

invasión de la superficie de las cepas de Trichoderma sobre cada uno de los
hongos fitopatógenos, al momento en que entran en contacto entre sí, las
mediciones se registrarán cada 24 h, hasta que el testigo cubra la superficie de
la placa petri. Luego se calculará el porcentaje de invasión (JARAMILLO, 2014)
y finalmente los porcentajes se asociarán a la escala creada por (ELIAS y
ARCOS, 1984) citado por (EZZIYYANI et al., 2004) (Cuadro 6).
- 40 -
Cuadro 6. Escala de evaluación de la capacidad antagónica (micoparasitismo),

de acuerdo a la medida de la invasión de la superficie, colonización y
esporulación del antagonista sobre los hongos fitopatógenos.
Grado Capacidad antagónica (Micoparasitismo)

Ninguna invasión de la superficie de la colonia del hongo
0 patógeno.
1 Invasión ¼ de la superficie de la colonia del hongo patógeno.
2 Invasión ½ de la superficie de la colonia del hongo patógeno.
3 Invasión ¾ de la superficie de la colonia del hongo patógeno.
Invasión total de la superficie de la colonia del hongo patógeno
4
esporulación sobre ella.
III.3.5.8. Tipos de Interacción hifal
Para comprobar el micoparasitismo, por medio de

microscopía, se analizará las interacciones hifales entre los antagonistas con
los patógenos, ya sea por: adhesión, enrollamiento, penetración, vacuolización,
lisis y granulación del citoplasma. (PÉREZ et al., 2020)
III.4. Influencia de cepas de Trichoderma spp. sobre el crecimiento de

plantones de cacao
III.4.1. Componentes en estudio
a) Cepas de Trichoderma spp.
Cuadro 7. Información de las cepas de Trichoderma spp. en estudio

N NOMBRE ESPECIE PROCEDENCIA FORMULACION
° COMERCIAL
1 Trichomax T. viride Trujillo, Perú Impreg. en maíz
2 Tricho-D T. harzianum Villavicencio, Colombia Polvo mojable
3 T34 Biocontrol T. asperellum Barcelona, España Polvo mojable
4 Trichosil T. harzianum Bangkok, Tailandia Suspensión Conc.
5 Aislamiento local T. harzianum Tingo María, Perú Impreg. en arroz
b) Material Vegetal
- 41 -
Se utilizará semillas de polinización abierta del genotipo IMC –

67, las cuales constituyen los plantones.
c) Sustrato de siembra
Consiste en una mezcla de suelo agrícola y compost en una

proporción de 3:1 respectivamente.
III.4.2. Tratamientos en estudio
Los tratamientos en estudio será la combinación de cada uno de

los factores, en total se tendrá 10 tratamientos y 2 testigos (Cuadro 8).
Factor (A) Cepas de Trichoderma sp.
a1 = T34 Biocontrol® (Trichoderma asperellum)

a2 = Trichomax® (Trichoderma viride)
a3 = Trichosil® (Trichoderma harzianum)
a4 = Tricho D® (Trichoderma harzianum)
a5 = Aislamiento local (Trichoderma harzianum)
Factor (B) Condición de sustrato
b1 = Sustrato esterilizado
b2 = Sustrato no esterilizado
Cuadro 8. Tratamientos en estudio.
Clave Tratamientos Descripción
T34 Biocontrol (T. asperellum) inoculado en sustrato

T1 a 1b 1
esterilizado.
T34 Biocontrol (T. asperellum) inoculado en sustrato no
T2 a 1b 2
esterilizado.
T3 a 2b 1 Trichomax (T. viride) inoculado en sustrato esterilizado.
Trichomax (T. viride) inoculado en sustrato no
T4 a 2b 2
esterilizado.
T5 a 3b 1 Trichosil (T. harzianum) inoculado en sustrato
- 42 -
esterilizado
Trichosil (T. harzianum) inoculado en sustrato no
T6 a 3b 2
esterilizado.
Tricho D (T. harzianum) inoculado en sustrato
T7 a 4b 1
esterilizado
Tricho D (T. harzianum) inoculado en sustrato no
T8 a 4b 2
esterilizado.
Aislamiento local (T. harzianum) inoculado en sustrato
T9 a 5b 1
esterilizado.
Aislamiento local (T. harzianum) inoculado en sustrato
T10 a 5b 2
no esterilizado.
T11 Testigo 1 Agua destilada aplicada al sustrato esterilizado.
T12 Testigo 2 Agua destilada aplicada al sustrato no esterilizado.
III.4.3. Diseño experimental
Se empleará el diseño completamente al azar (DCA) con arreglo factorial

de 5 x 2 + 2 conformando 12 tratamientos (incluido dos controles), se empleó 10
repeticiones por tratamiento, formando un total de 120 unidades experimentales (cada
unidad experimental representa 1 plantón de cacao). Los datos del comportamiento de
los tratamientos serán procesados con el programa estadístico INFOSTAT (DI
RIENZO, et al. 2011) y para comparar las medias se utilizará la prueba de Duncan con
un coeficiente de significancia de p=0,05.
Cuadro 9. Cuadro de análisis de varianza del diseño experimental.
Análisis de varianza GL GL
Tratamientos (a*b)-1 9
A (a-1) 4
B (b-1) 1
AxB (a-1)*(b-1) 4
Error experimental (a*b(r-1) 90
Total (a*b*r)-1 99
- 43 -
Se plantea el siguiente modelo aditivo lineal:
Y ijk =μ +α i + β j + ( αβ )ij +ε ijk

Dónde:
Yijk = Es la respuesta obtenida en el k-ésimo repetición, a la

cual se aplicó la i-ésima cepa de Trichoderma spp, con el j-
ésima condición de sustrato.
µ = Efecto de la media general.
αi = Efecto de la i-ésima cepa de Trichoderma spp.
βj = Efecto del j-ésimo condición de sustrato.
(αβ)ij = Efecto de la interacción del i-ésimo cepa de Trichoderma

spp. con la j-ésimo condición de sustrato.
Ɛijk = Efecto aleatorio del error experimental obtenida en el k-

ésimo repetición a la cual se le aplicó la i-ésima cepa de
Trichoderma spp, con el j-ésima condición de sustrato.
Para:
i = 1, 2, 3, 4, 5 Trichoderma spp.
j = 1, 2 condición de sustrato.
k = 1, 2, 3,…10 repeticiones.
III.4.3.1. Características del experimento.
Cuadro 10. Características generales del experimento (DCA)
Descripción Indicador
N° tratamientos 12
N° repeticiones 10
N° plantones por unidad exp. 1
- 44 -
N° total de plantones a evaluar 120

Área de la unidad experimental 19.64 cm2
Volumen de sustrato por U.E 345 cm3
III.4.3.2. Croquis de los tratamientos
La investigación consta de 12 tratamientos, de los cuales

dos son testigos a los que no se aplicarán ningún inoculo de Trichoderma spp.
y al resto de los tratamientos se aplicarán según el cuadro 8. Cada tratamiento
constara de 10 repeticiones, y la unidad experimental lo conformará un plantón.
Los tratamientos se distribuirán de forma aleatoria (Figura 3).
TRATAMIENTOS
R1 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 . T12
.
.
T1 T3 T6
REPETICIONES
R2 T2 T4 T5 T7 . T12
.
.
R3 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 . T12
.
. . . . . . . . .
.
. . . . . . . . . .
. . . . . . . . . .
.
R10 T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 . T12
.
.
Figura 3. Croquis experimental
III.4.4. Metodología
III.4.4.1. Preparación de medios de cultivo
Se preparará el medio de cultivo: Papa Dextrosa Agar

(PDA) según (FRENCH y HERBERT, 1982).
III.4.4.2. Aislamiento de las cepas de Trichoderma spp.

- 45 -
El aislamiento local proporcionado por el Laboratorio de

Fitopatología se replicarán en placas de petri con medio PDA; empleándose la
técnica propuesto por FRENCH (1982) citado por (MERCEDES L. I. 2009)
El aislamiento de Trichoderma spp. de los productos

comerciales T34 Biocontrol® (Trichoderma asperellum), Trichomax®
(Trichoderma viride), Trichosil® (Trichoderma harzianum), Tricho D®
(Trichoderma harzianum), se realizará utilizando 0.1g del producto comercial en
un medio artificial de PDA (Papa Dextrosa Agar).
Las placas sembradas, se incubarán a temperatura

ambiente, una vez que el hongo coloniza toda la placa petri, se procederá al
reaislamiento en placas petri con PDA. A partir de cultivos puros se utilizará en
la producción de Trichoderma spp. Las placas petri con evidencia de
contaminación por bacterias u otros hongos serán desechadas.
III.4.4.3. Producción de aislamiento de Trichoderma spp.
De cada aislamiento reactivado se extraerá 3 rodajas de

5 mm de diámetro y se colocarán sobre 100 g de sustrato arroz estéril en
bolsas de polipropileno. Cada bolsa con arroz inoculada, se incubará a
temperatura ambiente por 10 días bajo luz artificial. (PISCO, 2012).
III.4.4.4. Determinación de la concentración de conidias de

las cepas de Trichoderma spp.
Después de los 10 días de incubación de las bolsas con

arroz inoculada, se extraerán de cada bolsa 1 g de sustrato colocándolos en 9
ml de ADE (agua destilada estéril), a partir del cual se realizarán diluciones
seriadas (PISCO, 2012). La cuantificación de la concentración de conidias se
realizará empleando una cámara de contaje de Levi, que tiene un rayado
- 46 -
Neubaver, para ello se siguió la metodología descrita por (FRENCH, 1981)

citado por (PISCO, 2012).
III.4.4.5. Preparación del sustrato
El sustrato consistirá en una mezcla de suelo agrícola y

compost en una proporción de 3:1 respectivamente, con la finalidad de mejorar
la fertilidad del sustrato y brindar condiciones favorables para el crecimiento de
los aislamientos de Trichoderma sp. (PICHIS, 2013).
III.4.4.6. Esterilización del sustrato
EL sustrato estéril que se empleará para un número de

tratamientos, se obtendrá mediante la esterilización en una autoclave vertical, a
una temperatura de 120ºC, a una presión de 15 lbs., por un tiempo de 60
minutos. (PICHIS, 2013).
III.4.4.7. Uso y llenado de tubetes
Se usarán tubetes redondos T345 con una altura de 19.5

cm y volumen de 345 cm 3. El llenado de los tubetes con los dos tipos de
sustrato se hará a mano, en primera instancia se llenará hasta la mitad, luego
se sacude para eliminar los vacíos de aire y darle cierta compactación para
luego llenarlo al 100%.
III.4.4.8. Infestación del sustrato con cepas de Trichoderma

spp.
Las concentraciones de las cepas de Trichoderma spp.,

se ajustarán a una proporción de 1x10 8 ufc.gs-1. El sustrato estéril y no estéril
distribuidos en los tubetes de acuerdo a los tratamientos respectivos, se
infestará con soluciones de cada uno de los inóculos de Trichoderma spp. en
estudio a la concentración ya mencionada, durante el momento de la siembra.
- 47 -
Las soluciones se aplicarán via drench con un volumen de agua que permita
mantener al suelo en capacidad de campo (CC). Para los testigos, el sustrato
esterilizado y no esterilizado recibirá agua destilada, durante el momento de la
siembra.
III.4.4.9. Selección y pre-germinación de semilla de cacao.
Las semillas de cacao se obtendrán de mazorcas del

clon IMC-67, se seleccionarán semillas vigorosas, de la parte central del fruto,
posteriormente se extraerá el mucílago, se desinfectará con hipoclorito al 2% y
se lavará con ADE; luego las semillas serán colocadas en bandejas con aserrín
estéril y en capacidad de campo para la germinación, por un período de cuatro
días. (PICHIS, 2013).
III.4.4.10. Siembra de semillas de cacao
Se sembrarán de manera aséptica 120 semillas pre-

germinadas de cacao del clon IMC – 67; el mismo día que se realizará la
inoculación vía drench de las cepas de Trichoderma spp. a los tratamientos
correspondientes. Luego se cubrirá cada tubete por 15 días para evitar
contaminación y diseminación de esporas entre aislamientos.
III.4.4.11. Manejo agronómico de plantones de cacao en

invernadero
El riego se realizará de forma manual y localizada, a

partir de controles diarios, las plantas recibirán 100 ml de agua destilada para
mantener el sustrato a capacidad de campo, durante 2.5 meses. El control de
malezas en los tubetes se hará de manera manual.
III.4.5. Parámetros a evaluar

- 48 -
Para la evaluación se realizarán evaluaciones biométricas (cada 7 días)

de los plantones, hasta los 75 días. El valor de cada parámetro se obtendrá del
promedio de 10 unidades experimentales por cada tratamiento. Se evaluará los
parámetros como:
III.4.5.1. Altura planta
Se registrará la altura desde la base del tallo hasta el ápice de la

planta, con ayuda de una regla metálica milimetrada de 60 cm.
III.4.5.2. Número de hojas
Se realizará la cuantificación de las hojas, de cada uno de las

repeticiones de los tratamientos.
III.4.5.3. Diámetro de tallo
Se registrará el diámetro de tallo con ayuda de un vernier

digital a una altura de 2 centímetros de la base del tallo.
Asimismo al cumplirse los 75 días de evaluación, se procederá a

sacrificar los plantones y se evaluara otros parámetros. El valor de cada parámetro
se obtendrá del promedio de 10 unidades experimentales por cada tratamiento.
Se realizará las siguientes evaluaciones:
III.4.5.4. Longitud radicular
Se eliminará las bolsas de las plántulas y se colocarán en un

balde con agua destilada hasta separar los restos de suelos de las raíces. Se determinará
tomando la planta y midiendo desde el cuello de raíz hasta el extremo más distal de la
raíz de la planta.
- 49 -
III.4.5.5. Volumen radicular
Se utilizará para ello una probeta con un volumen

determinado de agua destilada (V1), se introducirá la plántula hasta el cuello de
la raíces previamente lavada, se medirá el volumen (V2) y por diferencia de
ambos volúmenes (V1 – V2) se obtendrá el volumen de la raíz.
III.4.5.6. Peso fresco total, de la raíz y parte aérea
Se tomará la planta y se le seccionará por el cuello de la

raíz, para posteriormente, y mediante el uso de una balanza electrónica, tomar
el registro del peso de cada una de las partes. El peso fresco total se obtendrá
de la suma de los datos de ambas partes.
III.4.5.7. Peso seco total, de la raíz y parte aérea
Se tomarán los tejidos seccionados por el cuello de la

raíz y se llevarán a una en una estufa por un tiempo de 3 días a 72 ºC, para luego de
esto se determinará el peso seco de cada una de las partes. El peso seco total
se obtendrá de la suma de los datos de ambas partes.
III.4.5.8. Análisis económico de los tratamientos
Para realizar el análisis económico de esta investigación

en sus respectivos tratamientos, se utilizará la relación beneficio/costo, para lo
cual se considerará lo siguiente:
a) Ingreso bruto por tratamiento
Este rubro se obtendrá por los valores totales en la

etapa de investigación para lo cual se plantea la siguiente fórmula:
- 50 -
IB =Y x PY
Donde:
IB = Ingreso Bruto
Y = Producto
PY = Precio del Producto
b) Costos totales por tratamiento
Se sacará mediante la suma de los costos fijos y

variables, empleando la siguiente fórmula:
CT = CF + CV
Donde:
CT = Costos Totales
CF = Costos Fijos
CV = Costos Variables
c) Beneficio neto (BN)
Se establecerá mediante la diferencia entre los

ingresos brutos y los costos totales.
BN = IB – CT
Donde:
BN = beneficio neto
IB = ingreso bruto
CT = costos totales
d) Relación Beneficio Costo
Mediante la siguiente fórmula se sacará la relación

beneficio costo.
- 51 -
R B/C = BN/ CT
Donde:
R B/C = relación beneficio costo
BN = beneficio neto
CT = costos totales
- 52 -
IV. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

Cuadro 11. Cronograma de actividades para el desarrollo del trabajo de investigación.
2021
Actividades/mes Abril Mayo Junio Julio Agosto Setiembre Octubre Noviembre Diciembre
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
Elaboración del proyecto x x x x x
Presentación del proyecto x
Aprobación del proyecto x
Ejecución del proyecto x
Recolección de frutos con moniliasis y pudrición parda x
Recolección de basidiocarpos de M. perniciosa x
Obtención de cepas de Trichoderma x
Preparación de medios de cultivos x
Aislamiento de cepas patógenas x x
Aislamiento de cepas de Trichoderma x x
Enfrentamiento de Trichoderma spp., vs. patógenos x x
Interacción hifal de Trichoderma spp., vs. patógenos x
Producción de aislamiento de Trichoderma spp. x
Determinación de la concentración de conidias de Trichoderma
spp.
x
Evaluación in vitro de los efectos antagonistas de Trichoderma spp. x x x
Preparación y esterilización del sustrato x
Llenado de tubetes x
Selección y pre-germinación de semilla de cacao. x
Siembra de semillas de cacao x
Infestación del sustrato con cepas de Trichoderma spp. x
Manejo de vivero x x x x x x x x x x x
Evaluación de parámetros de crecimiento de los plantones x x x x x x x x x x
Visita del jurado x x
Tabulación de datos x x
Redacción de tesis x x x x x x x x
Presentación del informe final x
- 53 -
Sustentación de tesis x
- 54 -
V. PRESUPUESTO
El presupuesto del proyecto que se ejecutará, tiene 4 actividades,

llegando a un monto de 5,540.59 soles, como se ve en el cuadro siguiente.
Cuadro 12. Actividad económica para desarrollo del experimento.

Valor
Sub
Actividades Unidad Cant. Unitari Total S/.
total S/.
o S/.
Conducción de los experimentos 495.00
Recolección de muestras de cepas patógenas Jornal 1.00 30.00 30.00
Preparación de medios de cultivo Jornal 1.00 30.00 30.00
Aislamiento de cepas patógenas Jornal 2.00 30.00 60.00
Aislamiento de cepas de Trichoderma Jornal 2.00 30.00 60.00
Siembra dual de Trichoderma vs. patógenos Jornal 2.00 30.00 60.00
Producción de aislamientos de Trichoderma Jornal 2.00 30.00 60.00
Deter. concentración de conidias de Trichoderma Jornal 1.00 30.00 30.00
Limpieza y acondicionamiento del invernadero Jornal 1.00 30.00 30.00
Preparación del sustrato y desinfección Jornal 1.00 30.00 30.00
Llenado y acomodo de tubetes Jornal 1.00 30.00 30.00
Recolección de mazorcas Jornal 0.50 30.00 15.00
Selección y pre-germinación de semilla de cacao Jornal 0.50 30.00 15.00
Preparación de las soluciones de Trichoderma Jornal 0.50 30.00 15.00
Siembra de semillas Jornal 0.50 30.00 15.00
Infestación del sustrato con Trichoderma Jornal 0.50 30.00 15.00
Labores culturales 560.00
Control de malezas Jornal 4.00 30.00 120.00
Riego Jornal 6.00 30.00 180.00
Evaluaciones en laboratorio Jornal 6.00 30.00 20.00
Evaluaciones en invernadero Jornal 8.00 30.00 240.00
Trabajo en gabinete 1,240.00
Tabulación de datos Jornal 10.00 40.00 400.00
Análisis económico Jornal 1.00 40.00 40.00
Redacción de Tesis Jornal 20.00 40.00 800.00
Insumos y Materiales 2741.90
Placas petri Unidad 230.00 2.50 575.00
Vaso de precipitación Unidad 1.00 22.00 22.00
Piseta Unidad 1.00 15.00 15.00
Asa de siembra en aro Unidad 1.00 15.00 15.00
Lámina Porta y cubre objeto Unidad 10.00 2.00 22.00
Paquete algodón de 500 gr Unidad 1.00 15.00 15.00
Saca bocado de 5 mm Unidad 1.00 13.00 13.00
Estilete Unidad 1.00 5.00 5.00
Bisturí Unidad 2.00 1.50 3.00
Paquete de guantes Unidad 1.00 35.00 35.00
Paquete de Mascarillas Unidad 1.00 6.00 6.00
Mechero de alcohol Unidad 1.00 20.00 20.00
Alcohol etanol 96° Litro 1.00 9.00 9.00
Lejía comercial Litro 0.30 9.00 2.40
Rollo de papel toalla Unidad 2.00 2.50 5.00
Capsula de cloranfenicol Unidad 3.00 2.00 6.00
Medio PDA Litro 5.00 20.00 100.00
Medio Jugo V8 Litro 2.00 25.00 50.00
- 55 -
Valor
Sub
Actividades Unidad Cant. Unitari Total S/.
total S/.
o S/.
Botellas de vidrio Unidad 5.00 2.50 12.50
Agua destilada Litro 10.00 1.5 15.00
Tubetes T345 Unidad 120.00 1.50 180.00
Bandejas portatubete Unidad 6.00 30.00 180.00
Tierra agricola Kg 75 0.5 37.50
Compost Kg 25 1.00 25.00
Semillas de cacao Kg 1.00 10.00 10.00
Trichomax Unidad 1.00 80.00 80.00
Tricho-D Unidad 1.00 180.00 180.00
T34 Biocontrol Unidad 1.00 120.00 120.00
T-22 Unidad 1.00 210.00 210.00
Plástico polietileno calibre 400 de color negro Metro 5.00 4.50 22.50
Regla milimétrica Unidad 1.00 3.00 3.00
Vernier digital Unidad 1.00 50.00 50.00
Cuaderno de campo Unidad 1.00 5.00 5.00
Marcadores indelebles Unidad 1.00 5.00 5.00
Cinta métrica Unidad 1.00 8.00 8.00
Banner de tesis Unidad 1.00 40.00 40.00
Encuadernado de volúmenes de tesis Unidad 6.00 90.00 540.00
Otros Unidad 1.00 100.00 100.00
Total, costos directos 5,036.90
Imprevistos 10 % 503.69
Costo total 5,540.59
- 56 -
VI. BIBLIOGRAFÍA
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produces nonanoic acid, an inhibitor of spore germination and mycelial
growth of two cacao pathogens. Physiological and Molecular Plant
Pathology, 67(6); 304-307. [En Linea:] ScienceDirect
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3. ATTARD A., GOURGUES M., GALIANA E., PANABIÈRES F., PONCHET

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I. DATOS GENERALES DE PREGRADO

Universidad : Universidad Nacional Agraria de la Selva

Facultad : Facultad de Agronomía

Título de Tesis : Antagonismo de cepas de Trichoderma spp Pers.

Autor : Bach. Henry Panduro Cerrón

Asesor de Tesis : Ing. Oscar Cabezas Huayllas

Escuela Profesional : Agronomía

Programa de Investigación : Cultivos Tropicales / Fitosanidad

Línea (s) de Investigación : Desarrollar ensayos de eficacia de pesticidas en

Eje temático de investigación : Control de enfermedades en plantas

Lugar de Ejecución : Laboratorio e invernadero de fitopatología de la

Fecha de Inicio : Mayo 2021

Término : Octubre 2021

UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA

ANTAGONISMO DE CEPAS DE Trichoderma spp Pers.

Ejecutor : Bach. Henry Panduro Cerrón

Asesor : Ing. Oscar Cabezas Huayllas

Inicio : Mayo 2021

Culminación : Octubre 2021

TINGO MARÍA – PERÚ

2.5.3.4. Promotor de crecimiento de las plantas......................

3.3.4.8. Determinación de la concentración de conidias de

3.4.4.8. Infestación del sustrato con cepas de

El cacao (Theobroma cacao L.), es un cultivo prioritario en Perú por su

El cultivo de cacao es afectado por enfermedades que causan pérdidas

Nuestros agricultores para el control de estas enfermedades hacen uso

El biocontrol haciendo uso de cepas de Trichoderma spp. es útil para

Ambos mecanismos pueden actuar en forma coordinada y su importancia en el

El uso de Trichoderma spp. reduciría las posibilidades de utilización de

I.1. Hipótesis planteada para el proyecto:

H0: Existe efecto de una de las cepas de Trichoderma spp. como

H1: No existe efecto de una de las cepas de Trichoderma spp.

I.2. Objetivo general

Evaluar el antagonismo de cepas de Trichoderma spp.

I.2.1. Objetivos específicos

1. Determinar los efectos antagónicos de cinco cepas de

2. Determinar la eficiencia de cinco cepas de Trichoderma spp.

II. REVISIÓN DE LITERATURA

II.1. Generalidades sobre el cacao

II.1.1. Origen y distribución

Estudios más recientes confirman que la región alta del

II.1.2. Importancia socio-económica del cacao

El cacao es un cultivo estrictamente tropical, pero se elabora y

En el año 2019, la producción de cacao en Perú alcanzó a 135,9

La clasificación taxonómica según (CRUZ y LINA, 2007) es la

II.1.4. Requerimientos ambientales

Es una planta que prospera bien bajo sombra; sin embargo

II.1.5. Principales enfermedades del Cacao

La pudrición parda (causado por Phytophthora spp.), moniliasis

II.2. Phytophthora sp.

II.2.1. Distribución geográfica

El género Phytophthora se encuentra distribuido en todo el

II.2.2. Clasificación taxonómica

Según (KAOSARI et al., 1978) las especies de Phytophthora

La especie con mayor importancia en sur América es P.

menudo, esta especie produce clamidiosporas con diámetro entre 30-35 µm en

II.2.4. Biología de Phytophthora sp

Phytophthora palmivora y P. megakarya tienen dos tipos de

Los esporangios son capaces de germinar directamente sobre la

Las zoosporas son atraídas por señales de la planta hacia los

periodo aproximado de 48 horas (ATTARD et al. 2008). La colonización del

Durante la reproducción sexual se forman las oosporas por