Tesis Christian BALs Tomate

Bacterias ácido lácticas como biocontroladoras de la marchitez
vascular ocasionada por Fusarium oxysporum y Ralstonia

solanacearum en tomate
Christian David Vargas Baquero
Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias Agrarias, Departamento de Agronomía.
Bogotá, Colombia
2020
Bacterias ácido lácticas como biocontroladoras de la marchitez
vascular ocasionada por Fusarium oxysporum y Ralstonia
solanacearum en tomate
Christian David Vargas Baquero
Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:

Magister en Ciencias Agrarias
Directora:
Ph.D. Carolina González Almario
Codirectora:
Ph.D. Adriana González Almario
Línea de Investigación: Fitopatología
Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias Agrarias
Bogotá, Colombia
2020
Agradecimientos
A mi directora Carolina González, mi codirectora Adriana González y mi asesor
Hugo Jiménez, por su apoyo, direccionamiento y orientación constante. Además de
su paciencia y dedicación en este proceso.
A Alba Marina Cotes por su apoyo incondicional en mi formación y buenos deseos.
A Sandra Milena Ramírez, Lorena Dávila, Edwin Rodríguez y Juan Camilo Ovalle,
por su apoyo, orientación y generosidad de recursos en la ejecución de actividades.
A la Fundación Juan Pablo Gutiérrez Cáceres, Universidad nacional y Agrosavia

por hacer todo esto posible
Resumen y Abstract IX
Resumen
La marchitez vascular en tomate ocasionada tanto por Fusarium oxysporum f. sp.
lycopersici (Fol) como por Ralstonia solanacearum (Rs) llegan a ocasionar pérdidas
superiores al 80% solo con uno de estos patógenos. Además, sumado al hecho,
que ambos microorganismos ocasionan síntomas similares que lleva a la dificultad
del diagnóstico del agente causal, también se ignora, la posibilidad de una posible
coinfección por parte de los dos microorganismos, lo cual conlleva a malas
implementaciones de estrategias de manejo. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo
fue evaluar la actividad antagónica y respuesta de defensa inducida por efecto de
bacterias acidolácticas (BAL) en plantas de tomate frente a los patógenos
vasculares de origen fúngico (Fol) y bacteriano (Rs) en modelos monopatogénicos
y en un modelo de coinfección. Por consiguiente, en el primer capítulo, se
estandarizó el primer modelo de coinfección entre los dos patógenos en tomate
variedad Santa Cruz Kada a partir de dos cepas previamente caracterizadas a nivel
molecular y por su virulencia en plantas de tomate. Se seleccionó un modelo
sincrónico a las concentraciones más altas evaluadas, lo cual permitió la expresión
más temprana de los síntomas. Por otro lado, en el segundo capítulo, mediante el
modelo establecido previamente, se evaluó la eficacia de biocontrol y la expresión
diferencial de genes asociados a rutas de señalización de resistencia sistémica de
una cepa de BAL seleccionada previamente por su alta eficacia a nivel in planta y
su alto grado de inhibición in vitro contra los dos patógenos. Los resultados
demostraron que la aplicación en semilla de la cepa AC40 es un potencial insumo
para el manejo de estas problemáticas ya que registró rangos de 52,3% de
eficiencia para el control de Fol, 68,6% para el control de Rs y 55,95% para el control
de la mezcla de los dos patógenos.
Palabras clave: Ralstonia solanacearum, Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici,

coinfección, Bacterias acido lácticas, control biológico.
X Bacterias ácido lácticas como biocontroladoras de la marchitez vascular ocasionada
por F. oxysporum y R. solanacearum en tomate
Abstract
Vascular wilt in tomato caused by Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (Fol) or by
Ralstonia solanacearum (Rs) causes losses of more than 80% with only one of these
pathogens. In addition, added to the fact that both microorganisms cause similar
symptoms leading difficulties in the diagnosis of the causal agent, the possibility of
a possible coinfection by the two microorganisms is ignored, which leads to poor
implementation of management strategies. Therefore, the objective of this work was
to evaluate the antagonistic activity and defense response induced by the effect of
acidolactic bacteria (BAL) in tomato plants against vascular pathogens of fungal (Fol)
and bacterial (Rs) origin in monopathogenic models and in a coinfection model.
Therefore, in the first chapter the first coinfection model between the two pathogens
in tomato variety Santa Cruz Kada was standardized from two strains previously
characterized at molecular and virulent level. A synchronous model was selected at
the highest concentrations evaluated, which allowed the earliest expression of
symptoms. On the other hand, in the second chapter, by means of the previously
established model, the efficacy of biocontrol and the differential expression of genes
associated to signaling routes of systemic resistance of a BAL strain previously
selected for its high efficacy at in planta assay and its high degree of in vitro inhibition
against the two pathogens were evaluated. The results showed how the application
in seed of AC40 strain is a potential input for the management of these problems
since it registered ranges of 52.3% of efficiency for the control of Fol, 68.6% for Rs
and 55.95% for coinfection model.
Keywords: Ralstonia solanacearum, Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici,

coinfección, Lactic acid bacteria, Biological control.
Contenido XI
Contenido
1. Capítulo 1. Establecimiento de un modelo de coinfección entre

Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici y Ralstonia solanacearum en tomate
21
1.1 Resumen .................................................................................................. 21
1.2 Estado del arte ......................................................................................... 23
1.2.1 Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, características morfológicas, ciclo
de vida y sintomatología ................................................................................. 23
1.2.2 Ralstonia solanacearum, características morfológicas, ciclo de vida y
sintomatología ................................................................................................ 24
1.2.3 Respuesta de la planta ante el ataque de patógenos ........................... 26
1.2.4 Coinfecciones, un enfoque holístico de la fitopatología ........................ 28
1.3 Materiales y métodos ............................................................................... 29
1.3.1 Sitio de estudio ..................................................................................... 29
1.3.2 Muestreos ............................................................................................. 29
1.3.3 Aislamiento, caracterización y selección de cepas de R. solanacearum
30
1.3.4 Cepa de Fol .......................................................................................... 33
1.3.5 Producción masiva de microorganismos............................................... 33
1.3.6 Estandarización de prueba de coinfección............................................ 33
1.3.7 Evaluación de la concentración de inóculos patogénicos y construcción
de una escala presuntiva diagramática .......................................................... 34
1.3.8 Análisis estadísticos .............................................................................. 36
1.4 Resultados y discusión............................................................................. 37
1.4.1 Aislamiento, caracterización y selección de cepas de R. solanacearum
37
1.4.2 Estandarización de prueba de coinfección............................................ 41
1.4.3 Evaluación de la concentración de inóculos patogénicos y construcción
de una escala presuntiva diagramática .......................................................... 44
1.5 Conclusiones y recomendaciones ............................................................ 48
1.5.1 Conclusiones ........................................................................................ 48
1.5.2 Recomendaciones ................................................................................ 49
2. Capítulo 2. Bacterias ácido lácticas, potenciales biocontroladoras de
Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (Fol) y Ralstonia solanacearum (Rs)51
2.1 Resumen .................................................................................................. 51
2.2 Estado del arte ......................................................................................... 53
2.2.1 Uso de plaguicidas y la urgencia de un cambio .................................... 53
2.2.2 Control biológico, una alternativa amigable ambientalmente ................ 53
2.2.3 Bacterias ácido lácticas, una alternativa promisoria para el control de
enfermedades ................................................................................................. 54
2.2.4 Inducción de resistencia mediada por BAL ........................................... 55
XII Bacterias ácido lácticas como biocontroladoras de la marchitez vascular
ocasionada por F. oxysporum y R. solanacearum en tomate
2.3 Materiales y métodos ............................................................................... 57

2.3.1 Sitio de estudio ..................................................................................... 57
2.3.2 Microorganismos ................................................................................... 57
2.3.3 Evaluación in vitro de la actividad antagónica de BAL vs. los patógenos
Fol y Rs........................................................................................................... 57
2.3.4 Evaluación in planta de la actividad antagónica de BAL vs. los
patógenos Fol y Rs ......................................................................................... 58
2.3.5 Vías de señalización activadas por las plantas de tomate inoculadas con
BAL en el modelo de coinfección .................................................................... 59
2.3.6 Análisis estadísticos .............................................................................. 63
2.4 Resultados y discusión............................................................................. 64
2.4.1 Actividad antagónica in vitro de BAL vs. los patógenos Fol y Rs .......... 64
2.4.2 Actividad biocontroladora in planta de BAL vs. los patógenos Fol y Rs 67
2.4.3 Vías de señalización activadas por las plantas de tomate inoculadas con
BAL en el modelo de coinfección .................................................................... 69
2.5 Conclusiones y recomendaciones ............................................................ 74
2.5.1 Conclusiones ........................................................................................ 74
2.5.2 Recomendaciones ................................................................................ 75
3. Discusión general ........................................................................................ 76
Contenido XIII
Lista de figuras
Pág.
FIGURA 1. F. OXYSPORUM F. SP. LYCOPERSICI. .......................................................... 23

FIGURA 2. R. SOLANACEARUM. ................................................................................. 26
FIGURA 3. ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA AL 1,5%.PARA DETECCIÓN DE RS. ... 38
FIGURA 4. ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA AL 1,5%.PARA DETECCIÓN DE
FILOTIPOS DE RS. .............................................................................................. 39
FIGURA 5. ABCPE DE LOS AISLAMIENTOS DE RS OBTENIDOS EN EL PRESENTE ESTUDIO.40
FIGURA 6. PROGRESO DE LA ENFERMEDAD BASADO EN EL ÍNDICE DE SEVERIDAD DE LOS
AISLAMIENTOS DE RS. ........................................................................................ 40
FIGURA 7. DETECCIÓN DE MICROORGANISMOS EN DIFERENTES MODELOS DE
COINFECCIÓN. ................................................................................................... 43
FIGURA 8. TIEMPO DE EXPRESIÓN DE LOS PRIMEROS SÍNTOMAS DE LOS DIFERENTES
PATÓGENOS EN DOS DIFERENTES CONCENTRACIONES.. ........................................ 45
FIGURA 9. IMÁGENES REPRESENTATIVAS DEL REGISTRO FOTOGRÁFICO DE LAS
INOCULACIONES INDIVIDUALES Y MEZCLA DE LOS PATÓGENOS A LAS
CONCENTRACIONES CON MENOR ORDEN DE MAGNITUD ......................................... 46
FIGURA 10. IMÁGENES REPRESENTATIVAS DEL REGISTRO FOTOGRÁFICO DE LAS
INOCULACIONES INDIVIDUALES Y MEZCLA DE LOS PATÓGENOS A LAS
CONCENTRACIONES CON MENOR ORDEN DE MAGNITUD ......................................... 47
FIGURA 11. IMÁGENES REPRESENTATIVAS DE LOS TRES TIPOS DE INHIBICIÓN CONTRA FOL
Y RS FORMADOS POR LAS BAL CUANDO SE SEMBRARON CINCO GOTAS.. ................ 58
FIGURA 12. IMÁGENES REPRESENTATIVAS DE LOS DIFERENTES RESULTADOS DE LAS
PRUEBAS DE INHIBICIÓN EMPLEANDO UNA SOLA GOTA DE BAL. .............................. 65
FIGURA 13. COMPARACIÓN INHIBITORIA IN VITRO DE AC06 SOBRE FOL59. ................... 65
FIGURA 14. ANÁLISIS CONGLOMERADO UTILIZANDO EL PROMEDIO DE INHIBICIÓN DE BAL
COMO VÍNCULO Y UNA DISTANCIA EUCLIDIANA AL CUADRADO ................................. 66
FIGURA 15. IMÁGENES REPRESENTATIVAS DE LA CEPA BAL AC40 APLICADA EN SEMILLA
RESPECTO AL TESTIGO EN LAS PRUEBAS IN PLANTA AL DÍA 20 POST INOCULACIÓN. .. 67
FIGURA 16. EXPRESIÓN RELATIVA DE LOS GENES ERF1, LOXA, PAL Y PR-1A A LAS 48
HORAS DE PLANTAS INOCULADAS Y NO INOCULADAS CON BAL DURANTE LA
INTERACCIÓN CON MODELOS MONOPATOGÉNICOS CON RS, FOL Y UN MODELO
SINCRÓNICO DE COINFECCIÓN ENTRE ESTOS DOS.. ............................................... 73
FIGURA 17. MODELO TEÓRICO DE LA RESPUESTA DE LA PLANTA DE TOMATE SIN Y CON
INOCULACIÓN DE BAL ANTE LA INFECCIÓN DE FOL. .............................................. 80
INOCULACIÓN DE BAL ANTE LA INFECCIÓN DE RS.. ............................................... 82
INOCULACIÓN DE BAL ANTE LA COINFECCIÓN DE FOL Y RS.. ................................. 84
XIV Bacterias ácido lácticas como biocontroladoras de la marchitez vascular
Lista de tablas
Pág.
TABLA 1. CEBADORES PS1/PS2 PARA LA IDENTIFICACIÓN DE RS ................................ 30

TABLA 2. CONDICIONES DE PCR DESCRITAS POR PASTRIK AND MAISS (2000) PARA
IDENTIFICACIÓN DE RS ....................................................................................... 31
TABLA 3. CEBADORES Y AMPLICONES ESPERADOS A PARTIR DE LA PCR MULTIPLEX PARA
LA DESIGNACIÓN DE FILOTIPOS DE RS (FEGAN AND PRIOR (2005) ......................... 31
TABLA 4. CONDICIONES DE PCR MULTIPLEX DESCRITAS POR FEGAN AND PRIOR (2005)
PARA LA DESIGNACIÓN DE FILOTIPOS DE RS ......................................................... 31
TABLA 5. ESCALA DE SEVERIDAD PARA RS DESCRITA POR ZHENG ET AL. (2017) .......... 32
TABLA 6. ESCALA DE SEVERIDAD DESCRITA POR RONGAI ET AL. (2017) ....................... 35
TABLA 7. CONDICIONES DE PCR DESCRITAS PARA LA AMPLIFICACIÓN DE LA REGIÓN DEL
FACTOR DE ELONGACIÓN EN TOMATE .................................................................. 61
TABLA 8. CEBADORES PARA GENES MARCADORES DE VÍAS DE RESPUESTA DE
RESISTENCIA EN PLANTAS DE TOMATE DESCRITOS POR CARMONA (2019) .............. 61
TABLA 9. CONDICIONES DE QRT-PCR USADAS POR CARMONA (2019) PARA LA
AMPLIFICACIÓN DE TODOS LOS CEBADORES DESCRITOS EN LA TABLA 8 .................. 62
TABLA 10. EFICACIA DE LAS BAL CONTRA FOL, RS Y FOL + RS, DATOS CALCULADOS A
PARTIR DEL ÁREA BAJO LA CURVA DEL ÍNDICE DE SEVERIDAD; E. EFICACIA; DS.
DESVIACIÓN ESTÁNDAR. MEDIAS CON UNA LETRA COMÚN NO SON
SIGNIFICATIVAMENTE DIFERENTES (P > 0,05) ....................................................... 67
TABLA 11. EFICIENCIA DE AMPLIFICACIÓN DE GENES DE TOMATE EVALUADOS DURANTE EL
ANÁLISIS POR PCR EN TIEMPO REAL. .................................................................. 69
Contenido XV
Lista de Símbolos y abreviaturas
Símbolos con letras latinas
Símbolos con letras latinas Término

°C Grados centígrados
Cm centímetro
con.ml-1 Conidios por mililitro
et al. et alii (y otros)
f. sp Forma specialis (forma especial)
G Gramo
HR Humedad relativa
Kg Kilogramo
M Molar
mL Mililitro
nm Nanómetro
ODS Operating Deflection Shape
rpm Revoluciones por minuto
UFC Unidades formadoras de colonia
UV Ultravioleta
Símbolos con letras griegas Término

μL microlitro
Superíndice Término
® Marca registrada
XVI Bacterias ácido lácticas como biocontroladoras de la marchitez vascular
Introducción
Hoy en día, el tomate es considerado una de las hortalizas de mayor importancia a
nivel mundial con una producción aproximada de 182 millones de toneladas, donde
países como China, India, Turquía y Estados Unidos lideran las mayores
producciones con 59, 20, 12 y 10 millones de toneladas respectivamente (FAO
2019). No obstante, en Colombia, a pesar de ser el mayor producto hortícola
nacional con 714.314 toneladas, presenta rendimientos muy distantes a sus
competidores internacionales con 33,94 toneladas/hectárea, posicionándose en el
puesto 72 a nivel global (FAO 2019). Esta baja competitividad ha sido atribuida a
varios factores entre los cuales se encuentra la carente oferta tecnológica del sector
agrario, así como también la situación socioeconómica de las zonas rurales (Matias
Camargo 2017). Sin embargo, el cultivo es una importante fuente de empleos,
debido a que demanda más del doble de horas de labor respecto a otros cultivos de
importancia como el arroz (Blank 2014).
Por otro lado, la alta demanda y amplia extensión aumenta la posibilidad de ser
afectado por problemas fitosanitarios (Burdon and Chilvers 1982), dentro de los
cuales la marchitez vascular ya sea de origen fúngico ocasionada por Fusarium
oxysporum f sp. lycopersici (Fol) o de origen bacteriano causada por Ralstonia
solanacearum (Rs) generan disminuciones en el rendimiento del 80%
(Ramyabharathi et al. 2012; Solanki et al. 2015) y 91% (Elphinstone 2005),
respectivamente en invernadero.
Por un lado F. oxysporum (Fox) es un hongo ubicuo que posee una amplia
diversidad genética (LeBlanc et al. 2017), que le permite tener diferentes estilos de
vida desde saprofito, no patogénico a patogénico (Bhuvanendra et al. 2010).
Actualmente, las cepas patogénicas en plantas de este hongo se agrupan en
alrededor de 150 formae speciales (ff. spp.) (Bertoldo et al. 2015; Gullino et al.
2017). En tomate precisamente, F. oxysporum f. sp. lycopersici causante del
marchitamiento vascular fúngico es uno de las de mayores limitantes en el cultivo.
La enfermedad se reconoce por un marchitamiento foliar clorótico ascendente
desde la zona basal hasta la totalidad de la planta y la producción de propágulos
inactivos como las clamidiosporas permiten al patógeno sobrevivir largos periodos
de tiempo en el suelo (Cha et al. 2016).
Por otro lado, Ralstonia solanacearum (Rs), es un complejo de especies, que
consiste en un grupo heterogéneo de cepas distribuidas espacialmente, pero
18 Bacterias ácido lácticas como biocontroladoras de la marchitez vascular
correlacionadas entre sí (Jimenez Madrid et al. 2019). Aunque las cepas de Rs

comparten rasgos en común, los grupos dentro de la especie poseen características
diferentes, como el rango de hospederos, la temperatura óptima para generar la
enfermedad y la capacidad diferencial para utilizar carbohidratos (Jimenez Madrid
et al. 2019). Este complejo de especies es el agente causal de la marchitez vascular
bacteriana en más de 200 especies de plantas (Mansfield et al. 2012). La
enfermedad se caracteriza en sus estados tempranos por una marchitez sin clorosis
en las horas más calurosas del día, una vez avanzada la enfermedad, la marchitez
se propaga por toda la planta hasta la muerte de esta (Lowe-Power et al. 2018).
Sin embargo, las interacciones entre las plantas y estos patógenos no se realiza en
forma individual, por el contrario, al pertenecer a un ambiente dinámico, las plantas
se encuentran expuestas continuamente a diferentes riesgos bióticos al mismo
tiempo, sometiendo a la planta a múltiples infecciones, conocidas como
coinfecciones (Abdullah et al. 2017; Tollenaere et al. 2016). Esta situación
representa un riesgo para el manejo sanitario, ya que el control de estas
enfermedades se centra principalmente a nivel individual mediante el uso de
pesticidas de origen químico que son potencialmente nocivos para la salud humana
y el ambiente (Shi et al. 2018; Toxnet 2019; Yu et al. 2009), además, la similitud de
los síntomas generados por los dos microorganismos (Rongai et al. 2017; Zheng et
al. 2017), conlleva a una ineficiente identificación del patógeno, ocasionando malas
implementaciones de alternativas de manejo, que en la mayoría de los casos, no
controlan el problema.
Por ende, se han incrementado trabajos en la búsqueda de alternativas como el
control biológico con la aplicación de hongos y bacterias principalmente del género
Trichoderma y Bacillus (Bidellaoui et al. 2019; Jangir et al. 2018b; Yendyo et al.
2018). No obstante, la producción de compuestos con efectos sobre la salud
humana como cereulidas y trilonginas por parte de estos biocontroladores, es aún
desconocida (Bauer et al. 2018; Weinhold 2013). Por lo tanto, el uso de bacterias
acidolácticas (BAL) surge como una alternativa promisoria, al tener categoría
GRAS, de sus siglas en inglés generally recognized as safe. (Varsha and
Nampoothiri 2016). El uso de estas bacterias en el control biológico de
microorganismos ha sido ampliamente estudiado por su capacidad productiva de
compuestos antibacterianos y antifúngicos, como el ácido láctico, el ácido acético,
el peróxido de hidrógeno y las bacteriocinas (Ariyapitipun et al. 1999; Chang et al.
1997; El-Mabrok et al. 2012; Hamed et al. 2011; Klaenhammer 1988; Laitila et al.
2002; Visser et al. 1986); y más recientemente, se ha postulado su acción como
promotoras de crecimiento vegetal (Lutz et al. 2012; Somers et al. 2007) e
inductoras de resistencia en plantas (Murthy et al. 2013).
Capítulo 1 19
Estudios previos ya han demostrado el rol de estas bacterias como biocontroladores

sobre hongos como F. oxysporum (Di et al. 2017; Hamed et al. 2011) y sobre
bacterias como Rs y Xanthomonas gardneri patógenas de plantas (Lemos Blainski
et al. 2018; Murthy et al. 2013), demostrando así, el potencial de las BAL como
insumo para formar parte de un programa de manejo integrado de enfermedades.
Por consiguiente, el propósito de este estudio fue analizar el efecto biocontrolador
de bacterias acidolácticas (BAL) contra dos patógenos vasculares (F. oxysporum y
R. solanacearum) utilizando el modelo de coinfección en tomate. Para ello, el
presente trabajo consta de dos capítulos, en el primero, se estandarizó el modelo
de coinfección de los dos patógenos en plantas de tomate y en el segundo capítulo,
se evaluó la actividad biocontroladora de las bacterias acidolácticas sobre el modelo
previamente diseñado finalizando con una aproximación molecular de las vías de
resistencia inducidas mediante las vías de señalización hormonal en cada una de
las diferentes interacciones.
Objetivo general
Evaluar la actividad antagónica y respuesta de defensa inducida por efecto de

bacterias acidolácticas (BAL) en plantas de tomate frente a patógenos vasculares
de origen fúngico (F. oxysporum f.sp. lycopersici) y bacteriano (Ralstonia
solanacearum)
Objetivos específicos
• Caracterizar molecularmente aislamientos de R. solanacearum y clasificar

estos aislamientos por su grado de virulencia en plántulas de tomate.
• Seleccionar los aislamientos de bacterias ácido lácticas por su actividad

antagónica in vitro frente a los aislamientos previamente seleccionados de R.
solanacearum y F. oxysporum f.sp. lycopersici por su alto nivel de virulencia
en plántulas de tomate.
• Determinar la capacidad de reducción de la severidad de la marchitez

vascular de BAL en plántulas de tomate.
• Estimar a nivel molecular la activación de señales de defensa inducida en la

planta por las BAL en presencia de F. oxysporum f.sp. lycopersici y R.
solanacearum.
1. Capítulo 1.
Establecimiento de un modelo de
coinfección entre Fusarium oxysporum f.
sp. lycopersici y Ralstonia solanacearum en
tomate
1.1 Resumen
La marchitez vascular ocasionada por Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (Fol) y
Ralstonia solanacearum (Rs) ocasiona pérdidas superiores al 80%. En
interacciones monopatogénicas, ambos microorganismos generan síntomas
similares, lo cual dificulta su identificación en campo, sumado el hecho de que en
la mayoría de los casos, las infecciones en plantas involucran múltiples especies
y/o genotipos que exhiben complejidades que no son capturadas en este tipo de
enfoque (Abdullah et al. 2017). Por consiguiente, en este capítulo, se estandarizó el
primer modelo de coinfección entre los patógenos Fol y Rs en tomate variedad
Santa Cruz Kada. En primer lugar, fueron aislados tres aislamientos de Rs a partir
de muestras de diferentes departamentos de Colombia, los cuales fueron
caracterizados molecularmente a nivel de filotipo y por su virulencia en planta. El
aislamiento más virulento se evaluó en diferentes modelos de coinfección
temporalmente dependientes con la cepa Fol59, aislada y caracterizada por Gómez
Marroquín (2019), se obtuvo que esta interacción infecciosa puede ser sincrónica o
asincrónica. Por último, un estudio comparativo de las aplicaciones de los
patógenos en mezcla e individualmente en dos diferentes concentraciones
demostró dos sucesos, primero que la concentración del inóculo patogénico influye
en los tiempos de expresión de los síntomas iniciales independientemente del
tratamiento y segundo, la aplicación simultánea de los dos patógenos, acelera los
tiempos de expresión de los síntomas de marchitez respecto a la aplicación
individual de cada microorganismo.
Palabras clave
Ralstonia solanacearum, Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, tomate,

coinfección, marchitez vascular.
Capítulo 1 23
1.2 Estado del arte
1.2.1 Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, características

morfológicas, ciclo de vida y sintomatología
Fusarium oxysporum Schlectend. Fr. f. sp. lycopersici (Sacc.) W.C. Snyder and H.N.
Hansen (Fol) hace parte del complejo de especies de F. oxysporum (Fusarium
oxysporum species complex - FOSC), causantes de la enfermedad destructiva del
marchitamiento vascular en más de 150 especies diferentes (Figura 1) (Asha et al.
2011; Bertoldo et al. 2015). Los hongos de esta especie se caracterizan por
presentar micelio aéreo blanco que al cabo de un tiempo cambia a tonalidades
rosadas o púrpuras (Figura 1), este micelio es hialino y da a lugar a tres tipos de
estructuras reproductivas, microconidios nacidos de fiálides simples, macroconidios
formados de conidióforos ramificados (Figura 1) y clamidosporas formadas en las
zonas terminal e intermedias del mismo micelio, estas últimas estructuras están
diseñadas para soportar largos periodos de tiempo en el suelo a la espera de
azúcares y aminoácidos de un hospedero (Nirmaladevi et al. 2016).
Figura 1. F. oxysporum f. sp. lycopersici. a. Marchitez vascular fúngica; b. Colonia

en PDA; c. Daños ocasionado en los vasos xilemáticos; d. Clamidospora terminal;
e. Clamidospora intermedia; y f. Macroconidios y microconidios.
Una vez la clamidospora germina se producen hifas de infección que se adhieren y

penetran en la raíz mediante la producción de poligalacturonasas (PGs), pectato
liasas (PLs), xilanasas y proteasas (Di Pietro et al. 2003; Michielse and Rep 2009),
una vez allí, inician la colonización micelial por los espacios intercelulares hasta
llegar a los conductos xilemáticos, iniciando la colonización del sistema vascular
(Figura 1), seguido de la formación de microconidios para facilitar la dispersión en
la planta (Srinivas et al. 2019).
La colonización del tejido por parte del patógeno conlleva al bloqueo de los vasos
xilemáticos, donde la acumulación de hifas, la liberación de micotoxinas y efectores
conllevan al bloqueo del transporte de agua y nutrientes en la planta ocasionando
la aparición de los síntomas característicos de enfermedad como epinastia, clorosis,
marchitamiento, defoliación hasta la muerte de la planta (Joshi 2018; Srinivas et al.
2019).
1.2.2 Ralstonia solanacearum, características morfológicas, ciclo

de vida y sintomatología
R. solanacearum al igual que Fol, no es una especie única, por el contrario, es un
complejo de especies (Ralstonia solanacearum species complex - RSSC) (Hayward
and Hartman 1994). Aunque a diferencia de Fol, RSSC a nivel de especie no solo
se agrupa en razas de acuerdo al rango de hospedantes (R1, R2, R3, R4 y R5),
sino también se agrupa de acuerdo a la temperatura óptima para generar la
enfermedad y en biovares (Bv1, Bv2, Bv3, Bv4, Bv5 y Bv6) acorde a la capacidad
diferencial para utilizar carbohidratos (Jimenez Madrid et al. 2019). Las cepas que
atacan tomate se asocian a la raza 1 (Bv1, Bv3 y Bv4) y a la raza 3 (Bv2 y
Bv2Tropical (Bv2T)) (Perea Soto et al. 2011).
Gracias al avance de técnicas y análisis moleculares, este complejo de especies se

ha clasificado en grupos diferenciales. En 2005 Fegan y Prior establecieron cuatro
grupos a los que llamaron filotipos, teniendo en cuenta el análisis de secuencia de
los genes de la región ITS, el gen hrpB y el gen endoglucanasa (egl). El filotipo I,son
cepas aisladas principalmente de Asia, incluye todas las cepas que pertenecen a
los biovares 3, 4 y 5. El filotipo II incluye las cepas de los biovares 1, 2 y 2T aislados
principalmente de América, como también el patógeno de la papa Rs raza 3,
distribuido mundialmente, y los patógenos de la raza 2 del banano. El filotipo III,
agrupa las cepas de origen africano y las islas circundantes, así como algunas
cepas pertenecientes a los biovares 1 y 2T. Por último, el filotipo IV agrupa cepas
aisladas de Indonesia que pertenecen a los biovares 1, 2 y 2T, así como las cepas
australianas, japonesas y a la especie R. syzygii. Así mismo, cada filotipo contiene
un número de secuevares definido como cepas con una secuencia muy conservada
dentro del área. Dentro de cada secuevar, existen líneas clonales que pueden ser
identificadas usando métodos de huellas genómicas como electroforesis en gel de
Capítulo 1 25
campo pulsado (PFGE), polimorfismos en la longitud de fragmentos (AFLP) o

amplificación de secuencias repetidas (rep-PCR) (Fegan and Prior 2005).
Recientemente, en el 2014, por medio de análisis comparativos en 68 cepas de
secuencias de genes y espacios intergénicos del ARN ribosomal 16S-23S,
secuencias del gen egl y las hibridaciones de ADN-ADN, se propuso la construcción
de genoespecies, las cuales incluyen en el primer grupo las del filotipo II, el segundo
grupo comprende Ralstonia syzygii y solo cepas de filotipo IV y por último, el tercer
grupo, está compuesto por cepas que pertenecen a los filotipos I y III (Safni et al.
2014).
En virtud de su alta variabilidad genética, se puede explicar el amplio rango de

hospedantes que puede atacar este complejo de especies (Allen et al. 2005). Una
vez localizados los exudados radicales, se inicia la quimiotaxis hacia las raíces
mediante motilidad flagelar (Hida et al. 2015; Yao and Allen 2006), utilizando
apéndices como el pilas tipo IV y compuestos como polisacáridos y proteínas
adhesivas se lleva a cabo la adhesión a la superficie radical formando microcolonias
que ingresan por medio de heridas o aperturas naturales (Hoffman et al. 2015; Yao
and Allen 2006), allí dentro, la bacteria migra hacia los vasos xilemáticos al cabo de
24 horas en plantas susceptibles (Caldwell et al. 2017). Existen diferentes reportes
del tipo de dispersión empleado por este patógeno, el primero de forma pasiva
utilizando las corrientes de flujo xilemático y el segundo, usando motilidad de
contracción (Liu et al. 2001). Posteriormente, el patógeno crece hasta formar
biopelículas que obstruirán el flujo de agua y nutrientes, sumado con varios factores
de virulencia, como enzimas para la degradación de la pared celular, sustancias
poliméricas extracelulares (EPS) y efectores tipo III, ocasionan los síntomas
marchitamiento hasta la muerte total de la planta (Figura 2) (Deslandes and Genin
2014; Lowe-Power et al. 2018). No obstante, la expresión de la enfermedad
depende del cuórum de la fitobacteria, ya que a densidades de 1*108 UFC/g de tallo
se empiezan a presentar los síntomas hasta alcanzar 1*1010 UFC/g de tallo
correlacionado con la muerte de la planta (Huang and Allen 2000), por otro lado,
concentraciones entre 104 a 107 UFC/g de tallo no generan síntomas en plantas
(Grimault and Prior 1993; Weibel et al. 2016).
Figura 2. R. solanacearum. a. Marchitez vascular bacteriana; b. Daños en los vasos

xilemáticos; c. Colonias rosadas con bordes lechosos mucoides, propias de la
bacteria en medio M‐SMSA y TZC (Perea Soto et al. 2011).
1.2.3 Respuesta de la planta ante el ataque de patógenos

El proceso de saturación de los ases xilemáticos y la presencia de compuestos
nocivos como toxinas y efectores debido a la infección por un patógeno vascular,
genera en la planta un estrés biótico que conlleva a la disminución del crecimiento
por la carencia del transporte de agua y nutrientes, que se traduce después en la
muerte de la planta (Lowe-Power et al. 2018; Srinivas et al. 2019). Ante esta
situación, las plantas han evolucionado para desarrollar mecanismos de defensa
contra el ataque de estos. Los mecanismos de defensa pueden ser pasivos
(preexistentes) o activos (inducidos) (Hammerschmidt 2014).
Defensas pasivas
En primer lugar, estas defensas se encuentran en la superficie, donde empieza la

interacción planta – patógeno y se presenta el primer intento de irrupción por parte
del agresor. Así mismo, estas defensas pueden ser:
• Estructurales. También llamadas preexistentes, estas se encuentran en la

planta antes que sufra el ataque. Se reconocen por la protección de la
Capítulo 1 27
superficie de los tejidos y se basan en las propiedades distintivas de una

especie o cultivar en particular. La cutícula formada por cutina y ceras, los
tricomas, las lenticelas, los depósitos de calosa, gomas, ligninas, la suberina,
la forma de los estomas y la misma pared celular forman parte de algunos de
los mecanismos estructurales de la defensa basal (Agrios 2005).
• Bioquímicas. Son aquel producto de la información genética propia de la

variedad o cultivar, que se producen sin ningún inductor. Normalmente su
almacenamiento se centra en la vacuola, pero en otros casos se almacenan en
las defensas estructurales prexistentes. Compuestos como aceites esenciales,
alcaloides, péptidos, proteínas, fenoles o taninos, terpenos e inductores de
proteasa son las formas más comunes como se encuentran en la planta y
pueden encontrarse en forma inactiva hasta la detección del patógeno y así
actuar sobre este, ejemplos clásicos son las saponinas, glucosinolatos,
fitoanticipinas y defensinas (Agrios 2005).
Defensas activas
En segundo lugar, se encuentran este tipo de defensas las cuales dependen de

señales de activación. Primeramente, existe una defensa activa ante un aislado o
una raza de patógeno incompatible que genera una expresión localizada de
respuestas como la producción de compuestos como las fitoalexinas y la respuesta
hipersensible (Hammerschmidt 2014). Seguidamente, cuando existe compatibilidad
con un patógeno la resistencia inducida puede ser:
• Local. Allí, la respuesta es en el mismo tejido u órgano mediante la

producción de fitoalexinas, proteínas PR (relacionadas con la patogénesis) y
cambios en la pared celular (Hammerschmidt 2009).
• Sistémica. La respuesta es espacialmente diferente al punto de inoculación.
Este tipo de resistencia también es conocido como “priming” (Conrath et al.
2002).
Este último tipo de resistencia, puede tomar dos diferentes formas dependiendo del
tipo de agente inductor y las vías de señalización que se desencadenan
(Hammerschmidt 2014). En primer lugar, la resistencia sistémica adquirida o SAR
por sus siglas en inglés systemic acquired resistance, es un tipo de resistencia que
se caracteriza por la formación de una necrosis localizada causada por el patógeno
inductor y depende de la señalización del ácido salicílico y de la expresión sistémica
de genes protéicos relacionados con la patogénesis (Hammerschmidt 2009;
Hammerschmidt 2014). Por otro lado, la resistencia inducida sistémica o ISR
(induced systemic resistance), se caracteriza por ser inducida por agentes externos
como bacterias promotoras de crecimiento (De Vleesschauwer and Höfte 2009), es

dependiente de la percepción del etileno y del ácido jasmónico y no está asociada
con la expresión de los genes PR, y a diferencia de SAR, no está asociada con la
formación de lesiones necróticas locales (Hammerschmidt 2014).
En las últimas décadas, el estudio de la resistencia inducida ha tomado gran

importancia para entender la interacción planta – patógeno mediante los análisis
comparativos de las vías de resistencia dependientes de las fitohormonas ácido
jasmónico (JA), etileno (Et) y ácido salicílico (SA), empleando como marcadores
moleculares genes reportados en las diferentes cascadas de activación (Di et al.
2017). La diafonía antagónica entre JA/Et y SA ha permitido asociar las vías con los
diferentes estilos de vida de los patógenos (Di et al. 2017; Robert-Seilaniantz et al.
2011). De esta forma, el JA y el Et se consideran vías mutuas afines a la defensa
contra microorganismos necrótrofos y herbívoros, en cambio, SA está asociado a
microorganismos biótrofos (Heil 2014; Robert-Seilaniantz et al. 2011). Sin embargo,
en los últimos años se ha reportado activación de las dos vías por parte de biótrofos
como Plasmodiophora brassicae y Plasmopara viticola (Guerreiro et al. 2016;
Lemarié et al. 2015).
1.2.4 Coinfecciones, un enfoque holístico de la fitopatología

La mayor parte de la fitopatología se ha enfocado en la interacción entre la planta y
un microrganismo en un ambiente determinado, este rumbo ha permitido grandes
avances en el conocimiento de esta área. No obstante, en la naturaleza, las plantas
se encuentran en un ambiente dinámico interactuando con varias especies y con
genotipos de patógenos (Tollenaere et al. 2017). Este enfoque holístico se define
como coinfección, de particular interés por que puede alterar el comportamiento de
enfermedades (Lobna et al. 2017). Este tipo de enfoque eleva el número de
interacciones en proporción al número de patógenos, ya que normalmente el
enfoque tradicional maneja una interacción, planta – patógeno, en cambio, en una
coinfección con dos patógenos el número aumenta a cuatro, ya que se contempla
las relaciones planta – patógeno 1, planta – patógeno 2, patógeno 1 – patógeno 2 y
planta – patógenos múltiples (Abdullah et al. 2017). Estas dos últimas pueden ser
de tipo antagónico, sinérgico, convivencial, mutualista o cooperativo y por lo tanto
el nivel del daño ocasionado en la planta está en función del tipo de interacción que
se presente (Abdullah et al. 2017).
Además, este tipo de interacciones también se clasifican espaciotemporalmente, ya

que pueden ser asincrónicas, si las infecciones son en tiempos diferentes y
sincrónicas, si las infecciones son simultáneas (Burdon and Laine 2019). Así mismo,
Capítulo 1 29
pueden ser locales si se presentan en el mismo punto con comunicación directa

entre los patógenos o sistemáticas, si atacan diferentes órganos y están mediadas
por el hospedante (Tollenaere et al. 2016).
Ante esta situación las respuestas de las plantas varían, en algunos casos la
infección de un primer patógeno predispone los sistemas de defensa de la planta
para el ataque de un segundo patógeno, un ejemplo se presenta en Arabidopsis
thaliana con una cepa biótrofa de Pseudomonas syringae, la cual induce una
defensa mediada por el ácido salicílico (SA) produciendo susceptibilidad a
necrótrofos como Alternaria brassicicola mediante la supresión de la vía de
señalización del ácido jasmónico (Spoel et al. 2007). En cambio, en otros casos la
presencia de un patógeno puede inducir resistencia contra el siguiente patógeno,
un claro ejemplo es el uso de la cepa avirulenta de F. oxysporum Fo47 en tomate,
la cual ejerce un efecto “priming” protegiendo de posteriores infecciones de cepas
virulentas de Fox (Aimé et al. 2013).
Aunque coinfecciones protagonizadas por Fox y Rs ya han sido reportadas con

otros patógenos en estudios previos (Aimé et al. 2013; Kamilova et al. 2008; Kay et
al. 2002; Kay et al. 2003; Lobna et al. 2017; Notz et al. 2002), aún no se ha
estandarizado las condiciones para generar este fenómeno entre estos dos
microorganismos causantes de marchitez vascular. Por lo tanto, el objetivo de este
capítulo fue estandarizar el primer modelo de coinfección entre los patógenos Fol y
Rs previamente caracterizados en tomate variedad Santa Cruz Kada.
1.3 Materiales y métodos
1.3.1 Sitio de estudio

Los experimentos se realizaron en las instalaciones del Laboratorio de Microbiología
Agrícola de la Corporación colombiana de investigación agropecuaria, AGROSAVIA
en el Centro de Investigación Tibaitatá, ubicado en Mosquera, Cundinamarca,
Colombia.
1.3.2 Muestreos
Las muestras de tallo de tomate, con presuntiva sintomatología de marchitez
vascular, se obtuvieron a partir de cultivos comerciales localizados en los municipios
de Mosquera, San Cayetano y Pacho, Departamento de Cundinamarca; Villa de
Leiva y Santa Inés, Departamento de Boyacá y Río Negro y San Antonio,
Departamento de Antioquia. Los muestreos en la mayoría de los casos fueron
ejecutados por el grupo de manejo integrado de enfermedades del proyecto

“Recomendaciones para el manejo integrado de gota y marchitez por Fusarium, dos
enfermedades prevalentes en el cultivo de tomate bajo condiciones protegidas”
dentro del macroproyecto “Desarrollo de un modelo de manejo integrado del sistema
productivo del tomate que contribuya a mejorar la inocuidad y sostenibilidad del
cultivo” de AGROSAVIA (Anexo A).
1.3.3 Aislamiento, caracterización y selección de cepas de R.

solanacearum
Secciones de tallos de las muestras con indicios de afectación vascular fueron
sometidos al protocolo de desinfección de Yendyo et al. (2018). El tallo se lavó con
una solución de etanol al 70%, luego se aplicó una solución de hipoclorito de sodio
(NaOCl) al 1% durante 2 minutos y nuevamente se lavó con 70% durante un minuto.
El lavado final se realizó con agua destilada estéril tres veces. Posteriormente,
explantes de 1 g del tejido desinfectado fueron macerados en 1 mL y el producto
obtenido se sembró en el medio semi selectivo M‐SMSA (Elphinstone et al. 1996) y
se incubó a 28°C+/- 2°C durante 48 horas (Anexo B).
Los aislamientos bacterianos fueron individualizados y seleccionados por sus

características propias de crecimiento del género en el medio M‐SMSA, colonias
rosadas con bordes lechosos mucoides (Perea Soto et al. 2011), luego los
aislamientos presuntivos fueron sometidos a tinción de Gram (Bartholomew and
Mittwer 1952). Posteriormente, el ADN de los aislamientos Gram negativos fue
extraído usando DNeasy UltraClean Microbial Kit (MoBio, Carlsbad, Calif.), de
acuerdo a las instrucciones del Kit, seguido de una identificación mediante PCR
usando los cebadores específicos de la región 16S PS1/PS2 (Tabla 1) siguiendo las
condiciones descritas por Pastrik and Maiss (2000) (Tabla 2).
Tabla 1. Cebadores PS1/PS2 para la identificación de Rs
Nombre cebador Secuencia

PS1 AGTCGAACGGCAGCGGGGG
PS2 GGGGATTTCACATCGGTCTTGCA
Capítulo 1 31
Tabla 2. Condiciones de PCR descritas por Pastrik and Maiss (2000) para
identificación de Rs
Pasos Temperatura (°C) Tiempo Ciclos
Desnaturalización inicial 95 5 minutos 1
Desnaturalización 94 30 segundos
Anillamiento 68 30 segundos 30
Extensión 72 45 segundos
Extensión final 72 5 minutos 1
4 -
Los aislamientos confirmados de Rs fueron definidos en filotipos empleando la

técnica de PCR multiplex de Fegan and Prior (2005), la cual emplea 4 cebadores
forward y un cebador reverse. Los cebadores utilizados, el amplicón esperado y su
respectivo filotipo son descritos en la Tabla 3, y las condiciones empleadas para la
amplificación por PCR son descritas en la Tabla 4.
Tabla 3. Cebadores y amplicones esperados a partir de la PCR multiplex para la

designación de filotipos de Rs (Fegan and Prior (2005)
Amplicón
Nombre cebador Secuencia esperado (pb) Filotipo
Nmult21:1F CGTTGATGAGGCGCGCAATTT 144 I
Nmult21:2F AAGTTATGGACGGTGGAAGTC 372 II
Nmult23:AF ATTACSAGAGCAATCGAAAGATT 91 III
Nmult22 ATTGCCAAGACGAGAGAAGTA 213 IV
reverse Nmult22 TCGCTTGACCCTATAACGAGTA - -
Tabla 4. Condiciones de PCR multiplex descritas por Fegan and Prior (2005) para
la designación de filotipos de Rs

Alineamiento 59 30 segundos 30
Extensión 72 23 segundos
4 -
Mediante un diseño completamente al azar generalizado, la patogenicidad de cada

cepa fue comparada con la cepa de referencia EAPUS (sin publicar), utilizada como
control positivo, mediante el siguiente modelo de bioensayo: se emplearon plántulas
de tomate variedad Santa Cruz Kada de 30 días crecidas en turba y trasplantadas
a suelo estéril. La unidad experimental contó con diez plantas, las cuales fueron
inoculadas en el suelo con 15 mL de suspensión bacteriana ajustada a 1x108
ufc.mL-1, por medio de la metodología descrita por He et al. (1983), en la cual una
lectura de absorbancia (ODS) de 1 a longitud de onda de 600 nm, corresponde a
una concentración de 1x109 ufc.mL-1. Posteriormente, las plantas fueron incubadas
durante 15 días a 28°C+/- 2°C y 60% HR. Se registró la incidencia de la enfermedad
mediante la ecuación 1 y la severidad durante 15 días usando la escala descrita por
Zheng et al. (2017) (Tabla 5), luego se calculó el área bajo la curva del progreso de
la enfermedad (ABCPE) para los análisis comparativos (Rivard et al. 2012). El
ensayo se repitió 2 veces en el tiempo.
Ecuación 1.
𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑝𝑙𝑎𝑛𝑡𝑎𝑠 𝑒𝑛𝑓𝑒𝑟𝑚𝑎𝑠

𝐼𝑛𝑐𝑖𝑑𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑒𝑛𝑓𝑒𝑟𝑚𝑒𝑑𝑎𝑑 = ∗ 100
𝑁ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑝𝑙𝑎𝑛𝑡𝑎𝑠
Tabla 5. Escala de severidad para Rs descrita por Zheng et al. (2017)
Grados Criterios
0 Sin síntomas observables
1 ¼ de las hojas marchitas
2 ½ de las hojas se marchita

Capítulo 1 33
3 ¾ de todas las hojas se marchita
4 Muerte de la planta
1.3.4 Cepa de Fol

La cepa de F. oxysporum f. sp. lycopersici, Fol59, usada en el presente estudio fue
suministrada por Gómez Marroquín (2019) y Carmona Gutiérrez (2019), la cual fue
molecularmente caracterizada y seleccionada por su alta virulencia en plantas de
tomate variedad Santa Cruz Kada.
1.3.5 Producción masiva de microorganismos

Para los posteriores ensayos de inoculación de patógenos, se emplearon los
siguientes protocolos de producción masiva, cuantificación y ajuste de
concentración de los microorganismos.
En primer lugar, la producción de Rs se realizó en caldo nutritivo incubado 28°C+/-

2°C durante 24 horas. Luego las células fueron separadas del caldo por
centrifugación a 10.000 rpm y resuspendidas en agua destilada estéril. La
concentración de la suspensión se realizó mediante lectura de absorbancia a λ 600
nm, donde el valor 1 de absorbancia a λ600 nm equivale a 1x109 ufc.ml-1 (He et al.
1983).
Por otro lado, la producción de microconidios de Fol59 se obtuvo de la siguiente

manera. A partir de cultivos de ocho días crecidos en Agar Papa Dextrosa (PDA) e
incubados a 25°C+/- 2°C, se extrajeron discos de 0,5 cm2 los cuales fueron
inoculados en Erlenmeyers de 1000 mL con 300 mL de Caldo Papa Dextrosa (PDB)
e incubados a 25°C+/- 2°C en agitación de 125 rpm durante siete días.
Posteriormente, el inóculo se filtró con muselina estéril y la suspensión fue
cuantificada por conteo de células en cámara de Neubauer y posteriormente fue
ajustada acorde a las concentraciones requeridas en las siguientes actividades,
descritas a continuación.
1.3.6 Estandarización de prueba de coinfección

Debido a que la expresión de los síntomas en tomate inoculado con Rs es más
temprana respecto a la inoculación con Fol (Di et al. 2017; González et al. 2011), se
determinó el momento de aplicación para los siguientes experimentos que
garantizara la presencia de los dos patógenos en la planta. Por lo tanto, siguiendo

el mismo modelo de bioensayo con plántulas de tomate, descrito anteriormente, se
aplicaron 15 mL de la suspensión al suelo con los siguientes tratamientos: T0:
testigo absoluto aplicación con agua destilada estéril, T1: aplicación individual de
Fol59 a 1x106 microconidios.mL-1, T2: aplicación individual de Rs a 1x108 ufc.mL-1,
T3: aplicación simultánea de Rs a 1x108 ufc.mL-1 y a 1x106 microconidios.mL-1. T4:
aplicación de Fol59 a 1x106 microconidios.mL-1 seguido de la aplicación de Rs a
1x108 ufc.mL 7 días después. T5: aplicación de Fol59 a 1x106 microconidios.mL-1
seguido de la aplicación de Rs a 1x108 ufc.mL 10 días después. Para corroborar la
presencia de los dos patógenos, el material vegetal de cada uno de los tratamientos
se desinfectó usando el protocolo sugerido por Yendyo et al. (2018), descrito
previamente. Una vez desinfectado, el material se sembró en medio selectivo para
cada uno de los microorganismos: Komada selectivo para Fusarium oxysporum
(Komada 1975) (Anexo C) y el macerado en medio M‐SMSA para Rs; los
aislamientos crecidos en este último medio fueron confirmados usando
ImmunoStrip® (Agdia, Inc) (Opina and Miller 2005) (Anexo D). El experimento contó
con 21 repeticiones donde la unidad experimental fue una planta. No se realizó un
análisis estadístico ya que el único objetivo fue asegurar la coinfección.
1.3.7 Evaluación de la concentración de inóculos patogénicos y

construcción de una escala presuntiva diagramática
Con el fin de seleccionar si la concentración del patógeno influía en la expresión de
los síntomas como se reporta en estudios previos (Moreno Velandia 2017), se
evaluó los inóculos patogénicos en el modelo de coinfección seleccionado
previamente, así como los modelos individuales de cada patógeno en dos diferentes
concentraciones, de modo que se construyeron los siguientes tratamientos: T0:
testigo absoluto aplicación con agua destilada estéril, T1: aplicación individual de
Fol59 a 1x106 microconidios.mL-1, T2: aplicación individual de Fol59 a 1x105
microconidios.mL-1, T3: aplicación individual de Rs a 1x108 ufc.mL-1, T4: aplicación
individual de Rs a 1x107 ufc.mL-1, T5: aplicación de Rs a 1x108 ufc.mL-1 y Fol a
1x106 microconidios.mL-1 de acuerdo al método de aplicación seleccionado
previamente, T6: aplicación de Rs a 1x107 ufc.mL-1 y Fol a 1x105 microconidios.mL-
1 de acuerdo al método de aplicación seleccionado previamente. Este experimento
se evaluó en un diseño completamente al azar, donde la unidad experimental fue

una planta, el experimento contó con 10 repeticiones técnicas y 3 repeticiones en el
tiempo. Adicionalmente, con los datos obtenidos se calculó el área bajo la curva
usando la ecuación 2 descrita por Pedroza and Samaniego (2009), luego se calculó
el efecto esperado ajustando la fórmula de Abbott (1925) (ecuación 3) y se calculó
Capítulo 1 35
finalmente el factor de sinergismo (Sf) descrito por Guetsky et al. (2002), mediante
la ecuación 4, donde Sf=1 hay efecto aditivo, Sf>1 hay sinergismo y si Sf<1 hay
antagonismo entre los microorganismos.
Ecuación 2.
𝑌𝑖 + 𝑌𝑖+1
𝐴𝐵𝐶𝑃𝐸 = ∑ ∗ (𝑡𝑖+1 − 𝑡𝑖 )
2
𝑖
Donde:
Y : Es el % de la enfermedad (severidad)
t : Tiempo en días transcurrido
Ecuación 3
(𝑎 + 𝑏) − 𝑎𝑏⁄100
a y b corresponden a los tiempos de los microorganismos en forma individual y ab

representa la mezcla.
Ecuación 4
𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑜𝑏𝑠𝑒𝑟𝑣𝑎𝑑𝑜
𝑆𝑓 =
𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑒𝑠𝑝𝑒𝑟𝑎𝑑𝑜
Por otro lado, cada uno de los tratamientos se sometió a registros fotográficos a
partir del tercer día post inoculación y la observación y registro de los síntomas se
realizó cada 2 días, utilizando como referencia las escalas descritas por Zheng et
al. (2017) para Rs y Rongai et al. (2017) para Fol (Tabla 6), todo ello con el fin de
construir una escala diagramática del modelo de coinfección que permita evaluar la
enfermedad en los siguientes experimentos.
Tabla 6. Escala de severidad descrita por Rongai et al. (2017)
Grados Criterios
0 Sin síntomas observables
1 Amarillamiento en las hojas basales

2 Amarillamiento de las hojas basales y tercio

medio y marchitez en una o dos hojas
3 Amarillamiento severo en las hojas. 50% de

las hojas marchitas y crecimiento inhibido
4 Síntomas generalizados, amarillamiento en

toda la planta, raíz principal necrosada,
necrosis vascular.
5 Planta muerta
1.3.8 Análisis estadísticos

Todos los datos obtenidos de las diferentes pruebas se sometieron a un análisis de
normalidad, independencia de los errores y homocedasticidad de varianza mediante
las pruebas de Shapiro-wilk, Durbin Watson y Levene; dependiendo del
cumplimiento de estos postulados, el análisis estadístico varió.
Para la comparación de virulencia de las cepas de Rs, se realizó un análisis de

varianza (ANOVA) de una sola vía y pruebas de comparación de medias utilizando
la prueba de Tukey con un nivel de significancia del 95%.
Para la prueba de evaluación de la concentración de inóculos, los datos del tiempo

de expresión se analizaron mediante modelos lineales generalizados mixtos, donde
la parte fija del modelo correspondió al tratamiento y el inóculo patogénico y la parte
aleatoria a las repeticiones. En cuanto a los resultados de normalidad e
independencia de los errores, las variables presentaron una distribución no normal
y errores no correlacionados; además, se observaron problemas en el supuesto de
homocedasticidad, por lo cual fue necesario incluir dentro del modelo las funciones
de varianza tales como: identidad (varIdent), exponencial (varExp), potencia
(varPower) para modelar la variabilidad presente entre plantas y repeticiones en el
tiempo; la selección del modelo se realizó mediante las medidas de ajuste de AIC
(criterio de Akaike) y BIC (Criterio Bayesiano de información), siendo los valores
más bajos de estos parámetros los que permiten seleccionar el modelo que mejor
se ajusta a cada una de las variables. Para el análisis de esa variable, se usaron
modelos lineales generalizados, tomando como funciones la distribución gamma
con la función de enlace log, con efectos fijos se usaron la concentración del inoculo,
el tipo de patógeno y su interacción; y como efectos aleatorios: las repeticiones y
las plantas. Se determinó las diferencias de medias entre cada uno de los
Capítulo 1 37
tratamientos respecto a la variable de respuesta mediante una comparación de LSD

Fisher (p < 0,05), con corrección de Bonferroni.
Las pruebas de Shapiro-wilk, y ANOVA se realizaron con el paquete stats v3.6.1,

las pruebas de Durbin Watson y Levene fueron realizadas con los paquetes, lmtest
y car respectivamente (Fox et al. 2012; Hothorn et al. 2019) y el modelamiento lineal
generalizado mixto se realizó con el paquete glmm (Knudson et al. 2012). Todas las
gráficas fueron realizadas empleando el paquete Plotly version 4.9 (Sievert et al.
2019). Todos los paquetes mencionados anteriormente se ejecutaron utilizando el
software estadístico R, versión 3.6.1
1.4 Resultados y discusión
1.4.1 Aislamiento, caracterización y selección de cepas de R.

solanacearum
A partir de las muestras colectadas en los municipios de Mosquera, San Cayetano
y Pacho, Villa de Leiva y Santa Inés y Río Negro y San Antonio, y posterior a su
desinfección y siembra en medios semiselectivos, se obtuvieron 36 aislamientos
presuntivos por sus características morfológicas en medio TZC, seis de ellos fueron
descartados por presentar características de bacterias Gram positivas (tabla 1. Del
material suplementario). De los 30 aislamientos restantes, solo las muestras 14, 30
y 32 amplificaron un fragmento cercano a 553 pares de bases (pb) de la región del
16S especifica de R. solanacearum utilizando los cebadores PS1-PS2 (Pastrik and
Maiss 2000). Los aislamientos fueron renombrados como C1, C2 y C3 (Figura 3).
Figura 3. Electroforesis en gel de agarosa al 1,5%. M. Marcador de peso molecular

1Kb+. Carriles del 1 al 36. Muestras del 1 al 36, las muestras 14, 30 y 32
representan los aislamientos C1, C2 y C3 respectivamente; Carril C. Control
positivo; y Carril N. Control negativo.
Debido a la metabolización del cloruro de trifenil tetrazolio y la presencia de varios

compuestos antibióticos como bacteriocina, penicilina, cloromicetina, sulfato ß de
polimixina y cristal violeta, el medio SMSA es utilizado con frecuencia para el
aislamiento de Rs debido a su capacidad inhibitoria de un gran grupo de
microorganismos (Elphinstone et al. 1996). No obstante, el crecimiento de géneros
como Klebsiella, Bacillus y Pseudomonas ya ha sido reportado en este medio
(Kalpage and De Costa 2015; Obrador Sánchez 2016) y en órganos de la planta
(Brilli et al. 2019; Olokun et al. 2019). Esto confirma la categorización de este medio
como semiselectivo y no selectivo (Madigan et al. 2016), y cómo el uso de técnicas
moleculares son una herramienta complementaria e indispensable para la detección
del patógeno para evitar falsos positivos (Pastrik and Maiss 2000). Además, estos
resultados presentan congruencia con los amplicones de 370 pb obtenidos de la
PCR multiplex de Fegan and Prior (2005), indicando que las cepas de Rs aisladas
en el presente estudio pertenecen al filotipo II, es decir, al filotipo Americano (Fegan
and Prior 2005) (Figura 4).
Capítulo 1 39
Figura 4. Electroforesis en gel de agarosa al 1,5%. M. Marcador de peso molecular

1Kb+. Carril 1. Control positivo (Eapus); Carril 2. C1; Carril 3. C2; Carril 4. C2;
Carril 5. Control negativo.
Mediante pruebas de virulencia en plántulas de tomate, en las tres réplicas

biológicas se corroboró la patogenicidad de todos los aislamientos confirmados de
Rs (Figura 5). Entre los aislamientos evaluados, C1 y C3 no presentaron diferencias
significativas respecto a la cepa de referencia Eapus (p < 0,05) y un análisis
comparativo del progreso de la enfermedad, mostró la misma tendencia, por lo cual
se seleccionó el aislamiento C1 por presentar en menor tiempo la sintomatología de
marchitez bacteriana (Figura 6).
Figura 5. ABCPE de los aislamientos de Rs obtenidos en el presente estudio.

Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05).
Figura 6. Progreso de la enfermedad basado en el índice de severidad de los

aislamientos de Rs obtenidos en el presente estudio durante 15 días.
La virulencia exhibida en este experimento por las cepas de Rs puede ser atribuida
a dos aspectos. En primer lugar, el uso de un material susceptible como la variedad
Santa Cruz Kada, la cual ha sido desarrollada con fines productivos y no presenta
resistencia contra este patógeno (Zeist et al. 2018). Además, su susceptibilidad ha
permitido los análisis comparativos con nuevos materiales, permitiendo así, el
desarrollo de variedades resistentes y estrategias de manejo de la enfermedad
(Araújo Pena et al. 2010; Zeist et al. 2018). En segundo lugar, el empleo de plántulas
de corta edad influye significativamente en la vulnerabilidad del genotipo hacia el
patógeno. Este fenómeno ya ha sido reportado en este patosistema, ya que estudios
Capítulo 1 41
realizados por Thomas and Upreti (2014), demostraron mayor gravedad de la

enfermedad en plantas de tomate de 2 a 3 semanas de edad que en plantas de 5 a
6 semanas, atribuyendo el crecimiento de las raíces como un factor principal, debido
a que los tejidos radiculares se van volviendo más resistentes a medida que las
plántulas crecen.
Así mismo, este comportamiento no es único en la interacción tomate – Rs, Liu et

al. (2018) registraron una relación inversamente proporcional de la edad de las
plántulas de melón con los síntomas de la marchitez bacteriana de la cucurbitácea
causada por Erwinia tracheiphila, a causa de una más rápida expresión de la
enfermedad en plantas de 2 o 4 semanas que en plantas de 6 u 8 semanas.
1.4.2 Estandarización de prueba de coinfección

De acuerdo con la Figura 7, se corroboró la presencia de los dos patógenos
mediante el crecimiento de los microorganismos en los medios semiselectivos
Komada para Fol y M- SMSA para Rs; las colonias bacterianas recuperadas en
medio M- SMSA dieron positivo en la prueba de detección ImmunoStrip® (Agdia,
Inc) específico para Rs. Así mismo, se confirmó el daño ocasionado por cada uno
de ellos por medio de cortes transversales del tallo. Por lo anterior, se confirma la
capacidad de los dos patógenos para invadir una misma planta. Además, la
presencia de los dos patógenos en los tratamientos T3, T4 y T5, demostró que la
coinfección entre Fol y Rs no presenta dependencia temporal, es decir, puede ser
sincrónica o asincrónica (Burdon and Laine 2019), siempre que la infección de Fol
sea inicial.
Capítulo 1 43
Figura 7. Desde a. a f., cortes transversales de tallos de tomate, a. T0: testigo sin
inoculación, b. T1: aplicación individual de Fol59, c. T2: aplicación individual de Rs,
d. T3: aplicación simultánea de Fol59 y Rs. e. T4: aplicación de Rs después de 7
días de la aplicación de Fol59. f. T5: aplicación de Rs después de 10 días de la
aplicación de Fol59; Desde g. a l., Medios semiselectivos para la detección de Rs
(parte superior) y Fol (parte inferior) g. T0: testigo sin inoculación, e la aplicación h.
T1: aplicación individual de Fol59, i. T2: aplicación individual de Rs, j. T3: aplicación
simultánea de Fol59 y Rs. k. T4: aplicación de Rs después de 7 días de la aplicación
de Fol59. l. T5: aplicación de Rs después de 10 días d de Fol59; Desde m. a r., test
de detección ImmunoStrip® (Agdia, Inc) específico para Rs, línea derecha control,
línea izquierda positiva para Rs. m. T0: testigo sin inoculación, n. T1: aplicación
individual de Fol59, o. T2: aplicación individual de Rs, p. T3: aplicación simultánea
de Fol59 y Rs. q. T4: aplicación de Rs después de 7 días de la aplicación de Fol59.
r. T5: aplicación de Rs después de 10 días d de Fol59.
Hasta la fecha, solo existe un único registro de este fenómeno en tomate, y fue
comunicado por Venkatesh et al. (2018), en el cual afirmaron mediante ensayos in
planta, un antagonismo del hongo hacia Rs con una reducción significativa de la
severidad de la marchitez bacteriana, sin embargo, se desconoce los experimentos
y resultados de este trabajo. No obstante, debido al amplio rango de hospedantes
de estos dos patógenos (Allen et al. 2005; Bertoldo et al. 2015), su presencia
conjunta es muy probable. Aun así, existen reportes de coinfección de uno de estos
microorganismos con otros fitopatógenos.
Por un lado, Deberdt et al. (1999), evaluó en varias líneas resistentes y susceptibles
la interacción entre Rs y dos nematodos, el nematodo endoparasitario del nudo
radicular, Meloidogyne incognita, y el nematodo reniforme semiaparasitario,
Rotyleitcbulus renifomzis. Este estudio demostró que la infección de las raíces del
tomate por nematodos del nudo de la raíz redujo la resistencia genética a la
marchitez bacteriana. Así mismo, Weibel et al. (2016), concluyó de acuerdo con sus
resultados in planta y con reportes obtenidos de productores de geranios, que muy
posiblemente Rs estuviera en una coinfección con una bacteria desconocida de la
zona.
Por otro lado, los casos de coinfección con F. oxysporum (Fox) respecto a los de
Rs son más recurrentes. Aimé et al. (2013) demostraron la infección sincrónica de
dos cepas de Fox en tomate. De igual forma, la interacción asincrónica entre este
hongo y P. fluorescens ya ha sido corroborada en tomate y trigo (Kamilova et al.
2008; Notz et al. 2002). Así mismo, la interacción de este microorganismo con otras
clases de fitopatógenos como nematodos o virus no está exenta, ya que existen
casos exitosos con los nematodos Meloidogyne javanica y Pratylenchus penetrans
en tomate, garbanzo y maíz respectivamente (da Silva et al. 2016; Lobna et al. 2017;
Maheshwari et al. 1995), y con los virus CMV y SHMV en frijol y habichuela
respectivamente (Chant and Gbaja 1986; Gbaja and Chant 1985).
Por consiguiente, con base en los resultados y los reportes de literatura, se

seleccionó el T3 (aplicación simultanea de los dos patógenos) como el modelo a
seguir para los siguientes ensayos, debido a que presentó mayor practicidad técnica
para su ejecución y aseguró la presencia de los dos patógenos en la planta.
1.4.3 Evaluación de la concentración de inóculos patogénicos y

construcción de una escala presuntiva diagramática
Al evaluar los tiempos de expresión de los primeros síntomas de los dos patógenos
aplicados en forma individual y en mezcla a dos diferentes concentraciones (Figura
8¡Error! No se encuentra el origen de la referencia.), no se evidenció
interacciones entre los tratamientos y las concentraciones evaluadas (p < 0,05) pero
sí se encontró efecto de los patógenos (p > 0,05) y el factor concentración (p > 0,05),
es decir que cada uno de los diferentes patógenos aplicados y su mezcla tienen un
comportamiento diferente, así mismo, cuando disminuimos el orden de magnitud de
la concentración del inóculo, la expresión de los síntomas toma más tiempo. El
efecto de la concentración sobre la expresión de los síntomas ya ha sido reportado
por varios autores. Por un lado, según Grimault and Prior (1993) y Weibel et al.
(2016) los sintomas de marchitez por Rs no se expresan a concentraciones de 104
a 107 UFC/g de tallo, sino hasta que alcanza concentraciones de 1*108 UFC/g de
tallo, en la cual se empiezan a presentar los síntomas, y a 1*1010 UFC/g de tallo el
síntoma asociado ya es la muerte de la planta (Huang and Allen 2000), esta misma
tendencia fue registrada por Nishiyama et al. (1999) quienes reportaron un
incremento poblacional de la bacteria a medida que incrementaba el daño
ocasionado por la planta. Esto se debe al uso de pequeñas moléculas difusibles de
señalización que permiten la comunicación entre sí, denominadas quorum sensing
(QS) (Miller and Bassler 2001). Esta bacteria como otras Gram-negativas emplean
la molécula acil homoserin lactona (AHL), la cual permite expresar genes asociados
a factores de virulencia en respuesta a la densidad de población (Kumar et al. 2016).
Uno de los factores más asociados a este proceso es la formación de una
biopelículas o biofilm, la cual al ser inhibida en la bacteria, conduce a la pérdida
significativa de virulencia y en algunos casos de patogenicidad (Mori et al. 2016).
Capítulo 1 45
Figura 8. Tiempo de expresión de los primeros síntomas de los diferentes

patógenos en dos diferentes concentraciones. Medias con una letra común no son
significativamente diferentes (p > 0,05).
Así como con Rs, trabajos realizados con Fox en frijol y ciclamen demostraron
también que la densidad poblacional de este hongo está asociada a los síntomas
expresados en la planta, e incluso se estableció la concentración 1 a 5 *104 UFC/ml
como un umbral para generar síntomas de una forma consistente (Elmer 2002;
Salgado and Schwartz 1993). De igual manera Moreno Velandia (2017), reportó una
relación proporcional de la incidencia y severidad de la marchitez vascular en
uchuva a las concentraciones de inóculo patogénico. Por lo tanto, hablar de un
sistema de comunicación basado en la densidad celular en hongos ya es posible,
debido a la confirmación de QS en varios organismos eucariotas (Padder et al.
2018); compuestos como el farnesol y el tirosol, han sido reconocidos como
moléculas de quorum en hongos como Candida albicans y pueden mediar procesos
como la morfogénesis y patogenicidad (Wongsuk et al. 2016).
En otro orden de ideas, de acuerdo con la Figura 9 y la Figura 10, se evidenció cómo
la aplicación conjunta de los patógenos aceleró la aparición de los primeros
síntomas hasta el séptimo día post inoculación para el tratamiento T5 respecto a T3
y T1 con diez y doce días respectivamente, los cuales hacen referencia a cada uno
de los patógenos por separado; y de igual forma, esta tendencia se mantuvo cuando
se disminuyó la concentración de los inóculos patogénicos en un orden de magnitud,
ya que el tratamiento mezcla T6 le tomó diez días para generar los primeros
síntomas, en cambio los tratamientos individuales T2 y T4 presentaron doce y
catorce días respectivamente (Figura 8¡Error! No se encuentra el origen de la r
eferencia.). Otro hecho interesante, fue que los síntomas obtenidos se asociaron a
los descritos para Fol por Rongai et al. (2017), observando desde el inicio un
amarillamiento y marchitez ascendente desde las hojas basales hasta alcanzar la

totalidad de la planta, sin embargo, a excepción del amarillamiento, los síntomas
también fueron semejantes a los descritos por Zheng et al. (2017) para Rs. De igual
forma los daños ocasionados en los haces vasculares asociados los tratamientos
en mezcla (Figura 7) indican la acción de los dos patógenos dentro del tejido. Por lo
tanto, a pesar que se usó los mismos criterios de la escala de Rongai et al. (2017)
para monitorear la enfermedad causada por la coinfección en los posteriores
ensayos, es muy importante resaltar que el uso de escalas diagramáticas para el
monitoreo del progreso de la enfermedad se vuelve poco eficiente para intentar
explicar el tipo de interacción de estos patógenos dentro de la planta.
Figura 9. Imágenes representativas del registro fotográfico de las inoculaciones

individuales y mezcla de los patógenos a las concentraciones con menor orden de
magnitud
Capítulo 1 47
Figura 10. Imágenes representativas del registro fotográfico de las inoculaciones

individuales y mezcla de los patógenos a las concentraciones con menor orden de
magnitud
Aunque de acuerdo con el factor de sinergismo expuesto por Guetsky et al. (2002),
en el presente trabajo, no se presentó sinergismo entre los dos patógenos, ya que
se obtuvieron índices de 0,79 y 0,74 para los tratamientos de coinfección T5 y T6
respectivamente, los cuales, no entran en este rango de interacción (Sf > 1). Sin
embargo, es evidente el hecho que la presencia de los dos patógenos acelera la
expresión de los síntomas en la planta de tomate.
Un hecho que puede explicar esta situación es la capacidad de Rs de producir el

compuesto ralsolamicina el cual le permite inducir engrosamiento de la pared celular
y formación de clamidiosporas en hongos como Fox, permitiéndole a esta la
capacidad de parasitar las hifas fúngicas con especificidad a las clamidosporas
(Spraker et al. 2016), de esta manera se proporciona un sitio de escape de la batería
de los mecanismos de resistencia de la planta (materiales resistentes) y por
consiguiente el ataque biótico hacia la planta se multiplicaría por la acción de Fol y
Rs generando un daño en el menor tiempo posible.
1.5 Conclusiones y recomendaciones
1.5.1 Conclusiones
• A partir de muestras de tallos de tomate con síntomas de marchitamiento

vascular, se logró aislar tres aislamientos de Rs los cuales fueron
confirmados tanto morfológica y molecularmente, como por su grado de
virulencia. Esto demuestra la presencia de Rs en cultivos de tomate y su
posible efecto como agente causal de la marchitez vascular.
• Se desarrolló un protocolo de coinfección de los dos patógenos vasculares
Fol y Rs, que permitió garantizar tanto de forma sincrónica como asincrónica
la infección de estos dos microorganismos en plántulas de tomate, bajo
condiciones controladas.
• Mediante las pruebas de evaluación de concentración de inóculo de los dos
patógenos, se corroboró una relación proporcional entre la concentración del
inóculo patogénico y la expresión de los primeros síntomas, incluso con la
coinfección sincrónica.
• A pesar de no presentarse sinergismo, mediante el factor de Guetsky et al.
(2002), fue evidente el hecho que la presencia de los dos patógenos aceleró
la expresión de los síntomas en la planta de tomate.
1.5.2 Recomendaciones
• Con el fin de caracterizar con mayor profundidad los aislamientos de Rs, se

sugiere ampliar los sititos de muestreo, así como emplear otras estrategias
para la caracterización molecular, ya sea por la secuenciación de la región
del gen de la endoglucanasa egl o el análisis genómico comparativo.
• Profundizar en el estudio de la interacción Rs – Fol en tomate para determinar
el comportamiento de estos dos microorganismos que causan una expresión
de síntomas más temprano respecto a cada patógeno individualmente.
• Diseñar, validar o/y aplicar estrategias más precisas de monitoreo de
enfermedades conjuntas, con el fin de ofrecer una herramienta para el
diagnóstico y seguimiento asertivo de estos dos agentes causales del
marchitamiento vascular.
2. Capítulo 2.
Bacterias ácido lácticas, potenciales

biocontroladoras de Fusarium oxysporum f.
sp. lycopersici (Fol) y Ralstonia
solanacearum (Rs)
2.1 Resumen
Aunque el control químico es la herramienta más utilizada para el manejo de
agentes causales de la marchitez vascular fúngica o bacteriana, el uso de
biocontroladores es igualmente aceptado, no solo por su eficacia sino también como
opción de manejo más amigable con el ambiente. Los hongos del género
Trichoderma y bacterias del género Bacillus son los biocontroladores más utilizados.
Estudios recientes han demostrado que las bacterias ácido-lácticas (BAL) podrían
poseer actividad antagónica contra fitopatógenos, sin embargo, requieren mayor
exploración, particularmente para el caso de los patógenos Fol y Rs en cultivos de
tomate. Es así como el objetivo de este capítulo fue evaluar el efecto biocontrolador
de 68 cepas de BAL, del Banco de Germoplasma para la Alimentación y la
Agricultura, sobre Fol y Rs a nivel in vitro e in planta (plántulas de tomate).
Inicialmente, mediante la técnica in vitro, “spot on the Lawn”, cada una de las cepas
fue evaluada individualmente contra cada patógeno, de las cuales fueron
seleccionadas tres cepas por su alta inhibición para experimentos in planta.
Posteriormente, cada una de las BAL seleccionadas fueron evaluadas bajo dos
sistemas diferentes de aplicación, por inmersión en semilla y una aplicación en
drench a los 28 días. Los resultados revelaron que el comportamiento de estas
bacterias es dependiente del tipo de aplicación, sin embargo, la aplicación en
semilla de la cepa AC40 y AC49 registró 52,3% de eficiencia para el control de Fol,
68,6% para el control de Rs y 55,95% para el control de la mezcla de los dos
patógenos. Por último, mediante RT-qPCR, se observó que la aplicación de AC040
en semilla, induce el gen PR-1a en cualquiera de los diferentes patógenos

evaluados y mientras que con el gen LOXA solo se indujo en el modelo de
coinfección, por el contrario se presentó una reducción de la expresión de ERF1 en
los tratamientos con Rs.
Palabras clave
Bacterias acido lácticas, coinfección, in vitro, in planta, control biológico.

2.2 Estado del arte
Las estrategias de manejo de enfermedades causantes de marchitamiento vascular
en tomate están ampliamente estudiadas y a pesar de su alto impacto económico,
generan colateralmente oportunidades para el desarrollo de nuevas tecnologías
eficientes, amigables con el medio ambiente y aplicables para el productor. En este
capítulo, se recopila información de estrategias de manejo, su funcionamiento y
cómo el uso de bacterias acido lácticas se muestra como una oportunidad
promisoria para el control de estos dos patógenos, no solo en forma individual, sino
también, en un modelo de coinfección desarrollado en el capítulo anterior.
2.2.1 Uso de plaguicidas y la urgencia de un cambio

Actualmente, el manejo fitosanitario en los sistemas productivos agrícolas se ha
realizado a base de compuestos de origen sintético donde predominan compuestos
halogenados, carbamatos y organofosforados (Nawaz et al. 2016), los cuales han
contribuido a la expansión de áreas de producción, incrementando así el
rendimiento y supliendo la demanda de alimentos (Lamichhane et al. 2016; Oerke
2006). No obstante, el avance de la ciencia en múltiples campos ha permitido
concientizar sobre el impacto de estos compuestos no solo a nivel humano, sino
también animal, microbiológico y ecológico, provocando de esta manera, la
limitación de productos agrícolas en los mercados del primer mundo (Bozzini 2017;
Donley 2019). Así mismo, durante décadas, el uso indebido y continuo de estos
compuestos, ha conllevado a la pérdida de efectividad por medio del desarrollo de
resistencia por parte del patógeno, al igual que el costo del desarrollo de tales
productos químicos (Borel 2017; Curutiu et al. 2017). Por consiguiente, uno de los
grandes desafíos de la agricultura del siglo XXI, es el control eficiente de patógenos
mediante alternativas limpias, ecológicas y de mínimo impacto sobre la salud
humana, animal, microbiológica y ambiental.
2.2.2 Control biológico, una alternativa amigable ambientalmente

Hoy en día, el interés por el desarrollo de nuevas tecnologías eficaces y amigables
ambientalmente, ha derivado en la disminución del predominio de pesticidas de
origen sintético en el manejo integrado de patógenos como Fol y Rs en tomate, lo
cual ha abierto una oportunidad de inclusión de múltiples estrategias de carácter
preventivo como el uso de compostajes, aplicaciones de vaporización o
solarización, prácticas culturares para cambios en el pH del suelo, rotación de
cultivos, uso de variedades resistentes, aplicación de aceites esenciales, fumigación
del suelo con fitobiocidas entre muchos otros, que no han resultado individualmente
eficaces a largo plazo para el control de estos patógenos (McGovern 2015; Yuliar
et al. 2015).
Otra de las herramientas más utilizadas y estudiadas para suplir el uso de

compuestos de síntesis química en los esquemas de manejo integrado de
enfermedades es mediante el uso de agentes de control biológico (ACB), entre ellos
hongos, bacterias y virus que predominan mediante sus múltiples mecanismos de
acción (Cotes 2018). Por un lado, los mecanismos pueden ser directos como el
parasitismo (Lobna et al. 2017), la antibiosis (Elanchezhiyan et al. 2018; Xue et al.
2019) o la producción de compuestos volátiles con actividad antimicrobiana (Jangir
et al. 2018a; Raza et al. 2016), o son indirectos mediante el cambio en las
condiciones del medio donde crecen (Jangir et al. 2018b), la competencia por
nutrientes (Bidellaoui et al. 2019; Marian et al. 2018), promoción de crecimiento
(Jangir et al. 2018b; Tahir et al. 2017) o la inducción de resistencia en la planta
(Abbasi et al. 2019; Tahir et al. 2017).
Del mismo modo que existen diferentes mecanismos de acción de los ACB, también
hay una gran versatilidad de sus formas de aplicación, que van desde suspensiones
de células puras (Cotes 2018), en células formuladas con excipientes que permitan
mayor viabilidad (Keswani et al. 2016), en forma endófita con la planta (Latz et al.
2018), usando insectos polinizadores (Dromph 2001) y mediante suelos supresivos
o comunidades sintéticas (García Valderrama 2018). Estas características permiten
aventajar el control biológico respecto a otro tipo de estrategias de manejo de
enfermedades (Cotes 2018). Sin embargo, es importante resaltar que para un
control fitosanitario exitoso es necesario la intercalación de varias estrategias de
manejo (Bannihatti and Suryawanshi 2019; McGovern 2015).
2.2.3 Bacterias ácido lácticas, una alternativa promisoria para el

control de enfermedades
Actualmente el mercado de bioproductos para el control de Fol y Rs es dominado
por formulaciones con ingredientes activos a base de hongos del género
Trichoderma y bacterias del género Bacillus. Sin embargo, la producción de
compuestos con efectos sobre la salud humana como cereulidas y trilonginas por
parte de estos biocontroladores, es aún desconocida (Bauer et al. 2018; Weinhold
2013). Por tanto, el uso de BAL surge como una alternativa promisoria en el
mercado, al poseer categoría GRAS, generally recognized as safe. (Varsha and
Nampoothiri 2016).
55
Las BAL son un grupo heterogéneo de bacterias Gram positivas que abarcan casi
30 géneros y se caracterizan bioquímicamente por oxidar azúcares como principal
ruta metabólica, ser catalasa negativas, no mótiles, no formadoras de esporas,
anaerobias facultativas y productoras de ácido láctico (Axelsson 2004); aunque
existen reportes de BAL formadoras de esporas o Gram negativas (Khalid 2011).
Además, su amplia capacidad productiva de compuestos ha despertado el interés
en múltiples campos dedicados a la conservación de alimentos, producción de
probióticos, producción de antibióticos y en el caso de la agricultura como
biofertilizantes y ACB (Lamont et al. 2017).
La mayoría de las BAL reportadas con ACB han sido reconocidas por sus múltiples
mecanismos de acción, de los cuales la promoción de crecimiento, la competencia
nutricional y la inducción de resistencia son los más reportados (Konappa et al.
2016; Lamont et al. 2017; Peyer et al. 2016). Su funcionalidad agrícola les permite
ser usadas en procesos de descomposición de material orgánico en el suelo
(Lamont et al. 2017), permitiendo ser empleadas en compost en forma individual o
en consorcios microbianos eficaces (Ahn et al. 2014), de esta forma las plantas
inoculadas con estos productos además de mostrar incrementos en crecimiento y
producción también han mostrado reducción en ataques de patógenos, mediante el
engrosamiento de la pared celular, procesos del sistema de inmunidad basal
constitutivo e inducción de resistencia (Agrios 2005; Konappa et al. 2016).
2.2.4 Inducción de resistencia mediada por BAL

Actualmente, una de las cualidades de mayor importancia de las BAL como ACB es
su capacidad de mediar bioquímicamente las diferentes vías de señalización, las
cuales permiten a la planta actuar contra uno o varios tipos de estrés de naturaleza
biótica o abiótica (Atkinson and Urwin 2012; Blainski et al. 2017; Konappa et al.
2016; Lemos Blainski et al. 2018) defensa vegetal hace parte de esta red de
señalización, en la cual, las fitohormonas como el ácido abscísico (ABA), ácido
salicílico (AS), ácido jasmónico (AJ) y etileno (ET) actúan como reguladores de
acuerdo con su concentración y composición, ante los diferentes tipos de estrés
mediante una compleja interconexión (Hammerschmidt 2009; Spoel et al. 2007).
Ácido abscísico. Es una pequeña molécula de la familia de los sesquiterpenos que

regula procesos fisiológicos como la germinación de semillas y crecimiento radical
y está asociada principalmente a procesos de estrés abiótico como desecación,
sequía, acumulación de cadmio y radiaciones UV (Vishwakarma et al. 2017).
Adicionalmente, la regulación de este compuesto ante el cierre estomático puede
asociarse como una medida contra agentes bióticos. Sin embargo, su acción
antagónica sobre las otras vías de defensa reguladas por otras fitohormonas como
AS (Jiang et al. 2010), también ha permitido que el ABA sea empleado como un
factor de virulencia de agentes patogénicos como Cercospora risicola, Ceratocystis
fimbriata y Magnaporthe grisea (Chanclud and Morel 2016).
Ácido salicílico. Esta fitohormona, regula una compleja vía de activación

bioquímica que conlleva a la activación de proteínas que permiten actuar frente al
ataque de patógenos biótrofos y hemibiótrofos y se asocia con la resistencia basal
y la resistencia sistémica Adquirida (SAR) (Hammerschmidt 2014). Dentro de este
desencadenamiento génico, se han empleado genes como marcadores propios de
esta ruta de señalización, entre éstos se encuentran, PR1 (pathogenesis-related
protein1), el cual se activa después de la síntesis de esta hormona y PAL
(phenylalanine ammonia lyase), que pertenece al metabolismo de fenilpropanoides
y facilita el aumento fenoles (Heil 2014; Shine et al. 2016).
Ácido jasmónico. Este compuesto y sus metabolitos estructuralmente

relacionados son derivados de lípidos que se encuentran asociados con la
regulación de la defensa contra microorganismos necrótrofos e insectos herbívoros
mediante la vía de la biosíntesis de oxilipina por medio de lipooxigenasas (Gfeller et
al. 2010). El gen LOXA (lipoxygenase a), ha sido empleado como un marcador
genético de esta ruta de señalización. Esta fitohormona presenta diafonía
antagónica con SA (Di et al. 2017; Robert-Seilaniantz et al. 2011), en cambio, con
la vía de señalización del ET se presenta de forma convergente (Pieterse et al.
2014).
Etileno. Por último, esta hormona volátil, que además de participar en procesos
como la senescencia, la abscisión, la floración, la maduración de frutos y la
germinación de semillas, también se encuentra asociada a vías de resistencia
contra patógenos (Pieterse et al. 2014). Uno de los marcados más empleados para
detectar la activación de esta vía, ha sido ERF1 (ethylene response factor 1), el cual
ha sido asociado en respuesta de microorganismos de biología necrótrofa (Jia et al.
2013).
Con base en lo mencionado anteriormente, en el presente capítulo, se evaluó la

capacidad antagónica de las BAL a nivel in vitro e in planta contra Fol y Rs, utilizando
el modelo de coinfección propuesto en el capítulo 1 de este trabajo. Así mismo, se
caracterizaron molecularmente las diferentes vías de señalización relacionadas con
el sistema de defensa en cada una de las diferentes interacciones.
57
2.3 Materiales y métodos
2.3.1 Sitio de estudio

Los experimentos se realizaron en las instalaciones del Laboratorio de Microbiología
Agrícola de la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria,
AGROSAVIA en el Centro de Investigación Tibaitatá, ubicado en Mosquera,
Cundinamarca, Colombia.
2.3.2 Microorganismos
68 cepas de Bacterias acidolácticas (BAL) aisladas de ensilajes (Anexo E),
provenientes de la colección de microorganismos con interés en Nutrición Animal
del Banco de Germoplasma para la Alimentación y la Agricultura fueron evaluadas
en el presente estudio.
La cepa de Rs empleada en los presentes experimentos fue la cepa C1 aislada y

seleccionada por su virulencia en el capítulo anterior.
La cepa de F. oxysporum f. sp. lycopersici, Fol59, empleada en este estudio fue

previamente aislada, caracterizada molecular y patológicamente en estudios
previos realizados por Gómez Marroquín (2019) y Carmona Gutiérrez (2019).
2.3.3 Evaluación in vitro de la actividad antagónica de BAL vs. los

patógenos Fol y Rs
La capacidad inhibitoria de las BAL se determinó sobre cada uno de los patógenos
por separado mediante la técnica “spot on the Lawn” (Castilho et al. 2019). Sin
embargo, ante el número de tratamientos posibles se realizó un ensayo exploratorio
inicial con el fin de depurar la mayor cantidad de cepas. A partir de cultivos de las
BAL crecidos en caldo MRS de 24 horas a 37°C +/- 2°C, se inoculó cinco microgotas
de volumen de 10 µL a una concentración de 1x10 8 células.mL-1 en una caja de
Petri con 15 mL de Agar MRS; posteriormente, se dejó secar durante media hora y
se incubó a 37°C+/- 2°C durante 24 horas. Después de la formación de colonias
visibles se añadió agar nutritivo o PDA semisólido (0.85%) mezclado con una
concentración de 1x104 ufc.mL-1 de Rs o Fol59 a 1x104 microconidios.mL-1
respectivamente. Se dejó solidificar durante cinco minutos y se incubó a 28°C+/-
2°C durante 48 horas, finalmente, se seleccionaron las cepas que presentaron algún
grado de inhibición (Figura 11).
a b c
d e f
Figura 11. Imágenes representativas de los tres tipos de inhibición contra Fol y Rs
formados por las BAL cuando se sembraron cinco gotas. a. Testigo Fol59; b. Nula
inhibición de Fol59; c. Inhibición de Fol59; d. Testigo Rs (C1); e. Nula inhibición de
Rs (C1); f. Inhibición de Rs(C1).
Posteriormente, empleando la misma técnica descrita anteriormente, con la única

diferencia de sembrar una gota de 10 µL de BAL en Agar MRS, se evaluó la
capacidad inhibitoria de las BAL seleccionadas por cada uno de los patógenos. Bajo
un diseño completamente al azar generalizado, el experimento contó con 5
repeticiones y se repitió tres veces en el tiempo, en el cual la unidad experimental
consistió en una caja de Petri. El área de inhibición se obtuvo a partir del análisis de
imágenes mediante el software ImageJ 1.52. Posteriormente, los datos de los
tratamientos que presentaron el mayor efecto significativo sobre los dos patógenos,
fueron sometidos a un análisis de conglomerados utilizando el promedio como
vínculo y una distancia euclidiana al cuadrado. Los tres mejores tratamientos fueron
seleccionados para usarse en los ensayos in planta.
2.3.4 Evaluación in planta de la actividad antagónica de BAL vs.

los patógenos Fol y Rs
Las BAL seleccionadas a partir de los resultados de las pruebas in vitro, fueron
evaluadas in planta en dos momentos diferentes de inoculación; en semilla, por
inmersión durante 10 minutos en suspensiones de BAL a 1x10 8 células.mL-1 y 28
días después de la siembra aplicando 5 mL de BAL a 1x10 8 células.mL-1 sobre el
59
sustrato. Se siguió implementando el mismo modelo de bioensayo descrito en el

capítulo anterior (numeral 1.4.2).
Se implementó un diseño completamente al azar en un arreglo factorial 3x2x4, con

tres repeticiones, la unidad experimental contó con 5 plantas, se evaluaron 3 cepas
inoculadas en los dos momentos diferentes (semilla y sustrato 28 días post-siembra:
primer factor) en suelos estériles infestados con Fol59 y Rs de forma individual y en
mezcla, contrastados en suelo sin ninguna aplicación (segundo factor). El
experimento tuvo una duración de 24 días y se mantuvo a 28°C+/- 2°C y 60% HR.
La incidencia y la severidad se registraron cada tres días siguiendo las escalas
descritas por Rongai et al. (2017) para Fol y Fol+Rs y por Zheng et al. (2017) para
Rs. Inicialmente, con los datos obtenidos se calculó el índice de severidad descrito
por Chiang et al. (2017) por cada momento de muestreo (ecuación 5),
posteriormente, se calculó el área bajo la curva del progreso de la enfermedad de
acuerdo con Pedroza and Samaniego (2009) (ecuación 2), seguido del porcentaje
de eficacia mencionado por Elshahawy et al. (2018) el cual se calcula de acuerdo
con la ecuación 6.
Ecuación 5
Σ ( 𝐹𝑟𝑒𝑐𝑢𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒 𝑐𝑎𝑑𝑎 𝑛𝑖𝑣𝑒𝑙 𝑑𝑒 𝑒𝑛𝑓𝑒𝑟𝑚𝑒𝑑𝑎𝑑 ∗ 𝑛𝑖𝑣𝑒𝑙 𝑑𝑒 𝑒𝑛𝑓𝑒𝑟𝑚𝑒𝑑𝑎𝑑)

IS % = ∗ 100
( # 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑜𝑏𝑠𝑒𝑟𝑣𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛𝑒𝑠) ∗ (𝑁𝑖𝑣𝑒𝑙 𝑚á𝑥𝑖𝑚𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑒𝑛𝑓𝑒𝑟𝑚𝑒𝑑𝑎𝑑)
Donde:
Y : Es el % de la enfermedad (severidad)
t : Tiempo en días transcurrido
Ecuación 6
(𝑇𝑟𝑎𝑡𝑎𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑡𝑒𝑠𝑡𝑖𝑔𝑜 − 𝑇𝑟𝑎𝑡𝑎𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜)

𝐸𝑓𝑖𝑐𝑎𝑐𝑖𝑎 = ∗ 100
𝑇𝑟𝑎𝑡𝑎𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑡𝑒𝑠𝑡𝑖𝑔𝑜
2.3.5 Vías de señalización activadas por las plantas de tomate

inoculadas con BAL en el modelo de coinfección
Con el propósito de dilucidar si el efecto biocontrolador de las BAL está asociado
con la inducción de resistencia, se empleó un análisis de expresión diferencial de
genes marcadores asociados a cada una de las diferentes vías de señalización
dentro de un diseño completamente al azar con un arreglo factorial 4x2x3 con tres
réplicas técnicas. Siguiendo la metodología descrita en la sección 2.3.4, se empleó

el mismo modelo de bioensayo, en el cual, se evaluaron las plantas sin inóculo y
plantas inoculadas con el tratamiento de BAL con mayor eficacia contra Fol, Rs y la
mezcla de los dos patógenos a 0, 24 y 48 horas post inoculación.
Extracción de ARN. Grupos de tres plantas fueron macerados en nitrógeno líquido,

el producto resultante se trasfirió a tubos de 2 mL, se adicionó 600 µL de Plant RNA
reagent (Invitrogen) y se agitó en vortex durante 1 minuto hasta la suspensión total
del tejido en el reactivo. Luego, se incubó durante 5 minutos en un rotador de tubos
o un balancín y se aclaró la solución mediante centrifugación durante 3 minutos a
13.000 rpm a temperatura ambiente. El sobrenadante obtenido, se transfirió a un
tubo de 2 mL libre de RNasa. Inmediatamente, se añadió 100 µL de NaCl a 5M y
300 µL de cloroformo-alcohol isoamílico (24: 1), se mezcló muy bien mediante
inversión y se centrifugó a 13.000 rpm durante 10 min a 4°C para la separación de
fases, la fase acuosa (la fase superior) se transfirió nuevamente a un tubo eppendorf
de 2 mL libre de RNasa. Enseguida, se adicionó LiCl a 4M en un volumen de ¾
respecto a la muestra (aproximadamente 450 µL) y alcohol isopropílico en un
volumen de ¼ respecto a la muestra (aproximadamente 150 µL), se mezcló por
inversión, se precipitó mediante incubación a 20°C durante 1 hora y se centrifugó a
13.000 rpm durante 25 min a 4°C. Después, teniendo cuidado de no tocar el pellet,
se eliminó el sobrenadante empleando una micropipeta, se añadió 1 mL de etanol
al 75% previamente enfriado para sedimentar el producto y se centrifugó a 13.000
rpm durante 5 min a 4°C. Posteriormente, se retiró el etanol cuidadosamente con
una micropipeta y nuevamente se centrifugó durante dos minutos para eliminar el
líquido residual. Finalmente, la muestra se dejó secar en hielo durante 15 minutos
aproximadamente y se resuspendió el pellet en 30 µL de agua libre de RNasa. Con
el fin de verificar la calidad del ARN extraído, se corrió un gel de electroforesis de
agarosa al 2% y usando espectrofotometría a una relación de 260/280 y 260/230 se
determinó la concentración y pureza con un equipo NanoDrop-ND-1000.
Síntesis de ADNc. El ARN total extraído del material vegetal fue tratado con
Ambion ™ DNasa I (sin RNasa) siguiendo el protocolo descrito en el anexo H con
el propóosito de eliminar el posible ADN genómico contaminante, con el fin de
verificar la calidad del ARN procesado, nuevamente se corrió un gel de
electroforesis de agarosa al 2% y usando espectrofotometría a una relación de
260/280 y 260/230 se determinó la concentración y pureza con el equipo NanoDrop-
ND-1000. Con el ARN total procesado, se sintetizó el ADN complementario
empleando ProtoScript First Strand cDNA Synthesis Kit E6300S de New England
Biolabs siguiendo las instrucciones del fabricante; posteriormente, todas las
muestras se ajustaron a 250 ng/µL como material de partida. El producto obtenido
61
se sometió a una PCR en tiempo final con el objetivo de verificar la presencia de

ADNc, para ello, se emplearon los cebadores LeEF1aqF y LeEF1aqR que
amplifican una región constitutiva del factor de elongación en tomate y se emplearon
las condiciones descritas a continuación (Tabla 7).
Tabla 7. Condiciones de PCR descritas para la amplificación de la región del factor

de elongación en tomate
Anillamiento 62 30 segundos 35
Extensión 72 1 minuto
4 -
PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR). Empleando el kit Platinum™ SYBR™

Green qPCR SuperMix-UDG y siguiendo las recomendaciones del autor, fueron
realizadas por triplicado todas las reacciones de qRT-PCR a un volumen final de 10
µL.
En primer lugar, con los genes descritos en la Tabla 8, se determinó la eficiencia de

amplificación empleando ADN de tomate a concentraciones de 14,5, 1,45, 0,145,
0,0145 y 0.00145 ng/µL con el fin de generar una curva estándar para verificar la
eficiencia de los cebadores y seleccionar la cantidad de ADNc a utilizar en las
reacciones finales. Los cebadores así como los parámetros utilizados para las
reacciones de qPCR (Tabla 9) se seleccionaron y ajustaron de acuerdo al estudio
realizado por Carmona Gutiérrez (2019). Con el fin de validar la no formación de
dímeros, se realizó con cada uno de los cebadores un ciclo desde 65 a 95 °C
correspondiente a la curva de disociación (Melting curve). Además, se incluyó para
cada una de las diferentes placas un control de la reacción sin ADN (NTC, No
Template Control) y el control negativo usado en la sintesis de ADNc (NRT, no
reverse transcriptase control).
Tabla 8. Cebadores para genes marcadores de vías de respuesta de resistencia en

plantas de tomate descritos por Carmona (2019)
Nombre Secuencia Gen y ruta de Fuente

cebador señalización
LeEF1aqF GATTGGTGGTATTGGAACTGTC EF1a, gen (Martínez-
LeEF1aqR AGCTTCGTGGTGCATCTC normalizador. Medina et al.,
Factor de 2013)
elongación tomate
LeERF1qF GAGGGGTCCTTGGTCTCTACTC ERF1, Factor de (Huang et al.,
LeERF1qR ACAGCAGCTGGAGATAATCCAT respuesta a etileno 2004)
y ácido jasmónico
LeLOXAqF GAAAAACCCCGATAAGGCAT LOXA, (León, 2013)
LeLOXAqR AGGAGACTCTCGTTGTCCGA Lipooxigenasa A,
inducida por MeJA
(Metil jasmonato)
LePALqF CGTTATGCTCTCCGAACATC PAL, Fenil alanina (Martínez-
LePALqFR GAAGTTGCCACCATGTAAGG amonio liasa, Medina et al.,
biosíntesis de SA 2013)
LePR1aqF GTGGGATCGGATTGATATCCT PR1a, Inducible por (Martínez-
LePR1aqR CCTAAGCCACGATACCATGAA ácido salicílico Medina et al.,
2013)
Tabla 9. Condiciones de qRT-PCR usadas por Carmona (2019) para la

amplificación de todos los cebadores descritos en la Tabla 8
Preparación base 50 2 minutos 1

40
Anillamiento 62 30 segundos
Melting curve 65 - 95 30 segundos 1
En segundo lugar, ya seleccionada la concentración de material genético a utilizar

y las condiciones de qRT-PCR, se realizó la amplificación de cada uno de los genes
a partir del ADNc de cada muestra, y se analizó la expresión diferencial de cada
uno de ellos bajo el método de cuantificación relativa usando el modelo matemático
de relación de expresión génica (REG) descrito por Pfaffl (2001) (ecuación 7). Para
ello se utilizó como referencia el gen EF1a, y como calibrador, el tratamiento testigo
sin inoculación de BAL y sin patógenos en cada uno de los diferentes tiempos.
63
Ecuación 7
𝐸𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎𝑔𝑒𝑛 𝑜𝑏𝑗𝑒𝑡𝑖𝑣𝑜 𝛥𝐶𝑃 𝑔𝑒𝑛 𝑜𝑏𝑗𝑒𝑡𝑖𝑣𝑜 (𝑐𝑎𝑙𝑖𝑏𝑟𝑎𝑑𝑜𝑟−𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎)

𝑅𝐸𝐺 =
𝐸𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎𝑔𝑒𝑛 𝑟𝑒𝑓𝑒𝑟𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 𝛥𝐶𝑃 𝑟𝑒𝑓𝑒𝑟𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 (𝑐𝑎𝑙𝑖𝑏𝑟𝑎𝑑𝑜𝑟−𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎)
2.3.6 Análisis estadísticos

Todos los datos obtenidos de las diferentes pruebas se sometieron a un análisis de
normalidad, independencia de los errores y homocedasticidad de varianza mediante
las pruebas de Shapiro-Wilk, Durbin Watson y Levene. Dependiendo del
cumplimiento de estos postulados, el análisis estadístico varió.
Para los ensayos in vitro, los datos obtenidos para cada patógeno se analizaron por
separado. Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) de una sola vía y pruebas de
comparación de medias utilizando la prueba de Tukey con un nivel de significancia
del 95%. Al no presentarse efecto significativo por parte de los experimentos en el
tiempo, se hizo una reducción del modelo para emplear la mayor cantidad de grados
de libertad en los tratamientos.
Para la prueba de evaluación de la eficacia de las BAL, los datos se analizaron

mediante modelos lineales generalizados mixtos (MLGM), donde la parte fija del
modelo correspondió al tratamiento y la parte aleatoria a las repeticiones. En cuanto
a los resultados de normalidad e independencia de los errores, todas las variables
presentaron una distribución binomial y errores no correlacionados; el modelo se
seleccionó por los coeficientes de AIC y BIC, siendo los valores más bajos el
indicativo de mejor ajuste del modelo.
De la misma manera, para la evaluación de expresión diferencial, los datos fueron

analizados mediante MLGM con datos de la familia gamma y enlace log, donde la
parte fija del modelo correspondió a los tratamientos en interacción con la aplicación
de la BAL, y la parte aleatoria, a las repeticiones y la hora post inoculación; el modelo
se seleccionó por los coeficientes de AIC y BIC, siendo los valores más bajos el
indicativo de mejor ajuste del modelo.
Las pruebas de Shapiro-Wilk, y ANOVA se realizaron con el paquete stats v3.6.1,

las pruebas de Durbin Watson y Levene fueron realizadas con los paquetes, lmtest
y car respectivamente (Fox et al. 2012; Hothorn et al. 2019) y el modelamiento lineal
generalizado mixto se realizó con el paquete glmm (Knudson et al. 2012). Todas las
gráficas fueron realizadas empleando el paquete Plotly versión 4.9 (Sievert et al.
2019). Todos los paquetes mencionados anteriormente se ejecutaron utilizando el
software estadístico R, versión 3.6.1.
2.4 Resultados y discusión
2.4.1 Actividad antagónica in vitro de BAL vs. los patógenos Fol y

Rs
Del ensayo exploratorio inicial, las cepas AC06, AC07, AC08, AC09, AC10, AC13,
AC14, AC16, AC19, AC20, AC23, AC24, AC25, AC30, AC31, AC32, AC33, AC34,
AC35, AC36, AC37, AC39, AC40, AC41, AC49, AC50, AC59 Y AC60 presentaron
algún grado de inhibición contra Fol. Por otro lado, solamente las cepas AC04,
AC11, AC12, AC27 y AC28, presentaron una inhibición nula de Rs (Figura 11).
Cabe resaltar que para algunos tratamientos, a pesar de haberse presentado

inhibición contra los patógenos cuando se usaron cinco gotas, al momento de
sembrar una sola gota, los comportamientos variaron, presentando una inhibición
total, leve o nula (Figura 12), un ejemplo ilustrativo, fue la inhibición de Fol59 por
parte de AC06 (Figura 13). Este comportamiento podría explicarse por el
mecanismo de quorum sensing, ya que altos niveles poblacionales de bacterias
pueden mediar la producción de compuestos con actividad antimicrobiana, por
ejemplo, la producción de compuestos inhibidores del crecimiento de varios
patovares de Xanthomonas como Cumacina 1 y Cumacina 2 son dependientes del
nivel poblacional de la bacteria biocontroladora P. aeruginosa cepa CGK-KS-1
(Kanugala et al. 2019). Así mismo, en BAL también se han reportado compuestos
con efectos antimicrobianos como la nisina y la lacticina producidas por Lactococcus
lactis, la lactocina S y sakacina producidas por L. sake, la carnobacteriocina BM1 y
B2, producida por Carnobacterium piscicola y las plantaricinas producidas por L.
plantarum, la cuales son dependientes del quorum sensing (Kuipers et al. 1998).
65
Figura 12. Imágenes representativas de los diferentes resultados de las pruebas de

inhibición empleando una sola gota de BAL. a. Testigo Fol; b. leve inhibición de Fol;
c. Inhibición de Fol; d. Testigo Rs; e. leve inhibición de Rs; f. Inhibición de Rs.
Figura 13. Comparación inhibitoria in vitro de AC06 sobre Fol59. a. Testigo; b.

inhibición con cinco gotas; y c. inhibición con una gota.
Al evaluar cuantitativamente la capacidad inhibitoria de las cepas, se observó un

efecto por parte de las cepas AC13, AC16, AC40 y AC49, las cuales inhibieron
significativamente el crecimiento de Fol59 (p < 0,05), con rangos de inhibición
medios entre 30 cm2 y 49 cm2. Por otro lado, las cepas AC07, AC13, AC20, AC21,
AC22, AC25, AC29, AC30, AC32, AC40, AC49 y AC50 inhibieron significativamente
el crecimiento de Rs con rangos de inhibición entre 50 cm2 y 60 cm2 (p < 0,05). Al
observar la Figura 14, se pudo observar la construcción de dos grupos, de los cuales
en el primero se ubicaron las cepas que presentaron mayores efectos contra los
patógenos, lo que permitió seleccionar a las cepas AC13, AC40 y AC49 para los
ensayos posteriores.
Figura 14. Análisis conglomerado utilizando el promedio de inhibición de BAL como

vínculo y una distancia euclidiana al cuadrado
Estos resultados confirman lo registrado en trabajos anteriores, donde se demuestra

la capacidad inhibitoria de las BAL sobre un gran número de microorganismos en
los que se encuentran los patógenos de este estudio. La inhibición de Rs por parte
de estas bacterias está asociada a diferentes compuestos entre ellos las
bacteriocinas, las cuales en ensayos in vitro han demostrado actividad contra una
variedad de fitobacterias como X. axonopodis pv. citri, causante del chancro de los
cítricos, X. campestris pv. vesicatoria causante de las manchas bacterianas en los
pimientos y tomates, Erwinia pyrifoliae causante del fuego bacteriano en rosáceas,
Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum causante de la pudrición húmeda
bacteriana en papa y Rs (Shrestha et al. 2009). Por otro lado, la inhibición de Fox
por parte de estas bacterias es aún más estudiada, ya que debido a la amplia
cantidad de compuestos como ácidos grasos, ácidos orgánicos y compuestos
proteicos (Gajbhiye and Kapadnis 2016), pueden inhibir la germinación de los
microconidios y crecimiento hifal (Zebboudj et al. 2014), además pueden eliminar
las micotoxinas como deoxinivalenol, zearalenona y fumonisinas permitiendo
detoxificar el medio de crecimiento (Niderkorn et al. 2006).
67
2.4.2 Actividad biocontroladora in planta de BAL vs. los

patógenos Fol y Rs
Los tratamientos evaluados presentaron interacción con el momento de aplicación
(p < 0,05), por consiguiente, se realizó una reducción del modelo eliminando la
evaluación individual de las cepas y la evaluación individual del momento de
aplicación, esto con el fin de utilizar más grados de libertad para la evaluación de
los tratamientos.
A pesar de que los análisis fueron realizados por patógeno, de acuerdo con la Figura
15, se observó una tendencia de la eficacia por parte de la cepa AC40 aplicada en
semilla y al momento del trasplante y AC49 aplicado en semilla presentaron
eficacias de 40,39%, 40,6% y 35,6% contra Fol respectivamente, contra Rs
presentaron 62,21%, 70,3% y 60,7% y contra la mezcla 51,6%, 47,5% y 50,8%
respectivamente (Tabla 10). Dichos resultados demuestran que la efectividad de las
BAL evaluadas en el presente estudio para el control de patógenos es específica de
la cepa.
Figura 15. Imágenes representativas de la cepa BAL AC40 aplicada en semilla

respecto al testigo en las pruebas in planta al día 20 post inoculación. a. Testigo
absoluto; b. Testigo Rs; c. Testigo Fol; d. Testigo Fol + Rs; e. AC40 en semilla; f.
AC40 en semilla + Rs; g. AC40 en semilla + Fol; h. AC40 en semilla + Fol +Rs.
Tabla 10. Eficacia de las BAL contra Fol, Rs y Fol + Rs, datos calculados a partir
del área bajo la curva del índice de severidad; E. Eficacia; Ds. Desviación estándar.
Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05)
Fol Rs Fol + Rs
Tratamien E (%) Ds E (%) Ds E Ds
tos (%)
A13 17,27 ± a 35,60 ± 17,73 a 3,55 ± 5,68 a
(semillas)
21,16
A13 40,67 ± bc 70,34 ± 8,71 b 47,5 ± 14,99 b
(trasplante)
20,43 4
AC40 52,30 ± c 68,65 ± 13,80 b 55,9 ± 20,83 b
(semillas)
20,32 5
AC40 40,39 ± bc 62,21 ± 17,72 b 51,6 ± 18,31 b
(trasplante)
26,12 5
AC49 35,57 ± bc 60,70 ± 12,18 b 50,0 ± 18,48 b
(semillas)
17,01 8
AC49 -2,27 ± a 36,38 ± 19,09 a 45,6 ± 10,49 b
(trasplante)
41,86 2
A pesar del enfoque monopatogénico, la actividad biocontroladora de las BAL en la

enfermedad de la marchitez vascular en tomate ya ha sido comprobada en
diferentes trabajos. Konappa et al. (2016) registraron un 61,1% de reducción de la
enfermedad de marchitez bacteriana en tomate. Mientras que Hamed et al. (2011)
de forma indirecta reportaron la actividad de estas bacterias mediante un incremento
significativo en el peso freso y longitud de la raíz cuando la semilla de tomate era
impregnada con el ACB y se trasplantaba en presencia de inóculo de Fol en el suelo.
Una explicación a este fenómeno es debido a que la interacción entre las BAL, la
planta y el patógeno dentro de un medio pueden estimular los mecanismos para el
control de patógenos (Lamont et al. 2017), como la promoción de crecimiento
mediante el aumento de fitohormonas, las cuales estimulan el desarrollo de
defensas pasivas estructurales en la planta como el aumento del grosor de la pared
celular y aumento de células en la zona radical (Agrios 2005; Hamed et al. 2011;
Konappa et al. 2016; Shrestha et al. 2014), la capacidad de producir compuestos
antimicrobianos y detoxificadores, como el ácido láctico y bacteriocinas que alteran
el medio donde crecen desfavoreciendo directa o indirectamente a patógenos del
suelo (Niderkorn et al. 2006; Wang et al. 2014) y la capacidad de sus estructuras y
compuestos para inducir la resistencia sistémica (Konappa et al. 2016; Lemos
Blainski et al. 2018).
De acuerdo con los resultados obtenidos, se seleccionó la aplicación en semilla de

la cepa AC040 para evaluar sus efectos sobre las vías de señalización asociadas
con la resistencia sistémica.
69
2.4.3 Vías de señalización activadas por las plantas de tomate

inoculadas con BAL en el modelo de coinfección
Con el fin de estudiar el efecto de la aplicación de la BAL AC040 aplicada en semilla
sobre las vías de señalización relacionadas con el sistema de defensa en plantas
de tomate, se analizó la expresión diferencial de los genes marcadores vinculados
con la vía de señalización del ácido salicílico, PAL y PR-1a; la vía de señalización
del ácido jasmónico, LOXA; y con una vía entre el ácido jasmónico y el etileno,
ERF1.
La eficiencia de la amplificación de los genes se presenta en la Tabla 11, todos los

genes presentaron eficiencias superiores al 90%, sin embargo, dada a la
variabilidad presentada entre los diferentes genes, se optó por emplear el método
matemático con corrección de la eficiencia descrito por Pfaffl (2001) ya que de
acuerdo con Fleige et al. (2006), permite obtener resultados más confiables cuando
se emplean varios genes con diferentes eficiencias.
Tabla 11. Eficiencia de amplificación de genes de tomate evaluados durante el

análisis por PCR en tiempo real.
Gen Ruta asociada Pendiente Eficiencia

EF1a Factor de elongación -3,0778 2,1130385
tomate
ERF1 Etileno y ácido jasmónico -3,2136 2,0472812
LOXA MeJA (Metil jasmonato) -3,1819 2,0619476
PAL ácido salicílico -3,165 2,0699305
PR1a ácido salicílico -3,5779 1,90324
Ya establecido el método de cálculo, se analizaron los niveles relativos de expresión

de los genes ERF1, LOXA, PAL y PR-1a en tres diferentes tiempos post inoculación,
0, 24 y 48 horas mediante un MLGM. Para ello se seleccionó por cada uno de los
genes los modelos número 4, los cuales presentaron los menores coeficientes de
AIC y BIC, además, que estos no presentaron sobre dispersión ya que la relación
entre “deviance” y los grados de libertad oscilaron en valores menores a uno (sobre
dispersión >4). Sin embargo, los resultados indicaron un efecto significativo por
parte de las horas post inoculación, más precisamente cuando se registró la
expresión a las 48 horas para los genes ERF1, PAL y PR-1a (p < 0,05) y a las 24
horas para LOXA (anexo I). Por lo tanto, se realizó un segundo modelamiento por
cada uno de los genes solo con los tiempos que presentaron diferencias
significativas, con el fin de observar un efecto más conciso de las BAL en interacción
con cada uno de los patógenos y la planta.
Rs induce la expresión de ERF1, pero disminuye cuando las plantas son

inoculadas con BAL
Con los resultados representados en la Figura 16a, se registró la mayor expresión

del gen ERF1 cuando la planta libre de BAL era sometida a la coinfección con los
dos patógenos con un valor promedio de relación de expresión génica (REG) de 26,
es decir veintiséis veces mayor a las plantas sin ningún tipo de inoculo microbiano
y aunque no se encontró un efecto del factor BAL sobre la expresión de este gen (p
> 0,05), síi se observó una disminución cuando la planta es inoculada con esta
bacteria y enfrentada a la vez con los dos patógenos, ya que presentó solamente
una expresión ocho veces mayor respecto al testigo. Esta misma tendencia, pero
en menor medida, se presentó cuando la planta se inoculó solo con Rs, ya que
presentó valores REG de ocho cuando la planta no fue tratada con BAL y cuando
síi se trató con BAL presentó valores de uno. Por el contrario, la expresión de este
gen no cambió cuando la planta fue inoculada únicamente con Fol (p > 0,05), pero
síi aumentó un poco cuando la planta con este patógeno fue tratada con BAL, ya
que su expresión fue 3 veces mayor respecto al testigo. Estos resultados indican
cóomo la expresión de este gen está en función de la interacción entre BAL y los
diferentes patógenos (p < 0,05), pero, aun así, se presentó una relación entre el
aumento de ERF1 y la presencia de la Rs.
ERF1 es un gen asociado a un factor de respuesta del etileno, el cual permite inferir
la presencia de esta fitohormona en la célula vegetal. Por lo tanto, con los resultados
en este caso de estudio, surge la hipótesis de sí el ataque por parte de Rs podría
incluir la activación de esta ruta de señalización como una estrategia de virulencia,
y la adición de Fol a esta interacción estaría de alguna forma favoreciendo este
proceso, lo cual se traduciría en una más rápida expresión de los síntomas, lo cual
se presentó en la sección 1.4.3 de este trabajo. La expresión significativa de genes
asociados con el etileno en plantas susceptibles a Rs ya ha sido reportado en
estudios previos, uno de ellos, realizado por Zuluaga et al. (2015), quienes al
comparar el transcriptoma de accesiones de Solanum commersonii resistentes
como F118 y susceptibles como F97, encontraron cómo en el material susceptible,
la expresión de genes asociados al etileno fue uno de los mayores grupos
precedidos por aquellos asociados al estrés biótico y la modificación de la pared
celular, mientras que en el material resistente la expresión del grupo de genes
asociado a esta fitohormona fue de los menos expresados.
71
La aplicación de BAL en semilla induce PR-1a ante la presencia de los

patógenos
En este caso de estudio se observó cóomo la expresión del gen PR-1a no está en
función de la interacción de BAL con cada uno de los patógenos (p > 0,05), lo cual
indica que la activación de este gen no es especifica de cada tratamiento. De igual
forma se corroboró que la aplicación de BAL induce PR- 1a (p < 0,05) y que los
modelos monopatogénicos y el modelo de coinfección activan este gen de manera
específica (p < 0,05) (anexo I). Donde, de acuerdo con la figura Figura 16b la mayor
expresión del gen se dio en las plantas inoculadas con los dos patógenos con una
expresión 6 veces mayor respecto al testigo y aún más, cuando la planta se expuso
ante estos dos patógenos y fue previamente estimulada con BAL ya que la
expresión fue dieciocho veces mayor, esta misma tendencia se presentó cuando las
plantas solo se inocularon con Fol con valores REG de 1,7 solo con el patógeno y
16,6 cuando se inoculóo con BAL. de igual forma, pero en menor medida, contra Rs
presentó valores de 6 y 11 sin BAL y con BAL respectivamente. Con estos
resultados y sumados al hecho que la aplicación de BAL a plantas sin patógenos
también estimuló la expresión de este gen, sugieren una activación de estado de
alarma o priming sobre las plantas de tomate asociado a la vía hormonal del AS
(Conrath et al. 2002; Jung et al. 2009). Sin embargo, según la Figura 16c, no se
presentaronó diferencias significativas respecto a la activación del gen PAL (p >
0,05), el cual expresa fenilalanina amoníaco amonio liasa una enzima clave en una
de las dos vías reportadas para la biosíntesis del AS (Chen et al. 2009). Indicando
de esta manera que posiblemente en las plantas de este estudio se sintetizó AS
usando la vía alternativa de la isocoristamina sintasa (ICS) y de esta manera la
fitohormona permitió aguas abajo la expresión de PR-1a (Chen et al. 2009). La
capacidad de BAL para mediar la respuesta inducida por esta vía de señalización
ya ha sido reportada por Konappa et al. (2016), quienes al caracterizar
enzimáticamente bacterias de este grupo con alta actividad biocontroladora frente
a Rs en tomate, encontraron que se produjo una inducción significativa de
fenilalanina amoníaco liasa, la cual como se mencionó previamente, hace parte de
la ruta de señalización para la defensa contra patógenos biótrofos mediada por AS.
LOXA es inducido a las 24 horas por BAL ante la coinfección
Por último, se encontró un efecto de la interacción entre la aplicación de BAL y los

patógenos a las 24 horas (p < 0,05), en la cual, la mayor expresión de este gen se
obtuvo cuando la planta fue previamente tratada con BAL y luego sometida a los
dos patógenos, dado que su expresión fue treinta veces mayor respecto al testigo,
por el contrario, cuando las plantas fueron sometidas a los dos patógenos pero sin
la BAL se presentó una expresión de este gen cerca de la mitad respecto al testigo.
Ya que LOXA, es un gen asociado a las lipoxigenasas, las cuales forman parte de
la ruta de señalización del JA, encargada generalmente de la respuesta ante
necrótrofos y herbívoros (Diniz et al. 2017), surge la hipótesis de que quizás la
coinfección entre Fol y Rs evite la activación de la respuesta de la planta a sus fases
necrótrofas, agraviando las células vegetales, lo cual conduciría a una mayor
rapidez en la expresión de los síntomas (sección 1.4.3); mientras que la inoculación
preventiva con BAL permitiría la respuesta por parte de la planta y de esta manera,
esto se traduciría en un retraso en la aparición de los síntomas de la enfermedad
(sección 2.4.3).
ERF1 PR-1a
40
20 a
30 ab
a 15
ab
REG
20 10 abc
ab abc
REG
ab 5 abc bc
10 c
bc bcd
cd d cd 0
0 Absoluto Fol Fol+Rs Rs
Absoluto Fol Fol+Rs Rs Tratamientos
-10
Tratamientos
a. Con BAL Sin BAL b Con BAL Sin BAL
.
PAL LOXA
2,5 40
a
2 a 35 a
30
1,5
REG
a a a 25
1 a a
REG
20
a
0,5 15 ab
0 10 ab
ab
Absoluto Fol Fol+Rs Rs 5 ab ab b b
Tratamientos 0
Absoluto Fol Fol+Rs Rs
Con BAL Sin BAL Tratamientos

c. d.
Figura 16. Expresión relativa de los genes a. ERF1, b. PR-1a, c. PAL y d. LOXA, en plantas de tomate tratadas y no
tratadas con BAL, durante la interacción con modelos monopatogénicos (Rs y Fol) y un modelo sincrónico de coinfección
(Fol+Rs). Las gráficas a, b y c muestran la expresión relativa de los genes ERF-1, PR-1a y PAL a las 48h post inoculación
y la gráfica d. la expresión relativa del gen LOXA a las 24h post inoculación. Medias con una letra común no son
significativamente diferentes (p > 0,05).
2.5 Conclusiones y recomendaciones
2.5.1 Conclusiones
• Se evidenció por parte de las cepas AC13, AC40 y AC49 un efecto
estadísticamente significativo de inhibición frente a los dos patógenos a nivel
in vitro.
• Mediante evaluaciones in planta de las tres BAL aplicadas en dos diferentes
formas, en semilla y antes del transplante, se evidenció cómo la efectividad
de las BAL es específica de la cepa para el control de la enfermedad causada
por Fol, Rs o la coinfección entre estos dos patógenos.
• Rs induce la expresión de ERF1, el cual podría ser una estrategia de
virulencia por parte de esta bacteria, por el contrario, el tratamiento previo
con BAL disminuye la expresión de este gen.
• La aplicación con AC040 en la semilla de tomate indujo la expresión de genes
asociados a respuestas sistémicas, precisamente para los genes LOXA y
PR-1a.
75
2.5.2 Recomendaciones
• Profundizar en el estudio de consorcios o comunidades sintéticas
conformadas por las BAL con mejores resultados inhibitorios para una mejor
eficacia de control de la enfermedad.
• Determinar una dosis efectiva mínima de las BAL para el control de los
patógenos.
• Evaluar a nivel metagenómico el efecto de las BAL sobre comunidades
microbianas nativas y ver el comportamiento de la eficacia biocontroladora.
• Evaluar diferentes marcadores moleculares asociados a estas vías de
señalización, sin embargo, es importante considerar, el uso de genes
marcadores que se encuentren en las vías finales de estas vías. Evaluar a
nivel metatranscriptómico el efecto de las aplicaciones de las BAL, dado que
se desconoce el efecto que pueda generar en otros genes de la planta.
• Evaluar a nivel de invernadero y campo la eficacia biocontroladora de las BAL
contra estos dos patógenos.
3. Discusión general
El desarrollo de tecnologías contra un solo patógeno y el desconocimiento de las

múltiples interacciones que tienen las plantas en la naturaleza con varios patógenos
en su ciclo productivo, transforman el desarrollo y registro de bioproductos en un
proceso inviable económicamente (Cotes 2018). Por consiguiente, la necesidad de
generar nuevas tecnologías es una realidad, por tanto, las bacterias ácido lácticas
pueden posicionarse como un recurso genético y metabólico sin explotar que
ofrecen una gran cantidad de soluciones bioquímicas a problemas agrícolas
urgentes como el manejo fitosanitario de enfermedades (Lamont et al. 2017). Una
de las enfermedades limitantes del cultivo de tomate en Colombia es el
marchitamiento vascular ocasionado por el hongo Fusarium oxysporum f. sp.
lycopersici (Fol) y la bacteria Ralstonia solanacearum (Rs), dos patógenos que
ocasionan síntomas similares en este cultivo, lo cual dificulta el diagnóstico del
agente causal, llevando a malas implementaciones de estrategias de manejo
(Lamont et al. 2017; Rongai et al. 2017; Zheng et al. 2017). Esta situación y con
base en el potencial que poseen las bacterias ácido lácticas, en el presente trabajo
se desarrolló todo un esquema de selección de un posible ingrediente activo para
el control multitarget de Rs y Fol.
Por un lado, fueron obtenidos tres aislamientos de Rs, aislados de zonas
productoras de tomate, los cuales produjeron los síntomas, respecto con la cepa
testigo, en el material susceptible Santa Cruz Kada (Netto et al. 2003): No obstante
se seleccionó aquella con la que más temprano se presentó la enfermedad para la
realización posteriormente de las pruebas de coinfección (Gog and Grenfell 2002).
Por otro lado, sumado a la alta virulencia de la cepa Fol59 reportada por Carmona
Gutiérrez (2019) y Gómez Marroquín (2019), se obtuvo un modelo biológico de
coinfección sincrónico entre dos patógenos en tomate (Tollenaere et al. 2016). El
fenómeno de coinfección ya ha sido reportado con varias especies (Jonkers et al.
2012; Mousa et al. 2015; Notz et al. 2002; Ongena et al. 2005; Orton and Brown
2016; Partida-Martínez and Heil 2011; Spoel et al. 2007; Tollenaere et al. 2017;
Toscano-Underwood et al. 2003), incluso en tomate (Aimé et al. 2013; Kamilova et
al. 2008), sin embargo y a pesar de lo expuesto por Venkatesh et al. (2018), antes
de este estudio no se conocía la metodología necesaria para llevar a cabo este
77
suceso. La ejecución de este modelo en condiciones controladas supone la

posibilidad de que exista la coinfección de forma natural (Tollenaere et al. 2012),
demostrando la complejidad de las interacciones a las cuales se encuentran
sometidas las plantas y la problemática de las actuales estrategias de manejo
basadas en interacciones bidireccionales con el sistema de "un solo patógeno, un
solo hospedero" (Barrett et al. 2009).
La evidencia que apoya el antagonismo potencial de las bacterias acidolácticas
contra Fol y Rs causantes de marchitamientos vasculares en tomate es reportada
en este estudio. Aquellas cepas que presentaron actividad antagónica a nivel in vitro
evidenciaron la capacidad de producir compuestos antimicrobianos, aunque no
fueron identificados en este estudio, en literatura ya han sido reportados
compuestos como ácido láctico, ácido benzóico, ácido mevalónico, ácido caproíco,
ácido propiónico, ácido butírico, ácido valérico, ácidos carboxílicos, lactona,
metilhidantoina, ácido quitosano caféico, acetato de sodio y compuestos proteicos,
los cuales han presentado control de hongos del género Fusarium y bacterias como
Rs (Corsetti et al. 1998; Gajbhiye and Kapadnis 2016; Helander et al. 1997; Laitila
et al. 2002; Peyer et al. 2016; Stiles et al. 2002; Yang et al. 2016). Esta metodología
permitió que las cepas que presentaron mayor actividad inhibitoria in vitro fueran
evaluadas in planta. En dicha evaluación, se registró actividad antagónica contra los
dos patógenos aplicados individualmente y en mezcla por parte de la cepa AC013
aplicada al momento del trasplante y AC40 y AC049 aplicadas en semilla y en el
trasplante, lo cual demostró que la actividad antagónica de estas bacterias depende
de su forma de aplicación (sección 2.4.2), además, supone la posibilidad de que su
interacción con la planta y con el(los) patógeno(s) dentro de un medio como el suelo,
pueden aumentar los mecanismos para el manejo de enfermedades (Lamont et al.
2017), como son la promoción de crecimiento mediante el aumento de fitohormonas
(Shrestha et al. 2014), la capacidad de producir compuestos como el ácido láctico
que alteran el medio donde se desarrollan generando dificultades para el
crecimiento de otros microorganismos, en este caso los patógenos del suelo (Wang
et al. 2014) y la capacidad de sus estructuras y compuestos para inducir la
resistencia sistémica (Konappa et al. 2016; Lemos Blainski et al. 2018). En este
último aspecto, se comprobó mediante la técnica RT-qPCR, que la cepa AC040
aplicada en las semillas indujo resistencia en la planta, solo que su efecto sobre la
planta varió según el patógeno objetivo, así como también la expresión de los genes
marcadores empleados en este estudio varió en el tiempo post infección. Con base
en los resultados obtenidos en esta investigación y complementados con otros
trabajos (Diniz et al. 2017; Müller and Munné-Bosch 2015; Zhang et al. 2019), fue
posible la construcción de modelos teóricos que podrían intentar explicar lo
sucedido cuando se aplicó BAL y luego se inoculó con Fol, Rs y Fol + Rs.
Interacción con Fol. Posiblemente el reconocimiento de MAMP´s y PAMP´s por

parte de la planta induzcan a la activación de señales que lleven a la síntesis de
corismato derivado de la ruta del ácido shikímico (Diniz et al. 2017). De acuerdo con
los resultados obtenidos en la Figura 16c, la expresión de PAL fue el doble respecto
a los tratamientos con los demás inóculos patogénicos. Es así como surge la
hipótesis que la síntesis de ácido salicílico (AS) se lleva a cabo por la vía
dependiente de la fenilalanina amonio liasa. Mediante óxido reducción, el AS
monomeriza NPR1, el cual puede ser traslocado al núcleo y se une a factores de
transcripción que permiten la expresión de PR-1a (Diniz et al. 2017); sin embargo,
la baja expresión de este gen en plantas inoculadas únicamente con Fol, plantea la
posibilidad de que este patógeno actúe bloqueando algún paso aguas abajo del AS,
quizás mediante efectores, conduciendo así a la baja expresión de PR-1a (Figura
17). Por otro lado, la aplicación previa de BAL, posiblemente, estaría inhibiendo ese
mecanismo de bloqueo de Fol, permitiendo así, la alta expresión de PR-1a (Figura
17), lo cual fue observado en su tratamiento respectivo. Cabe recordar que PR-1a,
está asociado a proteínas antimicrobianas para el control de patógenos biótrofos
(Conrath et al. 2002; Jiang et al. 2010; Spoel et al. 2007), las cuales estarían
contribuyendo al control observado de los síntomas de la enfermedad (sección
2.4.2). En otro orden de ideas, los bajos niveles de ERF1 en plantas inoculadas solo
con Fol, indican que el etileno no está asociado a la virulencia del patógeno,
mientras que la inoculación de BAL, estaría induciendo este gen, sin embargo, se
desconoce a qué factor de transcripción se esté uniendo corriente abajo. Por último,
no se encontraronó diferencias respecto al gen LOXa (sección 2.4.3), el cual está
asociado a la vía de señalización del ácido jasmónico, relacionado con el control de
necrótrofos (Zhang et al. 2019), indicando hipotéticamente, que la respuesta de la
planta a la fase necrótrofa del hongo no ocurre antes de las 48 horas en plantas de
tomate variedad Santa Cruz Kada de 30 días de edad (Figura 16d y Figura17).
Interacción con Rs. Al igual que con Fol, la detección de PAMP´s del patógeno, en
primer lugar, conducen a la síntesis de corismato derivado de la ruta del ácido
shikímico. Sin embargo, a diferencia de Fol, el bajo nivel de expresión de PAL,
supondría la posibilidad de que la síntesis de AS se lleve a cabo por la vía de la
isocoristamina sintasa (Diniz et al. 2017) (Figura 18). La monomerización de NPR1
por parte del AS, y posterior expresión de PR-1a es inducida aún más, cuando las
plantas fueron inoculadas previamente con BAL (anexo I) (Figura 18). En segundo
lugar, al igual que la aplicación de Fol, no se encontró diferencias respecto al gen
LOXa, suponiendo nuevamente la hipótesis que la respuesta de la planta a la fase
necrótrofa de esta bacteria no ocurre antes de las 48 horas en plantas de tomate
variedad Santa Cruz Kada de 30 días de edad, ni cuando fueron inoculadas con
BAL (Figura 17). Por último, este proceso de interacción entre Rs y tomate podría
79
conllevar a la acumulación de etileno en la célula, donde los receptores como ETR1

se unen a la hormona e inactivan CTR1, conduciendo a la separación de la región
C-terminal de EIN2 la cual interactúa con EIN3/EIL1 induciendo la expresión
significativa del factor de transcripción ERF1 (Figura 16 y Figura 18), el cual se une
a las cajas DRE activando la transcripción de los genes de alarma ante estreses
abióticos y no a las cajas GCC que inducen los genes de resistencia contra
patógenos (Müller and Munné-Bosch 2015; Zuluaga et al. 2015) (Figura 18). Por
otro lado, cuando la planta es tratada previamente con BAL, se presenta una
disminución significativa en la expresión del gen ERF1, suponiendo que uno de los
mecanismos de biocontrol de BAL para el control de Rs es la reducción en la
producción de etileno (Figura 18).
Interacción con Fol y Rs. El proceso de coinfección sincrónica entre los dos
patógenos, mostró resultados similares respecto a la inoculación individual de Rs
con los genes asociados a la respuesta contra fitopatógenos biótrofos, no obstante,
las plantas inoculadas con BAL, presentaron una mayor expresión de PR-1a
respecto al tratamiento solo con Rs (Figura 16). Por otro lado, el nivel de expresión
fue superior con los dos patógenos en el gen ERF1, indicando nuevamente el uso
del etileno como una potencial estrategia de virulencia por parte de la fitobacteria, y
cuando fue inoculada con el hongo, esta estrategia se intensificó aún más (Figura
19). Estos resultados podrían explicar el hecho que los síntomas en la coinfección
se expresaron mucho más rápido con los dos patógenos en conjunto (sección
1.4.3). Así mismo, el tratamiento con BAL, redujo significativamente la expresión de
ERF1, ayudando en esta forma en la reducción de los síntomas de la enfermedad
(sección 2.4.2) (Figura 19).
A pesar de que los anteriores modelos podrían ayudar a dar respuesta a los
fenómenos observados en este estudio, es importante considerar el uso de más
marcadores moleculares de estas vías de señalización, con el fin de dar una mayor
cobertura a lo sucedido a nivel molecular en la planta. También, es importante
considerar, el estudio de marcadores moleculares asociados a mecanismos de
virulencia de los patógenos durante estas interacciones para dilucidar de mejor
manera la interacción y respuesta de la planta contra estos dos patógenos y el
efecto de las BAL.
Con los resultados obtenidos durante todo este estudio, se demostró el rol de las
bacterias ácido lácticas como biocontroladoras de la marchitez vascular ocasionada
por Fol y Rs en tomate en modelos monopatogénicos, así como en un modelo de
coinfección, demostrando así el potencial de las BAL como un posible ingrediente
activo para el control multitarget de estos dos patógenos.
Figura 17. Modelo teórico de la respuesta de la planta de tomate sin y con inoculación de BAL ante la infección de Fol. a. Infección
con Fol. El reconocimiento de MAMP´s y PAMP´s por parte de la célula vegetal induce la activación de señales que lleven a la
síntesis de COS derivado de la ruta del ácido shikímico (Diniz et al. 2017). COS es usado por la vía dependiente de PAL para
sintetizar AS, sin embargo, debido a la baja expresión del gen PR-1a en plantas inoculadas únicamente con Fol, posiblemente este
81
patógeno actúe bloqueando algún paso aguas abajo del AS, conduciendo así a la baja expresión de PR-1a. La poca acumulación
de etileno en la célula, activan CTR1 el cual inactiva ETR1 e impide la separación de la región C-terminal de EIN2, el cual no activa
EIN3/EIL1 y conduce a la no expresión de ERF1. En la membrana del cloroplasto, AL no se convierte en OPDA por etapas de
catálisis secuencial de LOXa, AOS y AOC. Por lo tanto, OPDA no migra al peroxisoma evitando la formación de (+) - 7-iso-JA que
así mismo no permite la formación de Ile JA, de modo que CO1 no inhibe JAZ, el cual hace parte del complejo represor que bloquea
la expresión de genes de defensa dependientes de la vía del ácido jasmónico.; b. Infección con Fol en plantas inoculadas con
BAL. El reconocimiento de MAMP´s y PAMP´s por parte de la célula vegetal induce la producción de COS el cual es usado en la
vía de PAL para la síntesis de AS, este permite mediante procesos de óxido reducción, la monomerización de NPR1, el cual es
translocado al núcleo y se une a factores de transcripción que permiten la expresión de PR-1a (Diniz et al. 2017). Se produce la
detección de etileno en la célula, que inactiva CTR1 el cual permite la activación de ETR1 y permite la separación de la región C-
terminal de EIN2 para que sea translocada al núcleo e interactúe con EIN3/EIL1, permitiendo la expresión de ERF1. En la
membrana del cloroplasto, AL no se convierte en OPDA por etapas de catálisis secuencial de LOXa, AOS y AOC. Por lo tanto,
OPDA no migra al peroxisoma evitando la formación de (+) - 7-iso-JA que así mismo no permite la formación de Ile JA, de modo
que CO1 no inhibe JAZ, el cual hace parte del complejo represor que bloquea la expresión de genes de defensa dependientes de
la vía del ácido jasmónico.COS. Corismato; ICS. Isocoristamina sintasa; PAL. Fenilalanina amonio liasa; AL. Ácido α-linolénico;
AOS. Aleno óxido sintasa; AOC. Aleno óxido ciclasa; Cis(+)-OPDA. Precursor del ácido cis-(+)-12-oxo-fitodienóico; 7-iso-JA/(-)-
JA. (+)-7-iso-jasmonil/ácido jasmónico; Ile JA. Isoleucina de jasmonil; P. Plastidio; RE. Retículo endoplasmático; Las líneas
continuas representan resultados confirmados en este estudio; El grosor de las líneas continuas representan la cantidad de
expresión; las líneas discontinuas representan hipótesis realizadas a partir de la evidencia obtenida. La línea discontinua amarilla
representa la presencia de BAL en la célula; ↑. Mayor expresión respecto al testigo; ↓ Menor expresión respecto al testigo.
Figura 18. Modelo teórico de la respuesta de la planta de tomate sin y con inoculación de BAL ante la infección de Rs. a. Infección
con Rs. El reconocimiento de MAMP´s y PAMP´s por parte de la célula vegetal induce la activación de señales que llevan a la síntesis
de COS, el cual es usado por la vía dependiente de ICS para sintetizar AS, permitiendo la monomerización de NPR1 para su
traslocación al núcleo y su unión a factores de transcripción induciendo la expresión de PR-1a. La detección de etileno por parte de
ETR1 en RE conlleva a la inactivación de CTR1, llevando a la separación de la región C-terminal de EIN2 la cual interactúa con
EIN3/EIL1, permitiendo la expresión de ERF1, el cual se une a las cajas DRE induciendo la expresión de genes asociados a
condiciones de estrés abiótico. Por lo tanto, en el cloroplasto la baja expresión de LOXa, no permite la migración de OPDA al
83
peroxisoma evitando la formación de (+) - 7-iso-JA y de Ile JA, llevando a que CO1 no inhiba JAZ, el cual bloquea la expresión de
proteínas relacionadas con patogenicidad. b. Infección con Rs en plantas inoculadas con BAL. El reconocimiento de MAMP´s y
PAMP´s por parte de la célula vegetal induce la activación de señales que llevan a la síntesis de COS, el cual es usado por la vía
dependiente de ICS para sintetizar AS, permitiendo la monomerización de NPR1 para su traslocación al núcleo y su unión a factores
de transcripción llevando a la expresión de PR-1a. La inoculación previa con BAL, evita la detección de etileno por parte de ETR1
inactivado por la acción de CTR1 el cual impide la separación de la región C-terminal de EIN2, inhibiendo la activación de EIN3/EIL1
y conduciendo a la no expresión de ERF1. En la membrana del cloroplasto, AL no se convierte en OPDA por etapas de catálisis
secuencial de LOXa, AOS y AOC. Por lo tanto, OPDA no migra al peroxisoma evitando la formación de (+) - 7-iso-JA que así mismo
no permite la formación de Ile JA, de modo que CO1 no inhibe JAZ, el cual hace parte del complejo represor que bloquea la expresión
de genes de defensa dependientes de la vía del ácido jasmónico.; COS. Corismato; ICS. isocoristamina sintasa; PAL. fenilalanina
amonio liasa; AL. ácido α-linolénico; AOS. Aleno óxido sintasa; AOC. Aleno óxido ciclasa; Cis(+)-OPDA. Precursor del ácido cis-(+)-
12-oxo-fitodienoico; 7-iso-JA/(-)-JA. (+)-7-iso-jasmonil/ácido jasmónico; Ile JA. isoleucina de jasmonil; P. Plastidio; RE. Retículo
endoplasmático; Las líneas continuas representan resultados confirmados en este estudio; El grosor de las líneas continuas
representan la cantidad de expresión; las líneas discontinuas representan hipótesis realizadas a partir de la evidencia obtenida. La
línea discontinua amarilla representa la presencia de BAL en la célula; ↑. Mayor expresión respecto al testigo; ↓ Menor expresión
respecto al testigo.
Figura 19. Modelo teórico de la respuesta de la planta de tomate sin y con inoculación de BAL ante la coinfección de Fol y Rs. a.
Infección con Fol y Rs. El reconocimiento de MAMP´s y PAMP´s por parte de la célula vegetal induce la activación de señales que
llevan a la síntesis de COS, el cual es usado por la vía dependiente de ICS para sintetizar AS, permitiendo la monomerización de
NPR1 para su traslocación al núcleo y su unión a factores de transcripción induciendo la expresión de PR-1a. La detección de etileno
por parte de ETR1 en RE conlleva a la inactivación de CTR1, llevando a la separación de la región C-terminal de EIN2 la cual interactúa
85
con EIN3/EIL1, permitiendo la expresión de ERF1, el cual se une a las cajas DRE induciendo la expresión de genes asociados a
condiciones de estrés abiótico. Por lo tanto, en el cloroplasto la baja expresión de LOXa, no permite la migración de OPDA al
peroxisoma evitando la formación de (+) - 7-iso-JA y de Ile JA, llevando a que CO1 no inhiba JAZ, el cual bloquea la expresión de
proteínas relacionadas con patogenicidad. b. Infección con Fol y Rs en plantas inoculadas con BAL. El reconocimiento de MAMP´s
y PAMP´s por parte de la célula vegetal induce la activación de señales que llevan a la síntesis de COS, el cual es usado por la vía
dependiente de ICS para sintetizar AS, permitiendo la monomerización de NPR1 para su traslocación al núcleo y su unión a factores
de transcripción llevando a la expresión de PR-1a. La inoculación previa con BAL, evita la detección de etileno por parte de ETR1
inactivado por la acción de CTR1 el cual impide la separación de la región C-terminal de EIN2, inhibiendo la activación de EIN3/EIL1
y conduciendo a la no expresión de ERF1. En la membrana del cloroplasto, AL no se convierte en OPDA por etapas de catálisis
secuencial de LOXa, AOS y AOC. Por lo tanto, OPDA no migra al peroxisoma evitando la formación de (+) - 7-iso-JA que así mismo
no permite la formación de Ile JA, de modo que CO1 no inhibe JAZ, el cual hace parte del complejo represor que bloquea la expresión
de genes de defensa dependientes de la vía del ácido jasmónico.; COS. Corismato; ICS. isocoristamina sintasa; PAL. fenilalanina
amonio liasa; AL. ácido α-linolénico; AOS. Aleno óxido sintasa; AOC. Aleno óxido ciclasa; Cis(+)-OPDA. Precursor del ácido cis-(+)-
12-oxo-fitodienoico; 7-iso-JA/(-)-JA. (+)-7-iso-jasmonil/ácido jasmónico; Ile JA. isoleucina de jasmonil; P. Plastidio; RE. Retículo
endoplasmático; Las líneas continuas representan resultados confirmados en este estudio; El grosor de las líneas continuas
representan la cantidad de expresión; las líneas discontinuas representan hipótesis realizadas a partir de la evidencia obtenida. La
línea discontinua amarilla representa la presencia de BAL en la célula; ↑. Mayor expresión respecto al testigo; ↓ Menor expresión
respecto al testigo.
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Tesis Christian BALs Tomate

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Bacterias ácido lácticas como biocontroladoras de la marchitez

vascular ocasionada por Fusarium oxysporum y Ralstonia

Christian David Vargas Baquero

Universidad Nacional de Colombia

Christian David Vargas Baquero

Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:

Línea de Investigación: Fitopatología

Universidad Nacional de Colombia

A Alba Marina Cotes por su apoyo incondicional en mi formación y buenos deseos.

A la Fundación Juan Pablo Gutiérrez Cáceres, Universidad nacional y Agrosavia

Palabras clave: Ralstonia solanacearum, Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici,

Keywords: Ralstonia solanacearum, Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici,

1. Capítulo 1. Establecimiento de un modelo de coinfección entre

2.3 Materiales y métodos ............................................................................... 57

FIGURA 1. F. OXYSPORUM F. SP. LYCOPERSICI. .......................................................... 23

TABLA 1. CEBADORES PS1/PS2 PARA LA IDENTIFICACIÓN DE RS ................................ 30

Lista de Símbolos y abreviaturas

Símbolos con letras latinas

Símbolos con letras latinas Término

Símbolos con letras griegas Término

correlacionadas entre sí (Jimenez Madrid et al. 2019). Aunque las cepas de Rs

Estudios previos ya han demostrado el rol de estas bacterias como biocontroladores

Evaluar la actividad antagónica y respuesta de defensa inducida por efecto de

• Caracterizar molecularmente aislamientos de R. solanacearum y clasificar

• Seleccionar los aislamientos de bacterias ácido lácticas por su actividad

• Determinar la capacidad de reducción de la severidad de la marchitez

• Estimar a nivel molecular la activación de señales de defensa inducida en la

Ralstonia solanacearum, Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, tomate,

1.2 Estado del arte

1.2.1 Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, características

Figura 1. F. oxysporum f. sp. lycopersici. a. Marchitez vascular fúngica; b. Colonia

Una vez la clamidospora germina se producen hifas de infección que se adhieren y

1.2.2 Ralstonia solanacearum, características morfológicas, ciclo

Gracias al avance de técnicas y análisis moleculares, este complejo de especies se

campo pulsado (PFGE), polimorfismos en la longitud de fragmentos (AFLP) o

En virtud de su alta variabilidad genética, se puede explicar el amplio rango de

Figura 2. R. solanacearum. a. Marchitez vascular bacteriana; b. Daños en los vasos

1.2.3 Respuesta de la planta ante el ataque de patógenos

En primer lugar, estas defensas se encuentran en la superficie, donde empieza la

• Estructurales. También llamadas preexistentes, estas se encuentran en la

superficie de los tejidos y se basan en las propiedades distintivas de una

• Bioquímicas. Son aquel producto de la información genética propia de la

En segundo lugar, se encuentran este tipo de defensas las cuales dependen de

• Local. Allí, la respuesta es en el mismo tejido u órgano mediante la

como bacterias promotoras de crecimiento (De Vleesschauwer and Höfte 2009), es

En las últimas décadas, el estudio de la resistencia inducida ha tomado gran

1.2.4 Coinfecciones, un enfoque holístico de la fitopatología

Además, este tipo de interacciones también se clasifican espaciotemporalmente, ya

pueden ser locales si se presentan en el mismo punto con comunicación directa

Aunque coinfecciones protagonizadas por Fox y Rs ya han sido reportadas con

1.3 Materiales y métodos

1.3.1 Sitio de estudio

ejecutados por el grupo de manejo integrado de enfermedades del proyecto

1.3.3 Aislamiento, caracterización y selección de cepas de R.

Los aislamientos bacterianos fueron individualizados y seleccionados por sus

Tabla 1. Cebadores PS1/PS2 para la identificación de Rs

Nombre cebador Secuencia

Pasos Temperatura (°C) Tiempo Ciclos

Desnaturalización inicial 95 5 minutos 1

Extensión final 72 5 minutos 1

Los aislamientos confirmados de Rs fueron definidos en filotipos empleando la

Tabla 3. Cebadores y amplicones esperados a partir de la PCR multiplex para la

Pasos Temperatura (°C) Tiempo Ciclos