BIOQUIMICA 1

SEMINARIO 2: Bases nitrogenadas, nucleótidos y ácidos

nucléicos
Temario. Nucleósidos y nucleótidos: estructura química, clasificación, propiedades físicas y químicas.
Oligonucleótidos. Características de la unión entre nucleótidos. Hidrólisis alcalina de ARN.
Acidos Nucleicos. ADN: Composición. Funciones. Desarrollo estructural en una dimensión: estructura
secundaria de ácidos nucleicos. Estructura de doble hélice de Watson y Crick. Características,
interacciones que la estabilizan. Desnaturalización de la doble hélice. Temperatura de fusión (melting).
Curvas de desnaturalización. Formas B, A y Z. Desarrollo estructural en dos y tres dimensiones.
Superenrrollamiento. Topoisomería. DNA nuclear eucariote. Nucleosomas. ARN: Composición.
Funciones. Distintos tipos de RNA. Elementos de Estructura secundaria y terciaria.

Bibliografía General
Textos de Bioquímica: Zubay, Van Holde, Lenigher.
Molecular Biology. D. Freifelder

Bibliografía específica
Genes IV. Lewin

Cuestionario

Ud. se encuentra en el laboratorio donde normalmente realiza sus tareas de investigación. En este
momento en particular Ud. recibe una muestra de un laboratorio extranjero con la sola información de
que se trataría de una muestra que contiene ácidos nucleicos. Se trata de una muestra translucida y un
poco viscosa.
a) Primeramente decide repasar algunas propiedades de los ácidos nucleicos de manera que
luego pueda diseñar nuevos experimentos que le permitan avanzar en la caracterización de la muestra.
En dicho repaso se contesta las siguientes preguntas:
a.1 ¿Qué fuerzas estabilizan la estructura de los ácidos nucleicos?
a.2 ¿Por qué el DNA pierde estructura a pHs bajos y altos?¿Por qué es estable en soluciones
salinas diluidas cercanas a la neutralidad?
a.3 ¿Por qué el DNA no es hidrolizado en las condiciones (NaOH 0,3 N a 37° C por 16 horas) y el
RNA sí? Esquematice el mecanismo de la reacción química.
a.4 ¿Qué entiende por desnaturalización térmica? ¿Qué es el Tm?
a.5 Describa algún método físico que puedan ser utilizado para estimar la composición
nucleotídica del DNA. Como serán los resultados en caso de tener dos muestras de ADN de igual
concentración pero una de ellas con alto contenido de GC y la otra con alto contenido de AT.
b) Habiendo respondido las preguntas anteriores diseñe al menos un experimento que le permita
verificar que realmente la muestra enviada contiene ácidos nucleicos.
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Problema 1
a) ¿Por qué los ácidos nucleicos son moléculas que pueden contener información?
b) En la figura señale, englobando con un trazo continuo, lo siguiente:

1- un nucleótido
2- un nucleósido
3- una base púrica
4- una base pirimídica
5- un puente de hidrógeno
6- una unión fosfodiéster
7- un extremo 3'
8- un extremo 5'
9- una desoxirribosa

OH

Problema 2 En el esquema de la derecha se observa un DNA de doble hélice

en la que una hebra ha sufrido la pérdida de un segmento.
a) ¿Qué enlaces se han roto?
b) ¿Cuáles serán los nucleótidos que se añadirán, en qué orden y a
partir de qué extremo? (señale con una flecha)
c) Esquematice los nucleótidos faltantes.

Problema 3 Seleccione cuál/les de la/s secuencia/s descriptas abajo

corresponde con la secuencia complementaria de:

G G T T C C G C T T C T C A A C A TACGCAACCTGGTGG

GGTTC CGCTTCTCAACATACGCAACCTGGTGG
OH
a)
b) CCAAG GCGAAGAGTTGTATGCGTT GGACCACC
c) CCACC AGGTTGCGTATGTTGAGAAGCGGAACC
d) GGTGG TCCAACGCATACAACTCTTCGCCTTGG
e) 3 ’ -CC AAGGCGAAGAGTTGTATGCGTTGGACCACC - 5’
OH

f) En la biosíntesis de RNA (transcripción) se copia una de las hebras del dsDNA para generar el
transcripto de ribonucleótidos, es por ello que se definen entonces en el dsDNA, la hebra molde y hebra
codificante. Indique cual será la secuencia de RNA transcripto a partir de la hebra molde de DNA
siguiente:
GGC ATT TCG AAC ACG TAC AC

Problema 4 Se realiza un experimento con secuencias que corresponden al gen de la enzima glucolítica
fosfofructoquinasa de Homo sapiens, Mus musculus y Gallus gallus. En la tabla se muestran las

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secuencias de las moléculas utilizadas. Todas corresponden a la misma región interna de 45 pb del gen
en los tres organismos.

a) Defina la estructura primaria, secundaria y terciaria del DNA de Mus musculus y como se estabilizan
cada una de las estructuras.
b) Realice un gráfico estimativo y mencione que representa cada fase de la curva de temperatura de
fusión (o melting) para los fragmentos mostrados de cada una de las especies.
c) Cómo espera que sean las curvas de temperatura de fusión de una dsDNA hibrída: H.sapiens-
M.musculus y H.sapiens-G. gallus (aunque sus secuencias no sean perfectamente complementarias)
con respecto al dsDNA H.sapiens.

Problema 5 Una solución de ADN doble cadena es calentada y luego enfriada rápidamente. Explique
cómo cambiará la absorbancia a 260 nm durante el enfriamiento, si:
a) La solución fue calentada hasta una temperatura menor que Tm.
b) La solución fue calentada hasta una temperatura mayor que Tm.
c) Explique lo que esperaría observar si la molécula de DNA utilizada fuera:
c1) Simple cadena, con la secuencia: CTTGAACCGTCGACGGTTCAAG
c2) Doble cadena, con la secuencia:

En ambos casos el experimento se realiza como en la situación b).

Nota: Suponga que la longitud de los polinucleótidos no tiene incidencia, y que las mismas conclusiones
que Ud. obtenga, se aplican igualmente a cadenas mucho más largas.

Problema 6 Los gráficos de desnaturalización térmica que se muestran debajo corresponden a

experimentos realizados a partir de un mismo ácido nucleico (ADN de doble cadena), pero en diferentes
condiciones de concentración de Na+ (NaCl 0.01M; 0.1M y 4 M). ¿Cuál es la curva que corresponde a la
mayor concentración de Na+? ¿Por qué?

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Problema 7 En un ensayo se estudió la composición y estabilidad térmica de 5 ácidos nucleicos de

distinta procedencia. Para esto las muestras de DNA se solubilizaron en soluciones 0.02 M NaCl a pH=8.
Estas muestras se colocaron en cubetas donde se calentaron desde 25 C a 95 C mientras se media a
cada temperatura la absorbancia a 260 nm. Las curvas obtenidas se representan en la figura de abajo.

a) Calcule la temperatura de fusión para las 5 muestras del gráfico

b) Prediga el porcentaje G+C del DNA correspondiente a núcleo y mitocondria de conejo
c) Podría predecir la longitud relativa de las moléculas estudiadas? Justifique.

Problema 8 Dada una molécula de dsDNA cuya secuencia se esquematiza abajo, se realiza una
secuenciación según el método de Sanger utilizando el primer descripto:

5’ ATC GCT GCT ATC ATC TGA CTG ACT G 3’

primer ATC GCT GC

a) ¿Cuáles serán los fragmentos obtenidos después del tratamiento con los ddNTA y ddNTG?
b) Dibuje un esquema del resultado de la electroforesis correspondiente?

Problema (adicional) Para estudiar la replicación del DNA cromosomal en Escherichia coli se creció un
cultivo en un medio que contenía: 49 mM Na2HPO4, 22 mM KH2PO4, 50 mM NaCl, 10 mM glucosa, 1mM
MgSO4 y 0,003 mM FeCl3, al cual se le añadió, como fuente de nitrógeno, 100 mg por litro de 15NH4Cl. Al
cabo de 14 horas de crecimiento con agitación a 37ºC (suficiente como para que transcurran 14
generaciones), se agregó al medio 1 g por litro de 14NH4Cl, y se dejó crecer durante otras 4 a 8 horas. A
lo largo de todo este proceso se siguió el crecimiento mediante recuentos de células viables y recuentos
al microscopio (Figura 2.1). Como controles, dos cultivos crecieron en las mismas condiciones, pero con
15
NH4Cl durante todo el proceso o con 14NH4Cl durante todo el proceso. Estos controles fueron
cosechados por centrifugación, lisados con SDS, mezclados y sometidos a una centrifugación de
densidad en CsCl, en una ultracentrífuga analítica durante 20 horas a 140.000 x g. Al cabo de la
centrifugación, se fotografió la distribución del material en el tubo de centrífuga (Figura 2.2 izq: el tope
del tubo se encuentra a la izquierda y el fondo a la derecha), y la cantidad de material observado se
cuantificó por densitometría (Figura 2.2 der).

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Alícuotas apropiadas de los cultivos de la figura 2.1 se fueron tomando a tiempos equivalentes a 0; 0,3;
0,7; 1,0; 1,1; 1,5; 1,9; 2,3; 3,0 y 4,1 generaciones transcurridas después del agregado de 14NH4Cl. Las
muestras se introdujeron inmediatamente en baños de agua-hielo, se centrifugaron en frío a 1.800 g, 5
minutos, se resuspendieron en una solución 10 mM NaCl y 10 mM EDTA a pH=6,0, se lisaron con SDS y

se sometieron a centrifugación con CsCl en las mismas condiciones que los controles de la Figura 2.2.
También, al cabo de la corrida los tubos fueron fotografiados y el material que contenían, cuantificado
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por densitometría (Figura 2.3). Finalmente, se tomó al DNA purificado de cada uno de los controles de la
Figura 2.2 y al correspondiente a 1 generación después del agregado de 14NH4Cl, se los calentó a 100ºC
30 minutos, se los enfrió bruscamente y se los centrifugó en CsCl igual que antes. Los resultados
obtenidos por densitometría se muestran en la Figura 2.4 (B: DNA de 1 generación después del
agregado de 14NH4Cl, C: pico de la izquierda, DNA del control crecido en 14NH4Cl, pico de la derecha, DNA
del control crecido en 15NH4Cl).

a) Explique cuál es el principio de separación del DNA empleado en estos experimentos,

especificando los fenómenos físicos y/o químicos que tienen lugar y sobre los cuales se basan estos
métodos.
b) Discuta los resultados mostrados en las Figuras 2.1 a 2.4, y proponga en base a ellos un modelo
para la replicación del DNA en E. coli.