Laboratorio de Química Analítica Avanzada

PRACTICA No. 1

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA

Objetivo: el alumno aprenderá a empacar y a utilizar una columna de

cromatografía de reparto en la separación de compuestos.

INTRODUCCIÓN:

La cromatografía abarca una gran variedad de técnicas de separación

sumamente efectivas. La característica común de todas ellas es que los
componentes de la muestra se distribuyen entre dos fases, una de las
cuales es estacionaria, mientras que la otra se filtra a través de los
intersticios o sobre la superficie de la fase fija. El desplazamiento de la fase
móvil se manifiesta en la migración diferencial de los componentes de la
muestra.

No hay restricciones sobre la naturaleza de las fases, la fase estacionaria

puede ser sólida o líquida y la fase móvil, líquida o gaseosa. Igualmente, no
hay restricciones sobre el mecanismo de distribución de los componentes
de la muestra entre las dos fases. En la cromatografía líquido - sólido,
generalmente es adsorción sobre la superficie del sólido o una reacción
reversible que resulta del intercambio de iones o la formación de complejos
u otros productos.

En la cromatografía gas-sólido, normalmente es adsorción, pero puede ser

también capturada dentro de la estructura microscópica del sólido o una
reacción química reversible como el sólido. En la cromatografía líquido-
líquido es por partición del soluto, definida por la solubilidad relativa en los
dos líquidos. En la cromatografía líquido-gas es partición del soluto, definida
por la presión de vapor parcial del soluto en solución.

TÉCNICA:

Limpie y desengrase correctamente la columna la columna para evitar

contaminaciones y malos corrimientos en ésta, enjuague con un poco de
acetona y deje secar.

Dr. José Ramón Verde Calvo

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Empaque de la columna:

En el fondo de la columna se coloca un disco de vidrio poroso o un poco de

lana de vidrio o un poco de algodón para retener el empaque y la parte
superior de éste se cubre con papel filtro u otro material inerte para evitar
desniveles al agregar la muestra. Una vez empacada la columna, el nivel
del líquido nunca debe descender más allá del límite superior del empaque,
porque se formarán pequeñas burbujas de aire que causan acanalamientos
posteriores.

La velocidad de flujo del solvente debe mantenerse constante, con el objeto

de obtener datos que tengan significado y que se puedan registrar
fácilmente, la velocidad de flujo depende del tamaño de las partículas del
empaque, las dimensiones de la columna, de la viscosidad del líquido y de
la presión aplicada para forzar el descenso del líquido. Los resultados son
satisfactorios si la velocidad lineal promedio del solvente es del orden 1
cm/min.

La falta de uniformidad en el empaque de una columna trae como

consecuencia la formación de zonas irregulares que pueden provocar una
mala separación. Las columnas que se empleen en cromatografía de
líquidos, tienen en general un diámetro lo suficientemente grande como
para que se pueda aplicar vibración mecánica.

Disolventes:

Con el fin de facilitar el elución de las mezclas de compuestos que abarquen

una gran variedad de polaridades, con frecuencia se recurre a la técnica de
gradiente de elución, empleando una serie de solventes de polaridad
creciente. Es importante hacer notar que un aumento drástico de la
polaridad del solvente puede producir separaciones deficientes por lo que
de manera general se prefiere un aumento gradual en la polaridad de los
solventes seleccionados.

Formas de detección:

La mayoría de las fases estacionarias son blancas o casi incoloras, de

modo que es posible observar visualmente las bandas de los componentes
coloridos. Algunos componentes orgánicos fluorescen con la luz ultravioleta.

Dr. José Ramón Verde Calvo

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Los detectores para cromatografía de líquidos son muy selectivos y caros,

además de que solo se pueden utilizar en un margen pequeño de
concentraciones, existen microceldas del flujo para muchos instrumentos,
como refractómetros o espectrofotómetros de UV e infrarrojo, fluorómetros y
contadores de centelleo de líquidos. En todo caso, se pueden recoger
automáticamente fracciones del solvente y analizarlas después por
cualquier método, o los componentes se pueden recuperar por evaporación
del disolvente.

Preparación de la muestra a correr

Macerar 5 gramos de chile ancho (previamente cortado en pequeñas

fracciones) con 10 mL de hexano en un mortero. Aplicar la muestra con
ayuda de una pipeta Pasteur.
Con la ayuda de una lista eluotrópica de solventes, se seleccionan tres
solventes uno no polar, otro de polaridad intermedia y por último uno no
polar.

Recolección de las muestras:

Las muestras se colectan en tubos de ensaye en función de los colores y

del solvente en particular utilizado.

MATERIAL

1 piseta con agua destilada

1 vaso de precipitados de 250 mL
3 vasos de precipitados de 100 mL
1 pipeta Pasteur
1 agitador de vidrio
1 Columna para cromatografía
1 pinzas de 3 dedos con nuez
1 soporte universal
1 mortero con pistilo
5 tubos de ensayo de 20 x 200 mm con tapón de rosca
1 probeta de 50 mL

Dr. José Ramón Verde Calvo

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REACTIVOS:

Silica Gel para cromatografía en columna

Etanol o propanol o butanol
Hexano
Acetona
Éter de petróleo o cloroformo

CUESTIONARIO

1. Defina qué es la cromatografía.

2. Copie lista eluotrópica de solventes, que contenga más de 15 solventes.

3. Describa los problemas con los que se enfrentó para empacar

correctamente la columna.

4. Proponga un sistema de separación que permita estar seguro de que

cada fracción está constituida por un solo componente.

5. Explique el fundamento de la separación de los componentes de una

mezcla por cromatografía de reparto.

6. ¿Cómo selecciona los solventes en un sistema de elución por gradiente?

Dr. José Ramón Verde Calvo