Guía de Trabajos Prácticos Y de Ejercicios Curso de Bioquímica para PEMQB

Facultad de Ciencias
Universidad de Chile
GUÍA DE TRABAJOS
PRÁCTICOS Y DE EJERCICIOS
Curso de Bioquímica para PEMQB
Grupo de Profesores del

Laboratorio de Bioquímica y Biología Molecular
Facultad de Ciencias, Universidad de Chile
1
Bioquímica para PEMQB – Facultad de Ciencias – Universidad de Chile
PROTEÍNAS 1 - COMPUTADOR:
ESTRUCTURA TRIDIMENSIONAL DE AMINOACIDOS Y PROTEÍNAS
Tópicos a desarrollar
- Análisis de estructuras de aminoácidos y estados de protonación.

- Análisis de la estructura tridimensional de una proteína.
- Estructuras secundarias, ángulos diedros phi y psi, distribución de aminoácidos polares y
apolares.
Introducción
Las proteínas son macromoléculas formadas por cadenas de aminoácidos. Las proteínas son
las principales responsables de realizar las funciones biológicas y la estructura de las proteínas
guarda estrecha relación con su función. Los aminoácidos son moléculas que contiene un grupo
carboxilo (-COOH) y un grupo amino (-NH2) libres, más una cadena lateral (R) característica. Para
formar las proteínas los aminoácidos se unen entre sí, mediante lo que se denomina el enlace
peptídico. Éste se forma entre el grupo amino de un aminoácido y el carboxilo de otro, dando
como resultado un enlace covalente CO-NH. Este enlace se conoce también como amida.
La estructura terciaria de una proteína describe el plegamiento de la cadena polipeptídica
para ensamblar los diferentes elementos de estructura secundaria en un ordenamiento particular.
El conocimiento de esta estructura tridimensional (3D) es crucial para entender la función de una
proteína y para algunas aplicaciones como por ejemplo el diseño de drogas. La dilucidación
experimental de la estructura 3D (determinación) se realiza fundamentalmente por 3 métodos,
cristalografía de rayos-X, resonancia magnética nuclear y crio-microscopía electrónica.
Las estructuras de proteínas depositadas en el banco de estructuras de proteínas (Protein Data
Bank, PDB) proceden ya sea de datos cristalográficos (~88%), NMR (~8%) o crio-microscopía
electrónica (~4%). Muy pocas estructuras han sido determinadas por otros métodos.
Determinación de estructuras proteicas por difracción de rayos X.

Para determinar la estructura de una proteína por difracción de rayos-X, el primer paso es
la obtención de arreglos repetitivos en forma de cristal. Hay muchas proteínas que no son
cristalizables debido a que poseen grandes regiones hidrofóbicas, como las proteínas de
membrana (aunque algunos cristales han sido obtenidos en presencia de detergentes), o porque
poseen muy alta libertad conformacional en su estructura. Una vez obtenido el cristal, el siguiente
paso es la irradiación de éste con rayos-X. Los rayos-X son difractados por los electrones del
arreglo periódico de las moléculas en el cristal generando un patrón de difracción, que consiste
en miles de puntos (reflexiones) cuya posición e intensidad depende del tipo y la posición de los
átomos en el cristal de proteína. Transformar este patrón de difracción en un mapa de densidad
electrónica tridimensional requiere de la resolución de las fases de las ondas que formaron cada
punto. Finalmente, modelos moleculares atómicos de aminoácidos son acomodados en el mapa
de densidad electrónica mediante un proceso denominado refinamiento computacional. El
resultado es un grupo de coordenadas cartesianas (x,y,z) de cada átomo de la proteína.
2
Una propiedad importante del modelo final es su resolución. Pequeños valores de

resolución significan poca incerteza en las posiciones atómicas, valores más grandes significan
mayor incerteza. Así, por ejemplo, 5.0 Å es una resolución pobre dado que resuelve pocas
posiciones atómicas; 1 Å de resolución es una alta resolución para una proteína, puesto que los
átomos de hidrógeno pueden empezar a ser discernidos de otros átomos.
Determinación de estructuras proteicas por resonancia magnética nuclear.

La resonancia magnética nuclear es la absorción selectiva de ondas de muy alta
frecuencia por núcleos atómicos con spin distinto de cero, que están sujetos a un fuerte campo
magnético estacionario. La señal de un determinado núcleo (denominada desplazamiento
químico) depende de su ambiente electrónico, o sea, de la identidad y la distancia de los átomos
adyacentes. El hidrógeno (1H) es el único átomo naturalmente presente en proteínas que puede
ser observado por NMR, de manera que, para poder obtener señales de otros átomos es
necesario marcar uniformemente la proteína con 13C y/o 15N. La obtención de señales bien
resueltas limita el tamaño de la proteína analizada a no más de 30 kDa, aunque campos
magnéticos más poderosos pueden duplicar este límite. También, la proteína debe ser soluble a
altas concentraciones y estable por varios días sin agregación bajo las condiciones
experimentales.
El resultado de un análisis por NMR de una proteína es un grupo de estimaciones de
distancias entre pares específicos de átomos, denominadas restricciones. Con un número
suficiente de tales restricciones, el número de configuraciones consistente con los datos llega a
ser finito. El resultado final es una colección de modelos más que una estructura única. Regiones
en las que existen grandes discrepancias entre los distintos modelos, pueden implicar carencia
de información suficiente o desorden dado por el movimiento real de la molécula en solución, lo
cual finalmente puede ser determinado por las características de las señales de tales átomos. De
esta manera, el NMR provee indicios de la dinámica de la molécula en solución.
Determinación de estructuras por Criomicroscopía electrónica (cryo-EM)

Esta metodología se basa en la microscopia electrónica de transmisión en la cual la
muestra se visualiza a temperatura criogénica. Una fina capa de muestra de proteína en solución
es rápidamente sumergida en etano líquido de modo de obtener las proteínas fijadas en hielo
vítreo (muestra hidratada y congelada). Un haz de electrones es transmitido a través de la
muestra y se seleccionan cientos a miles de imágenes de la proteína en distintas orientaciones
permitiendo analizar estadísticamente distintas conformaciones y permitiendo reconstruir un
mapa de densidad desde las distintas orientaciones. Se obtienen mapas de baja resolución (3-5
Å), en donde se pueden refinar modelos de proteínas sin la necesidad de cristalizar o tener altas
concentraciones. Pero hasta la fecha en general se limita su uso para proteínas de gran tamaño
(mayor a ~100 kDa).
Inferencia de estructuras por modelamiento por homología

Proteínas de diversas fuentes y a veces con funciones distintas poseen secuencias
similares (están relacionadas filogenéticamente). Esto a su vez refleja similitud estructural: el
RMSD (Root Mean Square Deviation) de las coordenadas de carbonos- para proteínas que
comparten 50% de identidad de secuencia es generalmente 1Å. Este hecho ha servido para el
desarrollo del modelamiento comparativo de proteínas (también llamado modelamiento por
3
homología de secuencia), que consiste en la extrapolación de la estructura para una secuencia,

a partir de la estructura de proteínas filogenéticamente relacionadas.
Programa de visualización molecular, análisis de un aminoácido.
Existen varios programas para visualizar estructuras de proteínas. Entre los más populares
se encuentran "VMD"; (http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/), UCSF Chimera
(https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) y Pymol (https://pymol.org/2/ ). En este taller usaremos el
programa VMD (Visual molecular Dynamics), de ser necesario descargue e instale el programa
en su computador.
Reconociendo la estructura de los aminoácidos

En la carpeta denominada “aminoácidos” hay 39 archivos que corresponden a la
estructura de cada uno de ellos en ambas formas quirales (¿por qué no son 40?). Para empezar
a trabajar abra el programa VMD.
Inicialización del VMD: Ejecute desde el Menú Inicio de Windows el programa VMD. Si todo
anduvo bien deberían aparecer 3 ventanas. La ventana VMD Main, es la ventana de control del
programa, y funciona como cualquier programa de Windows. La ventana VMD OpenGL Display
es donde se representará la proteína y la otra es una consola de texto. Esto es lo que Ud. debería
observar:
Figura 1
Abrir el archivo: Para cargar la estructura de un aminoácido en el software VMD, abrimos VMD-
MAIN: File-New Molecule- Aparece una nueva ventana que nos permite buscar los archivos
(Browse). Escoja “cualquier aminoácido” de la carpeta aminoácidos y lo abrimos con los
botones open y luego load. Si todo anduvo bien aparecerá el aminoácido en la ventana VMD
OpenGL Display
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A B C
Figura 2. se muestra como ejemplo la Alanina en “lines” (A) como “CPK” (B) y VDW (C).
Manejo de “VMD Display”: La molécula de un aminoácido aparecerá inicialmente representada

por “Lines”. Cada línea representa una unión covalente entre dos átomos que están en los
extremos. Carbono es Cian (o celeste-verdoso), Nitrógeno es Azul, Oxigeno es Rojo,
Hidrogeno es blanco.
Ud. puede mover la molécula en el espacio para tener una idea de su forma tridimensional. Esto
se realiza mediante el mouse (botón derecho mueve respecto al centro, botón izquierdo rota
respecto al centro) y las teclas: r: modo rotación, t: modo traslación, c: centrar la
rotación/traslación, s: escalar la molécula(zoom). Prueben los tres modos de movimiento.
Otras herramientas se utilizan presionando las teclas de los números: 1; rotulo de átomos (clic
sobre 1 átomo). 2; medir distancia (hacer click sobre dos átomos). 3; medir un ángulo (hacer clic
sobre los tres átomos consecutivos que forman el ángulo). 4; medir un ángulo diedro (hacer clic
sobre los cuatro átomos consecutivos que forman el ángulo diedro)
Representaciones de moléculas: El programa VMD permite “mostrar” los átomos y las

moléculas de diferentes maneras y también colores. Para cambiar la representación del
aminoácido vaya a la ventana “VMD Main”, menú Graphics > Representations. Esto abrirá un
nuevo panel “Graphical Representations”.
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Pestaña para cambiar representación.
Menú desplegable para cambiar de color.
Menú desplegable para cambio de

representación.
Figura 3
El menú Graphical Representations es muy importante porque permite manejar la
representación de la molécula mediante “Drawing method” y su color mediante “Coloring
method” (Figura 3).
Para representar moléculas pequeñas como aminoácidos se suele utilizar las
representaciones denominadas como “lines”, “bonds” o “CPK” “VDW”. Estas
representaciones las puede cambiar en el cuadro de “Drawing Method”. Pruebe estas diferentes
conformaciones y rote el aminoácido.
De las representaciones, la que mejor representa la “realidad” de la molécula es VDW
(Figura 2C). La representación de VMD indica el volumen aproximado que ocupan los electrones
en los átomos constituyentes de la molécula. Este volumen no puede ser traspasado por otro
átomo y define el acercamiento máximo que pueden tener dos moléculas y por lo tanto el
impedimento estérico.
Actividades (tome capturas de pantalla a medida que vaya avanzando en el práctico):

Muestre su aminoácido como CPK e identifique los átomos que las componen. Si no
recuerda el código de colores puede presionar la tecla “cero” y haga click sobre el átomo cuya
identidad quiere conocer. La identidad del átomo aparecerá en la consola.
Identifique la cadena lateral, el grupo amino y carboxilo del aminoácido escogido. ¿Cuál
es el estado de protonación del grupo amino y el grupo carboxilo? El estado de protonación
observado para estos grupos, ¿es posible a pH fisiológico?
Según la convención de Fisher (la cual se relaciona con el gliceraldehido), se puede
identificar un isómero óptico (enantiómero) colocando el carbono más oxidado hacia arriba e
identificando el lado en que se encuentra el grupo funcional unido al carbono asimétrico. Para un
aminoácido, también se puede ayudar de la regla de CORN. Esta regla dice que si Ud orienta el
hidrogeno del carbono α mirando hacia Ud., el grupo carboxilo (CO), la cadena lateral (R) y el
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grupo amino (N) siguen el camino de la figura formando la palabra CORN si es que el aminoácido
es L. No confundir la convención D y L con el sistema Cahn-Ingold-Prelog (R y S), ni con la
clasificación experimental dextrorrotatoria (+) o Levorrotatoria (-) determinadas en un
polarímetro. ¿Qué tipo de aminoácido está observando (D o L)?
A partir de lo que ha aprendido en clases, ¿Qué tipo de aminoácido (D o L) es

preferentemente utilizado por las células? Averigüe sobre al menos dos diferentes roles para el
otro tipo.
Visualización de una estructura de proteína.

Si desea observar la información contenida en el archivo pdb utilice un editor de texto como
el wordpad (Figura 4). Los programas de visualización de estructura interpretan la información
contenida en el archivo pdb y la representan visualmente. Por ejemplo, el átomo 908 (Figura 4)
corresponde al carbono α (CA) de la Lys número 2 de la cadena A y está ubicado en las
coordenadas cartesianas x,y,z (19.469, 4.361, 8.492). La información de volumen, formación de
los enlaces covalentes y otras propiedades químicas de cada átomo es deducida de su
identificación en el archivo (CA; carbono alfa, CB; carbono beta... etc.).
Figura 4. Archivo PDB visualizado con un editor de texto.
El archivo 3IKT.pdb contiene las coordenadas cartesianas de la proteína T-Rex (represor

transcripcional) de Thermus aquaticus obtenida en presencia de uno de sus ligandos (NAD+).
Para cargar el archivo, abrimos VMD-MAIN: File-New Molecule- seleccionamos el archivo
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3IKT.pdb y lo abrimos con los comandos open y luego load. La proteína aparecerá representada
en la ventana VMD OpenGL Display.
Selecciones y Representaciones. (“VMD Main”, menú Graphics > Representations)

Menu- “Graphical Representations”: Tal como vimos en el caso de los aminoácidos Ud. puede
representar la estructura de diferentes maneras. Inicialmente hay una sola representación “all”
representada en “Lines” y coloreada por “name”. Pruebe modificando la representación de la
estructura como CPK, VWD y lines en el menú de “Graphical Representations”. Note lo
asombroso de su estructura y como cada átomo se localiza en un lugar específico del
espacio. También note el gran tamaño respecto al péptido analizado anteriormente. Esta proteína
es un homodímero constituido por 2 cadenas polipeptídicas idénticas denominadas como A y B.
Cada cadena está compuesta por 205 aminoácidos lo que hace un total de ¡3121 átomos
organizados en el espacio!
Ud. puede seleccionar los átomos o residuos de la proteína que quiere observar. En la
pestaña “selections” de la ventana Graphical Representations usted puede utilizar algunos tipos
de selección en sector “Selected Atoms”, además puede utilizar la sintaxis matemática con las
funciones “and”, “or” and “not” para expandir o restringir la selección.
Se pueden elegir aminoácidos por su nombre (ej: resname TYR y presione la tecla enter o botón
“Apply”, mostrará todas las Tirosinas). Por su posición en la secuencia (Ej. resid 1, mostrará el
primer aminoácido de todas las moléculas. “resid 1 and chain A”: mostrará el primer residuo de
la cadena A). Este comando acepta intervalos (ej Resid 2 to 4, mostrará los aminoácidos 2 a 4).
En el manual del programa puede encontrar muchas más opciones de selección de átomos.
Por ejemplo, para visualizar la cadena principal cambie represente la proteína como “tube” en el
cuadro “Drawing Method”. Si desea ver donde comienza la cadena agregue una representación
mediante el botón “Create Rep” y seleccione “resid 1”. Ud. debería ver la estructura como se
muestra a la izquierda de la Figura 5.
Algunas selecciones de átomos comunes:

all Muestra todos los átomos
backbone Muestra solo los átomos de la cadena principal
sidechain Muestra solo los átomos de la cadena lateral
protein Muestra solo los átomos de proteína
nucleic Muestra solo los átomos de ácidos nucleicos
polar Muestra los aminoácidos polares
hydrophobic Muestra aminoácidos hidrofóbicos
resname X Muestra átomos del residuo X (ej X=ALA para alanina
name X Muestra átomos de nombre X (ej X=CA para Cα)
resid X Muestra residuo número X (X es un numero)
chain X Muestra la cadena X (ej X=B para la cadena B de una proteína)
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Estructura secundaria y ángulos diedros

Identifique una hélice de la proteína y etiquete el inicio y el final con el numero “1”. Muestre solo
la hélice identificada mediante el comando “resid X to Y”. Vaya a la sección “Analysis” del menú
principal y seleccione “Ramachandran plot”. Se abrirá
una nueva ventana de la cual podrá visualizar la región
seleccionada previamente. ¿Qué ángulos diedros phi y
psi tienen? Realice el mismo ejercicio anterior, pero
eligiendo una hebra beta. En un esquema del grafico de
identifique si los valores obtenidos son coherentes con
el tipo de estructura secundaria. ¿Cuál es la diferencia
entre una hélice alfa y una hebra beta?
Flatt, P.M. (2019) Biochemistry – Defining Life at the Molecular Level. Published by
Western Oregon University, Monmouth, OR (CC BY-NC-SA). https://wou.edu/chemistry/courses/online-chemistry-textbooks/
Residuos hidrofóbicos y polares

Borre la línea de comando de la sección “selected Atoms” o presión el botón Reset. En la
línea de selección escriba “hydrofobic” o haga doble click en la sección “Singlewords”.
Represente los residuos hidrofóbicos como VDW (Draw style>Drawing Method> VDW) y de color
blanco ( Draw style>Coloring Method>Color ID>8). Agregue otra representación con el botón
“créate Rep”, presione “Reset” para borrar la selección previa y seleccione los residuos polares
en la nueva representación (Selections>Singlewords>polar). Represéntelos como VDW y con
color verde (ID 7). Haciendo doble click sobre cada representación puede ocultar o mostrar las
representaciones que está visualizando. ¿Qué tipo de residuos tienden a estar al interior de la
proteína y cuales en la superficie?
Visualización de la estructura cuaternaria de la proteína

Esta proteína contiene dos subunidades con idéntica secuencia y estructura (el ensamble
biológico es un homodímero). Para distinguir ambas subunidades cambie seleccione “Chain” en
el cuadro “Coloring Method”. Esto debiera mostrar la estructura como se observa a la derecha
en la figura 10. Pregunta: ¿Dónde cree que se ubica el sitio de unión a ligando?
Figura 5. A, visualización de cadena principal de proteínas y Ácidos nucleicos. B, distribución de

aminoácidos polares y apolares. C, Asociación de cadenas de proteína para formar la estructura
cuaternaria.
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Expresión de resultados
Elabore un informe mostrando los resultados de cada actividad y respondiendo además las
preguntas que aparecen durante el práctico, utilizando los aminoácidos escogidos como
referencia donde sea necesario. Adicionalmente, averigüe lo solicitado. Apoye sus respuestas
con las figuras obtenidas en el práctico.
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PROTEÍNAS 2- COMPUTADOR:
PDB, INTERACIÓN PROTEÍNA-LIGANDO Y COMPARACIÓN DE

ESTRUCTURAS DE PROTEÍNAS
a) Tópicos a desarrollar
- Herramientas pedagógicas del PDB-101

- Unión de ligandos y cambios conformacionales.
- Comparación de estructuras de proteínas homólogas.
- Predicción de estructuras 3D de proteínas mediante inteligencia artificial
Protein Data Bank (PDB)

El banco de estructura de proteína (PDB) creado en 1971, fue el primer repositorio de
acceso abierto y gratuito en las áreas de biología y medicina. Hoy en día es el lider mundial
en información experimental en estas áreas y cumple un rol fundamental en el
descubrimiento científico. Mediante su portal de internet y disposición de archivos
descargables, el PDB provee el acceso a información tridimensional de macromoléculas
biológicas (proteínas, ADN y ARN) que se encuentran en todos los organismos del planeta.
Conocer la estructura 3D de estas macromoléculas biológicas es esencial para el
entendimiento de sus funciones en la fisiología y patologías en humanos y animales, así
como su función en plantas y producción de alimentos y energía, como también en otros
ámbitos relacionados con la prosperidad global y sustentabilidad.
El RCSB PDB (Research Collaboratory for Structural Bioinformatics PDB) opera el US
data center para el archivo global de PDB y hace que los datos de PDB estén disponibles
sin cargo para todos los investigadores sin limitaciones de uso.
Cuando un grupo de investigación determina la estructura de una proteína mediante
cristalografía de rayos X, NMR o Cryo-EM, la deposita en la base de datos Protein Data
Bank y cada estructura se identifica con un código de cuatro caracteres.
La Visión de RCSB PDB es permitir el acceso al conocimiento acumulado de
estructuras 3D, función y evolución de macromoléculas biológicas, expandiendo las
fronteras de la biología fundamental, la biomedicina y la biotecnología. https://www.rcsb.org/
PDB-101 como herramienta pedagógica

Este portal (https://pdb101.rcsb.org/) es parte del RCSB PDB y está orientado a ayudar
a profesores, alumnos y público en general a contextualizar la importancia de las
macromoléculas y su estructura en diferentes aspectos, tales como la salud, en el
entendimiento del metabolismo celular, y en la biotecnología. Dentro de sus características,
se puede mencionar la sección “molécula del mes” (molecule of the month), donde se
muestra la estructura tridimensional determinada (proteína, ADN o ARN) de mayor
importancia en el mes, junto con su función.
Explore por las diferentes pestañas para obtener más información respecto a las
diferentes actividades que se pueden realizar.
Para el informe, utilice alguna molécula del mes de las publicadas entre los años
2020-2021 y describa en no más de 10 líneas cómo y en qué contenido mínimo obligatorio
(CMO) de biología o química la utilizaría para reforzar el contenido especificado.
Unidad asimétrica y ensamble biológico - herramientas de www.rcsb.org

El 88% de las estructuras depositadas en el PDB han sido resueltas mediante
cristalografía de rayos X, por lo que el ensamble de cadenas polipeptídicas resuelto (unidad
asimétrica) depende de la simetría del cristal, siendo la unidad asimétrica la unidad más
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pequeña a la cual se le pueden aplicar operaciones de simetría para generar la celda

unitaria completa. A su vez, la celda unitaria es la porción más pequeña del cristal que
permite reconstruir el cristal completo sólo por operaciones de translación. Es por lo que,
en las estructuras resueltas por cristalografía, la unidad asimétrica no siempre corresponde
al ensamble funcional (ensamble biológico) o que encontraríamos en solución. Sin
embargo, el ensamble biológico se puede estimar teóricamente analizando las interfaces
de asociación en el cristal, pero este ensamble es solo una hipótesis, de ser posible se debe
obtener evidencia experimental (SAXS, Cryo-EM, etc).
En la página web del https://www.rcsb.org/ busque la estructura 5N27 correspondiente
a la cadena pesada de Ferritina humana. El ensamble funcional de Ferritina es formado por
24 cadenas que estructuran una esfera de diámetro de 12 nm y que contiene una cavidad
central donde minerales de hierro insoluble son depositados. La unidad asimétrica
determinada por cristalografía es solo 1 de las 24 cadenas polipeptídicas. Esto se puede
observar en el panel derecho “biological assembly” y “asymetric unit”.
Busque la pestaña “3D View”, esa pestaña muestra un visualizador de proteínas
directamente en un navegador web. Por defecto se muestra el modelo de la unidad
asimétrica (1 cadena). En el lado izquierdo hay controles que permiten modificar la
visualización. En la sección “Structure > 5N27 | X-ray structure of human he…” Cambie
la opción “Type: Model” a “Type: assembly”. Discuta la importancia de analizar el ensamble
biológico y no la unidad asimétrica al momento de analizar la función de las proteínas.
Visualización de proteínas y ligando con herramientas de www.rcsb.org

En la página de RCSB, buscar el PDB 3IKT y buscar la pestaña “3D View”. En la parte
superior del visualizador se pueden elegir moléculas a visualizar de la estructura (ej,
Proteína, ADN o Ligando), busque el ligando NAD+ (Sequence of: 3IKT| cristal… > 3
NICOTINA..) y haga clic sobre el residuo “NAD”. Esto mostrará el ligando, los aminoácidos
alrededor de 5 Angstrom y las interacciones proteína-ligando. Dejando el puntero del mouse
sobre un átomo, el visualizador muestra en la esquina inferior derecha una etiqueta para
dicho residuo. Identifique todos los residuos que realizan puentes de hidrogeno con
la molécula de NAD, registrando el tipo de aminoácido y su número de acuerdo al archivo
PDB. ¿Qué mutaciones afectarán la unión del ligando? Elija 2 y justifique su proposición.
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Cambio conformacional inducido por unión de ligando

La función de todas las proteínas depende de su capacidad de unir otras moléculas o
ligandos. En el caso de las enzimas, estos ligandos sufren una transformación química, sin
embargo, en muchas otras proteínas la unión tiene que ver con la regulación de la expresión
génica o para el transporte de dichos ligandos, entre otras funciones. Los sitios de unión
corresponden generalmente a cavidades en la superficie de la proteína que poseen
complementariedad morfológica y electrostática con el ligando. Frecuentemente, existe una
red de puentes de hidrógeno entre el sitio y el ligando. En algunos casos la conformación
de la proteína unida al ligando puede diferir significativamente de la proteína libre, debido
al movimiento de cadenas laterales, loops o dominios completos.
En VMD abra los archivos PDB 1USG y 1USK_A mediante File>New Molecule, cuide que
la opción “Load files for:” este en “New Molecule”. Estos archivos son de una misma proteína
(proteína de unión a Leucina) cristalizada en condición Apo y en presencia de Leucina.
A continuación, superponga las estructuras de la proteína libre y con ligando. La
superposición mediante los comandos utilizados es una operación de rotación y traslación
aplicada sobre las coordenadas iniciales tal que se minimiza el RMSD (root mean square
Desviation) entre aminoácidos cercanos. Los átomos usados pueden ser, por ejemplo, los
carbonos alfa o todos los átomos.
1. En la ventana VMD Main abra el programa Multiseq (menú

Extensions>Analysis>Multiseq). Se abrirá una ventana de actualización (Updates
Available), haga clic en NO y se abrirá la ventana de Multiseq en la que se mostrará
la secuencia de aminoácidos de ambos archivos.
2. Realice un alineamiento estructural mediante el programa “Stamp” que se
encuentra en el menú “Tools > Stamp Structural Alignment”, Cambie la opción
“Similarity(scanscore)” a 2 y haga clic en OK.
3. En la venta “Graphical Representations” (“VMD Main”, menú Graphics >
Representations) establezca colores diferentes para cada estructura.
4. En la ventana Multiseq seleccione el ultimo residuo de Leu que se encuentra en la
secuencia 1USK. ¿Cuál es la estructura cristalizada con ligando?
Comparación de estructuras de proteínas homólogas.

Son proteínas homólogas aquellas que comparten un ancestro común. Con el
transcurso del tiempo, después de un evento de duplicación génica ocurre una acumulación
de cambios en las secuencias de los genes resultantes, y, por ende, en las secuencias de
las proteínas que ellos especifican. Sin embargo, generalmente la estructura espacial o
plegamiento de una proteína se conserva a pesar de la ocurrencia de cambios en su
estructura primaria. En esta parte del práctico compararemos las estructuras 3D de
hemoglobinas de diferentes especies para comparar como se relaciona la identidad de
secuencia entre proteínas homologas, el RMSD y el factor Q H (factor de homología
estructural el cual tiene un rango entre 0 a 1, donde 1 se refiere a proteínas idénticas).
Las hemoglobinas son proteínas cuya importancia fisiológica está asociada al
transporte de oxígeno molecular en los tejidos. Cada hemoglobina contiene un grupo
prostético hemo insertado en el interior de la proteína que es el responsable de la unión del
oxígeno.
1. Abrir los archivos PDBs 1hbg, 1gdi y 1jf4 en VMD, cuide que la opción “Load files
for:” este en “New Molecule” cada vez que cargue una molécula nueva.
2. En la ventana VMD Main abra el programa Multiseq (menú

Extensions>Analysis>Multiseq). Se abrirá una ventana de actualización (Updates
Available), haga clic en NO y se abrirá la ventana de Multiseq en la que se mostrará
la secuencia de aminoácidos de ambos archivos.
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3. Realice un alineamiento estructural mediante el programa “Stamp” que se

encuentra en el menú “Tools > Stamp Structural Alignment”, deje las opciones por
defecto y haga clic en OK.
4. En la ventana Multiseq se encuentra el alineamiento de secuencia basado en la
superposición estructural, coloree el alineamiento por similitud utilizando la matriz
de similitud BLOSUM30, menú View>Coloring>Sequence_Similarity >BLOSUM30.
¿Cuál es la estructura diferente y cuales son más parecidas?
5. Identificar los residuos idénticos (coloreados en azul oscuro) entre las tres
secuencias. Visualice las 3 estructuras con líneas y proponga la función de almenos
1 aminoácido conservados en relación con el tipo de interacción con el grupo HEM.
6. En la ventana Multiseq seleccione dos estructuras simultáneamente (presionando
la tecla Ctrl y haciendo clic en cada estructura), al final de la ventana se muestran
los valores para QH, RMSD y porcentaje de identidad. ¿Cómo los valores obtenidos
le permitirían determinar que estructuras son más cercanas evolutivamente?
7. Finalmente puede examinar la cercanía evolutiva entre las tres estructuras mediante
un árbol filogenético de distancia para la identidad de secuencias. En el menú
Tools>Phylogenetic Tree seleccione “all sequences”, “Sequences tree using Percent
Identity” y presione OK. ¿Qué proteínas son más cercanas?
Predicción de estructuras 3D de proteínas mediante inteligencia artificial: Alphafold

Alphafold es un algoritmo de inteligencia artificial desarrollado por DeepMind (Alphabet
Inc) y que predice la estructura 3D de una proteína desde su secuencia de aminoácidos.
Es el algoritmo más avanzado hasta la fecha y regularmente alcanza precisión comparable
a metodologías experimentales (X-tal, NMR and Cryo-EM), aunque relativamente limitada
a una cadena de aminoácidos, con posiciones de dominios muchas veces inciertas y sin
considerar interacción con ligandos, entre otras.
En el año 2021, DeepMind y el Instituto Europeo de Bioinformática EMBL se han
asociado para crear la Base de Datos de Alphafold y hacer las predicciones de estructura
de proteínas libremente disponibles para toda la comunidad científica. Entre las primeras
publicaciones se encuentran la predicción de todas las secuencias de proteínas conocidas
de un organismo (proteoma), como el proteoma humano entre otros.
https://alphafold.ebi.ac.uk/
Busque el modelo para la proteína Q9Y223 (código Uniprot) y analice el coeficiente de

confianza por residuo (pLDDT) y el grafico de predicted aligned error. Mediante el link “go
to UniProt” podrá encontrar las estructuras experimentalmente determinadas para esta
proteína. Analice qué porciones de la estructura primaria de esta proteína (N- y C- terminal)
se encuentran depositadas en el PDB. ¿Cuál cree que es el motivo por el cual no se puede
determinar la estructura completa de la proteína (desde el residuo 1 al 722)?
Expresión de resultados
Elabore un informe mostrando los resultados y actividades solicitadas, respondiendo
además las preguntas que aparecen en el práctico. Apoye sus respuestas con las figuras
obtenidas durante la realización de la actividad.
Adicionalmente, defina: homología, proteínas ortólogas, proteínas parálogas, residuos

idénticos y residuos similares. ¿Qué criterios definen que dos residuos se asignen como
similares en un alineamiento?
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PROTEÍNAS 3 – LABORATORIO:
CURVAS DE CALIBRACIÓN DEL MÉTODO DE BRADFORD Y DE ONF

Aprendizajes esperados
1. Aprender el manejo de un espectrofotómetro.
2. Aplicar la ley de Lambert-Beer a la determinación colorimétrica de analitos (BSA y ONF)
3. Determinar la concentración de BSA en una muestra problema.
Principios y técnicas de la fotometría

Cuando la luz atraviesa un medio transparente parte de ella puede ser absorbida, de modo que
la intensidad de la luz transmitida (I t) es siempre menor que la intensidad de la luz incidente (I o). En
1760, Lambert, trabajando con placas de vidrio, encontró que a medida que el espesor del medio
transparente, (l) aumentaba en progresión aritmética (1,2,3,4...) la intensidad de la luz transmitida
disminuía en progresión geométrica (16,8,4,2...). En otras palabras, la intensidad de la luz transmitida
es función de la intensidad de la luz incidente multiplicada por una potencia de 10 con exponente
negativo cuyo valor depende de una constante (coeficiente de extinción, ) que es característica para
cada medio transparente, y del espesor del medio. Lo anterior queda expresado en la siguiente relación:
It = Io x 10-l (1)
En 1852 Beer aplicó estos mismos principios al estudio de la absorción de la luz por soluciones
coloreadas de diferentes concentraciones, encontrando las mismas relaciones, esto es, a medida que la
concentración de la solución (c) aumentaba en progresión aritmética, la intensidad de la luz transmitida
disminuía en progresión geométrica:
It = Io x 10-c (2)
La combinación de las ecuaciones (1) y (2) da como resultado la Ley de Lambert-Beer que
relaciona la disminución de la intensidad de la luz transmitida con la concentración y el camino recorrido
por la luz al atravesar la solución, lo que se expresa matemáticamente como:
It = Io x 10-lc (3)
En sentido estricto, la ecuación (3) se cumple rigurosamente cuando se usa una radiación
monocromática. Si ambos miembros de la ecuación (3) se dividen por I o se obtiene lo siguiente:
It
= 10 -Ic (4)
Io
La razón It / Io se llama transmisión o transparencia. Cuando la luz transmitida es igual a la luz

incidente el valor de la razón es 1 y la solución es totalmente transparente. Si se descarta, por medio de
un control apropiado (blanco), la luz absorbida por las paredes del continente de la solución y por el
solvente y se considera sólo la transparencia de la sustancia disuelta (soluto) cuya concentración se
desea medir, se habla de transmitancia. Lo contrario a la transmisión se denomina opacidad y
corresponde al valor recíproco de ésta, es decir Io/It. Al aplicar logaritmos se obtiene que:
15
Io
log = lc (5)
It
El logaritmo de la opacidad se denomina absorción o extinción. Cuando los términos Io e It se

emplean en el sentido que se les dio al definir la transmitancia, este cuociente se denomina absorbancia
(A), de modo que:
A = lc (6)
La ecuación (6) muestra que la absorbancia es directamente proporcional al camino recorrido por
la luz y a la concentración de la solución, y que además depende de una constante que es característica
para cada sustancia a una longitud de onda () determinada. De esto se deduce que, si el espesor se
mantiene constante, la absorbancia de la solución dependerá sólo de su concentración. Este principio
permite determinar la concentración de una sustancia en solución por medio de la fotometría.
Cuando la concentración de un compuesto y el espesor, o la distancia recorrida por la luz, se
hacen iguales a la unidad, A se hace igual a  lo que permite determinar su valor; esta cantidad se
denomina coeficiente de extinción. Referido a un solvente y a una longitud de onda particulares, el
coeficiente de extinción es una propiedad específica del compuesto. La unidad comúnmente empleada
para medir la distancia recorrida por la luz es el cm, mientras que la unidad usada para expresar la
concentración puede ser cualquiera que se estime conveniente. No obstante, la unidad de concentración
más usada es moles/Litro (M). Si se mide la absorción de una solución 1 M puesta en una cubeta cuyo
ancho es de 1 cm se obtiene el coeficiente de extinción molar. Cuando la concentración se expresa en
g/L se obtiene el coeficiente de extinción específico.
Todo método espectrofotométrico se basa en la comparación de la absorción de luz por una
solución de un compuesto de concentración desconocida, con la de una solución de la misma sustancia
cuya concentración se conoce; a esta última se le denomina solución estándar o patrón. Si el compuesto
cuya concentración se desea medir absorbe la luz visible, las soluciones serán coloreadas y el método
se denominará colorimétrico. Los compuestos que no absorben en el espectro visible pueden hacerse
reaccionar para generar un compuesto coloreado.
La absorbancia de una solución es la resultante de la luz absorbida por el soluto más la absorbida
por el solvente. Para poder medir sólo la absorbancia del compuesto cuya concentración se desea
conocer, es necesario descartar la absorbancia de las otras sustancias presentes en la solución
(solvente, reactivos, etc.); por lo tanto, en todo método espectrofotométrico es imprescindible hacer una
mezcla que contenga todos los componentes de la solución excepto aquel cuya concentración desea
medirse; ésta se denomina blanco de la reacción, y su absorbancia debe restarse a las muestras
problema y a los patrones.
Como se indicó antes, la relación entre la absorbancia de una solución y la concentración del
soluto que absorbe queda descrita por la Ley de Lambert-Beer, que establece una proporcionalidad
directa entre ambas variables. Si esta proporcionalidad no se cumple, este método de medición no puede
emplearse. Por tanto, es indispensable conocer la sensibilidad del método al trabajar con cualquier
procedimiento espectrofotométrico, determinando el intervalo de concentraciones en el cual se cumple
la Ley de Lambert-Beer. Para esto debe hacerse una curva de calibración, que consiste en determinar
la absorbancia de una serie de soluciones de concentración conocida de un compuesto, tratadas con un
mismo método y medidas en el mismo tipo de aparato. Si la razón entre la concentración del compuesto
en estudio y su absorbancia (c/A) es constante, se deduce que el método empleado sigue la Ley de
Lambert-Beer. Esto se puede analizar convenientemente graficando la variación de la absorbancia en
función de la concentración; si la curva resultante es una línea recta indica que la relación entre ambas
variables es directamente proporcional. Cualquier otro tipo de curva indica que el método no sigue la
Ley de Lambert-Beer. Además, la curva de calibración permite, dentro del intervalo útil del método,
calcular el coeficiente de extinción.
16
Cuando se determina la concentración de un compuesto en solución mediante

espectrofotometría es indispensable mantener constante el paso de luz para lo cual se usan tubos
especiales (cubetas) exactamente calibrados. Generalmente, se usan cubetas de 1 cm de paso de luz
de modo que en estas condiciones la absorbancia queda determinada por  y la concentración del
compuesto (c). Lo anterior significa que para calcular la concentración debemos conocer el valor de A y
de . La forma más exacta para determinar la concentración de una solución problema es medir su
absorbancia e interpolar la concentración correspondiente en la curva de calibración (nunca extrapolar).
Finalmente, en toda determinación cuantitativa es necesario hacer duplicados de las diferentes
muestras por analizar para tener mayor seguridad acerca de la precisión de las determinaciones. En
cada experimento debe hacerse en forma simultánea tubos blanco y patrón.
Descripción general de un fotómetro o de un espectrofotómetro

Un fotométro, o un espectrofotómetro, consiste básicamente de las partes indicadas en la
siguiente figura:
La fuente de luz suministra un conjunto de longitudes de onda; el colimador y monocromador

ubicados a continuación permiten direccionar el haz de luz y seleccionar una longitud de onda,
respectivamente, la que es dirigida hacia el compartimiento donde se encuentra la muestra. La luz
transmitida a través de la muestra es recibida por un detector que la convierte en una señal eléctrica la
que es observada en un sistema de registro.
Aspectos prácticos en fotometría

Al usar cualquier método colorimétrico es indispensable conocer la sensibilidad de éste y el
rango en que el color desarrollado es directamente proporcional a la concentración de las muestras.
Para cumplir estos propósitos se efectúan los ensayos con cantidades crecientes conocidas de la
sustancia que se va a medir. Con el objeto de tener una mayor seguridad en las determinaciones es
necesario hacer duplicados de las diferentes muestras. Debido a que muchos reactivos son coloreados
(ej. Reactivo de Bradford) y por lo tanto influye en la absorbancia de las muestras, debe hacerse un
blanco que permita eliminar esta absorbancia para tener la absorbancia propia de la muestra problema.
Al relacionar la concentración de las diferentes muestras con sus respectivas lecturas en el
espectrofotómetro se puede obtener la concentración que corresponde a cada unidad en la escala del
instrumento. Esta relación se denomina factor de calibración y que generalmente se obtiene desde la
pendiente de la recta que ajusta a las distintas concentraciones.
17
❖ Actividad 1. Construcción de una curva de calibración para el método de Bradford y

determinación de la concentración de proteínas de una muestra problema.
En este trabajo práctico se determinará la concentración de la proteína BSA (Bovine Serum Albumin) de
una muestra de concentración desconocida. En general no existe un método completamente
satisfactorio para medir la concentración de proteínas en una muestra. La elección del método depende
de la naturaleza de la proteína, de otros componentes presentes en la mezcla (interferentes), la rapidez
y sensibilidad deseada. Entre los métodos más conocidos podemos mencionar:
1. Biuret: en soluciones alcalinas fuertes el biuret da color violeta con sulfato de cobre. La reacción es
muy general ya que es positiva para todos los compuestos que poseen 2 o más uniones peptídicas.
El color se debe a la formación de complejos de coordinación organometálicos del cobre con cuatro
átomos de nitrógeno de los enlaces amida del esqueleto peptídico y tiene un máximo de absorción
a 546 nm. El rango útil del método es entre 0,5 a 10 g/L (o mg /mL) de proteína.
2. Lowry: este método es mucho más sensible que el de Biuret ya que permite analizar muestras que
contengan alrededor de 5 a 100 ug/mL. El reactivo contiene los ácidos fosfo molíbdico y túngstico
que al ser reducidos por las proteínas producen especies reducidas de color azul (max 745-750 nm).
El reactivo también contiene iones cúpricos que facilitan el proceso de reducción. Los principales
centros reactivos en las proteínas son los enlaces peptídicos, aminoácidos aromáticos (Tyr y Trp) y
las cadenas laterales polares. Por lo tanto, el color desarrollado depende de la composición y
secuencia de aminoácidos en la proteína.
3. Bradford: el colorante azul de Coomasie presente en el reactivo se une a los grupos amino libres de
las proteínas. Se forma así un complejo de color azul cuya absorbancia se mide a 595 nm. Esta
técnica permite la cuantificación entre 1 a 10 µg de proteína en 1 mL final de solución. Este será el
método de cuantificación de proteínas que usaremos en este trabajo práctico.
El reactivo de Bradford contiene un colorante ácido (Azul de Coomasie G-250), el que al unirse a las
proteínas cambia su máximo de absorción desde 465 nm a 595 nm. El Coomasie se une
principalmente a residuos de aminoácidos básicos y aromáticos, especialmente arginina.
Comentario: Muchas veces los protocolos consideran la cuantificación en cantidad de proteína (ej µg)
y no en concentración (ej. µg/mL), siempre y cuando los volúmenes finales empleados en la curva de
calibración y de las muestras problemas sean los mismos. Se acostumbra a cuantificar en unidad de
cantidad, debido a que simplifica el cálculo para la concentración de la muestra problema.
d) Materiales
Solución patrón de BSA 0,1 mg/ml

Muestra problema de proteína
Reactivo de Bradford (5X)
d)Procedimiento Experimental
1. Construya una curva de calibración para el método de Bradford. Genere una tabla con 6
puntos (incluido el cero). Para ello diluya la solución patrón de proteína de modo que, tomando
diferentes volúmenes de ésta (por ejemplo 0,1- 0,2- 0,3 ml, etc) tenga la cantidad de proteína
que le permite el método (0 –10 µg). Considere el material volumétrico disponible para elegir
sus volúmenes. Complete con agua destilada hasta 0,8 ml.
2. Cuando esté listo para medir, agregue a cada tubo 0,2 ml de reactivo de Bradford y mezcle
bien. Incube al menos 5 minutos (no más de 10 min) sus muestras y mida la absorbancia a
18
595 nm, registre sus datos en su cuaderno de laboratorio. (El equipo debe estar encendido al
menos 15 min antes de la medición para que la lampara alcance una temperatura adecuada).
3. Coloque en un tubo entre 0,5 y 0,8 ml de su muestra problema, haga un duplicado y complete
a 0,8 mL con agua de ser necesario, agregue 0,2 mL de reactivo de Bradford, mezcle bien,
incube y mida.
Expresión de resultados durante el práctico

1. Con ayuda de papel milimetrado, confeccionar una gráfica con los resultados obtenidos,
colocando en la abscisa la cantidad de BSA en µg y en la ordenada la lectura (∆ respecto a la
muestra cero) del espectrofotómetro.
2. Con ayuda de una regla, calcular manualmente las ecuaciones de la recta y el factor de
calibración cuando corresponda.
3. Calcule la concentración de su muestra problema en mg/mL y repórtela en su hoja de papel
milimetrado con lápiz pasta indicando el rotulo ( ej, A, B o C), junto con la ecuación de la recta
determinada.
*Las hojas de papel milimetrado deben ser firmadas por el(la) profesor(a) a cargo de práctico y
deben ser adjuntadas en el informe respectivo.
❖ Actividad 2. Construcción de una curva de calibración de ONF para la determinación de la

concentración del producto de una reacción enzimática.
El o-nitrofenol (ONF) es el producto de varias reacciones enzimáticas de hidrolisis utilizando

sustratos sintéticos. En medio alcalino, el ONF tautomeriza tomando un color amarillo. La absorción de
este compuesto a 420 nm es directamente proporcional a su concentración por lo menos entre 0,02 a
0,30 moles/ml. La cuantificación del producto de una reacción enzimática en el tiempo permite
cuantificar la actividad de una enzima como se verá en prácticos posteriores. En la presente actividad
se utilizará las mismas soluciones, como medio, que serán utilizadas en los prácticos posteriores de
enzimas (buffer fosfato pH 6,0 y carbonato de sodio)
a) Materiales
Amortiguador fosfato de sodio pH 6,0 0,1 M

o-nitrofenol (ONF) 0,5 mM
Carbonato de sodio 1,0 M
b) Procedimiento Experimental
1. Confeccione una curva de calibración para la determinación de la concentración de o-nitrofenol
(ONF). Haga 6 puntos (incluido el cero), sin duplicados.
2. Ocupe un volumen final de 3,0 ml, en el que debe incluir 0,5 mL del amortiguador, 0,3 mL de
carbonato de sodio, agua y el ONF respectivo. Recuerde que su curva de calibración debe ir
desde 0,02 a 0,3 µmoles/ml de ONF.
3. ¡agite los tubos para una mezcla adecuada! y mida a 420nm. No elimine los tubos hasta el
final del practico.
19
4. Con ayuda de papeles milimetrados, confeccionar una gráfica con los resultados obtenidos,
colocando en la abscisa las concentraciones de ONF en µmoles/mL y en la ordenada la lectura
de absorbancia (∆ respecto a la muestra cero) del espectrofotómetro.
5. Con ayuda de una regla, calcular manualmente las ecuaciones de la recta y el factor de
calibración cuando corresponda.
6. Repórtela en su hoja de papel milimetrado la ecuación de la recta determinada con lápiz pasta.
Cuestionario para el informe
1. Determine las ecuaciones de la recta utilizando algún programa de computador ( ej Excel) y

compare los resultados obtenidos con el método manual.
2. Calcular la concentración de proteína de su muestra problema, expresando el valor en µg/mL
de solución, en moles/Litro (PM BSA = 66.000). En este caso, ¿Qué unidad le parece más
adecuado para ser reportado?
3. En términos de absorción de la luz ¿cómo se explica que un vidrio tenga color verde?
4. ¿Qué se entiende por coeficiente de extinción molar?
5. ¿Qué se entiende por absorbancia? Dé la fórmula que la define, indicando claramente el
significado de los términos.
6. Represente gráficamente la relación entre la transmitancia (ordenada) y la concentración de
una sustancia.
7. Represente gráficamente la relación entre absorbancia (ordenada) y la concentración de una
sustancia.
8. Se quiere determinar la concentración de una sustancia midiendo la absorbancia en una
longitud de onda en que también absorbe el solvente. ¿Cómo podría descartar la absorción
de éste?
20
ENZIMAS 1 – LABORATORIO:
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA Y CURVA DE PROGRESO
Índice de experimentos
- Determinación de la actividad enzimática de una preparación de lactasa
- Determinación de las condiciones de velocidad inicial de la enzima
Introducción
Las enzimas son proteínas que se encuentran en la célula mezcladas entre sí y con
muchas otras especies moleculares. Sin embargo, es posible detectarlas y determinarlas con
exactitud por las reacciones que catalizan. Para esto es necesario conocer el o los sustratos y el
o los productos de las reacciones y disponer de los métodos analíticos para medirlos. Al mismo
tiempo es imprescindible realizar todos los controles que permitan descartar posibles artefactos
que puedan simular una actividad enzimática, al hacer aparecer el producto o desaparecer el
sustrato de la reacción. Los controles más importantes en enzimología son:
Blanco de sustrato: Mezcla de reacción semejante a la mezcla donde se detecta la
actividad enzimática, en la cual la solución de sustrato se reemplaza por un volumen equivalente
de su solvente, el que habitualmente es agua o un amortiguador. Este control es útil cuando se
sospecha que los componentes del sistema, con excepción del sustrato, interfieren con el método
para medir el sustrato o los productos.
Blanco de enzima: En este control la solución enzimática se reemplaza por un volumen
equivalente de su solvente, el que generalmente es un amortiguador. Este control es importante
cuando el sustrato es inestable y da producto en ausencia de la enzima.
Tiempo cero: Este control contiene todos los componentes necesarios para la detección
de la actividad enzimática y consiste en que la reacción se detiene en el momento mismo de
completar el sistema. Esto puede realizarse agregando el agente inactivante antes o
inmediatamente después de completar la mezcla de reacción. Este control detecta interferencias
debidas a cualquiera de los componentes y debe ser tomado en cuenta para los efectos de la
cuantificación de la actividad enzimática.
En este trabajo práctico y en los siguientes relacionados con enzimas usaremos la enzima
comúnmente conocida como lactasa, la cual pertenece a la familia -galactosidasa. Esta familia
de enzimas cataliza la hidrólisis de los -galactósidos tales como lactosa u otros rompiendo el
enlace o-glucosídico. La lactasa se produce en las células que recubren las vellosidades del
intestino delgado y es fundamental para la infancia de todos los mamíferos. Esta enzima permite
la absorción de lactosa, ya que cataliza la hidrolisis del disacárido en glucosa y galactosa. Un
significante porcentaje (~70%) de la población mundial adulta desarrolla en algún grado una
deficiencia de la enzima lactasa que lleva a distintos trastornos gastrointestinales conocidos como
intolerancia a la lactosa y personas que presentan estos desordenes no pueden consumir leche
o productos lácteos. Para sortear este problema, las industrias alimentarias utilizan lactasas
recombinantes para crear productos libres de lactosa, además estas lactasas recombinantes
están disponibles en forma de comprimidos orales que pueden ser utilizadas previo a la ingesta
de productos lácteos.
21
CH2 OH CH2 OH
O O
OH O R OH OH
+ H2O + HO R
OH OH
-Galactosidasa
OH OH
La actividad de la lactasa es relativamente fácil de detectar pues actúa también sobre

sustratos sintéticos cromogénicos que al ser hidrolizados originan productos coloreados. El o-
nitrofenil--galactósido (2-nitrofenil--galactópiranosido) es un sustrato sintético de las -
galactosidasas por el cual la enzima presenta una alta afinidad, y que al ser hidrolizado libera o-
nitrofenol.
O2 N O2 N
CH2 OH
CH2 OH
O
O OH OH HO
OH O
+ H2O +
OH
OH
-Galactosidasa
OH
OH
El o-nitrofenol en medio alcalino tautomeriza, tomando un color amarillo. La absorción de

este compuesto a 420 nm es directamente proporcional a su concentración por lo menos entre
0,02 a 0,30 moles/ml (curva de calibración)
Es importante recordar que el estudio in vitro de una enzima implica que ésta debe ser
aislada y purificada, aunque sea parcialmente, para después analizar individualmente las
variables que influyen sobre su actividad. Para este proceso es indispensable fijar inicialmente
en forma tentativa las condiciones experimentales en que se realizará el ensayo enzimático,
tomando en consideración todos los conocimientos generales que se tienen sobre la naturaleza
de las enzimas y aquellos hechos particulares que nos permiten suponer algunas cualidades o
requerimientos especiales de la enzima en estudio. De este modo se debe elegir una
concentración saturante de sustrato, pH, una temperatura y un tiempo de incubación compatibles
con la naturaleza proteica de la enzima y que permitan analizar de manera apropiada los distintos
factores que influyen sobre la actividad enzimática. Recuerde que la unidad de actividad
enzimática (U) se define como la cantidad de enzima que cataliza la conversión de 1 µmol de
sustrato o producto en un minuto (µmol/min), por lo que la actividad enzimática de una solución
se mide en U/mL.
Para la caracterización de una actividad enzimatica, el tiempo de incubación es
especialmente importante y es posible determinarlo mediante una curva de progreso, que se
suele representar como la cantidad de producto formado en función del tiempo. Es importante
conocer la curva de progreso, pues solamente en el intervalo de tiempo en que la concentración
de producto es lineal en función del tiempo, la velocidad (Producto/tiempo) es proporcional a la
concentración de enzima. Esto suele ocurrir al inicio de la reacción, cuando la cantidad de
producto acumulado no es muy alta. Esta condición se conoce como velocidad inicial. A su vez,
la velocidad inicial presenta una dependencia hiperbólica con la concentración de sustrato
(ecuación de Michaelis-Menten).
Si una reacción enzimática se estudia durante un tiempo relativamente prolongado, en un
gráfico de velocidad versus tiempo se observará que, al comienzo, la velocidad de la reacción
se mantiene constante, aunque la concentración del sustrato disminuye. Sin embargo, después
de cierto tiempo, la velocidad de la reacción empieza a disminuir hasta hacerse nula. Esta es otra
forma de representación de una curva de progreso. La constancia inicial de la velocidad de la
reacción se interpreta como una indicación de que la concentración inicial de sustrato no ha
cambiado significativamente. La disminución posterior de la velocidad de la reacción corresponde
a un fenómeno más complejo y puede deberse a:
i) acumulación de productos, con lo cual se tiende a establecer el equilibrio de la reacción.
ii) inactivación gradual de la enzima.
22
iii) inhibición por el o los productos de la reacción.
En esta sesión se analizará la actividad hidrolítica de la lactasa sobre o-nitrofenil--

galactósido con los controles correspondientes y se evaluará la curva de progreso para las
condiciones del ensayo para identificar la región de velocidad inicial y se muestreará por un
tiempo prolongado esperando observar el equilibrio de la reacción.
a) Objetivos
1. Definir las condiciones experimentales para ensayar un sistema enzimático.
2. Determinar la actividad de la lactasa.
3. Determinar las condiciones de velocidad inicial de la reacción enzimática
b) Materiales

o-nitrofenil-β-galactósido (ONFG) 0,03 M
Solución de Lactasa
❖ Actividad 1. Determinación de la actividad enzimática de la lactasa

Procedimiento Experimental
1. Defina un volumen de incubación (por ejemplo 1,5 ml) en el que pueda distribuir en forma
cómoda y con el máximo de precisión, de acuerdo a sus condiciones de trabajo, los
componentes del sistema enzimático. Estos 1,5 ml del volumen de incubación deben contener
además un volumen libre que corresponde a agua y que le permitirá posteriormente modificar
la concentración de algunos de los componentes del sistema o ensayar el efecto de otros
modificadores. Calcular, de acuerdo con el volumen de incubación elegido, el volumen de
solución amortiguadora necesario para que su concentración final sea de alrededor de 30 mM;
y el volumen de la solución de sustrato para obtener una concentración final no inferior a 10
mM.
2. Coloque en un tubo de ensayo la solución amortiguadora, la preparación enzimática y el agua
necesaria para completar el volumen libre. ¡Mezcle bien!, equilibre los tubos a la temperatura
de incubación elegida durante 2 a 3 min e inicie la reacción agregando el sustrato. Anote el
tiempo. Incube simultáneamente un blanco de sustrato y un blanco de enzima. Fije un
tiempo de incubación que de acuerdo con la cantidad de preparación enzimática y a la
actividad de ésta, le permita obtener una coloración (detectable a simple vista), la que
corresponderá al menos a una concentración no inferior a 0,06 µmoles/ml de producto en el
volumen final de lectura en el espectrofotómetro (3 ml).
4. Al finalizar el tiempo de incubación detenga la reacción agregando solución de carbonato de
sodio. Tenga en consideración que el carbonato de sodio debe quedar a una concentración
mínima de 0,1 M en el volumen final (3 ml) de lectura para el espectrofotómetro.
5. Complete con agua hasta un volumen de 3 ml y lea en el espectrofotómetro a una longitud de
onda de 420 nm. Registre en su cuaderno de laboratorio los valores de actividad de la muestra
y de los controles.
23

Usando la curva de calibración para ONF (ecuación de la recta) realizada en el trabajo práctico
anterior, calcule los µmoles de ONF producidos. Defina una unidad de actividad enzimática (U) y
de acuerdo con ella exprese la actividad de la lactasa de su preparación en U/mL.
❖ Actividad 2. Estudio de la velocidad de hidrólisis enzimática del o-nitrofenil-β-galactósido en

función del tiempo de incubación (curva de progreso)
Procedimiento Experimental
Para este práctico se dispondrán de dos concentraciones diferentes de sustrato, por lo que
cada grupo deberá tener presente qué concentración utilizará en su ensayo para el posterior
análisis y discusión de los resultados.
1. Disponga una serie de tubos de ensayo (mínimo 6) de acuerdo con el número de tiempos de
incubación que desee analizar para construir su curva de progreso (considere un tubo al
menos de 60 min). Coloque todos los componentes del sistema enzimático, excepto el
sustrato. Mezcle bien, equilibre a la temperatura de incubación e inicie la reacción con el
sustrato. Recuerde incluir un tubo que corresponda al tiempo cero. Continúe la incubación a
temperatura constante.
2. Detenga las mezclas de reacción a los tiempos correspondientes adicionando el carbonato de
sodio.
3. Complete el volumen de cada tubo a 3 ml con agua y lea en el espectrofotómetro.
e) Expresión de Resultados durante el práctico

Con ayuda de un papel milimetrado, construya una gráfica con las absorbancias en función del
tiempo para su curva de progreso. A un costado, anote la actividad de la enzima de la actividad
1 (U/ml).
*Las hojas de papel milimetrado deben ser firmadas por el(la) profesor(a) a cargo de práctico
y deben ser adjuntadas en el informe respectivo.
d) Expresión de Resultados para el informe

1. Respecto a la actividad 1, indique las condiciones del sistema de incubación utilizado:
concentraciones finales de sus componentes, volumen final, tiempo y temperatura de
incubación.
2. Tabule los resultados de la curva de progreso indicando: tiempo de incubación, absorbancia,
µmoles*min-1 de ONF por mL de preparación enzimática (U/mL).
3. Construya una gráfica con los µmoles de ONF producidos en función del tiempo.
4. Construya una gráfica de la velocidad de la reacción en función del tiempo.
5. Señale la región de velocidad inicial y la región de equilibrio en los gráficos de 3 y 4 .
6. Compare el valor de actividad (U/mL) obtenido en la actividad 1, con el valor de velocidad inicial
obtenido en la actividad 2 y discuta.
e) Cuestionario para el informe

1. ¿Qué función cumple el carbonato de sodio en el sistema de ensayo de la lactasa?
2. ¿Cómo podría comprobar que una reacción química determinada es una reacción enzimática?
3. Si desea determinar una actividad enzimática cualquiera en un extracto de tejido:
a. ¿Qué controles haría?
24
b. ¿Qué consideración debe tener en cuenta para fijar el tiempo de incubación?

4. ¿Cómo afectan la forma de una curva de progreso: ¿la concentración de sustrato, la
concentración de enzima?
5. Una reacción enzimática se detiene espontáneamente después de transcurrido un cierto
tiempo:
a) ¿Qué explicación podría dar para este fenómeno?
b) ¿Cómo podría comprobar experimentalmente su hipótesis?
25
ENZIMAS 2 – LABORATORIO:
CURVA DE SATURACION DE LA LACTASA
Aprendizaje esperado
1. Entender la influencia de la concentración de sustrato sobre la velocidad de la reacción
catalizada por la Lactasa.
2. Manejo de datos para construir la ecuación de Michaelis-Menten y las transformaciones
lineales.
Objetivos
1. Calcular la constante de Michaelis (Km) y la velocidad máxima (Vmax) de una enzima.
Introducción
La primera ecuación general de velocidad para reacciones enzimáticas fue derivada en

1903 por Henri. Esta ecuación daba cuenta de la observación general de que la velocidad inicial
(v0) de una reacción enzimática era directamente proporcional a la concentración de enzima,
pero incrementaba de una manera no lineal con un aumento de la concentración de sustrato,
hasta una velocidad límite. Estos resultados puestos en forma gráfica (velocidad en función de
concentración de sustrato) generan, para la mayoría de las enzimas, una curva que corresponde
a una sección de una hipérbole rectangular. Esta relación se expresa en forma matemática por
la ecuación de Michaelis-Menten:
𝐕𝐦𝐚𝐱 ∗ 𝐒
𝐯𝟎 =
𝐊𝐦 + 𝐒
donde:
k1 k2
E+S ES → E+P
k-1
S es la concentración de sustrato
Vmáx es la velocidad máxima, la que se define como k2 x ET
Km es la constante de Michaelis-Menten, la que bajo condiciones de estado
estacionario se define como (k-1 + k2) / k1 y es equivalente a la concentración de
sustrato con la que se obtiene la mitad de la velocidad máxima.
Estado estacionario: Momento en que el complejo ES es constante.
ET: Enzima total (libre + unida a sustrato o producto)
Si se analiza detenidamente la ecuación anterior, notaremos que al incrementar la

concentración de sustrato (S), partiendo desde cero, la velocidad de la reacción (v0) aumenta en
proporción directa, esto es, la reacción es aparentemente de primer orden con respecto a la
concentración de sustrato. Por el contrario, a valores muy altos de S, la velocidad se aproxima a
(Vmax, y la reacción es de orden cero con respecto a S. En estas condiciones se dice que la enzima
está saturada. Entre los dos extremos de concentraciones de sustrato, la reacción será de orden
intermedio entre cero y uno.
26
Técnicamente, es difícil determinar manualmente con exactitud los parámetros cinéticos

Km y Vmáx desde un gráfico de velocidad inicial (v 0) en función de la concentración de sustrato
(S). Para esto, se utilizan diversas transformaciones lineales de la ecuación de Michaelis-Menten
entre las que se encuentran:
1. Lineweaver-Burk (dobles recíprocos)

1/v0 = (Km / Vmax) * 1/S + 1/Vmax
2. Hanes -Woolf
S/v0 = (Km/Vmax) + S * (1/Vmax)
3. Eadie-Hofstee
v0 = Vmax – (Km * v0/S)
4. Eisenthal- Cornish-Bowden (gráfico directo)
Vmax = v0 + (v0/S)*Km
Sin embargo, los parámetros cinéticos pueden determinarse directamente desde gráficos de v0
versus [S] mediante métodos de ajustes no lineales a la ecuación de Michaelis-Menten, pero es
necesario utilizar programas computacionales.
Como referencia, la Km de la Lactasa para sus diferentes sustratos es muy variable, pero
es cercana a 1 mM aproximadamente para para ß-galactósidos, tales como el o-NFG.
Actividad. Influencia de la concentración de sustrato sobre la velocidad de la reacción

catalizada por la lactasa.
b) Materiales

o-nitrofenil-β-galactósido (ONFG) 0,03 M
Lactasa
c) Procedimiento experimental
Para este práctico se dispondrán de dos concentraciones diferentes de enzima, por lo que
cada grupo deberá tener presente qué concentración utilizará en su ensayo para el posterior
análisis y discusión de los resultados.
1. Disponga una serie de por lo menos 8 tubos de ensayo con concentraciones crecientes de
ONFG (incluyendo el blanco de sustrato) en el rango de 0,3 a 10 veces el valor referencial de
Km. Recuerde que en un gráfico de dobles recíprocos un incremento constante en la
concentración de sustrato generará puntos aglomerados cerca del eje 1/v 0.
2. Agregue a cada tubo el resto de los componentes del sistema enzimático, excepto la enzima.
Mezcle bien, equilibre los tubos a la temperatura de incubación e inicie la reacción agregando
la preparación enzimática.
Incube exactamente durante el tiempo y la temperatura establecidos. Considere que la
concentración de sustrato es uno de los factores que afecta el tiempo durante el cual se
mantiene la linealidad en una curva de progreso. Detenga las reacciones agregando la
solución de carbonato de sodio. Complete el volumen a 3 ml con agua y lea en el
espectrofotómetro. Si la absorbancia está fuera de su curva de calibración para ONF, diluya la
solución con 0,1 M de carbonato de sodio. Mida la absorbancia y corrija por el factor de
dilución. Al informar especifique que valores fueron corregidos por algún factor de dilución.
27
d) Expresión de resultados durante el práctico

1. Dibuje una gráfica de la velocidad de la reacción enzimática (Absorbancia/min) en función
de la concentración de sustrato.
2. Mediante un gráfico de doble reciproco y determine manualmente Km (mM) y Vmax
(Abs/min) a partir de la recta.
e) Expresión de resultados para el informe

1. Tabule los resultados indicando: concentración de o-NFG (sustrato), absorbancia. En una tabla
aparte calcule los µmoles de o-NF producidos por min y por mL de enzima (U/mL), y su inverso
junto al inverso de la concentración de sustrato, mediante algún programa computacional
determine la ecuación de la recta para el grafico doble reciproco y determine los parámetros
Km (mM) y Vmax (U/mL).
2. Realice un ajuste no lineal hiperbólico, use el servidor http://www.ic50.tk/kmvmax.html y
compare los resultados de los parámetros cinéticos.
f) Cuestionario para el informe
Cuestionario a responder en el informe:

1.- Determine la fracción de Vmáx que se obtiene con una concentración de sustrato igual a 1/2
Km, 2 Km, 10 Km.
2.- Si una enzima tiene una velocidad máxima de 30 µmoles/min*mL y una K m de 5 mM, ¿con
qué concentración de sustrato se obtendrá un cuarto de su velocidad máxima?
3. En la reacción:
k1 k2
E+S ES E+P
k-1 k-2
la constante de Michaelis se define como (k -1 + k2 / k1). Si se define la constante Ks como k-1/k1,
¿en qué condiciones Km tendería a ser igual a Ks?
4. Complete la siguiente tabla de purificación agregando el rendimiento porcentual, la actividad

específica y el veces de purificación de la enzima en cada etapa de este procedimiento.
28
Volumen Actividad Conc. U. total Prot. Actividad Rend. Veces

enzimática Proteínas Enzima total especifica purif.
Etapa ml U / ml mg/ml U mg U/mg %
Extracto inicial 400 0,8 1,19
intercambio 110 2,5 0,81
iónico
interacción 30 5 0,12
hidrofóbica
5. ¿Qué razones condujeron al desarrollo de transformaciones lineales como Lineweaver-Burk?

¿Qué ventajas presentan? ¿Por qué son menos utilizados en la actualidad?
29

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