Práctica No.

6
CURVAS DE TITULACIÓN
DE AMINOÁCIDOS
FUNDAMENTO TEÓRICO:

Un aminoácido puede existir en varias formas iónicas, dependiendo del pH del medio en donde
se encuentre disuelto. Esta propiedad se describe mejor utilizando la ecuación de Henderson-
Hasselbach. Los aminoácidos tienen al menos dos grupos disociables, el amino y el carboxilo;
pueden tener más si el grupo R tiene a su vez grupos que se puedan ionizar.
Para cada uno de estos grupos existe un pK, el del carboxilo se le llamará PKCOOH y PKNH 2
al del amino.

La forma más protonada de un aminoácido que no tiene grupos ionizables en el grupo R es:

Esta especie totalmente protonada puede sufrir la pérdida de un protón del carboxilo y pasar
a la siguiente forma iónica:

Finalmente, cuando el grupo -NH3+ pierde un protón, el aminoácido pasa a la forma

menos protonada posible (-NH2):
 En la siguiente imagen se puede observar el proceso de ionización completo:

Si se aplica la ecuación de Henderson–Hasselbach a la reacción anterior, es fácil darse

cuenta, que las formas iónicas en las que puede existir un aminoácido, están determinadas por
el pH del medio en el que se encuentra disuelto, de tal manera que:

1. Cuando el pH < pKCOOH se encontrará únicamente (100%) la forma más protonada,

(ácida), del aminoácido, es decir la que se señala como A en el proceso de disociación
completa.

2.Se sabe que cuando el pH = pKCOOH existen la sal y el ácido en la misma cantidad, para
este caso se tendrá el 50% de la forma A, (ácido), y 50% de la forma B, (sal).
3. Cuando el pH > pKCOOH y pH < pKNH2, la forma A ya no se encuentra puesto que toda,
(100%), se ha convertido a la forma B.

4. Cuando el pH se acerca al valor del pKNH 2, el compuesto B, que a pHs más bajos se
comportó como sal, ahora es un ácido y dona protones para transformarse en el compuesto C.
De tal forma que cuando pH = PKNH 2 se tendrá 50% del compuesto B, (ácido) y 50% del
compuesto C, es decir, su sal.

5. Finalmente, cuando pH > pKNH2, la forma B ya no se encuentra y el 100% del aminoácido

se encuentra en la forma C.

En la Tabla siguiente se muestran los valores de pKCOOH, pKNH 2 y pKR para algunos
aminoácidos. El pKR está relacionado con los aminoácidos que tienen en el grupo R un grupo
ácido o básico, de tal manera que solamente este tipo de aminoácidos poseen algún valor de
pKR. Nótese como el valor de pKCOOH es más pequeño que el de pKNH 2, o sea que el
carboxilo es un ácido más fuerte, se disocia más fácilmente, que el grupo amino.

Valores de pKCOOH, pKNH2 y pKR de algunos aminoácidos.

A continuación, pondremos como ejemplo la ionización del ácido glutámico el cual tiene los
tiene los siguientes valores de pK: pKCOOH= 2.19, pKNH2=9.67 y pKR=4.25. Las diferentes
formas moleculares en las que se puede encontrar este compuesto dependiendo del pH son
las siguientes:

La siguiente figura muestra la curva de titulación para el ácido glutámico:

Curva de titulación del ácido glutámico. Las letras representan las fórmulas que se encuentran
en la imagen de ionización completa
PRÁCTICA No. 6
Objetivos:
Trazar las curvas de titulación de algunos aminoácidos y predecir el estado de ionización en que
se encuentran, dependiendo del pH.
Realizar la titulación de la glicina, un aminoácido neutro, y de la histidina, un aminoácido
básico, para obtener la curva completa de valoración utilizando un ácido titulante (HCl 0.5 M) y
una base (KOH 0.5 M).
Determinar a partir de la curva de titulación los valores pK y K de cada uno de los grupos
ionizables, así como las zonas tampón y la posible importancia fisiológica de estos equilibrios.

Material y Reactivos:
Material:
4 vasos de precipitado
2 agitadores
15 pipetas de 1 y 5mL
Reactivos:
Soluciones de aminoácidos
Solución de HCl 0.5 M para los grupos α carboxilo
Solución de KOH 0.5 M para los grupos α-amino.
Agua destilada

Procedimiento:

Teniendo en cuenta que los pK de los grupos funcionales de los aminoácidos se encuentran
localizados en distintos rangos de pH, es necesario realizar una titulación que abarque
prácticamente todo el rango de pH (ácido y básico) para cada aminoácido. Así, se emplea una
solución de HCl 0.5 M para los grupos α-carboxilo, y una solución de KOH 0.5 M para los
grupos α- amino. Dado que la histidina presenta el grupo ionizable imidazol en su cadena
lateral, es necesario también caracterizar su pKR. Por lo tanto, hay que realizar cuatro
valoraciones (dos por cada solución de aminoácido, una con ácido y otra con base). Otra
posibilidad es ajustar el pH de la solución inicial a valores muy ácidos ó muy básicos, y titular
con un solo agente; el problema de esta segunda aproximación radica en la dilución de la
muestra tras sucesivas adiciones de ácido ó base fuerte.

1. Calibrar el potenciómetro y lavarlo con agua destilada, según las instrucciones que se
proporcionan.
2. Medir 50 mL de la solución de aminoácido a valorar y añadirlos a un vaso de precipitados.
3. Introducir el electrodo en la solución y medir el pH (pH inicial). Anotar el valor en el protocolo
experimental.
4. Lavar el electrodo con agua destilada.
5. Añadir a la solución 0.5 mL ácido o base titulante, agitar con cuidado y medir el pH de
nuevo. Anotar el volumen añadido y el pH medido.
6. Repetir la adición de ácido o base titulante en alícuotas de 0.5 mL hasta terminar la
valoración, es decir, cuando se haya cubierto el rango entero de pH, o bien se haya
completado la titulación de todos los grupos funcionales de la molécula.

RESULTADOS:
Pasos a realizar para analizar los resultados obtenidos:

1. Tabulación de los datos experimentales. En una tabla se han de disponer los

siguientes datos, expresándolos siempre en unidades del SI: el volumen de
ácido o base titulante añadido, el volumen total, las moles de ácido o base
añadidas, el pH medido y [H3O+].
2. Representaciones gráficas. En una gráfica, se ha de representar V acido/base
vs. pH para la cada valoración realizada. En el eje de abscisas se representa la
cantidad de agente titulante añadido (equivalentes, moles, volumen…) de
ordenadas, el pH obtenido. Los puntos se pueden unir con una línea. En esta
gráfica se pueden distinguir las distintas fases indicadas en la práctica anterior
(Titulación del Tris, tema 2); cabe recordar que en el punto medio de la zona
tampón se localiza el valor pK, y en el punto medio del intervalo de viraje, el
punto de equivalencia. Así, a partir de la curva de valoración es posible
determinar de forma intuitiva el valor pKa y la cantidad de base valorada.
3. Deducción de resultados a partir de las gráficas y de los datos facilitados: -
gramos de aminoácido valorado.
- Valor de los K y pK de los grupos ionizables.
- Regiones de capacidad tampón.
- Punto isoeléctrico (pI).
- Formas ionizables del aminoácido en cada rango de pH.
- Carga eléctrica del aminoácido en cada rango del pH y solubilidad del mismo.

DIAGRAMA DE FLUJO DE LA PARTE EXPERIMENTAL

Calibrar el potenció metro y Medir 50 mL de la solució n de Introducir el electrodo en la

lavarlo con agua destilada, aminoácido a valorar y solució n y medir el pH (pH
segú n las instrucciones que se añ adirlos a un vaso de inicial). Anotar el valor en el
proporcionan. precipitados. protocolo experimenta

Repetir la adició n de ácido o

Añ adir a la solució n 0.5 mL
base titulante en alícuotas de
ácido o base titulante, agitar
Lavar el electrodo con agua 0.5 mL hasta terminar la
con cuidado y medir el pH de
destilada. valoració n, es decir, cuando se
nuevo. Anotar el volumen
haya cubierto el rango entero
añ adido y el pH medido.
de pH

RESULTADOS
1. Complete el siguiente cuadro con la información deseada relacionada con los AA que Ud título.
Nombre del aminoácido (AA) Histidina Glicina

Clasificación del AA Básico: Diamino- Neutro: Monoamino-

monocarboxílico monocarboxílico

Concentración del AA 0.25 M 0.5 M

Escriba la fórmula C6H9N3O2 NH2COOH

2.Use un papel milimétrico para realizar ambas curvas (con ácido y con base), recorte y
anexe al informe en el espacio a continuación.

TítulACION DE LA HISTIDINA
10

9.5

8.5

8
pH

7.5

6.5

6
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
Volumne de acido / base
 TítULACION DE GLISINA
8

7.5

6.5

6
PH

5.5

4.5

4
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
Volumn de acido/base

3.Sobre la base de sus cálculos complete el cuadro con la información deseada.

Valores Especie(es) química en fórmula Eq. OH Eq. H Carga

neta

His Gly Histidina Glicina His Gly His Gly His Gly

pK1 1.60 1.80 0.0 0.0 0.0 0.0 +1. +1

1.69 2.26 4 3 6 225 5

pK2 6.00 ----- 0.0 ---- 0.0 0.0 +0. 0

6.19 9.16 675 30 025 5
 pK3 9.60 0.0 0.0 ----- -0.5 -1
9.35 825 10 ---

pI 7.80 ----- 0.0 ---- 0.0 0.0 0 0

7.77 5.71 076 022 008
5 75

CUESTIONARIO
1. Usando la ecuación de Henderson-Hasselbalch, calcular el pKa de cada grupo ionizable
titulado.
Para histidina (titulado con KOH)

Para pH = 1.70

pKa = 1.70 – 0.301 = 1.39

pKa1 = 1.39

pH = 6.20

pKa = 6.20 – 0.301 = 5.89

pKa2 = 5.89

pH = 9.60

pKa = 9.6 – 0.301 = 9.29

pKa3 = 9.29
  
 
PI= (6.20 + 9.60)/2 = 7.90  

a) Para Glicina (titulación con H Cl)

Usando el mismo procedimiento que para la glicina

pKa = pH – 0.301

Para pH = 9.56

pKa = 9.56 – 0.301 = 9.25

pKa2 = 9.25

Para pH = 2.40

pKa = 2.40 – 0.301 = 2.09

pKa1 = 2.09

PI= (9.56 +2.40) /2 = 5.98 

2. ¿Coincide con el pKa reportado en los libros?

Se aproximan, mas no son exactamente igual

3. ¿Cómo se podría confirmar la identidad del aminoácido?

Realizando la titulación y comparando los resultados obtenidos de pKa´s y rango de las zonas buffer o tampón
contra los datos que existen en la bibliografía.

4. Dibujar la curva que se esperaría en la titulación del aminoácido neutro y la que se esperaría en la
titulación del aminoácido básico, señalando las especies predominantes en cada región.
a) Aminoácido Neutro, Glicina
Curva titulación Glicina (aminoácido neutro)
14
100 %
12

10
9.6

8
50 %
pH

6
5.97
100 %
50 %
4 +
50 % 50 %
2.34
2
100 %
0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 2

moles OH-

b) Aminoácido básico, Histidina

Curva titulación Histidina (aminoácido básico)

14
100 %
12

10
9.17

8
7.58 50 %
50 % + 50 %
pH

6
100 %
50 % + 50 % +
4 50 %
100 %

21.82

0
0

3
0.1
0.2

0.4

0.6
0.7
0.8
0.9

1.1

1.3
1.4

1.6

1.8

2.1

2.3

2.5

2.7
2.8
0.3

0.5

1.2

1.5

1.7

1.9

2.2

2.4

2.6

2.9

100 %

Moles OH-
 BIBLIOGRAFIA

TEXTO AUTOR PAGINAS EDITORIAL

Bioquímica la ciencia de Fornaguera, J., & 40 - 44 Costa Rica: EUNED

la vida Goméz, G.

8a edición Bioquímica Campbell M. K.; Farrel 59 - 71 Cengage Learning

vol. 1. S. O.

González-Núñez, V. Curvas de titulación de - Universidad de

aminoácidos, pH y Salamanca, España.
equilibrios acido-base.
Departamento de
Bioquímica y Biología
Molecular.

DATOS DEL ESTUDIANTE

NO MBRE EQU I PO GRUPO CALI FICACIO N

CODIGO

Jose Alejandro Laboratorio de

Barajas Torres bioquímica estructural

304176669