UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN ANDRES

FACULTAD DE CIENCIAS FARMACEÚTICAS Y BIOQUÍMICAS

CARRERA: BIOQUÍMICA
ASIGNATURA: BIOQUÍMICA APLICADA

NOMBRE: Kathlen Rodríguez Zambrano

Laboratorio N°7
LEY DE BEER - LAMBERT

A. Resumen:

B. Abstract:

C. Introducción:
La cinética enzimática estudia la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas.
Proporcionan información directa acerca del mecanismo de la reacción catalítica y de la
especificad del enzima. La velocidad de catálisis de una enzima podría determinarse bien
como velocidad a la que se forma el producto, o bien como velocidad a la que desaparece
el sustrato. La concentración de sustrato afecta de manera muy importante a la velocidad
de la enzima. Cuando se mantiene constante la concentración del enzima, se comprueba
que al aumentar la concentración de sustrato la velocidad de la enzima crece linealmente,
disminuyendo el incremento paulatinamente hasta alcanzar una meseta que corresponde a
un valor de velocidad que es la velocidad máxima.

Modelo de Michaelis-Menten L.Michaelis y M. Menten en 1913, diseñaron un modelo o teoría

general de la acción enzimática que explica el comportamiento hiperbólico de la velocidad con
respecto a la concentración de sustrato. En el modelo postularon que la enzima (E) se combina en
 primer lugar con el sustrato (S), de forma reversible, formando el complejo enzima-sustrato (ES),
que se descompone en un segundo paso dando la enzima libre (E) y el producto (P). La velocidad de
la última reacción es baja, y el modelo supone que la probabilidad de que la enzima reaccione con el
producto para volver a formar ES, es tan ínfima que resulta despreciable, quedando simplificado
este último paso en una reacción prácticamente irreversible. k3 ES → E + P La enzima puede existir
en dos formas, en forma libre (E) o combinada como ES, cuando la [S] es baja la mayoría de la
enzima estará libre y se verá favorecida la formación de ES, cuando se va incrementando la [S] la
velocidad aumenta linealmente. La [E] libre será la diferencia entre la [E] total o inicial y la [ES] o
enzima combinado con el sustrato, y la velocidad máxima se alcanzará cuando toda la enzima se
encuentre en forma de ES, llegándose a la saturación de la enzima por su sustrato, situación
responsable de la meseta que aparece en la gráfica. Al disponer de una concentración de sustrato
saturante, la reacción alcanza rápidamente un estado estacionario en el que la [ES] se mantiene
prácticamente constante y la velocidad medida durante este estado es la velocidad analizada por el
modelo de Michaelis-Menten que también se denomina modelo del estado estacionario. La
expresión más habitual de la ecuación de Michaelis-Menten: Cuando la velocidad es la mitad de la
velocidad máxima (v=V máx /2), se obtiene una equivalencia de la concentración de sustrato a la
constante de Michaelis ([S]=Km), lo que representa una medida más sencilla de determinar que la
relación de constantes de equilibrio, y permite expresar este parámetro cinético en unidades de
concentración. FISIOLOGÍA)GENERAL Jesús%Merino%Pérez%y%María%José%Noriega%Borge 7 La
ecuación de Michaelis-Menten puede transformarse algebraicamente para obtener
representaciones rectilíneas en las que las medidas de Vmax y Km resulten más precisas. Una de las
transformaciones se denomina de “doble recíproco” o ecuación de Lineweaver-Burk, y sería: € 1 v =
Km V max . 1 [S] + 1 V max Su representación gráfica será una línea recta. Otra linearización de la
ecuación de Michaelis es la obtenida por el método de Eadie-Hofstee, donde en el eje de abscisas se
representa v y en el de ordenadas v/S. Los parámetros Vmáxima. y Km caracterizan cinéticamente a
las enzimas denominadas michaelianas, (las enzimas no michaelianas son las denominadas
reguladoras o alostéricas ). La Km se relaciona con la afinidad de la enzima por el sustrato que será
tanto más alta cuanto más baja sea la constante de Michaelis; sin embargo, para muchas enzimas el
conocimiento de estos datos no proporciona mucha información respecto a los pasos de la reacción,
la velocidad o el mecanismo de la misma.

D. Métodos:
Lo que se hizo fue utilizar tres simuladores:
 El primer simulador fue para realizar Regresión no lineal por mínimos cuadrados
aplicada a la cinética de Michaelis y Menten.
o Lo primero que se hizo fue, elegir como formato un [S] y una V
o Luego se copió los datos, con respecto a las concentraciones de sustrato [S] y
las distintas velocidades (V):

o Posteriormente se seleccionó en mostrar gráfica, pudiéndose observar la

gráfica y los valores de Km y de Vmax

o Para que los valores de Km y de Vmax dejen de variar lo que se hizo

fue seleccionar “Cálculo”,

o Se obtuvo el Km y de Vmax y la gráfica ya interpolada

 El segundo simulador fue para realizar un Modelo de Michaelis y Menten -
Dependencia de la concentración de sustrato.
o Lo primero que se hizo fue, escribir los datos que se obtuvieron en el anterior
simulador (Vmax y Km)

o Luego se seleccionó el botón de trazar la gráfica, llegándose a obtener la

misma
o Para realizar una comparación de la isoenzima que a un principio se utilizó, tambien
se trabajó con otra isoenzima que tenía 4 veces mayor el valor de su Km.
Realizando los mismos pasos indicados anteriormente. Llegándose a obtener la
gráfica interpolada.

 El tercer simulador fue para realizar un Modelo de Michaelis y Menten con las
distintas representaciones lineales, como ser: Lineweaver y Burk, Hanes y Woolf y
Eadie y Hofstee.
o Lo primero que se hizo fue, escribir los datos que se obtuvieron en el primer
simulador (Vmax y Km).

o Luego se seleccionó en trazar datos, para obtener las gráficas de las

representaciones lineales, anteriormente mencionadas.
F. Tabla de datos: 

a) Regresión no lineal por mínimos cuadrados aplicada a la cinética de Michaelis y

Menten

Velocidad inicial según concentración de sustrato

[S]  v

1 4,15888308

2 6,59167373

3 8,31776617

4 9,65662747

5 10,7505568

6 11,6754609

7 12,4766493

8 13,1833475

9 13,8155106

10 14,3873716

Vmáx: 20.20152710354335 Gráfica
Km: 4.252816633438131

Km

b) Modelo de Michaelis y Menten - Dependencia de la concentración de sustrato 

Gráfica original  Gráfica para comparación

c) Modelo de Michaelis y Menten - Representaciones lineales 

Gráfica directa (Michaelis y Menten)  Gráfica de dobles recíprocos (Lineweaver y
Burk)
 Gráfica de Hanes y Woolf  Gráfica de Eadie y Hofstee

G. Resultados:
a) Regresión no lineal por mínimos cuadrados aplicada a la cinética de Michaelis
y Menten
1. Localizar la Vmáx y Km en la gráfica obtenida 
 Vmax

Vmax/2

Km

b) Modelo de Michaelis y Menten - Dependencia de la concentración de sustrato

1. Responder las siguientes preguntas: 
(1) ¿Cuánto sustrato es necesario para alcanzar el 95% de la velocidad
máxima? Justificar la respuesta localizando el punto en la gráfica 
Vmáx: 20,202 mM/min
Km: 4,253

20,202 ×0,95=19,192
Vmax [ S ] 20,202 [ S ]
Vo= →19,192=
Km + [ S ] 4,253+ [ S ]
81,624+ 19,192 [ S ] =20,202 [ S ] → 81,624=1,01 [ S ]
[ S ] =80,816 mM

(2) Una isoenzima tiene un Km cuatro veces mayor que el de la enzima

estudiada ¿Cómo es su gráfica? Adjuntar la foto de la gráfica de cinética de
ambas isoenzimas 
Km: 4,253 × 4 = 17,012
Vmáx: 20,202 mM/min
 La isoenzima tiene un Km cuatro veces mayor es la de color azul.

(3) ¿Cuál de las dos isoenzimas es más afín al sustrato? Justificar la respuesta 
R: La isoenzima más afín al sustrato es la estudiada, ya que tiene el Km de
4,253.  Eso quiere decir, que cuanto menor es Km mayor es la afinidad
(predomina la forma ES).

(4) ¿Cuál de las dos isoenzimas responde a un rango más amplio de

concentración de sustrato?  Justificar la respuesta 
R: La isoenzima que tiene un Km cuatro veces mayor que la otra, ya que al
momento de realizar el cálculo se obtuvo una concentración de 323,248 mM .
Km: 4,253 × 4 = 17,0113
Vmáx: 20,202 mM/min

20,202 ×0,95=19,192
Vmax [ S ] 20,202 [ S ]
Vo= →19,192=
Km + [ S ] 17,0113+ [ S ]
326,481+19,192 [ S ]=20,202 [ S ] → 326 , 4 81=1,01 [ S ]
[ S ] =323,248 mM

c) Modelo de Michaelis y Menten - Representaciones lineales 

1. Completar las siguientes tablas:

Datos para Gráfica de dobles recíprocos  (Lineweaver y Burk)

1/[S]  1/V
1 0,24044917
0,5 0,15170654
0,33333333 0,12022459
0,25 0,10355582
 0,2 0,09301844
0,16666667 0,08564972
0,14285714 0,08014972
0,125 0,07585327
0,11111111 0,07238241
0,1 0,0695054

Datos para Gráfica de  Hanes y Woolf

[S]  [S]/v 
1 0,24044917
2 0,30341308
3 0,36067376
4 0,41422329
5 0,46509219
6 0,51389834
7 0,56104807
8 0,60682615
9 0,65144172
10 0,69505399

Datos para Gráfica de  Eadie y Hofstee

v/[S] v
4,15888308 4,158883
3,29583687 6,591674
2,77258872 8,317766
2,41415687 9,656627
2,15011136 10,75056
1,94591015 11,67546
1,78237847 12,47665
1,64791844 13,18335
1,53505673 13,81551
1,43873716 14,38737

2. Obtener Km y Vmáx y explicar la obtención de estos valores en la

representación lineal de Lineweaver y Burk 

1/[S]  1/V
1 0,24044917
0,5 0,15170654
0,33333333 0,12022459
 1/V
0,25 0,10355582 0.3
0,2 0,09301844 0.25
f(x) = 0.189455955493745 x + 0.0537584608104664
0,16666667 0,08564972 0.2 R² = 0.997750631929878
0,14285714 0,08014972 0.15
0,125 0,07585327 0.1
0,11111111 0,07238241 0.05
0,1 0,0695054 0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

y=mx+b reemplazándolo en esta ecuación:

1
Vo
=m
1
( )
[S]
+b

Para hallar la pendiente:

y 2− y 1 0 , 0695054−0,1
m= → m= →m =0,04015
x 2−x 1 0,24044917−1
Para hallar b:

1
=
( )
1
Vo [ S ]
+b → 0,0695054=0,04015 ( 0,1 )+ b →b=0,691

De la ecuación de Lineweaver y Burk, reemplazar ( )1

Vo
=m
1
[S]
+ b:

Vo Vmax ( [ S ] ) Vmax Vo ( [ S ] )+0,691

1 Km 1 1 1 1
= + → =0,04015

Para hallar Vmax:

1
=0,691
Vmax
1
Vmax=
0,691
Vmax=1,447 mM /min
Para hallar Km:
Km
=0,04015
Vmax
Km=0,04015 ×22,22

Km=0 , 058
G. Conclusiones:
 Se llegó a obtener los valores de velocidad máxima (Vmax) y constante de Michaelis
y Menten (Km) a partir de resultados experimentales
 Se transformó la gráfica del modelo de Michaelis y Menten en gráficas lineales
utilizando la ecuación de Lineweaver y Burk.

H. Preguntas complementarias:

a) Los datos de abajo indican las velocidades de la reacción catalizada por la

hexoquinasa. Calcular la, Km  y la Vmax de la hexoquinasa a partir de la gráfica
de Michaelis-Menten: 
[S] Vo
(mM)  (mM/min)

0,05 30
0,10 43
0,15 52
0,20 57
0,30 58

1/Vo
1/[S]  1/Vo 0.035
0.03 f(x) = 0.00100921954401217 x + 0.0130380551993021
0,0333333 0.025 R² = 0.992721432612059
20 3 0.02
0,0232558 0.015
10 1 0.01
0.005
6,6666666 0,0192307 0
7 7 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
0,0175438
5 6
3,3333333 0,0172413
3 8

y=mx+b reemplazándolo en esta ecuación:

1
Vo
=m
1
( )
[S]
+b

Para hallar la pendiente:

y 2− y 1 0,01724−0,33
m= → m= → m=0,0187
x 2−x 1 3,33−20
Para hallar b:

1
=
( )
1
Vo [ S ]
+b → 0,01724=0,0187 ( 3,33 ) +b → b=0,045

De la ecuación de Lineweaver y Burk, reemplazar ( )

1
Vo
=m
1
[S]
+ b:

Vo Vmax ( [ S ] ) Vmax Vo ( [ S] )+0,045

1 Km 1 1 1 1
= + → =0,0187

Para hallar Vmax:

1
=0,045
Vmax
1
Vmax=
0,045
Vmax=22,22 mM /min

Para hallar Km:

Km
=0,0187
Vmax
Km=0,0187 ×22,22
Km=0,42
 b) Al medir la velocidad de una reacción enzimática 
1. la enzima debe estar purificado 
2. hay que añadir los cofactores 
3. la temperatura debe ser lo más alta posible 
4. hay que trabajar a pH óptimo 

c) Según el modelo de cinética enzimática de Michaelis-Menten 

1. la concentración del complejo enzima-sustrato es constante a lo largo de la
reacción
2. la concentración del complejo enzima-sustrato es elevada a lo largo de la
reacción
3. cuando la concentración inicial de sustrato es grande, la reacción es de orden 1 
4. cuando la concentración inicial de sustrato es pequeña, la reacción es de orden
0
d) Es cierto que: 
1. hay enzimas que no siguen el modelo cinético de Michaelis-Menten 
2. la velocidad de una reacción enzimática no cambia con el tiempo 
3. el valor de la KM de una enzima permite estimar la afinidad entre la enzima y el
sustrato
4. según el modelo cinético de Michaelis-Menten, la concentración del complejo
enzima-sustrato es muy elevada 

e) ¿Qué propiedad se cumple en una reacción enzimática a bajas concentraciones de

substrato?
1. La velocidad de reacción es directamente proporcional a la concentración de
substrato
2. Existe una alta probabilidad de unión enzima-sustrato 
3. La velocidad de reacción es independiente de la concentración de substrato 
4. Ninguna de las anteriores es correcta 
f) En la transformación lineal de Lineweaver-Burk se relaciona: 
1. la inversa de la velocidad máxima en función de la inversa de la concentración
de substrato
2. la inversa de la velocidad máxima en función de la inversa negativa de la KM 
3. la inversa negativa de la KM en función de la inversa de la concentración de
substrato
4. la inversa de la velocidad inicial en función de la inversa de la concentración de
substrato 

I. Bibliografía: