Guía de práctica de laboratorio de: Virología

Cuarta unidad: VIRUS EMERGENTES Y REEMERGENTES, VACUNAS

VIRALES Y RECOMBINANTES E INMUNIZACIÓN

Práctica N° 12: TOMA DE MUESTRA Y PROCESAMIENTO DE SANGRE TOTAL EN PAPEL

FILTRO PARA DETECCION DE ANTICUERPOS TOTALES CONTRA VIRUS DENGUE

1. PROPÓSITO/OBJETIVO/ LOGRO.

Realizar la toma de muestra de sangre total en papel filtro para pruebas

de ELISA e IHA para el virus dengue. Adquirir destreza en el
procesamiento de muestras obtenidas en papel filtro.

2. CONCEPTOS BÁSICOS (INTRODUCCIÓN O FUNDAMENTO).

El dengue constituye un serio problema de salud pública en las

Américas y en todo el resto del mundo a consecuencia del cambio
climático, de la globalización y otros factores que desencadenan la
presencia del mosquito Aedes aegypti vector del mencionado virus.
Desde la introducción de la técnica de ELISA se ha evaluado la opción
de utilizar el papel filtro, como un método fácil y de bajo costo para
obtener y transportar muestras de sangre entera y a partir de ello
detectar anticuerpos para el diagnóstico serológico en enfermedades
virales. En el Perú, ya se evaluó con éxito su uso para detectar
anticuerpos, siendo esto útil para estudios de seroprevalencia en
poblaciones afectadas por dengue.

3. EQUIPOS/MATERIALES Y REACTIVOS A UTILIZAR EN LA PRÁCTICA.

• Papel filtro WHATMAN N° 3. (40mm x 25 mm).

• Lancetas.
• Bolsas de Plástico para ½ kilo medida 5x10 (01 unidad).
• Solución Buffer Fosfato (PBS) (6ml).
• Albumina Bobina.
• Centrifuga Refrigerada.
• Tubos Falcon de 25ml.
• Viales.
• Parafilm.
• Micropipetas de 10-100ul y de 100-1000ul, con sus respectivas
punteras.
• Guardapolvo
• Guantes
• Mascarilla.
• Recipiente de mesa para desechos biológicos
 OBSERVACION:

Cada estudiante debe estar con su Equipo de protección Personal

(EPPs) y contar con los materiales para el desarrollo de la práctica.

4. NOTAS DE SEGURIDAD.

Durante la estadía en el laboratorio, obtención y/o procesamiento de

las muestras, al igual que para los otros exámenes de fluidos corporales,
se deben guardar las precauciones contenidas en el Manual de
Bioseguridad de cada laboratorio y seguir las buenas prácticas
necesarias para proteger al paciente, al operador, al observador y al
medio ambiente.

5. HIPÓTESIS (O CÁLCULOS).

NO CONTEMPLA

6. PROCEDIMIENTO.

➢ OBTENCION DE LA MUESTRA

• En el papel filtro, diseñar 02 círculos (16 mm de diámetro cada uno)

uno al lado del otro con 5mm de distancia entre ellos , y a un costado
dejar espacio para el código y/o identificación del paciente (ver
Figura )

• Punción con lanceta del pulpejo lateral dedo medio de la mano.

• Dejar fluir la sangre espontáneamente dentro del círculo marcado en
el papel filtro, tratando que la muestra cubra el diámetro indicado
(volumen aproximado 50uL).
 • Dejar secar al medio ambiente en un lugar protegido de la luz solar
directa.
• Colocar en bolsas de plástico y transportar al laboratorio a
temperatura ambiente, junto con al ficha clínico – epidemiológica.

➢ ELUCION DE LA MUESTRA PARA ELISA.

• Se recortan los círculos de papel filtro absorbidos con sangre total y se
colocaron en viales que contenían 2ml de buffer fosfato salino (PBS)
con Albumina bovina al 0.5% a 4°C durante toda la noche,
obteniendo una dilución de 1:100 como lo requiere el método
utilizado.
• Se elimina el papel filtro.
• Se procede a centrifugar a 3800 rpm por espacio de 15 minutos a
temperatura ambiente, para obtener el eluido.
• Utilizar el sobrenadante para el procedimiento de ELISA.

➢ ELUCION DE LA MUESTRA PARA INHIBICION DE LA HEMAGLUTINACION.

• Se recortan los círculos de papel filtro absorbidos con sangre total y se
colocaron en viales que contenían 2ml de buffer borato salino 0.5 M a
4°C durante toda la noche.
• Se elimina el papel filtro.
• Se procede a centrifugar a 3800 rpm por espacio de 15 minutos a
Temperatura ambiente, para obtener el eluido
• Al eluido se le agrega 500ul de kaolin al 25% con agitación ocasional
por 30 minutos.
• Centrifugar a 2000 rpm por espacio de 30 minutos a temperatura
ambiente.
• Absorber el sobrenadante con glóbulos rojos de ganso al 50% en
solución salina fisiológica a 4°C por 20 minutos con agitación
ocasional.
• Centrifugar a 1500 rpm por 15 minutos a 4°C, para obtener la muestra
final para la determinación de anticuerpos totales.

7. RESULTADOS O PRODUCTOS

El estudiante realizará la toma de muestra de sangre total en papel

filtro para pruebas de ELISA e IHA
para el virus dengue, adquiriendo destreza en el procesamiento de
muestras obtenidas en papel filtro.
8. CONCLUSIONES.

• De acuerdo a los resultados obtenidos, consideramos que pueden

utilizarse muestras de sangre obtenidas en papel filtro para la
detección de anticuerpos IgM contra dengue por ELISA de Captura
IgM, teniendo en la obtención de muestra de sangre total en
condiciones de campo como ventajas la facilidad de su realización y
transporte, además del bajo precio

9. CUESTIONARIO.

1. ¿se recomendaría el uso de papel filtro?

Sobre esta base se recomienda también validar el uso de papel filtro

como una alternativa para obtener muestras de sangre total para las
evaluaciones en otras patologías infecciosas de origen viral, como
fiebre amarilla, sarampión, rubeola, hepatitis viral, etc.
2. ¿Por qué se utiliza este método?

por ser un método de recolección sencillo y no requerir de muchos

cuidados en el envío al laboratorio.

Farzadegan y otros, en 1987,15 emplearon esta técnica en la

detección de anticuerpos contra el VIH con resultados muy
satisfactorios. De igual forma la toma de muestras en papel de filtro ha
sido empleada en la detección de IgM e IgC antivirus de la rubéola.

Burke y otros utilizaron la toma de muestra en papel de filtro para el

establecimiento del diagnóstico serológico de la encefalitis japonesa
(EJ), al comparar la detección de IgM mediante ELISA de captura y la
detección de anticuerpos inhibidores de la hemaglutinación,
demostraron la superioridad del método de captura de IgM para el
diagnóstico serológico de la EJ mediante muestras de sangre
absorbidas en PF; estos mismos autores reportaron la utilidad de este
tipo de muestra para la detección de anticuerpos IgM a virus dengue,
hepatitis A y hepatitis B.
10. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS CONSULTADAS Y/O ENLACES
RECOMENDADOS

• Gubler DJ, Clark GG. Dengue\Dengue hemorrhagic fever: the

emergence of a global health problem. Emerging Infec Dis 1995;1: 5557.
• Farzadegan H, Quinn T, Polk BF. Detecting antibodies to human immunodeficiency virus in dried
blood on paper filter. J Infect Dis 1987;155:10731074.
• Wassilak SGF, Bernier RH, Hermann KL, Orestein WA, Bart KJ, Amler R. Measles seroconfirmation
using dried blood specimens in paper filter. Pediatr Infect Dis 1984;3:117121.
• Vázquez S, Fernández R, Llorente C. Utilidad de la sangre almacenada en papel de filtro para
estudios serológicos por ELISA de inhibición. Rev Inst Med Trop Sao Paulo 1991;33: 309311.
• Guzmán MG, Kourí G, Bravo J. Normalización de la toma de muestra de sangre en papel de
filtro para la serología del dengue. Rev Cubana Med Trop 1982;34:114118.