Práctica 4

Lcda. Lexa Manrique

Profesora del Laboratorio
Bioquímica General para Bioanálisis
Método: cinético para amilasa vegetal por valoración
por retroceso usando el reactivo de Lugol

• Lugol modifica la
EXTRACTO estructura del almidón,
por lo tanto, evita la
hidrolisis pero no actúa
• POLISACARIDO
ENZIMÁTICO sobre los sitios de unión
del Complejo ENZIMA
• MOLÉCULA DE RESERVA •  -amilasa SUSTRATO
DE LAS PLANTAS. • amilasa • El Lugol en presencia del
• Almidón fosforilasa almidón produce un
color azul característico

SUSTRATO
(ALMIDÓN) REACCIÓN
ENZIMÁTICA
(Kennelly y Rodwell, 2000)
 Fundamento
AMILOPECTINA
27%

El almidón presente por

acción de las enzimas
provenientes de los extractos
enzimáticos después de 1, 2 y
AMILOSA 3 días de germinación es
hidrolizado, lo que implica la
73%
ruptura de los enlaces 
(14) que lo constituye,
transformándolo en unidades
de D-glucosa , -maltosa y
dextrosa

(Kennelly y Rodwell, 2000)

 Reacción química1:

Procedimiento:
1. Obtención de los extractos enzimáticos

Paso 1: Paso 2: Paso 3: Paso 4:

Desinfección de la Germinación de la Se desprende el Extracción de las
semilla. semilla durante 1, 2 y fragmento seminal (la enzimas provenientes
3 días. cápsula) y se macera del maíz germinado
las semillas. durante 1, 2 y 3 días
con solución tampón
de 5 unidades de pH.
(0,5 mmol/l)

1
(Kennelly y Rodwell, 2000)
2. Adecuación del sustrato (almidón):
Paso 1:
Paso 2:
Adición el sustrato
Medición de las sustancias
Medir 0,5 ml de almidón de amortiguadoras
concentración 1,4 g/l
a. Efecto temperatura:
Se adiciona la solución tampón
de 5 unidades de pH.
b. Efecto pH:
Se añadirá un pH distinto por
recipiente a 4, 5, 7, 8 y 11
unidades de pH,
respectivamente.
Paso 3:
Climatización del sustrato y de
los extractos enzimáticos
a. Efecto temperatura:
Incubar a distintas
temperaturas (0°C, 37°C, 40°C
y 80°C)
b. Efecto pH:
Incubar a 37°C todas las
experiencias.
 3. Reacción enzimática

Paso 1: Paso 2: Paso 3:

Inicio de la reacción Reacción Detección de la
enzimática enzimática reacción
Se inicia al añadir el Durará 10 min a a. Se adiciona 0,5
extracto enzimático la temperatura ml del reactivo de
de 1 , 2 ó 3 días de que corresponda. Lugol al 3%.
germinación por
cada efecto.
4. Medición de las densidades ópticas a 600
nm en absorbancia para el efecto del pH y de
la temperatura sobre la actividad catalítica de
la amilasa vegetal extraída después de
germinar durante 1, 2 y 3 días,
respectivamente.
Extracto 1 Extracto 2

Extracto 3 2 día de
1 día de germinación
germinación

3 días de
germinación
 Datos experimentales:
Tabla 1 Densidades ópticas obtenidas al medir el efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática de la
amilasa vegetal
Día de Temperaturas (°C)
germinación
0 37 40 65 80
0 1,092 1,144 0,908 1,460 1,385
1 0,570 0,906 0,693 0,696 0,849
2 0,240 0,048 0,230 0,224 0,590
3 0,140 0,020 0,080 0,028 0,500

Fuente: Datos obtenidos en el Laboratorio de Bioquímica General para Bioanálisis

Tabla 2 Densidades ópticas obtenidas al medir el efecto del pH sobre la actividad enzimática de la
amilasa vegetal
Día de pH
germinación
4 5 7 8 11
0 0,922 0,973 0,807 0,898 0,788

1 0,824 0,858 0,833 0,780 0,686

2 0,057 0,065 0,036 0,130 0,542

3 0,049 0,032 0,020 0,050 0,400

Fuente: Datos obtenidos en el Laboratorio de Bioquímica General para Bioanálisis

 Determinación de la actividad catalítica
de la amilasa vegetal
Fórmula: Act Dc1(abs) – Dm1 (abs)
= 10 min =

Calculo tipo para el efecto temperatura:

Insertando
los valores Act 0,908 abs – 0,623 abs 0,0285
iniciales  = 10 min = abs/min

Calculo tipo para el efecto pH:

Insertando Act 0,922 abs – 0,824 abs 0,0098
los valores
= 10 min = abs/min
iniciales
 Resultados
Tabla 4 Actividad enzimática de la amilasa vegetal al variar la temperatura del medio

Día
Díade
de Temperaturas
Temperaturas (°C)
germinaci
germinación
0 37 40 65 80

Después de 0 0,0285
1,4 1,1 0,9 1,0 1,3
calcular e
1 0,6 0,9 0,6 0,5 0,8
insertar en la
tabla 2 0,2 0,0 0,2 0,2 0,5
3 0,0 0,0 0,0 0,1 0,5
Fuente: Datos obtenidos en el Laboratorio de Bioquímica General para Bioanálisis

Tabla 5 Actividad enzimática de la amilasa vegetal al variar el pH del

medio
Día de pH
germinación
4 5 78 8 11
0 0,0098
Después de
calcular e
1
insertar en la
tabla
2

Fuente: Datos obtenidos en el Laboratorio de Bioquímica General para Bioanálisis

Gráficas Debe llevar título y numeración arábica

Se debe
Gráfico 1 Actividad enzimática de la amilasa vegetal al variar la temperatura del colocar
0,16 medio leyenda
Se debe
identificar los 0,14
ejes de
0,12
coordenadas
Actividad enzimática

0,1
0,08 E1
0,06 E2
0,04 E3
0,02
0

0 10 20 30 40 50 60 70 80
Temperatura (°C)

Gráfico 2 Actividad enzimática de la amilasa vegetal al variar el pH del medio

0,12

0,1

0,08
Acxtividad enzimática

0,06 E1

0,04 E2
E3
0,02

0
-0,02 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
pH
Resultados y valores de referencia

Enzima Experimental Teórico

pH óptimo Temperatura pH óptimo Temperatura Intervalo

(°C) óptima (°C) (°C) óptima (°C) De
inactivación
(°C)
-amilasa 4-6 60-65 73

-amilasa 4-5 55 65

Insertar los resultados como no se separó

-amilasa de la -amilasa se combinará
 Bibliografía
• Kennelly P y Rodwell V.
Enzimas: mecanismo de
acción. En: Murray R,
Kennelly P, Bender D,
Rodwell V, Botham K, Weil
A. 2000. Harper. Bioquímica
ilustrada. Edit. McGraw-Hill.
México. 28a ed. Cap7:51-61.
• Kennelly P y Rodwell V.
Enzimas: cinética. En:
Murray R, Kennelly P,
Bender D, Rodwell V,
Botham K, Weil A. 2000.
Harper. Bioquímica
ilustrada. Edit. McGraw-Hill.
Méxido. 28a ed. Cap 8:62-74.
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