Manual Recuperado Biología Molecular

Universidad Autónoma de Querétaro
Campus UAQ-Aeropuerto
Laboratorio de Biología Molecular
Lic. En Microbiología
Manual de Prácticas de Biología Molecular
Profesor: Dr. José Antonio Cervantes Chávez
Santiago de Querétaro, Qro. Enero, 2020.
i
Rectora: Dra. Margarita Teresa de Jesús García Gasca
Director de la FCN: Juana Elizabeth Elton Puente
Secretaria Académica: Dra. Elizabeth Elton Puente
Coordinador: Dr. Fidel Landeros Jaime
ii
ÍNDICE
ÍNDICE...................................................................................................................................1
Introducción............................................................................................................................2
Práctica 1. Extracción de ADN genómico...........................................................................3
Práctica 2. Observación de la heterocromatina “Cuerpos de Barr”....................................7
Práctica 3. Determinación de la concentración y pureza de una muestra de ADN
genómico...........................................................................................................................10
Práctica 4. Electroforesis de ADN en gel de agarosa........................................................12
Práctica 5. Reacción en Cadena de la Polimerasa “PCR”.................................................15
Práctica 6. Preparación y transformación de células competentes de Escherichia coli....19
Práctica 7. Clonación de Productos de PCR......................................................................23
Práctica 8. Aislamiento de ADN plasmídico.....................................................................26
Práctica 9. Determinación de la identidad de un plásmido por medio del uso de enzimas
de restricción.....................................................................................................................29
Práctica 11. Estudio de promotores inducibles.................................................................32
Práctica 12“En función del tiempo disponible”................................................................36
APÉNDICE A.......................................................................................................................39
APENDICE B.......................................................................................................................40
1
Introducción
El estudio de la biología molecular integra y reúne conocimientos y aplicaciones de

diversas disciplinas tales como: bioquímica, biofísica, microscopía, genética, microbiología
entre otras. En este manual reunimos ideas y propuestas de dichas disciplinas que
permitirán entender las bases moleculares implicadas en el funcionamiento de la célula.
La biología molecular está en pleno desarrollo, ha permitido grandes avances que

revolucionaron la forma de comprender la vida celular logrando un giro integrador con
análisis más profundos, permitiendo así descifrar un poco el misterio que envuelve la
naturaleza compleja de la unidad básica de la vida.
El entendimiento de esta disciplina con lleva años de estudio y dedicación. Cabe destacar
que no es una disciplina aislada, ya que la integración de otras áreas la complementan y
enriquecen. Por ello es importante que los estudiantes se involucren en dicha área, ya que,
con base en el conocimiento de conceptos básicos, pueden entenderse y aplicarse en
muchas áreas tales como la investigación, la industria, el diagnóstico, el diseño de terapia
génica entre otras. El objetivo principal de este manual es que el alumno adquiera la
formación experimental que le permita poder desarrollar habilidades en el uso y manejo de
las bases para diversas técnicas moleculares que son importantes para la comprensión de
muchos procesos de interés actual, como es la tecnología del ADN recombinante, la
ingeniería genética, la secuenciación del ADN, el código de barras para los
microorganismos, el silenciamiento génico, y más reciente la modificación del genoma vía
la tecnología de Crisper Cas.
“No evitéis las dificultades a vuestros hijos, más bien enseñadles a superarlas”.
Louis Pasteur
2
Universidad Autónoma de Querétaro- Campus Aeropuerto
Lic. En Microbiología Semestre 2020-I
Práctica 1. Extracción de ADN genómico
INTRODUCCIÓN
Aunque el ADN fue descubierto en los núcleos celulares por Friedrich Miescher en
el año 1869 no se le identificó como portador directo de la información genética en ese
momento. Fue hasta el año de 1944, que Oswald Theodore Avery y colaboradores,
descubrieron que algunas células de un cultivo de una cepa no virulenta de la bacteria
Diplococus pneumoniae (también denominada neumococo), se transforman en una forma
virulenta heredable o cepa productora de enfermedad, por la adición de ADN extraído de
neumococos virulentos.
Antes se creía que las cuatro bases principales halladas en el ADN – adenina,
timina, guanina y citosina se encontraban en proporciones equimoleculares en todas las
moléculas de ADN. Después, en el periodo comprendido entre 1940 y 1953, Erwin
Chargaff y sus colaboradores aplicaron técnicas cromatográficas para la separación y
análisis cuantitativo de las cuatro bases contenidas en muestras hidrolizados de ADN
aislados de distintos organismos. De estos datos se dedujeron las siguientes conclusiones
importantes:
1 La proporción en la composición de bases del ADN varía de una especie a otra.
2 Las muestras de ADN aisladas de distintos tejidos de una misma especie tienen la
misma composición de bases.
3 La composición en bases del ADN de una determinada especie no cambia con la

edad, con el estado nutricional, ni con las variaciones del entorno.
4 En casi todas las moléculas de ADN examinadas el número de restos de timina es

igual al número de restos de adeninas, decir A=T. Y el número de restos de guanina
es siempre igual al de restos de citosina (G=C). Como corolario, queda claro que la
suma de restos de purina igual a la suma de restos pirimidínicos, es decir
A+G=T+C.
5 El ADN extraído de especies estrechamente relacionadas poseen una composición

similar de bases, mientras que los que proceden de especies diferentes, es probable
que tengan una composición de bases distinta y puede utilizarse para clasificar a los
organismos.
3
A partir de la equivalencia de bases observada en el ADN de distintas especies, se
infirió que en las moléculas del ADN existe un nivel de organización estructural que debe
ser compatible con ciertas equivalencias de bases, pero incompatible con la de otra. De
hecho, ya se había sospechado que el ADN tenía una conformación tridimensional
específica. Puesto que las disoluciones de ADN son muy viscosas, se comprendía que las
moléculas de ADN fueran largas y rígidas en vez de compactas y plegadas.
El modelo estructural del ADN de Watson y Crick proponía que 2 cadenas
polinucleotídicas dextrógiras se hallaban enrolladas en forma de hélice alrededor de un
mismo eje, constituyendo así una doble hélice. Ambas cadenas son antiparalelas, es decir,
sus puentes fosfodiéster 3’-5’ internucleótidos van en direcciones opuestas. El
enrollamiento de ambas cadenas es tal que no pueden ser separadas sin desenrollarlas; este
tipo de enrollamiento se denomina plectonémico. Las bases purínicas y pirimidínicas de
cada una de las hebras están apareadas en los mismos planos con las bases de la otra hebra.
El apareamiento de las bases con que contribuyen las 2 hebras es tal, que solo encajan
en las estructuras determinados pares de bases que pueden ligarse entre sí, por enlaces de
Hidrógeno. Los pares permisibles son A-T y G-C, que son precisamente los pares de bases
que muestran equivalencia en el ADN.
Así, la doble hélice de Watson y Crick implica no sólo el máximo posible de pares de
bases conectadas por enlaces de Hidrógeno, sino aquellos pares que proporcionan las
máximas posibilidades en cuanto a acoplamiento y estabilidad.
OBJETIVO
Purificar ADN genómico íntegro y puro ser utilizado en reacciones subsecuentes.
MATERIALES
Gradilla para tubos Eppendorf.
Tubos Eppendorf.
2 tubos Eppendorf con perlas de vidrio.
Vórtex.
Centrifuga de mesa.
Puntas amarillas y azules estériles.
Juego de micropipetas.
Hielo/Hielera.
REACTIVOS
Cultivos de Ustilago maydis.

Buffer Tris-EDTA pH8 TE: 200 µl.
Buffer TSNTE (400 µl). Tris, SDS, NaCl, Triton X100, EDTA.
Fenol-cloroformo (200 µl).*
4
Solución de la RNasa A (10 mg/ml).
Acetato de sodio 3M.
Etanol absoluto frío (600 µl).
Etanol al 70% frío.
METODOLOGÍA
1.- 10 ml de cultivo del hongo U. maydis de 18 a 24 hrs. El cultivo contenido en un tubo
cónico que ha sido previamente centrifugado a 3500 rpm durante 5 minutos. Re-suspender
la pastilla celular en TE pH8 (200 µl).
2.- Tomar con la micropipeta de 1000 µl la muestra del paso anterior y pasarla a un tubo
Eppendorf que contiene las perlas de vidrio (300 l).
*Cuidar que NO rebase los 600 l (muestra y perlas de vidrio).
3.- Agregar 400 µl del Buffer TSNTE.
4.- Agregar 200 µl de fenol-cloroformo*.
*Este reactivo deberá ser usado de forma responsable en la campana de extracción
con guantes y lentes de seguridad para prevenir accidentes.
Tapar bien el tubo Eppendorf, asegurándose que no existan fugas antes de iniciar el
siguiente paso. Usar equipo de seguridad.
5.- Poner 3 min en el vórtex.

6.- Centrifugar 5 min a 12 000 rpm. Recuperar la fase acuosa (fase superior) en un tubo
Eppendorf y descartar el tubo que contiene la fase orgánica en el contenedor localizado en
la campana de extracción o en la mesa de trabajo.
7.- Agregar 5 µl de la enzima RNasa A.
8.- Mezclar en el vórtex durante 5 segundos.
9.- Incubar por 5 min a 37°C.
10.-Agregar 1/10 del volumen contenido en la muestra de acetato de sodio 3 M y 2
volúmenes de etanol absoluto frío.
Ej. Sí tiene 500 l, agregar 50 l de acetato de sodio 3M. Y 1000 l de etanol absoluto.
11.- Incubar a -20°C por 30 min.
12.- Centrifugar a 12 000 rpm por 10 min.
13.- Decantar *Nota: Observar donde se encuentra la pastilla de ADN y decantar con
cuidado evitar que la pastilla se vaya.
14.- Agregar 300 µl de Etanol al 70%.
Será necesario darle pequeños golpeteos al tubo Eppendorf para desprender la
pastilla en el etanol al 70%. Nota: la pastilla no se disuelve en este paso.
15.- Centrifugar 5 min a 12 000 rpm.
16.- Decantar.
5
*Observar donde se encuentra la pastilla de ADN y decantar con sumo cuidado
procurando que al momento de decantar no se lleve la pastilla.
17.- Colocar el tubo boca abajo (para secar) sobre una toalla de papel, evitar que la pastilla
se desprenda del tubo.
*Dejarla el tiempo necesario; éste no deberá de ser muy prolongado ya que la muestra
podría endurecerse y será difícil de disolver.
18.- Agregar 40 µl de agua grado biología molecular y disolver la pastilla.
19.- Mantener la muestra en hielo o almacenar a -20oC hasta que se realice la electroforesis.
RESULTADOS.
DISCUSIÓN.
CONCLUSIÓN.
CUESTIONARIO:
1.- ¿Cuáles son las funciones generales del ADN y del ARN?
2.- ¿Para qué sirven las perlas de vidrio en la extracción del ADN?
3.- ¿Para qué se utiliza el Buffer TRIS EDTA (TE)?
4.- ¿Cuál es la función del fenol-cloroformo en la extracción del ADN?
5.- Investigar las características químicas de cada uno de los componentes del buffer
TSNTE e indicar la función de estos durante la extracción del ADN.
BIBLIOGRAFÍA
Hoffman CS &Winston F (1987) A ten-minute ADN preparation from yeast efficiently

releases autonomous plasmids for transformation of Escherichia coli. Gene 57: 267–272.
6
Práctica 2. Observación de la heterocromatina “Cuerpos de Barr”
INTRODUCCIÓN
El fenómeno epigenético conocido como la inactivación del cromosoma X ha

intrigado a los científicos durante décadas. En la mayoría de los organismos diploides, se
expresan genes de los dos alelos. Sin embargo, esto no es posible en los cromosomas
sexuales, ya que el número de cromosomas X y Y difiere entre sexos (1).
Murray Barr y Ewart George Bertram observaron por primera vez en el núcleo un
corpúsculo condensado distinto al nucleólo. Se dieron cuenta que las gatas normalmente
poseen un único corpúsculo condensado mientras que los gatos no muestran ninguno. Estos
investigadores se refirieron a este corpúsculo como cromatina sexual y hasta la fecha se ha
denominado corpúsculo o cuerpo de Barr. En 1999, Mary Lyon sugirió que este corpúsculo
de Barr es un cromosoma X inactivo en hembras, el cual se enrolla de manera compacta,
formando la estructura conocida como heterocromatina, una forma condensada y por tanto
visible de la cromatina cuya característica principal es su nula actividad transcripcional (1).
La manifestación de la cromatina sexual no aparece siempre en forma de cuerpos de

Barr. En 1954, Davidson y Smith observaron en leucocitos polimorfonucleados de sangre
periférica la presencia de unas protuberancias en forma de palos de tambor (baquetas)
relacionadas con el sexo de la persona. Actualmente se acepta que son equivalentes a los
cuerpos de Barr, que, si bien se observan con más dificultad, los leucocitos neutrófilos son
los más idóneos para el recuento (3).
Por otra parte, posibles perturbaciones de la meiosis podrían explicar diversas

aberraciones cromosómicas, como la ruptura y recombinación anormal de un cromosoma
(translocación), la pérdida de una parte de un cromosoma (deleción), el retardo en la
separación de dos cromosomas a la falta de migración polar. Todos estos tipos de
aberraciones dan origen a anomalías en su número, dando como resultado que se produzcan
las aneuploidías, mismas que se caracterizan por la falta o exceso de algún cromosoma o
fracción de éste. Una alteración cromosómica puede expresarse como un síndrome, como
una sintomatología o ser recesiva y no presentar ningún tipo de expresión (2).
MATERIAL
1 Pipeta Pasteur desechable.

2 Microscopios por equipo.
Portaobjetos. Una caja para todo el grupo.
Cubreobjetos. Una caja para todo el grupo.
7
Aceite de inmersión.
Agua destilada.
Plumón indeleble.
Micropipeta y puntas para 200 l.
1 Vasos de precipitados (50 ml).
Pinzas.
Hisopos estériles.
Nota: Esterilizar previamente los hisopos (150 por grupo) proporcionados por los
estudiantes.
Reactivo aceto-orceína (proporcionada por el instructor)
Solución de fijación (Preparar por equipo en la campana de extracción de gases).

Alcohol metílico absoluto 20 ml
Ácido acético glacial 20 ml
Colocar el alcohol en el vaso de precipitados y agregar lentamente y por las paredes el
ácido acético.
METODOLOGÍA
Aceto-orceína
1) En portaobjetos limpio, agregar 10 l de agua destilada (extremo derecho del
portaobajetos); con el hisopo se hace un raspado suave de la mucosa bucal (área
interior de la mejilla), se desecha este primer material obtenido. Se practica un
segundo raspado suave sin lesionar la mucosa y se extiende sobre el
portaobjetos procurando que el frotis no quede demasiado delgado. Para esto,
hay que aplicar muy poca presión ya que las células se desprenden muy fácilmente.
Rápidamente, para evitar que se seque la preparación, se procede a la fijación y a la
tinción. Tomar muestra de individuos de sexo masculino y femenino, marcar con
plumón indeleble cada muestra.
2) Fijación: Sumergir (20 min) el portaobjetos inmediatamente en un vaso de

precipitado que contiene 40 ml de la solución fijadora, evitar que los portaobjetos se
junten. Transcurrido el tiempo con ayuda de las pinzas sacar el portaobjetos de la
solución fijadora. Secar el exceso de solución fijadora con ayuda de una sanita.
3) Sobre el portaobjetos que contiene el frotis de la mucosa bucal adicionar 1 gota de

solución de aceto-orceína (40 l) en el centro de la preparación y se colocar un
cubreobjetos.
4) Colocar una sanita y sosteniendo este con la mano izquierda, hacer

presión ligera con el pulgar derecho de un extremo al otro del
portaobjeto. Esta maniobra logra oprimir las células y elimina el exceso de
colorante. La observación de la preparación debe hacerse de inmediato.
5) Observar las preparaciones al microscopio con el objetivo de inmersión. Desechar la
preparación en un recipiente con antiséptico una vez realizada la observación.
8
RESULTADOS.
DISCUSIÓN.
CONCLUSIÓN.
CUESTIONARIO
1. Enuncie las diferencias entre la eucromatina y la heterocromatina.

2. ¿Cuál es la estructura química de la aceto-orceína?
3. ¿Por qué la aceto-orceína se une con el ADN?
4. ¿A nivel molecular como se realiza la inactivación del cromosoma X en hembras?
5. Describe anormalidades cromosómicas en el par sexual (al menos 4).
6. ¿Con qué colorante se puede sustituir la aceto-orceína?
7. Además de los mamíferos, existe algún tipo de silenciamiento similar al cromosoma
X en hembras. Explique a detalle el caso.
BIBLIOGRAFÍA
1. Silvia Baquedano Coarasa, Alejandro Usón Ferrando. Fundamentos de Genética:

Inactivación del cromosoma X. LANGEBIO. PDF File.
2. Pearl Solomon Eldra, R. Berg Linda, Martin W. Diana, 1999, Biología, Quinta
edición, Mc Graw-Hill.Interamericana.
3. Citogenética. Juan- Ramón Lacadena. 1° edición. Editorial Complutense. PDF File.
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Práctica 3. Determinación de la concentración y pureza de una muestra de ADN

genómico.
INTRODUCCIÓN
El ADN presente en soluciones acuosas se cuantifica midiendo la absorbancia (A) o

densidad óptica (DO) utilizando luz ultravioleta “UV”. La muestra es pura cuando no
contiene cantidades significativas de contaminantes como proteínas, fenol u otros
componentes de la célula. Por lo que la medición por espectrofotometría de la radiación UV
que se absorbe por las bases es única y exacta. La concentración de los ácidos nucleicos
suele determinarse midiendo la DO a 260 nm, puesto que las bases nitrogenadas purinas y
pirimidinas del ADN tienen la capacidad de absorber la luz UV a esta longitud de onda. La
interferencia de contaminantes puede determinarse por el cálculo del cociente, dado que las
proteínas absorben a 280 nm, se emplea el cociente obteniendo de la relación A260/A280
para calcular la pureza de los ácidos nucleicos. Así mismo, el fenol comúnmente utilizado
durante la extracción absorbe a 270 nm.
OBJETIVO
Conocer los principios básicos para determinar la concentración y pureza del ADN
por método espectrofotométrico. Correlacionar la lectura obtenida en el NanoDrop en
comparación con lo observado en un gel de agarosa.
MATERIALES
Muestra de ADN práctica 1.

Juego completo de micropipetas y puntas.
Tubos Eppendorf.
NOTA: Es responsabilidad del estudiante leer el manual del NanoDrop.
METODOLOGÍA
1.- Descongelar en hielo las muestras de ADN purificadas en la práctica 1.
2.- Agitar suavemente las muestras (sin vórtex).
3.- En compañía de su instructor:
10
4.- Ajustar a cero de absorbancia el NadoDrop utilizando para ello agua grado biología
molecular. Levantar el pedestal del aparato, colocar 2 l de agua en el dispositivo para
colocar la muestra. Bajar el pedestal y leer el blanco.
5. Seleccionar el modo de lectura: ADN.
6.- Colocar 2 l de la muestra como en el paso 4. Oprimir el botón “leer muestra”
7.- Observar la curva de absorbancia y tomar los datos obtenidos para concentración de
ADN, y la relación de la absorbancia 260/280.
8.- Entre cada muestra debemos de limpiar suavemente el equipo con papel seda.
En caso de tener que usar un espectrofotómetro con celda de cuarzo.
Para determinar la concentración de ADN de doble cadena de alto peso molecular,

plásmidos o productos de PCR, se realizan mediciones a 260 y 280 nm. Concentraciones
tan bajas como 2.5µg/ml pueden ser detectadas. A pH neutro, una solución de ADN a 1
mg/ml tiene una absorción máxima a 260 nm de 20 cuando se lee en una celda de 1cm.
(este valor es para moléculas de ADN de doble cadena con un contenido G+C de 50%.
En principio una solución de ADN de doble cadena a una concentración de 50 µg /ml debe
tener una A260 igual a 1.0.
Concentración ADN (µg/mL) = (A260) x (factor de dilución) x 50
RESULTADOS.
DISCUSIÓN.
CONCLUSIÓN.
CUESTIONARIO
1.- ¿Por qué se recomienda medir la absorbancia a 280 nm?
2. Espectrofotométricamente no es posible distinguir una muestra pura de ADN de una
contaminada con ARN. Proponga un método que permita determinar y/o observar el RNA
presente en la muestra.
3.- ¿Cuál es el rango del espectro electromagnético que corresponde a la luz ultravioleta?
4.- ¿Por qué se utilizan celdas de cuarzo para medir la absorbancia en el rango de luz
ultravioleta?
5.- Proponga un procedimiento para determinar la concentración de ADN lo más exacto
posible sin utilizar un espectrofotómetro, ni ningún otro equipo sofisticado.
6.- Explique la Ley de Beer.
BIBLIOGRAFÍA
Sambrook, J., and Russell, D. W. 1999. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd. ed.
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, U.S.A.
Manual NanoDrop2000. Spectrophotometer V3.7. ThermoScientific
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Práctica 4. Electroforesis de ADN en gel de agarosa
INTRODUCCIÓN
La mayoría de los polímeros biológicos poseen carga eléctrica y, por lo tanto, son
capaces de migrar bajo la influencia de un campo eléctrico. El transporte de partículas a
través de un soporte sólido mediante un campo eléctrico recibe el nombre de electroforesis.
Una forma de caracterizar una macromolécula es determinar la distancia que recorre en
función del tiempo al someterla a un campo eléctrico. Esta propiedad puede ser utilizada
para calcular el peso molecular de un biopolímero, distinguir moléculas por su carga neta o
su forma, detectar cambios de ácidos nucleicos de restos polares o no polares y viceversa.
Para realizar la electroforesis de manera eficiente, se requiere un medio de

migración adecuado; ya que se necesita suficiente fuerza de rozamiento para que las
moléculas de distinto tamaño se separen. Para ello se emplea un gel que consiste en una red
compuesta por un polímero orgánico (en este caso usamos agarosa, derivado de un
polisacárido producido por algunas especies de algas) que aumenta considerablemente la
fricción, impidiendo de manera simultánea, la difusión de las moléculas a través del medio
acuoso en todas las direcciones al colocar las muestras de ADN en el gel y someterlo a un
campo eléctrico.
OBJETIVO
Determinar la integridad del ADN purificado en la práctica 1 e identificar la presencia de
RNA en la muestra mediante la técnica de electroforesis.
MATERIAL
Cámara de electroforesis, peine para 8 pozos. Fuente de poder.
Micropipeta 20µl y 2µl.
Puntas amarillas estériles.
Fotodocumentador.
Parafilm.
Espátula de plástico.
Charola para transportar geles.
REACTIVOS
Muestra de ADN.
Agarosa al 1% en buffer TAE1X.
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Buffer de carga 6X, Xylen-Cyanol.
Solución de trabajo de GelRed (10,000X concentrado, agregar 5 l a 1 ml de buffer de
carga).
Buffer TAE concentrado 50X.
Agua destilada.
METODOLOGÍA
a) Gel de Electroforesis.
1.- Preparación del gel de agarosa al 1% (1 g de agarosa en 100 ml de Buffer TAE 1X).
2.- Homogenizar y disolver por calentamiento (horno de microondas) y esperar a que enfríe
(60oC), verter la agarosa en el portageles y dejar solidificar con el peine previamente
colocado, una vez solidificado retirar con cuidado el peine para evitar romper los pozos.
3.- Colocar el gel en la cámara de electroforesis y agregar el Buffer TAE 1X hasta la marca.
b) Preparación de la muestra de ADN.

1.- Colocar 4µl de colorante Xylen-Cyanol (buffer de carga) en el Parafilm.
2.- Tomar 5µl de la muestra de ADN, colocar sobre el buffer de carga y homogeneizar la
muestra.
3.- Se ajusta la micropipeta a un volumen de 9 µl, se toma dicho volumen, con cuidado se
coloca en los pozos procurando no romper el gel.
4.- Se enciende la fuente de poder y se ajustan las condiciones de corrida a 110 voltios
durante 30 min.
5.- Transcurrido este tiempo, apagar y desconectar la cámara, tomar el gel con una espátula
y colocarlo en una bolsa de plástico.
6.- Observar el ADN y/o RNA con luz UV en el transiluminador.
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIÓN
CUESTIONARIO
1.- ¿Cuál es el fundamento de la electroforesis en gel de agarosa?
2.- ¿Hacia qué polo migra el ADN durante la electroforesis y por qué?
3.- ¿Con base en qué se decide el porcentaje para realizar el gel de agarosa?
4.- ¿Qué otros colorantes además del GelRed pueden utilizarse para teñir el ADN? y ¿Cuál
es el fundamento molecular de estos colorantes?
5.- ¿Qué pasaría si se utilizará agua destilada en lugar del Buffer TAE 1X en la cámara de
electroforesis o en la solución del gel de agarosa?
6. Explica en qué consiste el gel de poliacrilamida y sus diferencias con la electroforesis en
gel de agarosa.
7.- ¿Cuál es la composición del buffer TAE?
13
8.- Describa las características químicas de los compuestos utilizados en el buffer TAE.
BIBLIOGRAFÍA
Manual de técnicas básicas de Biología Molecular.

Jorge Zabala Castro. Ediciones de la universidad Autónoma de Yucatán. Pág. 10, 17, 32
Biología Celular y Molecular. Matsudaira, Berk, Lodish, Kaiser.5ta edición, Editorial

Médica Panamericana.
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Práctica 5. Reacción en Cadena de la Polimerasa “PCR”
INTRODUCCIÓN
PCR, por sus siglas en inglés de Polymerase Chain Reaction ha sido uno de los más
grandes avances en el campo de la biología molecular. Fue creada en 1983 por Kary Mullis.
Este científico logró desarrollar esta técnica in vitro, que genera una reacción simulada
respecto a lo que sucede en una célula cuando se sintetiza ADN. Con esta técnica es posible
la síntesis de grandes cantidades de ADN a partir de un fragmento de interés, y conseguir
millones de copias en un par de horas. La Taq ADN-polimerasa es la encargada de este
proceso in vitro, además posee la capacidad de trabajar a temperaturas de desnaturalización
del ADN (95oC). Esta polimerasa proviene de la bacteria llamada, Thermus aquaticus que
habita en aguas termales, entre los 79° y 85°C.
La reacción consta, por lo regular, de treinta ciclos repetitivos que está conformado
principalmente de tres pasos por cada ciclo. El primero consiste en la separación de la doble
cadena por ruptura de los puentes de hidrogeno del ADN, provocando su desnaturalización,
para esto se necesita una primera temperatura de 95°C, por un minuto. Después del primer
paso, ocurre la hibridación de las cadenas desnaturalizadas con los cebadores,
oligonucléotidos o primers (ADN corto sintético de cadena sencilla), para esto necesitamos
una temperatura óptima para su plegamiento con los ADN desnaturalizados, esta
temperatura va a depender de la Tm (temperatura de fusión) de los oligonucléotidos,
generalmente oscila entre los 50 y 60°C, el tercer y último paso se efectúa a un temperatura
de 72°C, temperatura a la que la Taq polimerasa se une al ADN para comenzar a sintetizar
la cadena complementaria a la cadena molde mediante la incorporación de dNTPs
(desoxirribunucleósidos trifosfato) libres, en el extremo 3’ libre del oligonucléotido,
terminado este ciclo se repite y así sucesivamente hasta generar una cantidad suficiente de
ADN. Realizando la polimerización en la dirección 5´a 3´.
OBJETIVOS
Comprender las bases moleculares basada en la replicación del ADN y las aplicaciones de
la técnica del PCR.
MATERIALES
Gradilla para tubos de PCR.
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Tubos para PCR estériles.
1 Centrifuga de mesa.
Micropipetas: 20 µl y 0.2 µl. Y puntas estériles.
Máquina de PCR. Reservar el equipo con dos días de anticipación.
REACTIVOS CANTIDAD
Buffer Taq polimerasa 2.5 µl
50 mM MgCl2 0.75 µl
10 mM dNTPs 0.2 µl
Primer 5’ 0.5 µl
Primer 3’ 0.5 µl
ADN genómico (100 ng l-1). 1 µl

Taq polimerasa 0.15 µl
H2O cbp 25 µl
PROCEDIMIENTO I
METODOLOGÍA
1.- Colocar en un tubo para PCR cada uno de los reactivos en el orden en que se indican.
Mantener los reactivos y el tubo para PCR en hielo.
2.- Una vez terminado este paso, mezclar y dar un pulso en la centrifuga hasta 12000 rpm
para bajar todos los reactivos al fondo del tubo.
3.- Programar el termociclador.
4.- Colocar las muestras en los pozos y ejecutar el siguiente programa de amplificación de
ADN.
Oligonucleótidos diseñados en un fragmento del gen de actina de Ustilago maydis

(235 pb)
Primer 2035 F 5’ cttcctgacggacaggtgat3’
Primer 2036 R 5’ ctcgggaggagcaacaatc 3’
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PROCEDIMIENTO II: VISUALIZAR AMPLICON SINTETIZADO
MATERIALES
Cámara de electroforesis.
Agarosa al 1.2% en buffer TAE (1X).
Parafilm.
Micropipetas 20 µl.
Puntas 2 µl y 20 µl.
Buffer de carga 6X. Xilen-Cyanol.
Marcador de peso molecular. 100 pb.
Fotodocumentador.
METODOLOGÍA
1.- Preparar un gel de agarosa al 1.2 %, 8 pozos.
2.- En un parafilm colocar 4µl de colorante (colocar las gotas necesarias para el número de
pozos que vayamos a usar). Tomar con la micropipeta 10 µl de la muestra de PCR y
colocarla en la gota del buffer de carga, mezclar con la micropipeta subiendo y bajando la
muestra (solo 1 vez).
6.- Tomar 12 µl de la mezcla: producto de PCR más buffer y cargar en el pozo con cuidado,
procurando no romper los pozos.
7.- Colocar en un carril el marcador de peso molecular 100 pb.
8.- Encender la cámara de electroforesis a 100 V y correr durante 25 minutos.
9.- Observar el gel en el fotodocumentador.
RESULTADOS.
DISCUSION
CONCLUSIONES
CUESTIONARIO.
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1.- Explique las características del organismo del cual fue purificada la Taq ADN
polimerasa
2.- Explique nivel molecular, las diferencias entre las ADN polimerasas de las arqueas en
comparación con las de E. coli.
3.- ¿Para qué sirven los oligonucleótidos durante la reacción de PCR?
5.- ¿Qué es la temperatura de fusión (Tm) de los oligonucleótidos y qué factores pueden
influenciarla?
6.- ¿Qué significa la procesividad de una ADN polimerasa?
7.- ¿Las RNA polimerasa requieren de un primer para iniciar la reacción de síntesis?
8.- Suponga que durante una reacción de PCR en la cual no se incluye en ADN, al
momento de correr la electroforesis Ud. observa que existe amplificación. Puesto que
obtiene una banda del peso molecular esperado.
a) Como explica dicho resultado.
b) Como soluciona dicho problema.
9.- ¿Cuál es la diferencia entre una Taq ADN polimerasa recombinante y la nativa?
10.- ¿Qué características debe de tener un oligonucleótido?
BIBLIOGRAFÍA
Rodríguez, P. Barrera, H. (2004) La reacción en cadena de la polimerasa a dos décadas de

su invención. Ciencia UANL,Vol VIII. N° 3.
Pérez, A. Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction, PCR).
Universidad Politécnica de Valencia. Dep. Biotecnología. ETSIAMN.
18
Práctica 6. Preparación y transformación de células competentes de Escherichia coli
INTRODUCCIÓN
Los plásmidos son moléculas de ADN de doble cadena circulares, y en algunos
casos, lineales. Generalmente son de tamaño pequeño, son extracromosomales y se replican
de manera independiente al cromosoma, normalmente varias especies de bacterias los
portan ya que éstos portan genes que le confieren a la bacteria algún tipo de ventaja como
resistencia a antibióticos, metales pesados, enzimas para degradar ciertos sustratos,
producción de toxinas, factores de patogenicidad etc. Cabe mencionar que también se
encuentran en algunas levaduras (Jeremy, 2008).
Existen diferentes métodos para introducir plásmidos en las bacterias (proceso

llamado transformación) los cuales varían ampliamente de acuerdo a la naturaleza de su
mecanismo de acción, encontrando entre estos la electroporación, choque térmico-CaCl 2,
biobalísitica, las ondas de choque, etc. (Pierce, 2009).
Entre los métodos más baratos y con una buena eficiencia de transformación se
encuentra el de choque térmico con CaCl2, en esta técnica el cambio brusco de temperatura
junto con la alta concentración de ion calcio en el medio extracelular, forman poros
transitorios en la membrana, suficientemente grandes para que el plásmido entre en el
citoplasma bacteriano. Cuando una bacteria es capaz de tomar ADN exógeno e incorporarlo
se denomina “competente”. El nivel de competencia de la cepa bacteriana utilizada y el
método de transformación determinan el número de transformantes obtenidas, por ejemplo,
tenemos a la cepa Top10 la cual está patentada y es comercializada por la compañía
Invitrogen, esta cepa nos provee de una eficiencia de transformación alta con el método de
choque térmico-CaCl2 de 1 x109 cfu/µg de plásmido (Invitrogen, 2013).
Después de la reacción de transformación, las bacterias se transfieren a un medio

selectivo (generalmente con antibiótico) en el cual únicamente crecerán las células
transformadas. Adicionalmente se pueden añadir marcadores extras que nos indiquen
visualmente que la incorporación del plásmido se llevó a cabo correctamente. Estos
marcadores pueden ser la GFP (proteína verde fluorescente) RFP (proteína roja
fluorescente) gen Lac Z que codifica para la enzima β-galactosidasa que cuando se agrega
el sustrato gal- X las colonias son de color azul (Gilbert, 2005).
19
Figura 1. Pasos generales para la obtención de bacterias transformantes por el método de Cloruro de sodio y choque
térmico.
OBJETIVO
Inducir el estado de competencia en las células de Escherichia coli y comprobar la
adquisición de ADN exógeno al recuperar colonias resistentes a ampicilina.
MATERIALES
Palillos estériles.
Tubos Eppendorf estériles.
Juego de micropipetas y puntas estériles.
2 Placas de agar LB con ampicilina (100 g/ml)
Lámparas de alcohol (95%).
Matraz de 125 ml estéril con tapón de algodón.
Marcador indeleble.
Tubos cónicos de 50 ml estériles.
Gradilla tubos Eppendorf.
20
Cinta masking
Hielo
Hielera
Centrifuga de mesa
Baño de agua a 42oC
Incubador 37oC con agitación.
Incubador 37oC sin agitación.
REACTIVOS
Cultivo de E. coli cepa Top10 o DH5.
Medio de cultivo LB líquido.
CaCl2 100 mM (estéril).
METODOLOGÍA
Siempre en condiciones de esterilidad.
1. En la campana: tomar una colonia del cultivo de E. coli de la cepa Top 10 con un
palillo estéril y depositarla en tubo cónico de 50 ml con 10 ml de medio de cultivo
LB; crecer incubar toda la noche a 37oC en agitación a150 rpm.
2. A la mañana siguiente, inocular 30 ml de medio de cultivo LB con el cultivo
anterior (1 ml) en un matraz de 125 ml. Incubar a 37oC durante 3.5 horas a150 rpm.
3. Verter el cultivo en un tubo cónico de 50 ml estéril y centrifugar durante 8 minutos
a 4,500 rpm a 4oC.
4. Descartar el sobrenadante en un contenedor con cloro (1%) en la campana de flujo
laminar.
5. Re-suspender la pastilla de células con 3 ml de CaCl2 (100 mM).
6. Colocar en hielo por 30 minutos.
7. Centrifugar durante 8 minutos a 4500 rpm.
8. Adicionar 500 l de CaCl2 100 mM y re-suspender la pastilla de células.
9. TRANSFORMACIÓN
10. Rotular un tubo Eppendorf estéril y colocar 100 μl de células (siempre mantener en
hielo, cuando no se utilice).
11. Agregar 5μl del plásmido o de algún producto de reacción de ligación. Mezclar
suavemente con movimiento circular.
12. Colocar la muestra en hielo durante 15 minutos.
13. Aplicar un choque térmico a 42oC durante 2 minutos.
21
14. Pasar a hielo el tubo durante 2 minutos.
15. Agregar al tubo de reacción 600 μl de medio LB sin antibiótico e incubarlo a 37°C
en agitación por 1 hora a 150 rpm.
16. Tomar 100 μl y 200 l del cultivo de manera independiente y sembrarlo en la placa
de medio LB con ampicilina (100 g/ml), adicionar las perlas de vidrio
(aproximadamente 10 perlas), realizar movimientos circulares para distribuir el
inóculo en el área total de la placa.
17. Incubar a 37°C durante 24 horas.
RESULTADOS.
DISCUSIÓN.
CONCLUSIÓN.
CUESTIONARIO
1.- Mencione las características genotípicas de la cepa Top10 de E. coli.
2.- En la naturaleza ¿Cómo se induce el estado de competencia de las células?
3.- ¿Cuál es la función del CaCl2?
4.-Explica una aplicación de la técnica de transformación bacteriana.
6.- ¿Con qué propósito se da un choque térmico a las células y explica lo que sucede a nivel
celular?
7.- Indique el nombre de 3 genes que confieran resistencia a antibióticos utilizados en
plásmido comerciales.
8.- ¿Cómo se clasifican los antibióticos relacionados con la pregunta anterior?
9.- Indique el mecanismo de acción de cada uno de los antibióticos de la pregunta 7.
10.- Indique como funciona cada uno de los genes de resistencia mencionados en la
pregunta número 7.
BIBLIOGRAFÍA
Gilbert, S. F. (2005). Biología del desarrollo. Ed. Médica Panamericana.
Helena Curtis, N. S. (2008). Curtis. Biología. Editorial Panamericana.
Invitrogen. (2013). lifetechnologies.

http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/C404010#citationsList
Jeremy Mark Berg, L. S. (2008). Bioquímica . Reverte.
P., C. J. (2005). Prácticas de biología molecular. Pontificia Universidad Javeriana.
Pierce, B. A. (2009). Genética: Un enfoque conceptual. Ed. Medica Panamericana.
Koneman, Elmer W. Giovaniello. Diagnostico Microbiológico. Sexta edición 2008.

Editorial Panamericana. Pag consultadas:186-187.
22
23
Práctica 7. Clonación de Productos de PCR
INTRODUCCIÓN
Los plásmidos son moléculas circulares de ADN de doble cadena, son
extracromosomales y se replican de manera independiente del cromosoma bacteriano.
Debido a sus características como es: pequeño tamaño de los plásmidos, su replicación
independiente de cromosoma, su alto número de copia, su fácil manejo en laboratorio, la
presencia de genes reporteros y de selección, así como su relativa estabilidad hacen que sea
una molécula ideal para introducir genes foráneos de nuestro interés dentro de una bacteria;
es por esta función que los plásmidos también son llamados “vectores” (Ureña, 2005).
Cuando se inserta un gen de interés dentro en un plásmido proceso denominado

“clonación”, es necesario tener un esquema general de la “anatomía” de dicho vector, en
términos de las secuencias presentes para enzimas en el poli-linker o sitio múltiple de
clonación, origen de replicación, la presencia de genes de resistencia y/o reporteros.
Para clonar un gen en un vector es necesario cortarl “digerir” en el poli-linker con

enzimas llamadas endonucleasas o de restricción. Generalmente estas enzimas reconocen
una secuencia palindromica corta (no más de 10 nucleótidos) y hacen un corte que puede
dejar extremos denominados romos o cohesivos (Figura 1). En los extremos cohesivos un
fragmento pequeño de una de las cadenas de la doble hélice queda sin ADN
complementario; este corte hace que el vector que era una molécula de ADN circular ahora
sea una molécula lineal. En los extremos romos, las cadenas de DNA quedan con su
respectiva secuencia complementaria.
Figura 2. Extremos romos y cohesivos. (Brown, 2007).
24
El último paso denominado ligación, consiste en la unión física del vector con la
molécula de ADN que contiene nuestro gen de interés, esto se logra mediante la acción de
enzimas denominadas ligasas. De manera general existe comercialmente la ligasa T4 DNA
ligasa, purificada del bacteriófago T4, como se mencionó anteriormente esta enzima es
capaz de formar enlaces entre dos moléculas de ADN con extremos romos y/o cohesivos,
simplemente cambiarán las condiciones de reacción, así como la cantidad de enzima a
utilizar (Jeremy, 2008).
OBJETIVO
Clonar un producto de PCR utilizando un vector comercial y la enzima T4 DNA ligasa.
MATERIALES
Gradilla para tubos Eppendorf.
1 centrifuga de mesa.
Micropipetas: 20 µl y 0.2 µl.
Puntas estériles.
REACTIVOS CANTIDAD
Buffer Ligasa 2 µl
Vector pJet1.2 0.5 µl
Producto de PCR 5 µl
T4 ADN ligasa 2 µl
H2O cbp 20 µl
METODOLOGÍA
1.- Colocar en un tubo Eppendorf cada uno de los reactivos en el orden en que se
mencionan, siempre manteniendo los reactivos y el tubo en hielo.
2.- Una vez terminado este paso dar un pulso al tubo en la centrifuga hasta 12000 rpm para
bajar todos los reactivos al fondo de éste.
3.- Incubar a 4oC toda la noche.
4.- Almacenar a -20oC hasta su posterior uso.
Nota: También es posible incubar de 5 a 10 min a 37oC y proceder a la transformación.
RESULTADOS.
DISCUSIÓN.
CONCLUSIÓN.
CUESTIONARIO
25
1.- Esquematice la reacción de ligación que se realiza entre el vector y el inserto (producto
de PCR), catalizado por la enzima T4 DNA ligasa.
2.- ¿Cuál es la función del poli-linker presente en los vectores?
3.- ¿Qué tipo de ADN polimerasas adicionan una dA en los extremos 3´ del producto de
PCR?
4.- Existen vectores comerciales que explotan la característica de adicionar una dA al
producto de PCR. Explique cómo funciona dicha tecnología.
5.- Si Ud. no puede costear la tecnología mencionada en la pregunta 6. Como haría en su
laboratorio para poder realizarlo de manera “casera”.
6.- El vector pJet1.2 posee el gen de resistencia para ampicilina. Explique y esquematice
como funciona este gen de resistencia.
7.- El vector pCR2.1 de Invitrogen posee un gen reportero llamado LacZ. Explique cómo
funciona.
8.- El vector pJet1.2 posee otro sistema de selección más efectivo que el de la pregunta
anterior, denominado gen ccDB. Explique en qué consiste.
BIBLIOGRAFÍA
Helena Curtis, N. S. (2008). Curtis. Biología. Editorial Panamericana.
Jeremy Mark Berg, L. S. (2008). Bioquímica . Reverte.
Pierce, B. A. (2009). Genética: Un enfoque conceptual. Ed. Medica Panamericana.
Ureña, C. J. (2005). Prácticas de biología molecular. Pontificia Universidad Javeriana.
Terry Brown (2007). Genomas. Ed. Médica Panamericana.
26
Universidad Autónoma de Querétaro-Campus Aeropuerto
Práctica 8. Aislamiento de ADN plasmídico
INTRODUCCIÓN
Algunos organismos procariotas contienen fragmentos de material
extracromosómico (ADN o RNA) en el citoplasma, los cuales pueden variar de tamaño
(comúnmente más pequeños que el cromosómico) y cada organismo puede contener uno o
más, y pueden ser lineales o circulares. Su replicación es independiente del cromosoma, y
contienen información que generalmente otorgan ventajas al organismo, como genes de
resistencia a antibióticos, producción de toxinas o enzimas.
Estos también han sido utilizados en la ingeniería genética para la transformación y

manipulación de otros organismos, y comúnmente los conocemos como vectores. Mediante
este proceso de transformación se introducen genes de interés en el vector por medio de
enzimas de restricción y ligasas.
OBJETIVO
Purificar ADN plasmidico partir de células de Escherichia coli utilizando el método de lisis
alcalina.
MATERIAL
Centrifuga de mesa.
Juego de micropipetas: y puntas
Hielera.
REACTIVOS
Método de Birboim y Doly:
Solución I
Solución II
Solución III
Isopropanol frío.
Etanol al 70% frío.
Agua ultra pura libre de ADNsas.
CEPA: Cultivo bacteriano de E. coli resistente a ampicilina de 18 h de crecimiento.
27
En negritas material proporcionado por el almacén.
METODOLOGÍA
1.- Del cultivo de E. coli dispensar 1.5 mililitros en un tubo Eppendorf.
2.- Centrifugar durante 1 min a 12 000 rpm.
Decantar sobrenadante sin tirar la pastilla.
Repetir los pasos 1 y 2; dos veces más.
*A partir de este paso, será necesario mantener en hielo la muestra mientras no sea
utilizado.
3.- Añadir 200 µl de solución I (homogenizar) con ayuda de la pipeta de 200 µl.
4.- Añadir 400 µl de solución II (golpetear suavemente con las puntas de los dedos, hasta
que en la muestra se observe una baba al momento de abrir el tubo).
5.- Incubar en hielo 10 min.
6.- Agregar 300 µl de la solución III. Mezclar suavemente invirtiendo el tubo 5 veces.
7.- Incubar en hielo 10 min.
8.- Centrifugar a 12 000 rpm durante 10 min
9.- Recuperar sobrenadante*.
10.- Precipitar con 600 µl de isopropanol frío (MEZCLAR).
11.- Mantener a -20°C durante 20 min o hasta que se observe turbidez.
12.- Centrifugar 10 min a 12 000 rpm. Observar una pastilla blanquecina, decantar el
sobrenandante.
13.- Lavar la pastilla con 300µl de etanol al 70%. Golpetear suavemente el tubo tratando de
disgregar la pastilla.
14.- Centrifugar 5min a 12 000 rpm.
15.- Decantar y dejar secar la pastilla poniendo el tubo invertido sobre una toalla de papel.
Cuidando siempre que la pastilla no se desprenda del tubo.
16.- Agregamos 30 µl de Agua ultra pura para disolver el ADN plasmídico.
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIÓN
CUESTIONARIO
1.- ¿Cuál es la función de cada una de las soluciones del método de Birboim y Doly?
2.- ¿Cuál es la función del isopropanol?
3.- ¿Son los plásmidos exclusivos de células procariotas?
4.- Mencione los tipos de plásmidos que existen.
BIBLIOGRAFÍA
Alberts, B. H. (2004). Introduccion a la Biología Celular, 2a Edición. Madrid, España.:

Panamericana.
28
Luque, J., y Herráez, Á. Texto ilustrado de Biología Molecular e Ingeniería Genética:
conceptos, Técnicas y Aplicaciones en Ciencias de la Salud. Ed. Harcourt, 2001.
29
Práctica 9. Determinación de la identidad de un plásmido por medio del uso de

enzimas de restricción.
INTRODUCCIÓN
Todas las células contienen enzimas con capacidad de modificar el ADN. Una de
estas principales enzimas son las endonucleasas o enzimas de restricción, las cuales son
herramienta básica dentro de la ingeniería genética, ya que permiten cortar el ADN de
interés en fragmentos de secuencia específicos para purificarlos y posteriormente
manipularlos. Los fragmentos que cortan dichas enzimas son normalmente secuencias
palindrómicas cortas (4-8 pb) y específicas, estas enzimas son muy comunes en procariotas
y raras en eucariotas. Las endonucleasas protegen a los organismos de ADN hostil o
extraño como genomas víricos. Se dividen en 3 grupos: I y III se unen al ADN en sus
secuencias de reconocimiento pero cortan al ADN a una distancia considerable de estas.
Las II cortan al ADN en el interior de las secuencias de reconocimiento, por lo que es más
específico; muchas hacen cortes escalonados, dejando extremos “cohesivos o pegajosos” ya
que cada extremo es complementario en secuencia al de otro fragmento; otras cortan
haciendo extremos Romos, los cuales son rectos y las bases continúan emparejadas con sus
complementarias.
Las enzimas cortan las moléculas de ADN en segmentos que varían en longitud.
Como siempre cortan en el mismo sitio, el patrón de bandas en electroforesis de las
moléculas de ADN con la misma secuencia siempre será el mismo. Con esto podemos
generar un mapa de restricción del ADN.
Las enzimas de restricción son el primer paso para el diseño del ADN recombinante.
Las enzimas de restricción fueron descubiertas ya que a ciertos microorganismos no les
afectaba la infección por bacteriófagos. Fueron aisladas en la década de 1970, y su principal
la importancia es que hidrolizan los fragmentos de ADN, gracias a esto el huésped no es
afectado por los bacteriófagos y el ADN bacteriano está protegido por las metilaciones
correspondientes en las bases que conforman el sitio de restricción del ADN.
Lo importante de las enzimas de restricción es que generan un corte exacto y preciso en una
secuencia particular de ADN, estas se utilizan en los experimentos de clonación y
generalmente reconocen de cuatro a seis u ocho bases de forma palindrómica, formando los
extremos cohesivos, y una vez extraído el fragmento de ADN de interés se puede insertar a
un vector de ADN para generar la cadena de ADN recombinante con otra enzima llamada
ligasa que une los fragmentos de ADN.
30
CONSIDERACIONES PARA TRABAJAR CON LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Existen varios factores que son críticos al trabajar con enzimas de restricción y que pueden
afectar la actividad de las mismas:
1. Pureza del ADN. La reacción de enzimas es muy dependiente de la pureza,

contaminantes como proteínas, fenol, cloroformo, etanol, EDTA, SDS, altas
concentraciones de sal, etc. inhiben la endonucleasa.
2. Temperatura y pH. Las enzimas son muy sensitivas a temperatura y pH en lo que
respecta a su estabilidad y actividad. Buffer adecuado.
3. ADN contaminado con otro ADN.
4. Grados de metilación. Algunas endonucleasas son inhibidas por metilación.
5. Tipo de molécula de ADN. Si el ADN no tiene la secuencia que es reconocida por
la enzima accesible, esta no puede cortar el material genético (ej. si el ADN está
superenrollado el lugar de restricción no va a estar accesible para la enzima).
OBJETIVO
Corroborar la identidad de un plásmido utilizando enzimas de restricción.
MATERIAL
Tubos Eppendorf.
Micropipetas: 20µl, 2 µl. Punta estériles.
Cámara de electroforesis una por equipo (peine de 8 pozos)
Fuente de poder. 3 por grupo.
REACTIVOS
ADN plasmídico.
Enzimas: HindIII, SspI, PstI, EcoRI, BamHI, con sus respectivos Buffers. RNAsaA
Marcador de peso molecular.
Buffer de carga 6X
Agarosa 1% en Buffer TAE 1X
Agua Ultra Pura. TAE 1X
METODOLOGÍA
A un tubo Eppendorf agregar:
1.- 2.5 µl de Buffer indicado para la enzima a utilizar.
2.- 5 µl de ADN de plásmido.
3.- 0.4 µl de Enzima
4.- 17.1 µl de agua ultra pura.
5.- Incubar durante 90 min a 37°C. Transcurrido este tiempo agregar 2 µl de RNAsa A e
incubar 5 a 10 minutos a 37oC.
31
Electroforesis en gel de Agarosa para observar el producto de la digestión del ADN
plasmidico:
1.- Agarosa al 1%.
2.- Agregar Buffer TAE 1X a la cámara de electroforesis
3.- Poner el gel a gelificar con el respectivo peine, una vez que esté listo retirar el peine, y
colocar el gel en la cámara de electroforesis con cuidado.
4.- Adicionar 3 µl del buffer de carga 6X (colorante Xylen- Cyanol) al tubo de reacción y
centrifugar 10 segundos a 12,000 rpm.
5.- Tomar 15µl de esta muestra y cargar en el gel.
6.- Cargar en el gel 2µl de marcador de peso molecular de 1Kb *.
*NOTA: Solamente en un pozo por gel.
7.- Encender la fuente de poder a 100 voltios y dejar correr durante 60 min.
8.- Observar en el fotodocumentador.
RESULTADOS
DISCUSIÓN
CONCLUSIÓN
CUESTIONARIO
1.- ¿Existen de manera natural los sitios múltiples de clonación en los plásmidos?.
2.- ¿En qué se diferencia una enzima de restricción de una nucleasa?
3.- Explique la diferencia entre un extremo romo y un extremo cohesivo.
4.- De ejemplos de 5 enzimas que produzcan extremos cohesivos. Indique la secuencia que
reconocen, así como los microorganismos de los que se aislaron dichas enzimas.
5.- ¿En la naturaleza cuál es la función de las enzimas de restricción?
6.- ¿Qué es un isoesquizómero?
7.- Es posible ligar un fragmento cortado con la enzima EcoRV a un plásmido cortado con
la enzima SmaI. Si o No. Explique.
8.- Proponga una estrategia para ligar un fragmento EcoRV con un vector que ha sido
digerido con la enzima EcoRI
BIBLIOGRAFÍA
Alberts, B. H. (2004). Introduccion a la Biología Celular, 2a Edición. Madrid, España.:

Panamericana.
Luque, J., y Herráez, Á. Texto ilustrado de Biología Molecular e Ingeniería Genética:
conceptos, Técnicas y Aplicaciones en Ciencias de la Salud. Ed. Harcourt, 2001.
32
Práctica 11. Estudio de promotores inducibles
INTRODUCCIÓN
La expresión génica se regula principalmente a nivel transcripcional, esto

corresponde a la compleja interacción entre el promotor, la ARN polimerasa II y los
factores de transcripción basales, así como los específicos. Los promotores se definen como
una secuencia de ADN río arriba de la región codificante de un gen, en el cual se une la
maquinaria que va a activar la transcripción. Esta función y estructura, conocida del
promotor lo ha hecho una atractiva herramienta molecular para el establecimiento de
promotores constitutivos e inducibles (Kluge et al, 2018).
Un promotor constitutivo es aquel que induce la expresión de genes

independientemente de factores ambientales o del estadio del desarrollo del individuo, por
lo que promueve altos niveles de expresión, al regular genes involucrados en procesos
esenciales, como el metabolismo primario y de mantenimiento, por lo que son llamados
“house keeping genes”.
El uso de los promotores inducibles se adecuo a partir de la necesidad de sintetizar

un producto génico en condiciones específicas y controladas en función del tiempo. Un
promotor inducible ideal se caracteriza por una regulación fuerte controlable, una inducción
que pueda ser llevada a cabo por la célula sin que la lleve a la muerte, y una expresión
efectiva del gen de interés, que se coloca río abajo de la secuencia del promotor inducible
(De Guglielmo et al, 2016).
Existen dos tipos de promotores inducibles, los fisiológicos y los químicos. El

sistema de expresión regulado químicamente es inducido o reprimido por la ausencia o
presencia de compuestos químicos, como alcoholes, antibióticos, hormonas, fuente de
carbono, entre otros. Caso contrario con los promotores fisiológicos, cuya activación
depende de los factores abióticos, donde los sistemas son establecidos para la regulación de
genes dependiendo del estrés osmótico, temperatura, luz, etc (Kluge et al, 2018). Los
arreglos en este tipo de promotores pueden ser sintéticos, es decir, se toman elementos
presentes en genes previamente estudiados, y se construyen ya sea por síntesis o bien por
reacciones de ligación.
En el hongo fitopatógeno Ustilago maydis, el cambio al crecimiento filamentoso y

el desarrollo patogénico está controlado por un factor de transcripción heterodimérico, que
está formado de las proteínas de homeodominio bW y bE. Para identificar los genes en la
33
cascada reguladora que desencadena la interacción del heterodímero bW / bE, se construyó
una cepa en la que la transcripción de los genes b es inducible por la presencia de nitrato
(Brachmann et al, 2001). Una vez que este compuesto se adiciona al medio de cultivo, el
crecimiento del hongo cambia de forma de levadura, a crecimiento filamentoso.
OBJETIVO
Que el estudiante sea capaz de regular la expresión de un promotor inducible por

fuente de nitrógeno y observar el efecto de dicha expresión en la morfología de U. maydis.
MATERIALES
 Gradilla para tubos cónicos

 Tubos cónicos de 50 ml
 Juego de micropipetas y puntas para todos los volúmenes.
 Ultracentrífuga
 Vórtex
 Portaobjetos y cubreobjetos
 Microscopio
 Vaso de precipitado 250 mL
Nota: Indispensable para cada miembro del equipo: bata, guantes, lentes de
seguridad.
REACTIVOS
 Cepa de U. maydis FB2 y AB33

 Sales para U. maydis.
 Medios de cultivo:
AM-Glu 100 mL NM-Glu
Glucosa 1% 1g Glucosa 1%
Sulfato de amonio 0.3 g Nitrato de potasio 0.3%

0.3%
Sales para U. maydis 6.25 mL Sales para U. maydis
Agua destilada Aforar a Agua destilada

100 mL
 Agua destilada estéril
34
 Medio completo (MC). apéndice x
METODOLOGÍA
Día 1:
1. En un tubo cónico sembrar de 3 a 5 colonias de cada una de las cepas de U. maydis

en 5 mL de MC. Incubar de 18 a 24 h a 28 OC a 150 rpm.
Día 2:
Mantener condiciones de esterilidad en todo momento.
2. Verificar en microscopio que el cultivo no esté contaminado.

3. Centrifugar el cultivo a 3000 rpm durante 3 min.
4. Decantar el sobrenadante.
5. Agregar 10 mL de agua destilada estéril y agitar en el vórtex.
12. Inocular 5 mL de medio AM-Glu con 100 μL de las células lavadas e incubar el
cultivo de 18 a 24 h.
Día 3:
13. Observar en el microscopio que no esté contaminado el cultivo.

24. Decantar el sobrenadante, en condiciones de esterilidad.
26. Inocular 5 mL de NM-Glu y en AM-Glu con 100 μL de las células lavadas. Incubar
el cultivo de 18 a 24 h.
35
Día 4:
27. Observar en el microscopio.
OBSERVACIONES
DISCUSIÓN
CONCLUSIÓN
CUESTIONARIO
1. ¿Cuáles son los elementos basales presentes en un promotor?
2. ¿Cuáles son las diferencias entre un promotor de procariotas y uno de eucariotas?
3. A nivel experimental, ¿Cómo se delimita una región promotora?
4. ¿Qué usos biotecnológicos pueden tener los promotores inducibles?
5. ¿Cómo identificas un promotor en una secuencia de ADN?
6. Suponga que está trabajando en una empresa farmacéutica y necesitan producir
grandes cantidades de insulina.
a. ¿Qué tipo de promotor utilizarías?
b. ¿Por qué utilizarías ese promotor?
BIBLIOGRAFÍA
1. Banks, G. R., Shelton, P. A., Kanuga, N., Holden, D. W. & Spanos, A. The
Ustilago maydis nar 1 gene encoding nitrate reductase activity: sequence and
transcriptional regulation. Gene 131, 69–78 (1993).
2. Brachmann, A. , Weinzierl, G. , Kämper, J. and Kahmann, R. Identification of
genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis. Molecular
Microbiology, 42: 1047-1063 (2001).
3. De Guglielmo C, Z. M. & Fernandez Da Silva, R. Principales promotores utilizados
en la transformación genética de plantas. Revista Colombiana de Biotecnología 18,
119 (2016).
4. Kluge, J., Terfehr, D. & Kück, U. Inducible promoters and functional genomic
approaches for the genetic engineering of filamentous fungi. Applied Microbiology
and Biotechnology 102, 6357–6372 (2018).
36
Universidad Autónoma de Querétaro-Campus Aeropuerto
Práctica 12“En función del tiempo disponible”
Estudio de una vía de señalización en un modelo eucariota
Introducción
Todas las células presentan sistemas de respuesta a las diferentes situaciones ambientales,
para ello sintetizan las proteínas necesarias para balancear el desequilibrio provocado por
los cambios externos e internos de la célula (1). La activación de dichas respuestas se da
mediante una cascada de varias reacciones que ocurren de manera sumamente controlada.
Estas se denominan vías de señalización, que transducen la información del exterior al
interior de la célula hasta llegar a la activación de génica generando proteínas reguladoras
y/o mediadoras de los procesos celulares, manteniendo así activa a la célula en un balance
con su entorno. Las vías de señalización se activan por cualquier cambio que haya en
contacto con la célula de manera específica, y finamente regulada (2).
Considerando el medio ambiente en el que se desarrollan los microorganismos, es común

que estos se encuentren con variaciones drásticas respecto al pH extracelular. El cambio en
el pH induce diversas respuestas en la célula como puede ser la síntesis de proteasas,
permeasas y fosfatasas, regular la síntesis de antibióticos (3). En el caso de los hongos,
cuando estos se encuentran en condiciones de pH alcalino, se activa la vía de señalización
llamada Rim101 o PacC. El final de esta vía es el factor de transcripción del mismo nombre
Rim101/PacC, que migra al núcleo posterior a un proceso proteolítico y activa la
transcripción de genes en respuesta a pH alcalino (4). Esta vía ha sido descrita en algunos
ascomicetos como Aspergillus nidulans y Candida albicans. Recientemente en U. maydis
se identificó los genes que participan en esta vía de señalización: Rim20, Rim13, Rim23 y
Rim9, así como el factor de transcripción activado por esta vía Rim101/PacC (3, 4).
En el caso de esta vía de señalización, la secreción de proteasas al medio de cultivo es

regulada de manera positiva por Rim101. Caso contrario, la interrupción por mutación de
esta vía, genera una cepa que secretan un polisacárido al medio de cultivo, como
consecuencia de una alteración en la síntesis de su pared celular.
Objetivo general: Observar los efectos fenotípicos derivados de truncar la vía de

señalización Rim101.
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Objetivos particulares:
Evaluar la capacidad para hidrolizar gelatina de la cepa 283 y la cepa silvestre FB2.
Producción del polisacárido en función el pH por las cepas 283 y FB2
Materiales:
3 Placa Petri estéril desechable de 90 x 15
3 Matraz Erlen Meyer de 250 mL
Micropipeta de 100 a 1000 µL
Puntas estériles para micropipeta 100 a 1000 µL
Reactivos:
Ácido clorhídrico 1 %
Hidróxido de sodio 1 %
Gelatina
Medios de cultivo:
Medio completo
Medio mínimo modificado, sin agar con gelatina al 2%.
Procedimiento:
Ejercicio I.- Colocar 5 mL de medio completo un tubo cónico estéril e inocular con una
asada del cultivo fresco de las cepas 283 y FB2. Incubar a 28 °C a 150 rpm por 24 horas.
Preparar el medio mínimo modificado en tres frascos diferentes, de tal forma que uno de
ellos quede a pH 5 +/- 0.2, otro a pH 7 +/- 0.2 y el último a pH 9 +/- 0.2. Esterilizar en
Autoclave y vaciar de modo aséptico en placas Petri estériles de 90 x 15.
Terminado el tiempo de incubación sembrar 100 µL del cultivo en el centro de la caja.

Dejar secar en condiciones de esterilidad.
Incubar las placas de forma invertida por 72 horas a una temperatura de 28 °C.
Terminado el periodo de incubación de las placas, registrar las diferencias presentadas entre
las placas dependiendo del pH del medio. Agregar solución de Coomasie para tinción de
proteínas. Dejar reacciona durante 5 minutos. Descartar el colorante y a contraluz,
determinar la presencia o ausencia de halos de hidrólisis de la proteína.
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Para la producción del polisacárido, inocular 30 ml de medio de cultivo MC con 300 l del
cultivo previo de la cepa FB1 y AC401, de manera independiente. Agregar 30 l de
ampicilina (stock 100 g/ml).
Incubar a 28oC en agitación a 150 rpm, de 36 a 40 h. Posteriormente, centrifugar a 3500

rpm durante 4 minutos Recuperar sobrenadante a un matraz limpio. Y descartar las células.
Agregar un volumen igual de etanol al 96% que deberá de haber estado a menos 20 oC
durante 1 h. Mezclar, e incubar a 4oC de 1 h a 24 h. Determinar la presencia del
polisacárido como una masa blanca flotante.
Resultados
Conclusiones
Discusión:
Bibliografía:
1 Garrington, T. P., & Johnson, G. L. (1999). Organization and regulation of mitogen-

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Science, 311(5764), 1113-1116.
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from the basidiomycete Ustilago maydis is functional in multiple pH-sensitive
phenomena. Eukaryotic cell, 4(6), 999-1008.
4 Cervantes Chávez J. A. Ortiz-Castellanos, L., Tejeda-Sartorius, M., Gold, S. and Ruiz-
Herrera J. (2010). Fungal Molecular Biology. Functional analysis of the pH responsive
pathway Pal/Rim in the phytopathogenic basidiomycete Ustilago maydis. 47(5) 446-457.
ISSN: 1087-1845.
39
APÉNDICE A
Soluciones
1. FENOL-CLOROFORMO (1:1), 100ml.
1. Medir 50ml de fenol y vaciar en un frasco color ámbar (o cubrir con aluminio). Ajustar a
pH 8 con amortiguador Tris.HCl pH 8. Tomar en cuenta las especificaciones de la marca de
fenol a utilizar.
2. Agregar 50ml de cloroformo.
3. Mezclar suavemente, almacenar a 4oC.
2. Acetato de Sodio 3M, 10ml. EQUIPO 1
1. Pesar 2.64g de Acetato de Sodio.

2. Disolver en 8ml de agua destilada.
3. Aforar a 10 ml con agua destilada
4. Esterilizar en autoclave.
3. CaCl2 100 mM, 100ml. EQUIPO 2
1. Pesar 1.47g de CaCl2.2H2O.

2. Disolver en un volumen 90 ml de agua destilada.
3.- Aforar a 100 ml con agua destilada.
4. Agarosa 1%
1. Pesar 1g de agarosa grado biología molecular.

2. Agregar 100ml de buffer TAE 1X.
3. Calentar en el horno de microondas hasta su completa disolución
4.- Agregar 6 l de bromuro de etidio (10 mg ml-1).
5. Bromuro de Etidio 10 mg ml-1
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(Para 1ml).
1. Pesar 10 mg de bromuro de etidio.
2. Agregar 1 ml de agua destilada estéril.
3. Disolver, cubrir con aluminio y almacenar a 4°C.
NOTA: El bromuro de etidio es un agente mutagénico.
APENDICE B
Buffers y Medios de Cultivo
1. TSNTE para 100 ml. EQUIPO 3
Triton X-100 2%.

SDS 1%.
NaCl 100mM.
Tris-HCl pH8 10mM. Stock 1M.
EDTA pH 8 1mM. Stock 0.5 M.
Colocar 50 ml de agua destilada, agregar cada uno de los componentes en el orden
indicado, aforar a 100 ml con agua destilada.
Esterilizar en autoclave.
2. TE 100 ml. EQUIPO 4
2ml, 0.5 M Tris-Cl pH 8.

0.2ml, 500mM EDTA pH 8.0
Agregar agua destilada hasta obtener un volumen total de 1000 ml

Esterilizar en autoclave.
5. TAE 50X stock. EQUIPO 5
1. Disolver 48.4.2g de Tris en 150ml de agua destilada.

2. Cuidadosamente, añadir 11.50 ml de ácido acético.
3. Añadir 20ml de EDTA 0.5 M pH 8.
4. Aforar con agua destilada a 200 ml.
6.- Tris 1M pH 8. EQUIPO 6
1.- Disolver 12.1g de Tris en 80 ml de agua destilada

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2.- Calibrar el potenciómetro en la campana de extracción de gases.
3.- Con una pipeta Pasteur desechable, agregar por las paredes del matraz el ácido
clorhídrico (UTILIZARLO AL 50%, SOLICITAR AL SR. ARIOSTO 50 ML DE ÁCIDO
CLORHIDRICO AL 50% EN AGUA DESTILADA) hasta ajustar el pH a 8. Evitar que el
agitador magnético toque el potenciómetro.
4.- Aforar a 200 ml con agua destilada.
Medio completo
Medio mínimo
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Universidad Autónoma de Querétaro

Manual de Prácticas de Biología Molecular

Profesor: Dr. José Antonio Cervantes Chávez

Santiago de Querétaro, Qro. Enero, 2020.

Director de la FCN: Juana Elizabeth Elton Puente

Secretaria Académica: Dra. Elizabeth Elton Puente

Coordinador: Dr. Fidel Landeros Jaime

El estudio de la biología molecular integra y reúne conocimientos y aplicaciones de

La biología molecular está en pleno desarrollo, ha permitido grandes avances que

Práctica 1. Extracción de ADN genómico

1 La proporción en la composición de bases del ADN varía de una especie a otra.

3 La composición en bases del ADN de una determinada especie no cambia con la

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Cultivos de Ustilago maydis.

5.- Poner 3 min en el vórtex.

Hoffman CS &Winston F (1987) A ten-minute ADN preparation from yeast efficiently

Práctica 2. Observación de la heterocromatina “Cuerpos de Barr”

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La manifestación de la cromatina sexual no aparece siempre en forma de cuerpos de

Por otra parte, posibles perturbaciones de la meiosis podrían explicar diversas

1 Pipeta Pasteur desechable.

Reactivo aceto-orceína (proporcionada por el instructor)

Solución de fijación (Preparar por equipo en la campana de extracción de gases).

2) Fijación: Sumergir (20 min) el portaobjetos inmediatamente en un vaso de

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Muestra de ADN práctica 1.

NOTA: Es responsabilidad del estudiante leer el manual del NanoDrop.

En caso de tener que usar un espectrofotómetro con celda de cuarzo.

Para determinar la concentración de ADN de doble cadena de alto peso molecular,

Concentración ADN (µg/mL) = (A260) x (factor de dilución) x 50

Manual NanoDrop2000. Spectrophotometer V3.7. ThermoScientific

Práctica 4. Electroforesis de ADN en gel de agarosa

Para realizar la electroforesis de manera eficiente, se requiere un medio de

b) Preparación de la muestra de ADN.

Manual de técnicas básicas de Biología Molecular.

Biología Celular y Molecular. Matsudaira, Berk, Lodish, Kaiser.5ta edición, Editorial

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Primer 2035 F 5’ cttcctgacggacaggtgat3’

Primer 2036 R 5’ ctcgggaggagcaacaatc 3’

Rodríguez, P. Barrera, H. (2004) La reacción en cadena de la polimerasa a dos décadas de

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Después de la reacción de transformación, las bacterias se transfieren a un medio

8. Adicionar 500 l de CaCl2 100 mM y re-suspender la pastilla de células.

Gilbert, S. F. (2005). Biología del desarrollo. Ed. Médica Panamericana.

Helena Curtis, N. S. (2008). Curtis. Biología. Editorial Panamericana.

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Pierce, B. A. (2009). Genética: Un enfoque conceptual. Ed. Medica Panamericana.

Koneman, Elmer W. Giovaniello. Diagnostico Microbiológico. Sexta edición 2008.

Práctica 7. Clonación de Productos de PCR

Cuando se inserta un gen de interés dentro en un plásmido proceso denominado

Para clonar un gen en un vector es necesario cortarl “digerir” en el poli-linker con