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MEDCLI-3420; No. of Pages 4 ARTICLE IN PRESS

Med Clin (Barc). 2015;xxx(xx):xxx–xxx

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Nota clínica

Neuropatía óptica de Leber: utilidad de la secuenciación masiva en el

estudio de mutaciones mitocondriales en aparente homoplasmia
Pilar Carrasco Salas a,∗ , Carmen Palma Milla a , Javier López Montiel a , Carmen Benito b ,
Sara Franco Freire b y Juan López Siles a
a
Centro de Genética Molecular Genetaq, Málaga, España
b
Hospital Materno-Infantil, Hospital Universitario Carlos Haya, Málaga, España

información del artículo r e s u m e n

Historia del artículo:
Recibido el 9 de julio de 2015
Aceptado el 1 de octubre de 2015
On-line el xxx
Palabras clave:
Ácido desoxirribonucleico mitocondrial
Neuropatía óptica hereditaria de Leber
Secuenciación de última generación
Homoplasmia
Fundamento y objetivo: La neuropatía óptica hereditaria de Leber se caracteriza por una pérdida de visión
aguda o subaguda, producida por mutaciones en el ADN mitocondrial.
Pacientes y métodos: Presentamos el estudio molecular realizado en una familia en la que solo uno de sus
miembros presentaba signos de la enfermedad.
Resultados: En el caso índice y en la madre se detectó la mutación m.11778G>A en el gen MT-ND4 en
heteroplasmia. La hermana del caso índice, sin manifestaciones oculares, acudió a consulta para consejo
genético. El estudio de dicha mutación por secuenciación Sanger mostró que la portaba en homoplasmia.
Sin embargo, mediante secuenciación de última generación (NGS) se pudo comprobar que se encontraba
realmente en heteroplasmia.
Conclusiones: Confirmar que una mutación se encuentra en homoplasmia es importante cara al consejo
genético. Hemos observado que la NGS permite distinguir entre grados elevados de heteroplasmia y
verdaderas homoplasmias y, por tanto, es de utilidad en el estudio de pacientes en los que se detectan
mutaciones en homoplasmia con metodologías de menor sensibilidad analítica.
© 2015 Elsevier España, S.L.U. Todos los derechos reservados.

Leber hereditary optic neuropathy: Usefulness of next generation sequencing

to study mitochondrial mutations on apparent homoplasmy

a b s t r a c t

Keywords: Background and objective: Leber hereditary optic neuropathy is characterized by acute and subacute visual
Mitochondrial deoxyribonucleic acid loss, produced by mitochondrial DNA mutations.
Leber hereditary optic atrophy Patients and methods: The molecular study of a family with only one affected member is presented.
Next-generation sequencing
Results: In the index case and in her mother, the mitochondrial mutation m.11778G>A in the MT-ND4
Homoplasmy
was detected in the heteroplasmic state. The index case’s sister, without ocular manifestations, asked
for genetic counseling. The study of the mentioned mutation by Sanger sequencing identified it in an
apparent homoplasmic state. However, by means of next-generation sequencing (NGS), the mutation
was actually in a heteroplasmic state.
Conclusions: Regarding genetic counseling, verifying a mutation in homoplasmic state is really important.
We have observed that NGS allows us to discriminate between high levels of heteroplasmy and homo-
plasmy, meaning that it is a useful technique for the analysis of apparent homoplasmic results obtained
with less sensitive technique, as Sanger sequencing.
© 2015 Elsevier España, S.L.U. All rights reserved.

∗ Autor para correspondencia.

Correo electrónico: pcarrascos@ymail.com (P. Carrasco Salas).

http://dx.doi.org/10.1016/j.medcli.2015.10.015
0025-7753/© 2015 Elsevier España, S.L.U. Todos los derechos reservados.

Cómo citar este artículo: Carrasco Salas P, et al. Neuropatía óptica de Leber: utilidad de la secuenciación masiva en el estudio de
mutaciones mitocondriales en aparente homoplasmia. Med Clin (Barc). 2015. http://dx.doi.org/10.1016/j.medcli.2015.10.015
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Introducción
La neuropatía óptica de Leber (LHON, de sus siglas en inglés
Leber hereditary optic neuropathy) es una enfermedad mitocondrial
neurodegenerativa que afecta al nervio óptico y que se caracteriza
por una pérdida súbita de visión en adultos jóvenes1 . La pérdida
visual presenta una tendencia a la estabilidad, aunque se han des-
crito casos de recuperación visual espontánea, relacionados con la
edad de inicio de la enfermedad y con el tipo de mutación2 .
La enfermedad de LHON se produce por mutaciones en el ADN
mitocondrial (ADNmt): más del 90% ocurren en las posiciones 3460,
11778 o 14484, conocidas como mutaciones primarias3 . A dife-
rencia de otras citopatías mitocondriales, la mayoría de dichas
mutaciones se detectan en homoplasmia4 , es decir, que todas
las moléculas de ADNmt (en una sola célula hay cientos o miles
de moléculas de ADNmt) son portadoras de la mutación deletérea.
La existencia de ADNmt normal y mutado, situación conocida como
heteroplasmia, está presente solo en un 10-15% de los pacientes con
LHON.
Para la detección de mutaciones puntuales en el ADNmt, la téc-
nica gold standard es la secuenciación Sanger por su sencillez y dis-
ponibilidad en la mayoría de los laboratorios de genética molecu-
lar. Sin embargo, no proporciona información cuantitativa sobre
el grado de heteroplasmia y no detecta heteroplasmias inferiores
al 15%5 . Para estos casos, es útil el uso de otras técnicas, como la
variante de la PCR cuantitativa basada en el sistema de mutación
refractario a la amplificación, y más recientemente, la secuencia-
ción masiva.
Observación clínica y resultados
Exponemos el caso de una mujer de 26 años que ingresó en
Neurología por disminución de la agudeza visual y visión borrosa
en el ojo derecho. La exploración neurológica general fue normal.
No refería dolor con los movimientos oculares, alteración en la per-
cepción de los colores, fotofobia ni cefalea. Se solicitó resonancia
magnética nuclear para descartar una posible enfermedad desmie-
linizante, y se realizó punción lumbar, que no mostró hallazgos
patológicos. La exploración por parte de Oftalmología con lámpara
de hendidura y el fondo de ojo realizado mostró hallazgos nor-
males en ambos ojos. La tensión intraocular se encontraba dentro
del rango de normalidad, y los potenciales evocados visuales y el
retinograma fueron normales. La perimetría detectó un déficit cam-
pimétrico periférico en el ojo derecho y estableció el juicio clínico
de neuritis óptica retrobulbar derecha.
Descartada la presencia de esclerosis múltiple, se solicitaron
estudios complementarios en busca de una causa secundaria, inclu-
yendo el estudio molecular de LHON, que representa la causa
hereditaria más frecuente de neuritis óptica6 . Para realizar este
estudio molecular, se extrajo en primer lugar ADN total a par-
tir de una muestra de sangre mediante el extractor automático
MagNA Pure (Roche Diagnostics, West Sussex, UK). La amplifica-
ción del ADN total se llevó a cabo mediante PCR, con cebadores
específicos de las regiones del ADNmt donde se encuentran las
mutaciones más frecuentes en pacientes con la enfermedad:
m.3460G>A, m.11778G>A y m.14484T>C (secuencia de referen-
cia utilizada: secuencia de Cambridge revisada, NC 012920). Cada
reacción de PCR tenía un volumen final de 25 ␮l: 100-150 ng de
ADN total, 12,5 ␮l de PCR Master Mix de Promega® (Madison,
Wisconsin, EE. UU.), 1,5 ␮l de MgCl2 , 25 mM y 25 pmoles de cada
iniciador.
Se realizó un paso inicial de desnaturalización de 5 min a 94 ◦ C
y 30 ciclos de: un minuto de desnaturalización a 94 ◦ C, 30 segundos
de hibridación a 54 ◦ C y un minuto de extensión a 72 ◦ C, con un paso
final de extensión a 72 ◦ C durante 7 min.
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mutaciones mitocondriales en aparente homoplasmia. Med Clin (Barc). 2015. http://dx.doi.org/10.1016/j.medcli.2015.10.015
Tras verificar la presencia de amplificación en un gel de agarosa
al 2%, se secuenciaron los fragmentos amplificados mediante
secuenciación Sanger en el secuenciador automático ABI 3130
de Applied Biosystems (Life Technologies, Carlsbad, California,
EE. UU.). El análisis de las secuencias obtenidas mediante el
software SeqScape® v2.5 (Life Technologies) mostró la presencia
de la mutación m.11778G>A en el gen MT-ND4 en heteroplasmia
(fig. 1A). Esta mutación está presente en el 70% de los pacientes con
LHON, confirmándose así el diagnóstico clínico de la enfermedad.
Dado que las enfermedades mitocondriales se heredan por vía
materna, se realizó el estudio de la mutación detectada en la madre
de la paciente, de 53 años de edad y asintomática. Se confirmó
que la portaba también en heteroplasmia, siendo mayor la can-
tidad de ADNmt mutado con respecto al ADNmt normal según los
cromatogramas obtenidos con la secuenciación Sanger (fig. 1B).
La hermana del caso índice, de 23 años y sin manifestaciones
oculares, acudió a la consulta para consejo genético. El estudio de
la mutación m.11778G>A utilizando la misma metodología San-
ger mostró que se encontraba en homoplasmia (fig. 1C). Debido
a la ausencia de síntomas y con vistas a realizar un consejo gené-
tico adecuado, se solicitó la realización de estudios adicionales para
comprobar si realmente estaba en homoplasmia.
La secuenciación masiva o next generation sequencing (NGS,
«secuenciación de nueva generación») representa una herramienta
valiosa para determinar de manera cuantitativa el estatus de una
mutación7 y, por tanto, podía ser de utilidad en este caso. Para llevar
a cabo el estudio mediante NGS se amplificó de nuevo, mediante
PCR, el fragmento donde se encuentra la mutación m.11778G>A,
siguiendo las mismas condiciones de amplificación. Posterior-
mente, se generó y enriqueció la librería mediante el kit Nextera®
XT (Illumina, San Diego, California, EE. UU.). La secuenciación
mediante paired-end de 150 pb se llevó a cabo en el secuencia-
dor masivo MiSeq® (Illumina), obteniéndose una cobertura para
esa posición de 175x, de las cuales 145 se correspondían al alelo
alternativo (A) y 30 al alelo de referencia (G), lo que supone una
heteroplasmia del 83% (fig. 2). Como alineador se utilizó el BWA, y
como variant caller, el GATK.
El estudio posterior por NGS de la mutación que nos ocupa en el
caso índice y en la madre mostró niveles de heteroplasmia del 66 y
75%, respectivamente (la cobertura en esa posición fue de 958x en
el primer caso, y de 909x en el segundo).
Discusión
La LHON es una enfermedad sin tratamiento específico, alta-
mente discapacitante, que disminuye de forma importante la
calidad de vida de quienes la presentan, por lo que es de vital
importancia su diagnóstico para instaurar medidas encaminadas
al control de factores de riesgo y para dar el apropiado consejo
genético a enfermos y familiares.
Esta enfermedad se caracteriza por una penetrancia incompleta:
aproximadamente un 50% de los hombres y un 90% de las mujeres
que presentan alguna de las 3 mutaciones primarias no desarrollan
pérdida de visión2 . Por lo tanto, deben existir otros factores genéti-
cos o ambientales que pueden tener un efecto en el desarrollo de la
misma. Los factores que parecen ser más importantes son la edad,
el sexo, la diferencia del ADNmt mutado en los diferentes tejidos y
el nivel de heteroplasmia8–10 .
En esta familia, sin embargo, el caso índice, con menor hete-
roplasmia que su madre, presentó atrofia óptica a la edad media
de diagnóstico en mujeres que portan la mutación m.11778G>A
(24 años)11 . Esto podría deberse a diferencias en el grado de hete-
roplasmia en los diferentes tejidos (sangre vs. nervio óptico) en el
caso índice y en su madre. Debido a la baja penetrancia de la enfer-
medad de LHON, es común no observar antecedentes de herencia
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Figura 1. Electroferogramas en los que se muestra la mutación m.11778G>A en heteroplasmia en el caso índice (A), en su madre (B), y en homoplasmia, en la hermana del
caso índice (C).

mitocondrial y detectar manifestaciones oculares en un solo miem-
bro de la familia, lo que puede complicar la orientación diagnóstica
de estos pacientes.
Para la madre, el riesgo de desarrollar deficiencia visual es bajo;
la gran mayoría de los pacientes que tienen dicha mutación de-
sarrollan síntomas antes de los 50 años12 . A la hermana del caso
índice, debido a la edad y a que presenta un porcentaje elevado de
heteroplasmia, se le recomendó acudir cada 6 meses a Oftalmología
para revisiones periódicas. El hecho de que sea mayor el porcentaje
de ADNmt mutado que el de su madre se explica por el fenómeno de
«cuello de botella»13 . La LHON, y en general todas las enfermedades
mitocondriales producidas por mutaciones en el ADNmt, se here-
dan por vía materna: las madres portadoras pasarán la mutación a
todos sus hijos. Sin embargo, el porcentaje de ADNmt mutado en
los óvulos de una mujer portadora de una mutación varía por este
fenómeno, que no es más que un proceso de restricción y poste-
rior amplificación de las moléculas de ADNmt que se produce en el
ovocito durante la embriogénesis.
La NGS, a diferencia de la secuenciación Sanger, permite leer
numerosas veces cada base del genoma, por lo que esta caracterís-
tica se puede utilizar en el caso del ADNmt (presente en múltiples
copias potencialmente distintas) para leer distintas secuencias,
detectar así niveles bajos de heteroplasmia y cuantificar mutacio-
nes heteroplásmicas. El número de veces que cada base del genoma
está presente en las lecturas que realiza el secuenciador masivo se
denomina cobertura14 . Por ejemplo, una cobertura de 30x para una
posición indica que se han realizado 30 lecturas de ese nucleótido.
Tradicionalmente, la sensibilidad analítica se ha definido como la
proporción de muestras biológicas que tienen un resultado positivo
y son clasificadas correctamente como positivas. En las técnicas de
secuenciación Sanger y NGS, este término hace referencia a la pro-
babilidad de que se detecte una variante cuando está presente en la
región analizada15 . La sensibilidad analítica de la NGS para detectar
heteroplasmias depende de la cobertura; a mayor cobertura, mayor
sensibilidad. Se recomienda un mínimo de 40 lecturas o reads para
detectar grados bajos de heteroplasmia16 .

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Figura 2. Visualización de los datos de secuenciación masiva en la hermana del caso índice mediante el visor Integrative Genomics Viewer. Se observa un nivel de heteroplasmia
del 83% en la posición 11778 del ADN mitocondrial.
Hemos observado que la NGS es útil no solo para detectar niveles
bajos de heteroplasmia, sino para distinguir también entre grados
elevados de heteroplasmia y verdaderas homoplasmias. Confirmar
que una mutación se encuentra en homoplasmia en un paciente
es importante cara al consejo genético. Si una mujer es homoplás-
mica para una mutación en el ADNmt, todos sus hijos la heredarán
también en homoplasmia; por el contrario, si es heteroplásmica,
puede transmitir un nivel bajo de ADNmt mutado a su descenden-
cia, siendo menor el riesgo de padecer la enfermedad9 .
En la enfermedad de LHON, el porcentaje reportado de pacientes
con mutaciones en heteroplasmia es bajo. Sin embargo, esta afirma-
ción se basa en estudios que utilizaron otras metodologías, como el
ensayo de elongación de cebadores4 . Por tanto, sería recomenda-
ble confirmar, utilizando nuevas tecnologías de mayor sensibilidad,
como la NGS, si realmente es tan elevado el porcentaje de homo-
plasmia en esta enfermedad.
Conflicto de intereses
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
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