PCBP D Tesis 2008 Jorge Rubio Pina

POSGRADO EN CIENCIAS Y BIOTECNOLOGÍA DE
PLANTAS
Estudios moleculares sobre la síntesis de

alcaloides bencilisoquinolínicos de
Argemone mexicana
Tesis para obtener el grado de Doctor en Ciencias

presenta:
JORGE ALBERTO RUBIO PIÑA
Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C.
Mérida, Yucatán, México
2008
Declaración de propiedad
Declaro que la información contenida en la sección de

materiales y métodos experimentales, los resultados y
discusión de este documento proviene de las actividades de
experimentación realizadas durante el periodo que se me
asignó, para desarrollar mi trabajo de tesis, en las Unidades y
Laboratorios del Centro de Investigación Científica de Yucatán,
A.C., y que dicha información le pertenece en términos de la
ley de la propiedad industrial, por lo que no me reservo ningún
derecho sobre ello.
IBQ. Jorge Alberto Rubio Piña

RECONOCIMIENTOS
Este trabajo se realizó en la Unidad de Bioquímica y Biología

Molecular de Plantas del Centro de Investigación Científica de
Yucatán, bajo la dirección del Dr. Felipe Augusto Vázquez
Flota, a quien le agradezco su respaldo y el interés mostrado
en la planeación, desarrollo y evaluación del mismo.
Se agradece al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por

la beca otorgada a Jorge Alberto Rubio Piña para estudios de
doctorado (185784).
Este trabajo fue financiado con fondos de los proyectos 52062

de la Convocatoria 2006 para la Consolidación de
Investigadores (SNI CONACYT); P1-60746 de la Convocatoria
Nacional de Investigación Básica (SEP-CONACYT) 2006;
052778 de la Convocatoria CONACYT para la Formación de
Doctores 2007 y 06-177 RG/810/LA - UNESCO FR:
3240157854 de la Academy of Sciences for the Developing
World (TWAS), Convocatoria 2007.
¡¡
AGRADECIMIENTOS
Esta tesis doctoral, si bien ha requerido de esfuerzo y mucha

dedicación por parte del autor y su director de tesis, no hubiese
sido posible sin la cooperación desinteresada de todas y cada
una de las personas que a continuación citaré y, muchas de las
cuales, han sido un soporte muy fuerte en momentos de
angustia y desesperación.
Primero y antes que nada gracias Dios por ser mi mejor amigo ,
mi fortaleza, darme todo lo que tengo y nunca dejarme caer.
Por permitirme llegar hasta este momento tan importante de mi
vida y lograr otra meta más en mi carrera.
Agradezco enormemente a mis padres Carlos y Judith, por su

cariño, comprensión y apoyo sin condiciones ni medida.
Gracias por darme la vida, por guiarme sobre el camino de la
fe , del amor y la educación. Ahora entiendo su forma de
amarme cuando miro en retrospectiva y me veo. Nuevamente
gracias por estar ahí en todo momento.
A mis hermanos (Giadys, Carlos, Gabriela y Judith) que

siempre estuvieron pendientes de mi y de las necesidades que
pudiera pasar.
A mi esposa Yolanda por ser mi compañera de viaJe, la

persona que ha compartido la carga de mis estudios y porque
en su compañía las cosas malas se convierten en buenas, la
tristeza se transforma en alegría y la soledad no existe.
Al doctor Felipe Vázquez Flota, mi asesor de tesis, quiero

agradecer su amistad, paciencia y sobre todo reconocer que
mucho de lo que hoy he aprendido es por sus enseñanzas.
De igual manera mi más sincero agradecimiento a la M.C.

Miriam Monforte González por haberme dirigido durante mis
¡¡¡
primeros pasos por la ciencia, por su amistad y por la ayuda
técnica prestada para la realización de esta tesis.
Especialmente agradezco al Dr. José Ramírez Benítez por el

apoyo técnico ofrecido durante el análisis in situ de los
transcritos y alcaloides.
Agradezco particularmente a los miembros de mi comité tutoral

y de evaluación de tesis: Dra. Virginia Herrera, Dra. Renata
Rivera, Dra. Luisa López, Dr. Gregario Godoy, Dr. Edmundo
Lozoya, Dr. Rafael Rojas, por sus atinadas observaciones y la
revisión crítica con la que enriquecieron el presente escrito.
A mis compañeros y amigos con los que comparto las mismas

experiencias y nos ponemos el hombro cada vez que se
necesita, por su apoyo y ánimo en cada etapa que se pasa y
viene a lo largo de estos años de estudio.
Deseo extender un reconocimiento a los profesores del

Posgrado en Ciencias y Biotecnología en Plantas del Centro,
que generosamente me brindaron un poco de su experiencia, a
todos les estaré eternamente agradecido por su apoyo.
En general quisiera agradecer a todas y cada una de las

personas que han vivido conmigo la realización de esta tesis
doctoral, con sus altos y bajos desde los más profundo de mi
corazón les agradezco el haberme brindado todo el apoyo,
colaboración, ánimo y sobre todo cariño y amistad.
iv
DEDICATORIA
A Laura Yolanda de la Vega Bias
Solo tú, solo yo, en un mundo incierto de sensaciones dulces,

de sentimientos de añoranza del otro ... unidos hasta el
despertar en el que aun seguiremos juntos.
A mis padres Carlos y Judith
Enseñarás a volar,
pero no volarán tu vuelo.
Enseñarás a soñar,
pero no soñarán tu sueño.
Enseñarás a vivir,
pero no vivirán tu vida.
Sin embargo ...

en cada vuelo,
en cada vida,
en cada sueño,
perdurará siempre la huella
del camino enseñado
V
vi
ÍNDICE GENERAL
RESUMEN 1
ABSTRACT 3
INTRODUCCIÓN 5
CAPÍTULO 1 ANTECEDENTES 7
1.1. Argemone mexicana 7
1.1.1. DESCRIPCIÓN BOTÁNICA 8
1.1.2. USOS TRADICIONALES 8
1.1.3. COMPOSICIÓN QUÍMICA 9
1.2. ALCALOIDES BENCILISOQUINOlÍNICOS 1O
(ABis)
1.2.1. RUTA DE SÍNTESIS DE LOS ABis 11
1.2.2. Formación de norcoclaurina 12
1.2.3. Formación de reticulina a partir de norcoclaurina 12
1.2.4. Formación de benzofenantridinas y 13
protoberberinas
1.2.5. Síntesis de alcaloides morfinanos 16
1.3. REGULACIÓN Y LOCALIZACIÓN TEJIDO- 18
ESPECIFICA DE LOS ABis
1.4. COMPARTAMENTALIZACIÓN SUBCELULAR 20
DE LAS ENZIMAS DE LA SÍNTESIS DE LOS
A Bis
1.5. TRANSPORTE INTERCELULAR DE LAS 22
ENZIMAS BIOSÍNTETICAS DE LOS ABis
1.6. SÍNTESIS DE ABis EN CULTIVOS DE CÉLULAS 23
in vitro
1. 7. TRANSDUCCIÓN DE SEÑALES EN LA 27
SÍNTESIS DE ABis EN RESPUESTA A LA
INDUCCIÓN
1.8. ANÁLISIS DE LA ACUMULACIÓN DE ABis EN 30
CULTIVOS in vitro DE Argemone mexicana
1.9. RECAPITULACIÓN DE LOS ANTECEDENTES 31
1.1 O. REFERENCIAS 32
vii
CAPITULO 2 MATERIALES Y MÉTODOS 47
2.1 . OBJETIVOS 47
2.2. HIPÓTESIS 48
2.3. ESTRATEGIA EXPERIMENTAL 48
2.4. MATERIAL BIOLÓGICO 49
2.6. REFERENCIAS 50
CAPÍTULO 3 AISLAMIENTO DE LOS ADNcs 51

DE LA NORCOCLAURINA SINTASA {NCS) Y
LA ENZIMA FORMADORA DEL PUENTE DE
LA BERBERINA {BBE)
3.1. INTRODUCCIÓN 51
3.2. MATERIALES Y MÉTODOS 51
3.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 58
3.4 CONCLUSIONES 71
3.5. REFERENCIAS 71
CAPÍTULO 4 CARACTERIZACIÓN 73
MOLECULAR DE LA NORCOCLAURINA
SINTASA (NCS) Y LA ENZIMA FORMADORA
DEL PUENTE DE LA BERBERINA {BBE) EN
Argemone mexicana
4.4. CONCLUSIONES 116
4.5 REFERENCIAS 117
CAPÍTULO 5 EFECTO DEL JASMONATO DE 127

METILO Y ACIDO SALICÍLICO EN LA
EXPRESIÓN DE LA NCS Y BBE EN
SUSPENSIONES CELULARES DE Argemone
mexicana
viii
5.4. CONCLUSIONES 138
5.5. REFERENCIAS 139
CAPÍTULO 6 DISCUSIÓN GENERAL y 145

PERSPECTIVAS
6.1 REFERENCIAS 159
DATOS COMPLEMENTARIOS 165
ANEXO 1 169
ix
X
ÍNDICE DE FIGURAS
FIGURA 1.1. Argemone mexicana 1O

FIGURA 1.2. Representación de la ruta de biosíntesis 12
de los ABis
FIGURA 1.3. Síntesis de los alcaloides tipo 15
benzofenantridina
protoberberina
morfina nos
FIGURA 1.6. Modelo hipotético de la cascada de 29
señales en respuesta a la activación con
un inductor de levadura en
suspensiones de Eschscholzia
californica
FIGURA 2.1. Esquema de la estrategia experimental 49
propuesto para este proyecto
FIGURA 3.1 Esquema utilizado para la síntesis de la 56
primera cadena de ADNc utilizando un
oligo de ARN y un oligo d(T) del estuche
GeneRacer
FIGURA 3.2. Secuencias de aminoácidos 59
conservados de la NCS y BBE
FIGURA 3.3. Amplificación de los ADNcs parciales 59
correspondientes a la NCS y BBE
FIGURA 3.4. Comparación de las secuencias de 61
aminoácidos deducidos de NCS y BBE
aminoácidos deducidos a partir de
NCSAm1 y NCSAm2 con secuencias de
NCS reportadas
FIGURA 3.6. Comparación de la secuencia de 65
BBEAm1
xi
FIGURA 3. 7. Amplificación de los extremos 5' y 3, 66
correspondientes a los ADNcs de la
NCS y BBE por RACE
FIGURA 3.8. Empalme de las secuencias de la 67
NCSAm1 y de la NCSAm2
nucleótidos de NCSAm1 y NCSAm2 de
Argemone mexicana
FIGURA 3.10. Empalme de las secuencias de la 69
BBEAm1 y de la BBEAm2
nucleótidos de BBEAm1 y BBEAm2 de
Argemone mexicana
NCSAm1 y NCSAm2 de Argemone
mexicana
FIGURA 4.2. Alineación de las secuencias de 87
aminoácidos deducidos de la NCSAm1
y NCSAm2 con secuencias reportadas
para la norcoclaurina sintasa (NCS)
BBEAm1 y BBEAm2 de Argemone
mexicana
FIGURA 4.4. Alineación de las secuencias de 91
aminoácidos deducidos de la BBEAm1 y
BBEAm2 con secuencias reportadas
para la enzima formadora del puente de
la berberina
FIGURA 4.5. Árbol filogenético obtenido mediante la 94
aplicación del método neighbor-joining
(método del vecino más próximo)
utilizando la secuencia de nucleótidos
codificantes de la NCSAm1 y NCSAm2
de Argemone mexicana
xii
FIGURA 4.6. Árbol filogenético obtenido mediante la 96
aplicación del método neighbor-joining
(método del vecino más próximo)
utilizando las secuencia de nucleótidos
codificantes de la BBEAm1 y BBEAm2
de Argemone mexicana
FIGURA 4.7. Análisis de restricción de los ADNcs de 97
la NCS y BBE de Argemone mexicana
FIGURA 4.8. Análisis tipo Southern blot de la NCS de 99
Argemone mexicana
FIGURA 4.9. Análisis tipo Southern blot de la BBE de 101
Argemone mexicana
FIGURA 4.1 O. Acumulación de ABis y análisis de 105
expresión de la NCS y BBE en plantas
maduras de Argemone mexicana
FIGURA 4.11. Acumulación de ABis y análisis de 112
expresión de la NCS y BBE después de
la germinación de semillas de
Argemone mexicana
FIGURA 4.12 Acumulación de ABis y análisis de 115
expresión de la NCS y BBE en plantas
en desarrollo de Argemone mexicana
(post-emergencia)
FIGURA 5.1. Curva de crecimiento y acumulación de 133
sanguinarina de la suspensión celular
AmMiF de Argemone mexicana durante
un ciclo de cultivo
FIGURA 5.2. Acumulación de sanguinarina en 135
suspensiones celulares de Argemone
mexicana expuestas a jasmonato de
metilo y ácido salicílico
FIGURA 5.3. Acumulación de sanguinarina y análisis 136
de expresión de la NCS y BBE en
suspensiones celulares de Argemone
mexicana
FIGURA 6.1 Esquema de la acumulación de 151
xiii
alcaloides de tipo benzofenantridina y
protoberberina durante el desarrollo de
plantas de Argemone mexicana
FIGURA6.2 Modelo hipotético de la cascada de 155
señales en respuestas a jasmonato de
metilo y acido salicílico en suspensiones
celulares de Argemone mexicana
xiv
ÍNDICE DE CUADROS
CUADRO 1.1. Enzimas involucradas en la síntesis de 24

los ABis en plantas para las que han
sido aislados los ADNcs
correspondientes
CUADRO 3.1. Cebadores empleados para la 55
amplificación del ADNc parcial de la
NCS y la BBE en Argemone mexicana
amplificación de los extremos 5, y 3, de
la NCS y la BBE en Argemone
mexicana
CUADRO 3.3. Porcentaje de identidad de la secuencia 62
de aminoácidos deducidos de los
ADNcs parciales de la norcoclaurina
sintasa de Argemone mexicana
(NCSAm1 y NCSAm2) con otras
especies
CUADRO 3.4. Porcentaje de identidad de la secuencia 64
de aminoácidos deducidos del ADNc de
la enzima formadora del puente de la
berberina de Argemone mexicana
(BBEAm1) con otras especies
amplificación del ADNc parcial de la
NCS y la BBE en Argemone mexicana
CUADRO 4.2. Relación de secuencias utilizadas en los 82
análisis de comparación y filogenéticos
CUADRO 4.3. Porcentaje de identidad de las 86
secuencias de aminoácidos deducidos
de la NCSAm1 y NCSAm2 con
secuencias reportadas para la
norcoclaurina sintasa (NCS), proteínas
de patogénesis (PR10), proteínas con
unión a citocininas (CSBP) y proteínas
XV
alergénicas Bet V1 (MAP)
CUADRO 4.4. Porcentaje de identidad de las 89
secuencias de aminoácidos deducidos
de la BBEAm1 y BBEAm2 con
secuencias reportadas para la enzima
formadora del puente de la berberina
(BBE), proteínas dependientes de FAD
xvi
ABREVIATU RAS
4-HPAA 4-hidroxifenilacetaldehído
4'0MT 3 •-hidroxi-N-metilcoclaurina 0-metiltrasferasa
6'0MT 6-0-metiltransferasa
A Bis Alcaloides bencilisoquinolínicos
ADN Ácido desoxirribonucleico
ADNc Ácido desoxirribonucleico complementario
ANA Ácido naftalénacetico
ARN Ácido ribonucleico
ARNm Ácido ribonucleico mensajero
BAP 6-bencilaminopurina
BBE Enzima formadora del puente de la berberina
CFS ( S)-chelantiofolia sintasa
CNMT Coclaurina N-metiltransferasa
COR Codeinona reductasa
CTAB Bromuro de hexadeciltrimetil amonio
DBOX Dihidobenzofenantridina oxidasa
DRR 1,2-dehidroreticulina reductasa
EDTA Ácido etilendiaminotetraacético
ETOH Etanol
FAD Flavín adenina dinucleotido
IPTG lsopropil ~-D-1-thiogalactopiranósido
JA Ácido jasmonico
LPC Lisofosfatidilcolina
MES Material electrónicamente-denso
MEJA Jasmonato de metilo
MOPS Ácido 3-( morfolino )propanosulfónico
MSH ( S)-cis-N-metilestilopina 14-hidroxilasa
NCS Norcoclaurina sintasa
NMCH N-metilcoclaurina 3'hidroxilasa
P6H Protopina-6-hidroxilasa
PF Peso fresco
PS Peso seco
PVPP Polivinilpolipirrolidona
PCR Reacción en cadena de la polimerasa
RE Retículo endoplásmico
RT-PCR Reacción de la polimerasa del ARN retrotranscrito
SA Ácido salicílico
xvii
SAT Acetil coenzima A: salutaridinol-7-0-acetiltransferasa
SDS Dodecil sulfato de sodio
SPS ( S)-estilopina sintasa
SOMT Escoulerina-9-0-metiltransferasa
SOR Salutaridina: NADPH 7-oxidoreductasa
STS Salutaridina sintasa
TNMT Tetrahidroprotoberberina-cis-N-metiltransferasa
Tm Temperatura de desnaturalización
Tris Hidroximetil aminometano clorhidrato
TYDC Tirosina/dopa descarboxilasa
X-GAL 5-bromo-4-cloro-3-indolii-~-D-galactopiranosido
xviii
RESUMEN
Cardo santo (Argemone mexicana L, Papaveraceae) es una

planta a la que se atribuyen propiedades medicinales que
posiblemente se relacionen con su capacidad para acumular
alcaloides tipo isoquinolínicos (berberina y sanguinarina). Estos
alcaloides se forman a partir de la tirosina mediante una
compleja serie de reacciones enzimáticas que suceden en
diferentes compartimentos celulares. En este trabajo se
aislaron y caracterizaron los ADNc correspondientes a dos
enzimas involucradas en la síntesis de alcaloides en A.
mexicana: la norcoclaurina sintasa (NCS) y enzima formadora
del puente de la berberina (BBE). En general, la secuencia de
las dos isoformas aisladas para la NCS y para la BBE
mostraron un 70% de identidad con las ya reportadas en
Papaver somniferum, Eschscholzia californica (ambas de la
familia Papaveraceae) y Talictrum flavum (familia
Ranunculaceae ). De igual forma, presentaron identidad con
otras proteínas de defensa, sugiriendo un antecesor común con
éstas. El análisis filogenético apoyó esta interpretación. Tanto
la NCS como la BBE parecen formar familias génicas con un
número reducido de copias.
Por otro lado, el análisis de la expresión de la NCS y BBE en

diferentes tejidos mostró una relación entre los niveles de
transcritos y la acumulación de los alcaloides en plantas
maduras. En plántulas en desarrollo, la sanguinarina se pudo
detectar desde etapas tempranas, no así la berberina que sólo
se observó en etapas más avanzadas y solamente en las
partes aéreas. La acumulación de los transcritos, tanto de la
NCS como de la BBE, mostró una correlación con la de los
alcaloides. Algo similar se detectó en suspensiones celulares,
que fueron capaces de acumular sanguinarina, aún sin ser
sometidas a condiciones de inducción del metabolismo
secundario. No obstante, la exposición de éstas al jasmonato
de metilo (MEJA), pero no al ácido salicílico, aumentó la
1
acumulación de sanguinarina y este efecto fue posterior al
aumento en el nivel de los transcritos.
Estos datos, en conjunto, sugieren que la síntesis de alcaloides

en A. mexicana tiene características particulares, distintas a los
reportados en otras plantas que producen alcaloides del mismo
tipo.
2
ABSTRACT
Argemone mexicana L, (Papaveraceae) is known with the

common na me of "cardo santo", among others. lt has been
used since ancient times for its alleged healing properties,
probably due to the isoquinoline alkaloids that it produces, such
as berberine and sanguinarine. These alkaloids are formed
from tyrosine, through a complex series of enzyme reactions,
taking place in different subcellular compartments. In this work,
the cDNAs corresponding to two of the enzymes involved in
alkaloid biosynthesis in A. mexicana were isolated and
characterized: norcoclaurine synthase (NCS) and the berberine
bridge enzyme (88E). For both enzymes, two isoforms were
isolated by RT-PCR and sequence analysis revealed up to 70%
identity with those previously reported from Papaver
somniferum, Eschscholzia californica (both Papaveraceae) and
Talictrum flavum (Ranunculaceae). Significant identity was
found with other defense related proteins, suggesting a
common ancestor. A phylogenetic analysis supported this
interpretation. 8oth, NCS and 88E seem to belong to small
gene families.
8oth, NCS and 88E transcripts accumulated in the alkaloid

accumulating .tissues roots, stem and capsule, suggesting that
such tissues may also be the sites for synthesis. In developing
seedlings, sanguinarine was detected from early stages
whereas berberine was only detected at later phases and only
in the aerial tissues. NCS and 88E transcript accumulation
correlated with alkaloid accumulation. A similar trend was
observed in cell suspensions which accumulated important
levels of sanguinarine, even in the absence of treatments to
induce secondary metabolism. However, exposure to methyl
jasmonate (MEJA), but not to salicylic acid , increased
sanguinarine accumulation and this effect was occurred after
the increase of transcript levels.
3
Taken together, these results suggest that alkaloid biosynthesis
in A. mexicana present important differences, in comparison
with other plants.
4
INTRODUCCIÓN
Los alcaloides son compuestos nitrogenados, de naturaleza

alcalina, con una distribución taxonómica restringida y que
ejercen un efecto fisiológico en organismos diferentes a los que
lo producen (Hashimoto y Yamada, 1994). Si bien diversos
organismos pueden producirlos, las plantas son consideradas
como la fuente principal ya que son muy comunes en ellas. La
función de los alcaloides está relacionada con diferentes tipos
de interacciones del organismo que los produce con su
entorno, como aquellas entre plantas con herbívoros o de
plantas con microorganismos.
El nitrógeno de los alcaloides proviene de ciertos aminoácidos,

por lo que se pueden definir los diferentes grupos de alcaloides
por su origen biosintético. Las principales familias de alcaloides
provienen de la ornitina/argina, lisina, triptofano, fenilalanina y
tirosina. La tirosina da lugar a los alcaloides
bencilisoquinolínicos (ABis), una de las familias más
numerosas.
Muchos de los ABis presentan actividad farmacológica y

algunos de ellos son útiles en el tratamiento de diversas
afecciones. Estos alcaloides son comunes en las
Papaveraceas, familia que incluye a Argemone mexicana, una
planta utilizada en la medicina tradicional mexicana y que es
capaz de sintetizar alcaloides tipo benzofenantridina
(sanguinarina) y protoberberina (berberina); dos subgrupos de
los ABis con una potente actividad antimicrobiana que sugiere
su participación en la protección química de las plantas que los
forman.
La biosíntesis de estos alcaloides se ha estudiado debido a que

su acumulación puede promoverse cuando las plantas, o sus
tejidos, son expuestos a condiciones que simulan un ataque
por patógenos o herbívoros. Más aún, varias de las enzimas
involucradas en la formación de estos alcaloides han sido
5
aisladas y caracterizadas, por lo que se han empezado a
entender los mecanismos moleculares y los controles
bioquímicos que regulan el flujo de los intermediarios. Estos
trabajos han indicado que estos alcaloides se acumulan de
manera diferencial en los tejidos de las distintas especies que
los producen. De este modo, los mecanismos regulatorios
descritos en otras especies pueden diferir de los que operan en
A. mexicana.
Con el fin de documentar las particularidades de la síntesis de
ABis en A. mexicana, en este trabajo se aislaron los ADNc
correspondientes a dos de las enzimas involucradas en este
proceso; la norcoclaurina sintasa (NCS) y la enzima del puente
de la berberina (BBE). Una vez que se dispuso de ambas
clonas, éstas fueron utilizadas como sondas moleculares para
estudios sobre la regulación molecular de la síntesis de
alcaloides, que incluyeron el análisis de la expresión tejido
específico y la relación que ésta guarda con el tipo y contenido
de alcaloides, tanto en plantas maduras como en plántulas en
desarrollo. Más aún, utilizando un cultivo de células en
suspensión, derivado de hojas, se analizaron los efectos de
algunos inductores del metabolismo secundario sobre los
niveles de los transcritos y los alcaloides. De esta manera, este
trabajo marca el inicio de los estudios a nivel molecular de esta
interesante planta de la medicina tradicional mexicana.
6
CAPÍTULO 1
ANTECEDENTES
1.1. Argemone mexicana
La familia Papaveraceae incluye plantas cuyos compuestos

qUJm1cos tienen propiedades farmacológicas. Varios
integrantes de esta familia se han ganado un lugar en la
terapéutica tradicional mexicana y con frecuencia se
mencionan en la historia de la medicina en diferentes culturas
nativas de América (Lozoya y Lozoya, 1982; Schwarzbach y
Kadereit, 1999). Por otro lado, la flora mexicana es una de las
más diversas del mundo. Lá disponibilidad de estos recursos
naturales, junto con el avance cultural de los antiguos
habitantes de la región de lo que hoy es México propició la
identificación y manejo de plantas que podían satisfacer
diferentes necesidades de esos pueblos, incluyendo las de
medicinas y de elementos para usos religiosos. Gracias a las
diferentes fuentes históricas, se han podido reconocer muchas
de las plantas utilizadas con fines curativos y ceremoniales.
Una de estas plantas es Argemone mexicana, probablemente
la papaverácea silvestre más abundante en nuestro país
(Fig.1.1 ). Esta planta tiene varios nombres comunes en
español, como amapola montés, cardo o cardo santo, así como
en diversas lenguas indígenas como chicalote (Náhuatl),
guechinichi (Zapoteco), y k'ix- k'anlol (Maya), entre otros. Se
encuentra ampliamente distribuida en los estados de
Aguascalientes, Coahuila, Colima, Chiapas, Chihuahua,
Durango, Guanajuato, Guerrero, Jalisco, Estado de México,
Morelos, Nuevo León, Oaxaca, Puebla, Querétaro, Quintana
Roo, Sinaloa, Sonora, Tamaulipas, Tlaxcala, Veracruz y
Yucatán (Lozoya y Lozoya, 1982). Se le puede encontrar como
flora arvense y vegetación secundaria en áreas de cultivo
abandonadas, pastizales y orillas de carreteras.
7.
1.1.1. DESCRIPCIÓN BOTÁNICA
Argemone mexicana es una planta anual que contiene un látex

amarillo brillante. Alcanza entre 30 y 90 cm de alto; su tallo es
solitario y ramoso en la base, con espinas escasas
perpendiculares o ligeramente reflejas. Sus hojas son alternas
y sésiles, lobuladas de aproximadamente 4 a 8 cm de ancho y
de 6 a 20 cm de largo, las basales son ovalolanceoladas y las
superiores elípticas u ovaladas y espinosas. Sus flores pueden
ser amarillas o blancas de 3 a 7.5 cm de diámetro. Los frutos
son cápsulas de entre 4 y 6 carpelos, dehiscentes por el vértice
(Lozoya y Lozoya, 1982). Esta planta crece en los climas
semicálidos y templados, con alturas que van desde el nivel del
mar hasta los 2750 m, su distribución por la zona bioclimática
se encuentra entre las zonas áridas y de selva baja caducifolia
(Villaseñor-Ríos y Espinosa-García, 1998).
1.1.2. USOS TRADICIONALES
Existen datos de que esta planta era utilizada por las culturas
prehispánicas con fines curativos (Emmart, 1940; Willcox et al.,
2007). Se empleaba para el tratamiento de nubes o cataratas,
aplicando directamente el látex sobre los ojos. También era
usada para aliviar la fiebre, para curar úlceras sexuales, la
sarna, como purgante y en ciertas enfermedades cutáneas.
Entre los usos medicinales también aparece el que se hace de
sus flores para preparar infusiones consideradas sedantes,
narcóticas y antitusivas. De igual forma, el aceite obtenido de
las semillas se ha utilizado para aliviar los cólicos ya que
desvanece el dolor, produciendo un efecto hipnótico notable.
Hay que señalar que tales usos medicinales fueron adquiridos
a lo largo de su historia y que la presencia de alcaloides en
diferentes partes de la planta puede explicar las propiedades
que se le atribuyen (Lozoya y Lozoya, 1982).
8
1.1.3. COMPOSICIÓN QUÍMICA
A esta planta se le ha llamado "fábrica de alcaloides" debido a

sus compuestos químicos, algunos de conocida toxicidad y que
pueden producir diversos efectos. Estos alcaloides son del
grupo de los bencilisoquinolínicos, típicos de las Papaveraceas,
e incluyen compuestos del grupo protoberberina (berberina),
predominantes en las partes aéreas, así como del grupo
benzofenantridina (sanguinarina), mayoritario en la raíz y las
semillas (Lozoya y Lozoya, 1982). Estos alcaloides tienen en
común propiedades antibióticas sobre un rango amplio de
microorganismos patógenos (Beuria et al., 2005; Villinski et al. ,
2003; Sánchez-Mendoza et al., 2008) y han sido utilizados en
tratamientos para prevenir la placa dento-bacteriana y como
expectorante (Robert y Wink, 1998). Además, a la sanguinarina
se le atribuye la capacidad de inhibir la proliferación de varios
tipos de células cancerígenas y la disrupción de microtúbulos
(Adhami et al. , 2004; Ahmad et al., 2000; Wolff y Knipling ,
1993). Otros alcaloides presentes en cantidades menores
incluyen la coptisina, alocriptopina, la queleritrina y
dihidroqueleritrina que poseen propiedades de modificar la
función cardiaca, según estudios realizados en farmacología
animal (Lozoya y Lozoya, 1982; Sánchez-Mendoza et al.,
2008).
Las semillas de Argemone contienen un 93% de ácidos grasos

de los cuales el 80% corresponden a ácidos insaturados
(linoléico, oléico, ricinoléico, palmitoléico y linolénico) y el resto
lo constituyen los ácidos saturados palmítico y esteárico. Por
otro lado, de las flores se han aislado derivados de flavonoides
como la isoharmnetina, el glucósido de 3-isoharmnetina y la 7-
isoharmnetina, (Lozoya y Lozoya, 1982).
9
Figura 1.1. Argemone mexicana . A) Cápsula en desarrollo; B) cápsula
dehiscente; C) tallo con espinas perpendiculares; D) flor (amaril la); E) hoja
lateral.
1.2. ALCALOIDES BENCILISOQUINOLÍNICOS (ABis)
Desde el descubrimiento y caracterización de los

constituyentes químicos del opio (morfina , codeína , tebaína ,
papaverina , noscapina) , la pasta formada con el látex seco de
la amapola (Papaver somniferum) , en el siglo XIX, un gran
número de ABis han sido aislados . Más de 2,500 alcaloides de
este tipo han sido identificados en familias del superorden de
las Magnoliflorae y de las Ranunculiflorae (Berberidaceae,
Ranunculaceae, Menispermaceae, Fumariaceae,
Papaveraceae) (Facchini y De Luca , 2008) . Algunos de estos
10
alcaloides son usados como fármacos, incluyendo la morfina, la
codeína, la papaverina, la berberina, la sanguinarina y la (+)-
tubocurarina, entre otros (Fig. 1.2). La función de los ABis en
plantas incluye protección contra herbívoros y agentes
patógenos. La actividad farmacológica de algunos de estos
alcaloides los hace útiles en el tratamiento de diversas
afecciones y nos permite tener una idea de su función biológica
en la planta (Facchini, 2001; Zieg¡ler y Facchini, 2008). Por
ejemplo , la morfina tiene eficacia como analgésico, la
colchicina provoca la disrupción de los microtúbulos y la ( +)-
tubocurarina es un bloqueador neuromuscular. Esto sugiere
que los alcaloides también podrían funcionar en plantas como
protección en contra del ataque de herbívoros. Por otro lado,
las propiedades antimicrobianas de la sanguinarina y la
berberina sugieren que estos alcaloides confieren protección
contra patógenos (Schmeller et al., 1997; García et al., 2006).
Muchas plantas, tales como las Papaveraceas, invierten
considerables recursos para la producción de estos alcaloides,
lo que sugiere que estos componentes juegan un papel
relevante en la fisiología de la planta (Schmeller et al., 1997;
Wink et al. , 1998).
1.2.1. RUTA DE SÍNTESIS DE LOS ABis
De manera general, la ruta de biosíntesis de los ABis se puede

dividir en tres etapas (Fig. 1.2). En la etapa inicial, · dos
moléculas de tirosina, el aminoácido que da origen a todos los
alcaloides de este tipo, experimentan una serie de reacciones
para producir dopamina y 4-hidroxifenilacetaldeido (4-HPAA),
dos intermediarios que se condensan para producir (S)-
norcoclaurina, que es considerado como el precursor central de
todos los ABis. La segunda etapa corresponde a la formación
de (S)-reticulina, el último intermediario común en la síntesis de
todos los alcaloides de este tipo. En la etapa final, la ruta de
biosíntesis se ramifica para producir los tres tipos principales
de alcaloides de este grupo: benzofenantridina (sanguinarina),
protoberberina (berberina) y los morfinanos (morfina).
11
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1
HaCO
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Figura 1.2. Representación de la ruta de biosíntesis de los ABis.

Abreviaciones: TYDC, tirosina/dopa decarboxilasa; NCS, norcoclaurina
sintasa; BBE, enzima del puente de berberina.
1.2.2. Formación de norcoclaurina
Las reacciones iníciales de la biosíntesis de los ABis, consisten

en una serie de descarboxilaciones, orto-hidroxilaciones y
desaminaciones que convierten dos moléculas de tirosina en
dopamina y en 4-hidroxifenilacetaldehído (4-HPAA),
respectivamente (Rueffer y Zenk, 1987) (Fig. 1.3). Estas
reacciones involucran la participación de una familia de
enzimas conocida como tirosina/dopa descarboxilasa (TYDC)
que . convierten la tirosina y su derivado hidroxilado, la
dihidroxifenilalanina (L-DOPA) en sus respectivas aminas (Fig .
1.3). La norcoclaurina sintasa (NCS) cataliza la condensación
de dopamina y 4-HPAA para producir (S)-norcoclaurina, que es
12
el precursor central de todos los ABis (Samanani et al., 2004;
Liscombe et al., 2005).
1.2.3. Formación de reticulina a partir de norcoclaurina
La ( S)-norcoclaurina se convierte en ( S)-reticulina mediante

una serie de reacciones ordenadas que incluyen una
hidroxilación y tres metilaciones (Fig. 1.3). Las primeras dos
metilaciones son catalizadas por la 6-0-metiltransferasa
(6'0MT) (Sato et al., 1994) y la coclaurina N-metiltransferasa
(CNMT) (Frenzel y Zenk, 1990), mientras que la N-
metilcoclaurina 3'hidroxilasa .(NMCH) es la responsable de la
subsiguiente reacción de hidroxilación (Pauli y Kutchan, 1998).
Finalmente la 3, -hidroxi-N-metilcoclaurina 0-metiltrasferasa
(4'0MT), lleva a cabo la última reacción de esta serie (Sato et
al., 1994). La ( S)-reticulina es el punto principal de ramificación
en la biosíntesis de los ABis, que incluyen los de tipo
benzofenantridina (Kutchan y Zenk, 1993). Una segunda rama
conduce a la formación de los alcaloides protoberberina
(Hashimoto y Yamada, 1994) y otra más a los alcaloides
morfinanos (Facchini y Bird, 1998) (Fig. 1.3).
1.2.4. Formación de benzofenantridinas y protoberberinas
El primer paso en la síntesis de sanguinarina y berberina

involucra la conversión del grupo N- metilo de ( S)-reticulina en
el componente del puente metileno de la ( S)-escoulerina por
acción de la enzima formadora del puente de la berberina
(BBE) (Steffens et al., 1985). La ( S)-escoulerina es convertida a
( S)-estilopona por acción de dos oxidasas dependientes del
citocromo P-450, la ( S)-chelantiofolia sintasa (CFS) y la (S)-
estilopina sintasa (SPS), resultando en la formación de dos
grupos metilenodioxi (Bauer y Zenk, 1989; 1991 ). La (S)-
estilopina es N-metilada por una enzima llamada
tetrahidroprotoberberina-cis-N-metiltransferasa (TNMT)
(Rueffer et al., 1990). Después del paso de N-metilación, una
tercera monooxigenasa dependiente del citocromo P-450, la
13
( S)-cis-N-metilestilopina 14-hidroxilasa (MSH) conduce a la
formación de protopina (Rueffer y Zenk, 1987) (Fig. 1.3).
Por su lado, la conversión de la protopina a sanguinarina

involucra una hidroxilación, llevada a cabo por otra enzima
dependiente del citocromo P-450, la protopina-6-hidroxilasa
(P6H). Seguidamente un rearreglo intramolecular produce la
dihidrosanguinarina (Tanahashi y Zenk, 1990) que por acción
de la dihidrobenzofenantridina oxidasa (DBOX), es convertida a
sanguinarina (Schumacher y Zenk, 1988) (Fig.1.3).
En cuanto a la formación de berberina, en algunas familias de

plantas como las Berberidaceas y las Ranunculaceas, ésta se
inicia con la metilación de la ( S)-escoulerina para dar lugar a la
(S)-tetrahidrocolumbamina. La reacción es catalizada por la
escoulerina-9-0-metiltransferasa (SOMT) (Sato et al., 1994). El
siguiente paso involucra la formación de un puente
metilenodioxi en la (s)-tetrahidrocolumbamina llevada a cabo
por la canadina sintasa (CDS), dependiente del citocromo P-
450, para formar la (S)-canadina (Rueffer y Zenk, 1994).
Finalmente la ( S)-canadina, también conocida como la (S)-
tetrahidroberberina, se oxida a berberina por acción de la (S)-
canadina oxidasa (CDO) en Coptís y Tha/íctrum (Amman et al.,
1986) o por la (S)-tetrahidroprotoberberina oxidasa (STOX) en
Berberís (Hashimoto y Yamada, 1994). Aunque estas enzimas
catalizan la misma reacción, sus propiedades bioquímicas son
bastante diferentes. La STOX de Berberís es una proteína
flavinilada con un amplio espectro para el uso de sustratos, en
tanto que la CDO de Coptis y Thalíctrum contiene hierro y
procede mediante un mecanismo diferente y acepta
preferentemente a la (S)-canadina como sustrato (Hashimoto y
Yamada, 1994) (Fig. 1.4).
14
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4-H idro x1f emlacetald eh1d o

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HO
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(Morfrna)
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S-Estrlopma
Figura 1.3. Síntesis de los alcaloides tipo benzofenantridina (sanguinarina) .

La localización subcelular de las enzimas biosintéticas se indica con los
siguientes colores: citosol , amarillo; lumen del retículo endoplásmico, azul ;
membrana del retículo endoplásmico, púrpura . En color rojo se muestran las
modificaciones en la estructura de los intermediarios hasta la síntesis de
sanguinarina . Abreviaciones: TYDC , tirosina/dopa decarboxilasa ; NCS,
norcoclaurina sintasa ; 6'0MT, norcoclaurina 6-0-metiltransferasa; CNMT
coclaurina N-metiltransferasa; NMCH , N-metilcoclaurina 3 ·-hidroxilasa ;
4'0MT, 3'-hidroxi-N-metilcoclaurina 4 '-0-metiltransferasa; BBE , enzima del
puente de berberina; CFS , chelantifolina sintasa ; SPS, estilopina sintasa;
TNMT, tetrahidroprotoberberina cis-N-metiltransferasa; MSH N-
metilestilopina-14-hidroxilasa ; P6H , protopina 6-hidroxilasa; DBOX,
dihidrobenzofenantridina oxidasa .
15
Columbamina '~ • +
STO~ N
OCHJ
OCHJ
Berberina
Protoberberlnas
Vesiculas
Figura 1.4. Síntesis de los alcaloides tipo protoberberina (berberina).

Abreviaciones: BBE, enzima del puente de berberina; SOMT, escoulerina-9-
0-metiltransferasa; CDS, canadina sintasa; CDO, canadina oxidasa; STOX,
tetrahidroprotoberberina oxidasa.
1.2.5. Síntesis de alcaloides morfinanos
En algunas especies del género Papa ver, la conversión de (S)-

reticulina a su (R)-enantiómero representa la primera etapa en
la síntesis de los alcaloides morfinanos. Esto se lleva a cabo en
dos pasos; el primero de ellos es la reducción estéreo
específica de la 1,2-deshidroreticulina a (R)-reticulina, que es
catalizada por acción de la 1,2-deshidroreticulina reductasa.
Esta es una enzima citosólica dependiente de NADPH , que ya
ha sido purificada de P. somniferum (De-Eknamkul y Zenk,
1992). El siguiente paso requiere el acoplamiento de un carbón
intramolecular con el carbón fenólico de la (R)-reticulina, que es
catalizado por la salutaridina sintasa (STS), dando lugar a la
salutaridina (Gerardy y Zenk, 1993a, b) (Fig.1.5). La enzima
16
citosólica salutaridina: NADPH 7-oxidoreductasa (SOR), reduce
la salutaridina a (7S)-salutaridinol (Gerardy y Zenk, 1993a),
mientras que la transformación de (7S)-salutaridinol en tebaína
involucra una acetilación llevada a cabo por la salutaridinol-7-
0-acetiltransferasa (SAT) que utiliza acetiiCoA como donador.
SOR y SAT han sido detectados sólo en P. somniferum y P.
bracteatum. Las últimas etapas de la transformación de tebaína
en morfina consisten en una serie de reacciones, en las que la
tebaína se convierte en codeinona, que se reduce a codeína
(Lenz y Zenk, 1995), para finalmente ser desmetilada y
producir morfina (Fig. 1.5). Solo la codeinona reductasa (COR),
una enzima citosolica dependiente de NADPH cataliza la
reducción de codeinona a codeína (Lenz y Zenk, 1995;
Unterlinner et al., 1999).
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H 5 ? : N C H , STS
H-
H,CC~o SO~H~>COo HO
H HO HO H NCH, H NCH::o
H H, H H
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~~ Tebalna
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H~
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Morfina
COR
Morfinona
'
HO~
H»FNCH,
Oripavina
Figura 1.5. Síntesis de los alcaloides tipo morfinanos (morfina).

Abreviaciones: DRR, 1,2-dehidroreticulina reductasa; STS, salutaridina
sintasa; SOR, salutaridina: NADPH 7-oxidoreductasa; SAT, acetil-
coenzimaA: salutaridinol-7-0-acetiltransferasa; COR, codeinona reductasa.
17
1.3. REGULACIÓN Y LOCALIZACIÓN TEJIDO-ESPECIFICA
DE LOSABis
La síntesis de alcaloides en las plantas puede presentar

diferentes grados de complejidad ya que puede involucrar la
participación de diferentes tejidos, diferentes tipos celulares en
un mismo tejido y diferentes compartimentos en una misma
célula (Facchini, 2001 ). Más aún, además de esta separación
espacial, también puede ocurrir una separación temporal, en la
que parte de la ruta de síntesis de un alcaloide no puede
ocurrir, sino hasta que el tejido alcanza cierto estado de
madurez (Facchini , 2001; Ziegler y Facchini , 2008).
En el caso de la síntesis de morfina (Figs. 1.3 y 1.5), diferentes

tejidos están involucrados en el proceso de síntesis en P.
somniferum. Así, la TYDC se expresa principalmente en tallos y
raíz en menores niveles en las cápsulas. En los tallos, los
transcritos se acumulan en abundancia en las células del
metafloema (Facchini y De Luca, 1995). En esta especie, el
metafloema se encuentra en estrecha asociación con las
células laticíferas lo que establece una relación directa entre
los sitios de síntesis de los alcaloides o sus precursores con el
tejido vascular (Facchini y De Luca, 1995). De esta manera, el
transporte de los alcaloides a los sitios finales de acumulación
se facilitaría. Por su lado, la NCS también es más activa en
raíces y tallos en P. somniferum (Samanani y Facchini, 2001 ),
mientras que los transcritos de la NMCH son más abundantes
en tallo, seguidos por la raíz, hojas y tejidos florales (Huang y
Kutchan, 2000). La actividad de la STS y la SOR, que
participan en la síntesis de morfina (Fig. 1.5), pueden ser
detectadas en las raíces y brotes (Gerardy y Zenk, 1993a,
1993b). En contraste, la COR, responsable del último paso de
la síntesis de morfina, se encuentra distribuida en todos los
tejidos. No obstante, la mayor actividad ocurre en cápsulas y
en partes jóvenes de los tallos (Huang y Kutchan, 2000). Si
bien estos resultados sugieren que algunos intermediarios de la
síntesis de la morfina deben ser transportados de las raíces a
18
las diferentes partes aéreas donde el alcaloide se acumula,
tanto en raíces como en tallos se pueden localizar los
transcritos correspondientes a enzimas involucradas en las tres
etapas de la síntesis de ABis, concretamente de la morfina.
Esto sugiere que todas las reacciones podrían tomar lugar en
un mismo tejido (Bird et al., 2003; Ziegler y Facchini, 2008). No
obstante, esto no implica que todas estas reacciones sucedan
en el mismo tipo celular. Mediante inmunofluorescencia, y
utilizando anticuerpos purificados por afinidad contra BBE,
CYP8081 y COR (Figs. 1.3, 1.4 y 1.5), se pudo observar que
los antígenos correspondientes se localizaban en las regiones
parietales de las células que conforman los tubos cribosos del
floema , mientras que, por hibridación in situ, se observó que los .
transcritos correspondientes se encontraban en las células
acompañantes, adyacentes a éstos. Más aún , los alcaloides no
se lograron detectar en ninguno de estos dos tipos celulares,
sino en un tercero; las células laticíferas (Bird et al., 2003;
Ziegler y Facchini, 2008). De esta manera, la síntesis de estos
alcaloides puede involucrar hasta tres distintos tipos celulares.
Por otra parte, la acumulación de sanguinarina (Fig. 1.3) en

raíces de P. somniferum podría indicar que las enzimas
involucradas en su síntesis se encuentran solamente en este
órgano (Facchini y De Luca, 1995). Sin embargo, los niveles
sustanciales de ARNm y de actividad de BBE en los brotes,
sugieren que los intermediarios involucrados en la síntesis de
la sanguinarina pueden ser transportados de los brotes a las
raíces (Steffens et al., 1985; Facchini et al. , 1996b). De modo
similar, y aún cuando la berberina, una protopina, se acumula
en las raíces primarias de Coptis japonica , la baja actividad en
estos tejidos de la SOMT, que participa en la síntesis de este
alcaloide (Fig. 1.4), sugieren que éstas no son el sitio principal
de síntesis (Fujiwara et al. 1993). De hecho, la síntesis de
berberina podría ocurrir en las raíces laterales y en los tallos,
donde se detectó la mayor actividad de SOMT. De manera
interesante la NCS se expresa principalmente en raíces y tallos
en Talictrum flavum (Samanani et al. , 2002).
19
1.4. COMPARTAMENTALIZACIÓN SUBCELULAR DE LAS
ENZIMAS DE LA SÍNTESIS DE LOS ABis
Algunas de las enzimas que participan en la síntesis de los

ABis se encuentran asociadas a diferentes compartimientos
subcelulares mientras que otras se encuentran en el citosol
(Fig. 1.3). La compartimentación de estas enzimas tiene como
consecuencia la retención de los alcaloides tóxicos en
estructuras cerradas, aislándolos del citosol, donde podrían
interferir con otros procesos metabólicos. Por otro lado, la
distribución de las enzimas en diferentes estructuras
subcelulares, implica que los intermediarios deben ser
transportados entre ellas y este tráfico subcelular podría
representar un nivel importante de regulación metabólica
(Facchini, 2001 ; Ziegler y facchini, 2008).
El estudio de la síntesis de sanguinarina en P. somniferum

mediante el fraccionamiento de componentes celulares en un
gradiente de densidad, sugiere la localización no citosólica de
las enzimas involucradas en la conversión de ( S)-reticulina a
sanguinarina. Así, la BBE, CFS, SPS, MSH, y P6H (Fig. 1.3)
han sido localizadas en formaciones vesiculares
submicroscópicas (microsomas) (Amman et al, 1986; Bauer y
Zenk, 1989; 1991 ; Rueffer y Zenk, 1987; Tanahashi y Zenk,
1990). Todas las enzimas anteriores, con excepción de la BBE,
son dependientes de citocromo P-450 y están asociadas con
las membranas del retículo endoplásmico (RE) o con vesículas
derivadas de éste. Además, a diferencia de las otras enzimas,
la BBE no está embebida de manera integral en la membrana
(Bird y Facchini 2001; Liscombe y Facchini, 2008). Los
microsomas, a los que se asocian algunas de estas enzimas
tienen una densidad entre 1.11 y 1.14 g mr 1 , lo que sugiere la
existencia de vesículas diferentes a las derivadas del RE y
posiblemente especializadas en la síntesis de alcaloides
(Amman et al., 1986; Bauer y Zenk, 1989). Más aún, la
oxidación final de la dihidrosanguinarina a sanguinarina,
catalizada por DBOX (Fig. 1.3), ocurre probablemente en estas
20
vesículas (Amman et al, 1986), que terminan por fusionarse
con la vacuola central , donde se acumula la sanguinarina
(Amman et al, 1986; Liscombe y Facchini, 2008).
De este modo, al menos tres compartimentos subcelulares

están involucrados en este proceso; el RE, vesículas
microsomales y la vacuola. En este sentido, el producto de la
traducción del transcrito de la BBE es inicialmente dirigido al
RE, para después ser enviado a la vacuola, por medio de las
vesículas ya descritas, en donde realizaría su función
(Alcántara et al, 2005; Bird y Facchini, 2001; Liscombe y
Facchini, 2008). No obstante, dado que el pH óptimo para la
actividad de la BBE es básico (8.8; Steffens et al. , 1985), las
condiciones ácidas de la vacuola, harían poco probable el
funcionamiento de la enzima (Facchini, 2001 ). De igual forma,
la NCS posee un posible péptido señal que la dirigiría al RE
(Samanani et al., 2004).
La acumulacion de sanguinarina en la vacuola sugiere que el

contenido de las vesículas de transporte incluyen a la BBE, así
como diversos intermediarios que pueden ser transportados del
RE hacia este organelo (Amann, et al., 1986). Es interesante
hacer notar que en suspensiones celulares de P. somniferum
tanto la NMCH, como la BBE y la sanguinarina fueron co-
localizadas en el RE (Alcántara et al; 2005). Más aún, la
acumulación de sanguinarina inducida por la exposición a
homogenados fúngicos, produjo una dilatación del RE,
conjuntamente con la acumulación de material
electrónicamente-denso (MES) entre éste y la vacuola. La
presencia de MES sugiere la ocurrencia de compuestos
químicos, probablemente alcaloides, en las vesículas derivadas
del RE y que terminan fusionándose con la vacuola central
(Alcántara et al , 2005). Esto sugiere que el proceso de síntesis
de este alcaloide se inicia en el RE, del cual se desprenden las
vesículas especializadas en las que el proceso continúa, para
finalizar en la vacuola, donde el alcaloide se acumula.
21
1.5. TRANSPORTE INTERCELULAR DE LAS ENZIMAS
BIOSÍNTETICAS DE LOS ABis
Por lo general los alcaloides se acumulan en tipos específicos

de células probablemente como una forma de protección contra
su toxicidad, relacionada con su participación en mecanismos
de defensa. Por ejemplo, los alcaloides de Catharanthus
roseus se acumulan en los idioblastos y en las células
laticíferas (St-Pierre et al., 1999; De Luca y St-Pierre, 2000),
mientras que en Talictrum flavum se localizan en la endodermis
de la raíz y en la corteza o médula del tallo (Samanani et al.,
2005). De igual forma, en Papaver somniferum los alcaloides
se acumulan en las células laticíferas adyacentes o próximas a
los elementos de los tubos cribosos del floema (Bird et al.,
2003; Liscombe y Facchini, 2008). El citoplasma de las células
laticíferas se conoce como látex y puede contener todos los
organelos y vesículas donde se acumulan los alcaloides
(Alcántara et al., 2005). El látex fue considerado por mucho
tiempo como el sitio dónde ocurría la biosíntesis de los ABis.
Esta percepción parecía reafirmarse cuando, recientemente, la
enzima COR fue identificada como una de las proteínas más
abundantes en una fracción cruda del látex de tallos de P.
somniferum (Decker et al., 2000; Hagel et al., 2008). Sin
embargo, el látex cosechado de cápsulas y tallos puede
resultar contaminado con el citoplasma presente en las células
circundantes, especialmente de las que se encuentran en el
floema (Facchini y St-Pierre, 2005). De hecho, como ya se
mencionó, la localización in situ de los transcritos y las enzimas
involucradas, confirman que este proceso no involucra a las
células laticíferas, sino que éstas podrían ser únicamente los
sitios de acumulación (Bird, et al. 2003; Weid, et al. 2004;
Liscombe y Facchini, 2008). Un total de siete enzimas; 6'0MT,
CNMT, NMCH, 4'0MT, BBE, SAT, COR, han sido localizadas
por inmunocitoquímica en los elementos de los tubos cribosos
en P. somniferum mientras que los transcritos correspondientes
se localizan en las células acompañantes (Samanani et al.
22
2006; Liscombe y Facchini, 2008). La localización de los
transcritos y sus proteínas correspondientes en diferentes tipos
de células, sugiere la existencia de un mecanismo de
movilización intercelular de los transcritos hacia los elementos
de los tubos cribosos del floema. Esto sería posible gracias a
que algunas de estas enzimas poseen las secuencias que
facilitarían su transporte simplástico (Oparka y Turgeon, 1999;
Oparka, 2004 ). Esto quedó demostrado cuando el extremo N-
terminal de una presunta BBE de N. benthamiana se fusionó
con la proteína verde fluorescente, lo que permitió visualizar el
transporte de la proteína quimérica entre las células
acompañantes y los tubos cribosos vía plasmodesmo (Oparka,
2004).
Es interesante notar que previamente no se tenía evidencia de

que las células de los tubos cribosos pudieran tener un
metabolismo complejo ya que pierden el núcleo durante su
maduración. Por esta razón , se asumía que sólo poseían un
número limitado de proteínas; las necesarias para su propia
conservación y el transporte de solutos. No obstante, la lista de
funciones fisiológicas ahora conocidas para los elementos de
los tubos cribosos incluye el transporte de macromoléculas,
como el ARN (Jorgensen et al., 1998), así como la biosíntesis
de diferentes compuestos, incluyendo el ácido jasmónico
(Hause et al. 2003), ácido ascórbico (Hancock et al., 2003) y
otras moléculas relacionadas con los mecanismos de defensa
(Walz et al. 2004).
1.6. SÍNTESIS DE ABis EN CULTIVOS DE CÉLULAS in vitro
El perfeccionamiento de las metodologías de cultivos in vitro de

células vegetales, y en particular la inducción del metabolismo
secundario, redundó en el descubrimiento de muchas enzimas
que participan en estas vías de síntesis. En los últimos años,
los ADNcs correspondientes a las enzimas involucradas en la
síntesis de los ABis han sido aislados y caracterizados en
diversas especies, lo que ha permitido estudiar el efecto de
23
diversos inductores sobre la actividad transcripcional (Cuadro
1.1 ).
Cuadro 1.1. Enzimas involucradas en la síntesis de los ABis en plantas

para las que han sido aislados los ADNcs correspondientes.
Enzimas Especies Num. Expresión Inducción Referencia

copia (Fúnglcos,
Jasmonatos)
TYDC T. flavum 15 Tallo, raíz si Samanani et al. 2005
P. somniferum Facchini et al. 1994
NCS T. flavum 2 Tallo, si Samanani et al. 2004
P. somnireum pecíolo Liscombe et al. 2005
C. japonica Minami et al. 2007
6'0MT T .flavum 1 Tallo, raíz, si Samanani et al. 2005
P. somnireum hoja, Morishíge et al. 2000
C.japonica cápsula Ounaroon et al. 2003
CNMT T. f/avum 1 Tallo, raíz, si Samanani et al. 2005
P. somniferum brotes Choi et al. 2002
C.japonica Facchini et al. 2003
NMCH T. flavum 263 Tallo, raíz, si Samanani et al. 2005
P. somniferum hoja, brote Pauli et al. 1998
E. californica Huang et al. 2000
4'0MT T. ffavum 2 Tallo, brote si Samanani et al. 2005
P. somniferum Morishige et al. 2000
C. japonica Facchini et al. 2003
BBE T. ffavum, 3 Tallo, raíz, si Sama na ni et al. 2005
P. somniferum hoja, brote, Dittrich et al. 1991
B. stolonifer, cápsula Chou et al. 1998
E. californica Facchiní et al. 1996b
Hauschild et al. 1998
SOMT T. flavum 1 Tallo, raíz si Samanani et al. 2005
C.japonica Takeshita et al. 1995
COR P. somniferum 6 Tallo, rafz, No Unterlinner et al.1999
hoja, brote,
cápsula
P. somniferum es un modelo ventajoso para el estudio de la

regulación diferencial de la síntesis de los ABis ya que produce
tanto los de tipo benzofenantridina, como los de tipo
morfinanos, si bien esta última capacidad se pierde en cultivos
no diferenciados (Facchini y Bird, 1998; Zulak et al., 2008). En
las suspensiones celulares de esta planta se han podido
detectar las enzimas involucradas en la síntesis de morfina, no
24
obstante, dicho alcaloide no logra acumularse, aun en
condiciones en que se induce la activación del metabolismo
secundario, como el tratamiento con jasmonatos (JA) y
homogenados fúngicos (Lenz y Zenk, 1995; Facchini y Bird ,
1998). Estos tratamientos, por otra parte, logran inducir la
síntesis de sanguinarina, no solo en P. somniferum, sino
también en cultivos de E. californica (Ditrich y Kutchan, 1991 ).
Los cultivos de diferentes especies de Papaveraceas que
producen estos alcaloides, son capaces de sintetizarlos cuando
se exponen a inductores del metabolismo secundario. Por
ejemplo, en cultivos de P. somniferum, E. californica y S.
canadensis, solamente se detectan trazas de sanguinarina en
condiciones normales de mantenimiento. Sin embargo, al ser
expuestas a un inductor este alcaloide se acumula en
contenidos de hasta el 4% peso seco (PS) (lkuta, 1998; Zulak
et al., 2008).
De manera general, la actividad de las enzimas biosintéticas

asociadas a la membrana se promueve por acción de los
inductores, no así las citosólicas (Biechert et al., 1995). Sin
embargo, varios miembros de la familia de la TYDC, que son
enzimas citosólicas, se expresan de manera rápida y transitoria
en suspensiones celulares de P. somniferum como respuesta a
los tratamientos con inductores (Facchini et al., 1996a, 1998).
Esta inducción podría requerir la participación de JA, ya que la
aplicación de este compuesto produce efectos similares
(lgnatov et al., 1996). De modo interesante, en los cultivos de
Papaver los transcritos para NMCH y BBE que participan en la
formación de intermediarios comunes para las
benzofenantridinas y protoberberinas (Fig. 1.3), presentaron
patrones de expresión similares a los de la TYDC. Por su parte,
la expresión de COR, involucrada en la formación de morfina
sólo pudo detectarse en niveles muy bajos, que no se
modificaron en respuesta al inductor (Huang y Kutchan, 2000).
La coordinación de la expresión de BBE con NMCH también

ocurrió en cultivos de E. ca/ifornica tratados con jasmonato de
25
metilo (MEJA), provocando la acumulación de los transcritos
correspondientes (Pauli y Kutchan, 1998; Blechert et al. , 1995;
Dittrich y Kutchan , 1991 ; Pauli y Kutchan, 1998). Más aún , la
actividad de las enzimas CFS , SPS, MSH, P6H, todas
dependientes del citocromo P-450, también aumentaron
después de la exposición al inductor (Bauer y Zenk, 1991 ;
Blechert et al., 1995).
Por su parte, en cultivos de S. canadiensis se ha demostrado

que la actividad de la DBOX, enzima que participa en la
formación de las benzofenantridinas, incrementa entre 4 y 14
veces en suspensiones celulares tratadas con MEJA y ácido
salicílico (SA), respecto a cultivos no tratados (lgnatov et al. ,
1996).
Las suspensiones celulares de especies productoras de

berberina como T. tuberosum y C. japonica (Ranunculacea)
pueden ser inducidas, conduciendo a la acumulación de este
alcaloide (De Luca y Laflamme, 2001; lkezawa et al. , 2008).
Así, la exposición a MEJA aumentó la actividad de cuatro
diferentes 0-metiltransferasas que actúan en la síntesis de este
alcaloide en cultivos de T. tuberosum (Frick y Kutchan, 1999).
Esto establece un contraste con los cultivos que acumulan
alcaloides de tipo benzofenantridina, como P. somniferum y E.
californica, en los que la actividad de las metiltransferasas no
es sensible a este inductor (Frick y Kutchan, 1999).
Tomando en cuenta estos resultados, es claro que la

biosíntesis de sanguinarina y berberina puede resultar
promovida por diferentes tipos de inductores, como
consecuencia de la activación coordinada de genes de su
biosíntesis. Sin embargo, estos inductores pueden activar
distintos conjuntos de genes en diferentes especies de plantas,
lo que parece depender de la clase de ABis que producen . De
este modo, los hallazgos en una especie no pueden ser
extrapolados a otras sin un análisis cuidadoso.
26
El estudio de los promotores de genes involucrados en la
síntesis de los ABis permite explorar aspectos en el control de
la formación de éstos. El análisis de expresión temporal de
construcciones hechas uniendo promotores de los genes Tydcl
y Bbe1 de P. somniferum, con el gen reportero GUS, ha
permitido la identificación de las regiones necesarias para la
funcionalidad de dichos promotores (Park et al. , 1999).
Además, se han logrado identificar dominios de entre 100 y 150
nucleótidos que son necesarios para la inducción por heridas
en estos dos genes (Park et al., 1999). Por su parte, el análisis
funcional del promotor de la Bbe1 de E. ca/ifornica reveló una
secuencia de 150 nucleótidos, que comparte un 55% de
identidad con la región equivalente en el promotor para este
mismo gen en P. somniferum (Hauschild et al. , 1998). Esto
sugiere que dichas secuencias podrían participar en la
activación de este gen a los inductores u otros estímulos
comunes (Facchini, 2001; Ziegler y Facchini, 2008).
1.7. TRANSDUCCIÓN DE SEÑALES EN LA SÍNTESIS DE

ABis EN RESPUESTA A LA INDUCCIÓN
Como ya se señaló en el apartado anterior, las suspensiones

celulares de diversas Papaveraceas reaccionan a diferentes
inductores (homogenizados fúngicos, levaduras y jasmonatos)
promoviendo la biosíntesis de los ABis. Esta respuesta es la
parte final de un sistema que se inicia tras la percepción del
estímulo inicial. Es importante resaltar que, en cultivos de
Eschscholzia californica, la activación de la síntesis de
alcaloides ocurre utilizando concentraciones de un inductor,
preparado con extracto de levadura, muy por debajo del umbral
requerido para estimular los eventos asociados con la
respuesta hipersensible como el depósito de proteínas en las
paredes celulares, la acumulación de compuestos fenólicos, la
lignificación y muerte celular (Roos et al., 1998). Este aumento
en la síntesis de alcaloides se relaciona con la acidificación del
citosol que, a su vez, resulta de la salida de protones de la
vacuola (Roos et al. , 1998). Diversos datos sugieren la
27
existencia de dos vías de señalización involucradas en el
incremento de los alcaloides en estos cultivos. Por un lado, se
ha demostrado que las concentraciones bajas del inductor
(entre 0.2 a 1 ~g/ml) promueven la síntesis de ABis, sin
aumentar los contenidos internos de JA, mientras que las
concentraciones elevadas (>5 ~g/ml), sí lo hacen (Farber et al.,
2003). El JA es una hormona que funciona como mediador
químico en la inducción de la síntesis de alcaloides en E.
californica (Biechert et al., 1995) y en C. roseus (Van der Fits y
Memelink, 2000), entre otros. De manera interesante, la
inducción en respuesta al JA, en los cultivos de E. califórnica,
no está acompañada por la acidificación del citoplasma, pero sí
desencadena las reacciones asociadas con la respuesta
hipersensible (Farber et al., 2003). Como ya se mencionó,
estos datos sugieren la existencia de dos rutas diferentes de
señalización que convergen para la biosíntesis de alcaloides y
que se ilustran en la Figura 1.6. La primera de estas rutas
dependería de los JAs y no ha sido bien detallada. Esta se
basa en que las concentraciones elevadas del inductor
(extracto de levadura) establecen una interacción con una
fosfolipasa A2 soluble que conduce a un aumento en la
producción del jasmonato, a partir del ácido linolénico. El
aumento de este compuesto promueve la activación de genes
relacionados con la defensa, entre ellos, los de la síntesis de
alcaloides (Fig.1.6; Faber et al., 2003). La segunda ruta parece
depender del flujo de protones y conduce hacia la síntesis de
los alcaloides, aún sin tener una relación directa con los JA y la
repuesta hipersensible. Esta última comprende la activación de
una proteína Ga, asociada a la membrana plasmática, y que
podría establecer el contacto con el inductor (Viehweger et al.,
2006). Se ha demostrado que esta proteína puede activar a
una fosfolipasa A2 , sobre la misma membrana, provocando un
aumento de lisofosfatidilcolina (LPC) dentro del citoplasma
(Roas et al., 1999; Viehweger et al., 2002, Heinze et al., 2007).
La LPC actúa, a su vez, como un segundo mensajero
conectando la membrana plasmática con el tonoplasto, lo que
podría activar a los transportadores H+/Na+, aumentando el
28
flujo de protones de la vacuola al exterior, llevando a la
acidificación transitoria del citoplasma (Roos et al. , 1999;
Viehweger et al. , 2002; Schwartze y Roos, 2008). De esta
manera , el flujo de protones funcionaría como un intermediario
para la síntesis de los alcaloides. En este sentido , la
acidificación artificial del citoplasma a partir del flujo de
protones de la vacuola , utilizando ácido butírico y ácido pavílico
promov1o la síntesis de alcaloides. Por otro lado , el
agotamiento de la poza vacuolar de protones, manipulando el
pH intracelular, impide dicha respuesta. Aquí es importante
tener en mente que la acidificación del citoplasma ocurre por la
salida de protones vacuolares (Fig . 1.6; Roos et al. , 1998). Los
mecanismos moleculares para la activación de los genes
debido al cambio de pH aún están por ser identificados.
Concentración baja
Co ncentración de inductor
elevada de inductor '\.
Na; ____ __ __
Áctdo linoléntco
--
\ / H' /Na'
Incremento del
jasmona to
:~ (citoplasma) :::::::::;::::::: ..:.~)
L'lp H
_ --------- Inducción de las
Acttvacton e nzimas biosintéticas
Respuesta transcrip tona l
hlpersensible deA Bis
Figura 1.6. Modelo hipotético de la cascada de señales en respuesta a la

activación con un inductor de levadura en suspensiones de Eschscholzia
californ ica. Dos tipos de respuesta pueden activarse dependiendo de la
magnitud del estímulo, representada por la dosis del inductor. Ver
explicación en el texto. (Modificado de Roos et al., 2006).
29
1.8. ANÁLISIS DE LA ACUMULACIÓN DE ABis EN
CULTIVOS in vitro DE Argemone mexicana
Con frecuencia los cultivos in vitro de diversas especies de

Papaveraceas pueden acumular diversos alcaloides. Esto
puede ser resultado de la modificación de las rutas
biosintéticas durante el proceso del establecimiento de los
cultivos y el contenido exógeno de hormonas en los medios de
cultivos (Eirlert y De Luca, 1994; Long y Benfey, 2006). En el
caso de Argemone, existen trabajos previos para la producción
de alcaloides en cultivos in vitro. Entre estos se encuentra la
adición de precursores al medio de cultivo, como fenilalanina y
tirosina. De hecho, con base en estos trabajos se propuso que
la tirosina es el precursor de la biosíntesis de ABis (Khanna et
al. , 1982).
En nuestro laboratorio, se han establecido cultivos de callos de

A. mexicana generados a partir de hoja joven (Campos-
Tamayo, 2002). En estos cultivos se observó la presencia de
sanguinarina, pero no de berberina, que se identificaron con
base en criterios de cromatografía de capa delgada (Carrillo-
Pech, 2006). La acumulación de sanguinarina en estos cultivos
fue sensible a la luz, ya que, en condiciones de oscuridad se
presentó un menor contenido, en comparación con aquellos
cultivados en condiciones de luz (Carrillo-Pech, 2006). Los
reguladores de crecimiento también modificaron el patrón de
acumulación de alcaloides ya que la adición de ácido
naftalenacético y 6-bencilaminopurina aumentaron el contenido
de sanguinarina (Campos-Tamayo, 2002)
A partir de estos callos, se obtuvo una suspensión celular, para

cuya obtención fue necesario variar el pH del medio de 5.5 a
6.0, ya que a pH ácido, se observaba el oscurecimiento de las
suspensiones, probablemente debido a la formación de
polifenoles, tipo melanina (Carrillo-Pech, 2006). La modificación
del pH también permitió el aumento en el índice de crecimiento
durante un ciclo de cultivo, lo que puede estar relacionado con
30
las condiciones ambientales en las que la planta se desarrolla,
ya que prefiere los suelos alcalinos (Ramakrishnan y Gupta,
1972). En esta suspensión, como en los callos, se identificó la
presencia de sanguinarina, pero no la de berberina. No
obstante, a diferencia de los callos, las suspensiones
sometidas a diferentes condiciones de iluminación no
mostraron un cambio significativo en el contenido de
sanguinarina, aunque el perfil cualitativo presentó algunas
variaciones. Además de los efectos de la luz mencionados
previamente, se pudo observar que los cultivos in vitro fueron
susceptibles a la aplicación de inductores químicos, como el
jasmonato de metilo (MEJA) (Carrillo-Pech, 2006).
1.9. RECAPITULACIÓN DE LOS ANTECEDENTES
De la revisión anterior se desprende que Argemone mexicana

(Papaveracea) es una planta que se ha utilizado en la medicina
tradicional mexicana. La presencia de algunos alcaloides
bencilisoquinolínicos (ABis), derivados de la tirosina, como la
sanguinaria y la berberina, podría explicar las propiedades que
se le atribuyen, ya que estos alcaloides tienen probada
actividad antimicrobiana y leishmanicida. La ruta de síntesis de
los ABis es larga y complicada, ya que involucra alrededor de
1O enzimas, dependiendo del tipo de alcaloide en particular de
que se trate (Fig. 1.2; 1.3; 1.4 y 1.5). Estas enzimas están
distribuidas en diferentes tejidos, diferentes tipos celulares y,
en una misma célula, en distintos compartimentos
subcelulares. Esto implica la posible participación de sistemas
de transporte para la movilización de los intermediarios entre
los diferentes sitios. Más aún, al menos en P. somniferum, las
enzimas pueden ocurrir en diferentes tipos celulares que los
transcritos. Ahora bien, esta distribución puede no ser la misma
en diferentes especies. Por ejemplo, la expresión de TYDC es
abundante en raíces de P. somniferum mientras que es baja en
las de T. flavum, en la cual es más abundante en el rizoma, un
tallo modificado (Samanani et al. , 2005, Ziegler y Facchini,
2008).
31
Por otro lado, en cultivos celulares de P. somniferum, E.
californica y otros, la sanguinarina sólo puede detectarse en
condiciones de inducción del metabolismo secundario, mientras
que en los de A. mexicana este alcaloide se acumula en
cantidades significativas, aún en condiciones de mantenimiento
(Campos-Tamayo, 2002). Esto indica que los procesos de
síntesis de estos alcaloides pueden presentar características
particulares en las diferentes especies que los producen.
Las características propias de la síntesis de los ABis en A.
mexicana no han sido analizadas y, puesto que este proceso
puede diferir en las plantas que los producen , podría diferir de
los ya estudiados. Este trabajo pretendió sentar las bases para
el estudio molecular de la síntesis de alcaloides en A.
mexicana. Para ello, se aislaron los ADNc correspondientes a
dos enzimas claves en la síntesis de ABis; la NCS y la BBE.
Una vez disponibles, y después de su caracterización, las
clonas se utilizaron como sondas moleculares para el análisis
de la expresión de los genes correspondientes en los diferentes
tejidos de plantas maduras, así como en plántulas en
desarrollo, y en cultivos de células en suspensión sometidos a
diferentes condiciones. Los resultados obtenidos permitieron
identificar similitudes y diferencias del proceso de síntesis de
ABis entre A. mexicana y otras plantas, y así, establecer qué
eventos han sido conservados entre los diferentes géneros y
familias productoras de ABis.
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45
46
CAPÍTULO 2
MATERIALES Y MÉTODOS
Con base en la revisión presentada anteriormente, este trabajo

plantea los siguientes objetivos.
2.1. OBJETIVOS
Objetivo general
Analizar la expresión de los genes correspondientes a la

norcoclaurina sintasa (NCS) y la enzima del puente de la
berberina (BBE) en Argemone mexicana, con el fin de
establecer su posible participación en el control de las síntesis
de los alcaloides bencilisoquinolínicos en esta especie.
Objetivos particulares
1) Aislar y caracterizar los ADNc correspondientes a la

norcoclaurina sintasa (NCS) y la enzima del puente de la
berberina (BBE) de A. mexicana.
2) Analizar de la expresión génica de la NCS y la BBE en
diferentes tejidos de plantas maduras de A. mexicana,
así como el contenido de alcaloides en los mismos
tejidos.
3) Analizar la expresión génica de la NCS y la BBE, así
como el contenido de alcaloides en plántulas en
desarrollo de A. mexicana.
4) Evaluar el efecto del jasmonato de metilo (MEJA) y el
ácido salicílico (SA) sobre la expresión génica de la NCS
y BBE, así como sobre el contenido de los alcaloides en
suspensiones celulares de A. mexicana.
47
2.2. HIPÓTESIS
La síntesis de los alcaloides bencilisoquinolínicos (ABis) de

Argemone mexicana presenta aspectos regulatorios
(moleculares y fisiológicos) diferentes de los ya reportados en
otras especies.
2.3. ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
Para cumplir con los objetivos planteados, se siguió una

estrategia experimental dividida en dos partes (Fig. 2.1 ). En la
primera parte, se aislaron los ADNcs correspondientes a los
genes que codifican para las enzimas NCS y BBE. Para ello se
generaron oligonucleótidos basados en las secuencias de
aminoácidos conservadas en enzimas de otras especies
productoras de ABis. Estos oligonucleótidos se utilizaron como
iniciadores en la reacción de la polimerasa, con ARN
retrotranscrito de diferentes tejidos de A. mexicana (RT-PCR).
En la segunda parte, con los ADNc ya aislados, se procedió a
la caracterización molecular de los genes. Dicha
caracterización involucró el análisis de la redundancia genética,
así como de los patrones de expresión . Para esto último, se
analizaron diferentes tejidos de la planta, así como
suspensiones celulares expuestas a diferentes condiciones que
afectan la biosíntesis de los alcaloides (Fig. 2.1). Los
resultados fueron comparados con los reportados para otras
especies acumuladoras de ABis.
48
Aislamiento de los ADNc de NCS y BBE 1
1 de A. mexicana
1
1 RT·RCP 1
L Obtención de sondas 1
1
l Análisis molecular 1
1
.¡.
1 Redundancia genética 1
1
Análisis de expresión
1
r
Expresión tejido Suspensiones celulares
específica en plantas
1 1
de campo 1 Inducción JA, SA 1
1 Ralz 11 Hoja 11 Tallo 11 Cápsula 1 l
Curso temporal de la 1
activación transcripcional
1
Figura 2.1. Esquema de la estrategia experimental propuesto para este

proyecto. Los detalles se describen en el texto en el apartado diseño
experimental.
2.4. MATERIAL BIOLÓGICO
Las plantas utilizadas en este trabajo se colectaron en

diferentes zonas de la ciudad de Mérida. Las plantas fueron
identificadas taxonómicamente por el Dr. Roger Orellana
Lanza, de la Unidad de Recursos Naturales de este Centro.
Las plantas fueron colectadas completas, incluyendo las raíces,
se trasladaron al laboratorio en bolsas de polietileno,
conservadas en hielo. En el laboratorio, fueron lavadas con
agua jabonosa y enjuagadas,· primero con agua corriente y
después con agua desionizada. Se secaron con toallas de
papel absorbente y se separaron los diferentes tejidos (hojas,
tallos, raíces y cápsulas) que fueron pesados, congelados con
nitrógeno líquido y conservados a -aooc hasta que se
utilizaron. También se colectaron semillas que fueron
etiquetadas y almacenadas a temperatura ambiente.
49
La línea celular utilizada en el trabajo se obtuvo a partir de
callos de hoja (Campos Tamayo , 2002; Carrillo Pech, 2006) y
se ha mantenido en el medio PC (Phillips y Collins, 1979) a pH
5.5, suplementados con 25 g/L de sacarosa y 1.5 mg/L de
ácido naftalénacetico (ANA) y 0.5 mg/L de 6-bencilaminopurina
(BAP) como reguladores del crecimiento . Los cultivos
estuvieron en condiciones de cuarto de cultivo a 25°C y bajo
luz continua entre 40 y 50 IJmol m-2 s- 1 (lámparas fluorescentes
de 39 W), con una agitación continúa de 100 rpm.
Los diferentes tratamientos aplicados se describen en las
secciones correspondientes.
2.6. REFERENCIAS
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diferenciación celular sobre la síntesis de alcaloides en cultivos
in vitro de Argemone mexicana y Catharanthus roseus. Tesis
de licenciatura. Químico Farmacéutico Biólogo. Facultad de
Química. UADY. Mérida, Yucatán, México.
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50
CAPITULO 3
AISLAMIENTO DE LOS ADNcs DE LA

NORCOCLAURINA SINTASA (NCS) Y LA ENZIMA
FORMADORA DEL PUENTE DE LA BERBERINA
(BBE) DE Argemone mexicana
3.1 . INTRODUCCIÓN
La investigación sobre la biosíntesis de los ABis se ha centrado

en un número limitado de especies. De este modo, Coptis
japonica y Talictrum flavum, ambas de la familia de las
Ranunculaceas, han sido modelos para el estudio de la
biosíntesis de berberina, mientras que Eschscholzia californica
y Papaver somniferum (Papaveraceas) se han empleado como
sistemas para investigar la síntesis de sanguinarina y de
morfina, respectivamente (Liscombe y Facchini, 2008).
Si bien estos alcaloides comparten la misma ruta de
biosíntesis, algunas diferencias en los mecanismos que la
regulan pueden existir (Liscombe y Facchini, 2008). Más aun,
la manipulación genética de plantas o cultivos in vitro para
aumentar la producción de alcaloides ha generado resultados
inesperados, revelando la existencia de puntos de control que
no se habían evidenciado anteriormente (Facchini, 2001) lo que
demuestra la necesidad de conocer mejor los factores que
controlan la biosíntesis de estos compuestos (Facchini y De
Luca, 2008).
La norcoclaurina sintasa (NCS; EC. 4.2.1.78) es una enzima
clave para la síntesis de los ABis, ya que condensa
oxidativamente la dopamina con el 4-HPAA, formando la
norcoclaurina, el compuesto que constituye el esqueleto
carbonado central de los ABis (Fig.1.3; Samanani et al., 2004).
Recientemente, se han aislado dos isoformas de la NCS en P.
somniferum (Liscombe et al., 2005) y una de T. flavum
(Samanani et al. , 2004), las cuales tienen menos del 40 % de
51
identidad entre ambas especies. Es interesante hacer notar
que la parte central de estas proteínas (residuos 40-170)
presentan similitud (28-44%) con miembros de la familia de las
proteínas relacionadas con patogénesis como las PR-1 O que
incluyen a la familia de proteínas alergénicas Bet V1 que han
sido divididas en 14 clases (Liscombe et al. , 2005). No
obstante, las NCS de P. somniferum y de T. flavum se
distinguen entre estas proteínas ya que son las únicas que
presentan una extensión de aminoácidos en los extremos N- y
e-terminales, con las características de posibles péptidos señal
y transmembranales respectivamente (Facchini et al. , 2007).
Por otro lado, recientemente se aisló el ADNc de una presunta
NCS a partir de cultivos celulares de C. japonica
(Ranunculaceae). Esta NCS, se distingue de las anteriores
debido a que corresponde a una dioxigenasa dependiente de
2-oxoglutarato (Minami et al. , 2007) y no presenta identidad
significativa con las NCS de P. somniferum y T. flavum . Más
aún, no está claro el mecanismo enzimático mediante el cual
podría llevar a cabo la reacción. De manera interesante, en
estos cultivos también se logró el aislamiento del ADNc de una
presunta PR1 O, con un 65 % de identidad con la NCS de T.
flavum y que al ser expresado tuvo la capacidad de catalizar la
formación de (s)-norcoclaurina a partir de dopamina y 4-HPAA
(Minami et al. , 2007). Estos resultados demuestran la
necesidad de realizar mayores estudios en C. japonica para
aclarar la participación precisa de estas dos enzimas en la
formación de la (s)-norcoclaurina (Liscombe y Facchini , 2008).
Por su parte, la síntesis de los diferentes tipos de ABis,
involucra la oxidación del grupo N-metilo de la ( S)-escoulerina,
lo que resulta en la formación de un puente N-metileno con el
C-8 (Fig. 1.3). Esta reacción es catalizada por la enzima del
puente de la berberina (BBE; EC. 1.21.3.3), una flavin proteína.
Los ADNcs para esta enzima han sido aislados a partir de
diferentes especies como B. stolonifera, E. californica, P.
somniferum (Dittrich y Kutchan, 1991; Facchini et al., 1996;
Samanani et al. , 2005). A pesar de la divergencia evolutiva
52
entre estas especies, todas presentan un alto grado de
conservación y corresponden a proteínas de aproximadamente
519 residuos, con un peso molecular de 59 kDa. Además, en
todos los casos se ha encontrado el dominio entre los residuos
104 y 166 en la región intermedia, que corresponde al sitio de
unión alFAD y un presunto péptido de tránsito en el extremo N-
terminal, acorde con su localización microsomal. La
conservación de estas características sugiere que son
esenciales para su funcionamiento (Liscombe et al., 2005).
Este capítulo describe el aislamiento de los ADNcs
correspondientes a la NCS y BBE de A. mexicana. El interés en
estas enzimas se debe a que participan en puntos claves de la
biosíntesis de ABis (Fig. 1.2; 1.3), los cuales nos permitirán
estudiar eventos relacionados con la formación de estos
compuestos.
3.2. MATERIALES Y MÉTODOS
3.2.1. Material biológico
Plantas de A. mexicana, con flores y cápsulas, fueron

colectadas en poblaciones silvestres localizadas en los
alrededores de la ciudad de Mérida (20°58'00" N/89°37'00" 0),
en el estado de Yucatán. Una vez identificadas, fueron
transportadas al laboratorio en bolsas de polietileno,
conservadas en hielo. Las plantas fueron lavadas con agua fría
y divididas en hojas, tallos, raíces, flores y frutos (cápsulas)
mismos que se congelaron y se conservaron a -80°C hasta su
utilización.
3.2.2. Extracción de ARN
La extracción del ARN total se realizó a partir de 1.0 g de tejido

utilizando N2 líquido. La extracción se hizo con el reactivo Trizol
de acuerdo a las modificaciones publicadas (Rubio-Piña y
Vázquez-Fiota, 2008, Anexo 1).
53
3.2.3. Amplificación de los fragmentos de ADNc de la NCS
y BBE a partir de retrotranscritos (RT-PCR}
La síntesis de ADNc se realizó por transcripción reversa
utilizando como molde 5l-Jg de ARN total de diferentes tejidos
(ver resultados), 1O l-JM de oligo-d(T) y (1 O U/l-JI) de
transcriptasa reversa (M-MLV; lnvitrogen), de acuerdo a las
instrucciones del proveedor. El ADN de cadena sencilla así
formado fue sometido a la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) para el aislamiento de los ADNcs parciales
correspondientes a la NCS y la BBE. Se utilizaron 1O l-JM de
cebadores específicos (Cuadro 3.1) y (0.5 U/l-JI) de Taq ADN
polimerasa (lnvitrogen). El producto esperado para la NCS
correspondía a un fragmento de 305 pb utilizando los
cebadores NCSF y NCSR (Cuadro 3.1 ). El programa consistió
en 30 ciclos con etapas de 30s cada una a 94 y 50°C, y de 1
min a 72°C, para la desnaturalización, alineamiento y
amplificación, respectivamente, precedidos por una etapa de 3
oc
m in a 94 y finalizado con otra de 1O m in a 72°C.
Los productos esperados utilizando los cebadores diseñados

para la BBE correspondieron a 390, 1107 y 1125 pb, para las
combinaciones b-e, b-d y a-e respectivamente (Fig. 3.1 ). El
programa consistió de 30 ciclos con dos etapas de 30 s cada
una a 94 y 60°C, y una de 1.5 min a 72°C, para la
desnaturalización, alineamiento y amplificación, precedidos por
una etapa de 3 m in a 94 oc y finalizado con otra de 1O m in a
72°C.
Por último, se diseñaron cebadores para amplificar un
fragmento de 467 pb del ADNc de la actina, con los cebadores
ACTF y ACTR (Cuadro 3.1 ). El programa consistió de 30 ciclos
de dos etapas de 30 s cada una a 94 y 60°C y una de 1 min a
72°C, para la desnaturalización, alineamiento y amplificación,
respectivamente, precedido por una etapa de 3 m in a 94 oc y
finalizado con otra de 1O m in a 72°C.
54
Cuadro 3.1. Cebadores empleados para la amplificación de los ADNc
parciales de la NCS y de la BBE en Argemone mexicana.
Cebador Secuencias 5' ~3 · Referencia<'>
NCSF GGIGATGGAGGTGTIGGTAC NC5-P.s (AY860500; 280 pb)
NCSR GAGATGACTICTGCCATGG NC5-P.s (AY860500; 590 pb)
BBEF1(a) TGGACTATAAGATIAAGAAGTGGTGG BBE-E.c (565550; 280 pb}
BBEF2 (b) AGTGGTGGTCATAGTIATGAAGGGTI BBE-E.c (565550; 300 pb)
BBER1(c) TGCACCCCAGACACCACC BBE-E.c (565550; 690 pb}
BBER2(d) CCAATCTATICTICCGAGAT BBE-E.c(565550; 1410 pb)
ACTF CACIACTACTGCTAAACGGGAAA Act- P.s (EB740770; 90 pb)
ACTR ACATCTGCTGGAAGGTGCTG Act-P.s (EB740770; 550 pb}
*Tomando como referencia las secuencias de P. somníferum y E.

calíforníca, para el diseño de cebadores
3.2.4. Amplificación de los extremos 5'y 3' por RACE

(Rapid Amplification of cONA Ends)
Para amplificar los extremos 5 • y 3 · de los ADNcs de la NCS y

BBE, se utilizó el estuche GeneRacer Kit (RLM-RACE,
lnvitrogen), la Figura 3.1 presenta el esquema general del
ensayo. Para la síntesis del ADNc de cadena sencilla se realizó
una reacción de transcripción reversa utilizando como molde 5
j.lg de ARN total de raíz, obtenido como ya se describió. El
oligoribonucleótido adaptador (5'-CGA CUG GAG CAC GAG GAC
ACU GAC AUG GAC UGA AGG AGU AGA AA-3') fue ligado al extremo
5 · de acuerdo a las instrucciones del fabricante y la síntesis de
ADNc se llevó a cabo utilizando como cebador el oligo-d(T)-
GeneRacer (5'-GCT GTC AAC GAT ACG CTA CGT AAC GGC ATG ACA
GTG (T)N-3'), según las indicaciones del proveedor. Con 0.5 !JI
de este producto se realizaron las amplificaciones por PCR
utilizando los cebadores GeneRacer-5'(5-CGA CTG GAG CAC
GAG GAC ACT GA-3), y GeneRacer-3' (5-GCT GTC AAC GAT ACG
CTA CGT AAC G-3), en combinación con los cebadores
específicos para la NCS y BBE, según el extremo a amplificar
55
(Cuadro 3.2). Para la PCR se utilizó la enzima Platinum Taq
DNA Polymarase High Fidelity (lnvitrogen) de acuerdo con las
especificaciones del GeneRacer Kit.
A Eatructura cap 6' Cola de poli A 3 '
ARNm m,Gop-p-p-- - - - - - - - - - - AAAAAAA
ARN oligo Gene Racer

A AAAAAA
••••••- ------------------~-- illllii -(N )~
+--------- Ollgo d(T) Gene Racer

Sfntesls de la primera cadena de ADNc Transcrlptasa Reversa
B
Amplificac ión del extremo 6'
--
Cebador 6 · Gene Racer
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - T T TTTTT-(Nhe
Primera cadena de ADNc - - Cebador especifico NCS, BBE
Amplificación del extremo 3'

Cebador eapecfftco NCS, BBE
_ _ _ _..____.::=:~~·- - - - -TITITTI-(NNNNNNNN)
Primera cadena de ADNc --
Cebador3' Gene Racer
Figura 3.1. A) Esquema utilizado para la síntesis de la primera cadena de

ADNc utilizando un oligorinobucleótido y un oligod(T) del estuche
GeneRacer (lnvitrogen). B) Proceso utilizado para la amplificación de los
extremos s· y 3' del ADNc de la NCS y BBE, utilizando cebadores del
GeneRacer y cebadores específicos para cada ADNc.
El programa utilizado para la amplificación de los extremos 5 · y

3, se realizó de acuerdo a las especificaciones del GeneRacer
Kit. Consistió de un ciclo de 2 min a 94°C; seguido de ·5 ciclos
de 30 s a 94°C y 1 min a 72°C. Posteriormente 5 ciclos de 30 s
a 94°C y 1 min a 70°C. Por último, se realizaron 25 ciclos de 30
s a 94°C; 30 s de las temperaturas de alineamiento de acuerdo
a los cebadores específicos (Cuadro 3.2) y 1 min a 68°C; se
finalizó con una extensión de 1O min a 68°C
56
Cuadro 3.2. Cebadores empleados para la amplificación de los extremos 5"
y 3" de la NCS y la BBE en Argemone mexicana .
Cebador Extremo Tm . Secuencias s·~3 ·

NCSF1 3" 65 TTTTCCCTCCAGGTGCTGTGCCC
NCSR1 5" 64 ACIGCACCTGGAGGGAAAACAAT
NCSR2 5" 65 TAACAACGGGGCACAGCACCTGG
BBEF1 3" 63 TTCATTAGGATTCACAGCAGGTTGG
BBER1 5" 64 ATCGGCTGCGAGACCGTATTT
Tm: Temperatura de alineamiento utilizada en el programa RACE
3.2.5. Clonación, secuenciac1on y análisis de los

fragmentos aislados
Los productos de la RT-PCR fueron resueltos en geles de

agarosa al 1% y teñidos con bromuro de etidio. Los fragmentos
fueron aislados del gel utilizando el estuche QIAEX 11 Gel
Extraction (QIAGEN lnc) y ligados al vector pGEM-T Easy
Vector System 11 (Promega), de acuerdo a las instrucciones del
proveedor. Con los plásmidos obtenidos se transformaron
células competentes E. coli (DH5a) (Stratagene, La Jolla CA)
(Sambrook et al., 1989). Las bacterias, conteniendo los
plásmidos e insertos, fueron seleccionadas en medio LB con
100 mg/L de ampicilina, 0.5 mM de isopropil ~-D-1-
thiogalactopiranósido (IPTG) y 1.6 mg de 5-bromo-4-cloro-3-
indolii-~-D-galactopiranósido (X-GAL). Las colonias bacterias
seleccionadas fueron cultivadas en medio LB liquido con 100
mg/L de ampicilina para multiplicar los plásmidos y éstos se
recuperaron por lisis alcalina (Sambrook et al., 1989), se
secuenciaron mediante el método de didesoxiribonucleótidos
marcados utilizando un secuenciador automático ABI PRISM™
31 O del servicio comercial (Macrogen; Seúl Corea), las
secuencias obtenidas fueron comparadas con las depositadas
en bases de datos del GenBank, utilizando el paquete BLAST
(Basic Local Alignment and Search Tool;
57
www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) (Aitschul et al., 1997). Para el
alineamiento de secuencias se utilizaron los programas
Multialin (http://bioinfo.genotoul.fr/multalin/multalin.html) y CLC
Main Workbench (CLCBio Software).
3.3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.3.1. Obtención de los ADNcs parciales de la

norcoclaurina sintasa (NCS) y la enzima formadora del
puente de la berberina (BBE) de Argemone mexicana
Para obtener las secuencias de los ADNcs correspondientes a

la NCS y BBE, se diseñaron cebadores (Cuadro 3.1) utilizando
las secuencias reportadas para diferentes especies (Papaver
somniferum, Eschscholzia californica, Berberís stolonifera y
Talictrum flavum). Estas secuencias presentan una identidad
de alrededor del 80% entre sí. Los cebadores se diseñaron
considerando el grado de conservación de las secuencias
analizadas, la temperatura de desnaturalización (Tm) y el
tamaño del producto esperado (Fig. 3.2). Para la NCS los
cebadores sentido y antisentido correspondieron a las
secuencias localizadas entre los aminoácidos 86 y 187, en
tanto que para la BBE fueron entre los aminoácidos 99, 228 y
4 75, tomando como base la secuencia de P. somniferum en
ambos casos
La amplificación de los ADNcs parciales se llevó a cabo
utilizando la metodología de RT-PCR a partir de ARN total de la
raíz de A. mexicana y los cebadores ya descritos. Se lograron
amplificar los fragmentos con los tamaños esperados,
utilizando el ADNc de raíz en ambos casos (Fig. 3.3). Para la
NCS, se obtuvo un ADNc de 305 pb, mientras que para la BBE
los productos fueron de 390, 1107 y 1125 pb. De igual modo,
como control positivo se logró la amplificación de un fragmento
de 467 pb del ADNc de la actina.
58
A
... ...
... ...
[::::J NCS P.o ... ...
-NCSAm
B BBE
P . sorm iferum E!WTIRLRSGGH
E.califomica G,; WTI RLRSGGH
B .stolonifera G,WTIRLRSGGH
T .flavum G WTIRLRSGGH
Consensus GSWT 1 RLRSGGH '
a.a.
99 a .a. 475a.a .
Fig. 3.2. Secuencias de aminoácidos conservados de la NCS (A) y BBE (B)

que se emplearon como base para el diseño de cebadores y el aislamiento
de los fragmentos de ADNc correspondientes. Las líneas punteadas indican
las regiones consideradas tomando como base la secuencia de Papaver
somniferum. Los recuadros señalan las diferencias de aminoácidos .
NCS BBE
A B
1000pb
300pb
Fig. 3.3. Amplificación de los ADNcs parciales correspondientes a la NCS

(A) y BBE (B) por RT-PCR. En B; los carriles: 1, 2, 3 y 4 corresponden a
combinaciones de los cebadores b-e (390pb}; b-d (1107 pb}; a-d (1125 pb);
y ACTF-ACTR (467pb), respectivamente (Cuadro 3.1 ).
59
El análisis de 30 clonas conteniendo los ADNc parciales de la
NCS reveló dos secuencias, con un 85 % de identidad entre sí
(Fig. 3.4A). Las secuencias de nucleótidos se denominaron
NCSAm1 y NCSAm2, las cuales tienen un tamaño de 305 pb,
correspondiendo a un marco de lectura de 101 aminoácidos
deducidos
Por su parte, el análisis de 20 clonas conteniendo los diferentes
ADNcs parciales de la 88E (Fig. 3.38), correspondieron a una
sola secuencia (Fig. 3.48). La secuencia única se nombró
88EAm1 de 1125 pb, la cual correspondió a un marco de
lectura de 375 aminoácidos deducidos.
Las secuencias obtenidas, tanto para la NCS y la 88E se

compararon con las depositadas en base de datos del
Gen8ank, utilizando el programa 8.LAST (Aitschul et al., 1997).
La comparación de las secuencias de aminoácidos de la
NCSAm1, NCSAm2 y 88EAm1 reveló una identidad
significativa con otras secuencias ya reportadas en P.
somniferum, E. californica y T. f/avum, en ambos casos
(Liscombe et al., 2005).
60
~ ~
. 1 1
A NCSAm1 GDGGVGTVLD 1VFPPGAVPRCYKEKF 1Ñ 1 NKKRLKEV 1M 1EGGYLOMGCT 51
NCSAm2 GDGGVGTVLDIVFPPGAVPR~YKEKFVKINN~KRLKEVIMIEGGYLOMGCT 51
Coo~n~ sGOGGVGTV L DIVFPPGAVPR'YKEKF''I'N"KRLKEVIMIEGGYLOMGCT
60 80 ·100
1 1 1
NCS.Ail\1 Y DR 1HV 1~KTPNSCV 1kss 1 1YDVK~EYAE~MSKL 1TT 1 PLKSMAEV 1 101
NCSAm2 SYriDR 1HV'LEKTPNSCV 1ESS 1 1YEVK~EYADEMSKL 1TT PLKSMAEV 1 101
Coo~nsu s ' Y' DRIHV' 'KTPNSCVI'SSIIY'VK'EYA' 'MSKLITT'PLKSMAEVI
20
1
B BBEAm1 WTIRLRSGGHSYEGLSYTADTPFVLIDLMNLNRISIOI
40 60
1 1
BBEAm1 DSETAWVESGA TLGELYYA 1TEL TDSLGFTAGWCPTVG
80 100
1 1
BBEAm1 SGGHISGGGFGMMSRKYGLAAONVEDVILIOSRGAILD
m 1~
1 1
BBEAm1 RKLMGEDVFWAVRGGGGGVWGAIYAWKIKLLPVPKKVT
1ro RO
1 1
BBEAm1 VFRVTKNVNIEEASFLIHKWQYVADELDDDFTVSILGG
~o m
1 1
BBEAm1 ANGNEVWVIFLGLHLGCKTVAKSI IDKKFPELGLIEEE
2co 2ro
1 1
BBEAm1 FLEMNWGESFAYLSGLKTVKELNNRFLKFODRAFKTKV
280 300
1 1
BBEAm1 DFTKETLPLEAIOGLLEILSKEPRGFIALNGFGGKMSK
no ~o
1 1
BBEAm1 ISNDFTPFPHRKGTKLMVEYIVAWSKDEESRSDEFFDW
360
1
BBEAm1 LRNIYDYMEMFVSKNPRVGYVNHIDLDLGRIDW
Figura. 3.4. Comparación de las secuencias de aminoácidos deducidos de

NCSAm1 y NCSAm2 (A). Secuencia de aminoácidos deducidos
correspondiente al ADNc parcial de la BBEAm (8). Los recuadros señalan
las diferencias de aminoácidos.
Análisis de la secuencia parcial de la NCS de Argemone

mexicana
La secuencias de aminoácidos deducidos de la NCSAm2

mostró un 86% de identidad con la región comprendida entre
los aminoácidos 86 y 186 de las dos NCS de P. somniferum
(Liscombe et al., 2005), y de un 60% con el tramo entre los
61
residuos 87 y 187 de T. flavum (Samanani et al., 2004) (Cuadro
3.3; Fig. 3.5). Por su parte, NCSAm1 presentó un 77% y 81%
de identidad con los tramos comprendidos entre los residuos
86 y 186 de las NCS 1 y NCS2 de P. somniferum
respectivamente (Liscombe et al., 2005) y un 58% con el tramo
entre los residuos 87 y 187 de la de T. flavum (Samanani et al.,
2004). Ninguna de las dos secuencias aisladas presentaron
identidad significativa con la NCS de C. japonica (Minami et al. ,
2007).
Cuadro 3.3. Porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos

deducidos de los ADNcs parciales de la norcoclaurina sintasa de Argemone
mexicana (NCSAm1 y NCSAm2) con otras especies (de res iduos de 86 a
186}
Secuencias Otras especies

de NCS1P.s NCS2P.s NCST.f NCSC.j
Argemone % identidad
NCSAm1 77 81 60
NCSAm2 86 87 58
NCS1 P.s, NCS2P.s (P. somniferum); NCSC.j (C. japonica) ; NCST.f (T.
flavum)
62
1111 1211 uo 1!0
1 1 1 1
NCSaml • • •GOGGVGTV LO 1VFPPGAVPRQyKEKF ltl ONK_KRL KEV Ul l EGGYLP.,GCUYLOR 1Hy 1~KT PNSCV 1KS S11 YDYK EY 81
NCS.A.rn~ • • • • GOGGVGTV LO 1VFPPGAVPR~YKEKFV 1HNEKRLKEV 1M 1EGGYLOMGCTSYMOR 1HHEKTPNSCV 15SS 11 YEVKi EY 81
P.somNCS~ OV I'E,GÑGGVGTV LO 1VFPPGAVpR.YKEKFVff 1~HEK~LKEV 1M 1EGGYLOMGC T~YMOR 1H FEKT PNSCV 1ES S11 YEVK EY 166
P.sornNCS1 OVI'AG~GGVGTVLOI,FP GAVPR~YK EKFVKIÍIHEKRLKEVVMI EGGYLOMGCTfYMORIH FEKTPNSC Yi'ESS IIY EVK EY 166
HavuroNCS E11 •GOGGVGT 1LDIITFXPGEFPHEYKEKF f LVONEHRL K~V QMI EGGYLOLGV T YMO I 1HVVPTGkDSCV 1KSSTEY~VKPEf 167
P.somPRIO DVVEG~GGLGTV L~~YY,P~GSVPLSYKEKFVTIIONHKRLKEVRQ 1EGG YL EMGCTF YMOSFQ 1LKKTHOSC T1RS 1TK YEVSAEL 127
CjapNCS Ell· GOGGEGS LOIITF PPGQFPH~ Y REKFVFFOHKNRYKLV EQ 1DGJ!.FFOLGV T~YMO T1RVYA GPDSC V1KSTTEYHVKfEf 163
Conseosus OV 1• GOGGVGTV LO 1VF PPGAVPR ' YKEKFV ' 1ONEKRLKEV 1M 1EGGYLOMGCT ' YMOR 1HV' EKT PNSCV 1' SS11 YEVK ' EY
Figura 3.5. Comparación de las secuencias de aminoácidos deducidos de

la NCSAm1 y NCSAm2 con las NCS reportadas para otras especies. El
alineamiento se realizó con secuencias correspondientes a la NCS1 de P.
somniferum (AAX56303.1); NCS2 de P. somniferum (AAX56304.1 ); T.
flavum (AAR22502.1) y C. japonica (BAF45337.1) El color azul representa
aminoácidos idénticos. Los recuadros señalan las diferencias de
aminoácidos.
Análisis de la secuencia parcial de la BBE de Argemone

mexicana
La secuencia de aminoácidos de la BBEAm1 (Cuadro 3.4; Fig.

3.6), mostró una identidad del 80% con el tramo comprendido
entre los residuos 99 y 473 de la BBE de P. somniferum
(Facchini et al, 1996), del 77% con el tramo entre los residuos
95 y 469 de la de E. californica (Dittrich y Kutchan, 1991 ), del
66% con el tramo entre los residuos 91 y 466 de B. stolonifera
(Chou et al., 1998) y del 65% con el tramo entre los residuos 92
y 467 de T. flavum (Samanani et al. , 2005). Es interesante
63
notar que BBEAm1 presentó un dominio RSSGHSYEGLS, de
unión a flavina, lo que coincide con su naturaleza de flavín-
oxidoreductasa (Dittrich y Kutchan, 1991; Facchini et al., 1996).
Cuadro 3.4. Porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos

deducidos del ADNc de la enzima formadora del puente de la berberina de
Argemone mexicana (BBEAm1) con otras especies .
Secuencias Otras especies

de Argemone ....,s=s=E=-=P:-.s-----,B=B=E=--=E:-.c----=s=-=s=-=E=--=8-
.s----=s=-=s=-=E=-=r:-:.f -
%identidad
BBEAm 79 77 67 65
BBEP.s (P. somniferum), BBEE.c (E. californica), BBEB.s (B. stolonifera) ,

BBET.f(T. flavum) .
64
"r ~f 'tr
9!16Aml •••••! . ••• •••Wflll
SOOHSYfOLS r'AO·f,,\1 IDLMNLNitiSliO '3*
~ 'AKPllfiKI'SPIV~POSK!I!li!ITVHCCTIIISWTIIt SOOHSYfOLS TAOTffV VDUMNLNltiSIDV 134
e 1r>0 'QttUIII(PS~IIVOSKIILII(TIIlCIIt~OSWflll ' SOOI.SYI!Ols TIOTP,ILIOU~NLNit~SIOL ~~
8~ l'ltra HIIPKtPIIPS~III.PQ.IK!fi.AAIVVCIMIIOLWTIIt SOO.HSYI!Oll . IIAIHffYVIOl,loiNLNitiSIO\ 1:'8
""" r'I'IICfr OP8VIILPIISIIOQ~AI! 1 CCTitOSWTIIl J·OOHSUOL ·S AOjfPrYIID~MNtNOISiO\ 1~
Cctlw<~M Hit' t• 'Kt$ " 11 LPOSKUl'!IT" ·CCT"'9SWYllt S<lqfiS.VIOL 'S 'fAPTPP'V ' 1 OUÍNLNitl SI DL
~lil' •
1 ' 1 1
tnj ~S!TAWVI!SCIATLOI!LYYA I Tfi:~DlLOPTAOWcP'rVOSOOHI SOOCIPOMNSilWYOLUONY:lD l'i. 1OÍ IDil
P lilm>l•~m UITAWVI$0ATI.OIIL V'tA IAQSiJOJi.Oflll>AOWCPTVOSOOHI SOOOPOMN$1ti(YOUAO!IVYDA: 1L 1OS ~05
E . 1M:1 IS!TAWYI!SOiTLOI!L.Y'rA 111!¡SSII(LG,fAOWCP 'ÍVOlOOHI SOOOfOii!MlRII'tOUADNYVOA ILIDA 2ó2
!l •slic TAWVUGA TLOI! hCA IUnOTLGPJGGYCpTVO. SOOH 1SOOOfOMNSRKYGUAONY DA_ ~ 1~DA 1
T~ OTOf,l.,-yUOATLOI! YHAIIIISSGJNA,I.AOJCPT.fGSOOHI AP.OGfOMJoo!SIU<YOLAADIIVVOA!oilYOA
COn.xi\SII'i • IITo\WYtU&TLOI!L VYAO!!S$0TLOPTAOWCI'TVOSOOHI $00010WISIU!,YOLAAONVVDo\ lll 011
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' !l'IQ lLUOftlSVL·OOAOIIS'O • WwL Tli!LO:PHI!GLIIU'AI<UPOJ,L;p.LGLYeiOrLI!MSWOUFAYLAOI,.'ff Q
8s~~~ ALI!OOFTLSYLAOAOTNO · JWPIFLOL~LG'KILAISIVOQNf'I!LNLYMI!OCIII!MSWYI!SFAIILAOLNI l~
l ~LI!OOfiL YLAG~HKOIIIWLTfLOLYLOI'KIL:AISJ'"KKfJIIILNLlLI!OCIII!MSWYI!ATAILAOLKI 3n
(01!1:1' IL I!DOnLS'Y l ·GOANGH • • 'WL. TtlOLH~GPK" 'Al(f•tOKK,I!LOL'YI!fO• LIMSWOUFA YLAOLI(T
'f . . f . ' .
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P ~-111'1 ' SILNNitfLKPDIIlMKTKYOHI(JI i'LN-PIHAUI!IL$10)0Gf' IAL!IOF'OGICMSII'STOffPU!Hiti< ~~q
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<l<lnwmm GT 'LMYU 1YAW•' '01!.' SKI' U:~OWLHK.PYOYM•PPVSKNPAVGYYNHI DLDL"OR l OW' NICTI 'SN•A 1
Figura 3.6. Comparación de la secuencia aminoácidos deducidos de la

BBEAm1 con las BBE reportadas para otras especies. El alineamiento se
realizó con secuencias correspondientes a la BBE de P. somniferum
(AAC61839.1), E californica (AAB20352.1); B. stolonifera (AAD17487.1); y
T. flavum (AAU20769.1 ). El recuadro indica el presunto dominio de unión a
flavina. Los recuadros señalan las diferencias de aminoácidos.
3.3.2. Amplificación de los extremos 5'y 3' de la NCS y BBE

por RACE (Rapid Amplification of cONA Ends)
Una vez obtenidos los ADNcs parciales para la NCS y BBE de

A. mexicana, se procedió al aislamiento de los extremos 5' y 3'
de ambas para obtener secuencias completas. Para esto, se
65
diseñaron cebadores específicos tomando como base la
secuencia de los ADNcs aislados (Cuadro 3.2). Posteriormente,
se amplificaron por PCR las secuencias correspondientes,
utilizando como molde ADNc de raíz sintetizado de acuerdo
con las especificaciones del paquete GenRacer kit (Fig. 3.7).
A 5' 3'
NCS
300pb
B
BBE
600pb
-
Figura 3.7. Amplificación de los extremos s· y 3' correspondientes a los
ADNcs de la NCS (A) y BBE (B) por RACE.
Las reacciones para la NCS generaron productos de tamaños

cercanos a los esperados (300 pb para el extremo 5' y 600pb
para el 3') (Fig. 3.7A). El análisis de estos productos mostró la
presencia de dos secuencias diferentes, tanto para los
extremos 5 ' y 3 '. Estos fragmentos clonados, se denominaron
pNCSAm1-5; pNCSAm1-3; pNCSAm2-5 y pNCSAm2-3, según
contuvieran los extremos correspondientes. Por otra parte, para
la BBE sólo se observó un producto para cada reacción.
Ambos tuvieron los tamaños esperados; 600 y 1200pb para los
66
extremos 5' y 3' respectivamente (Fig. 3.78). Estos fragmentos
clonados se denominaron p88EAm-5 y p88EAm-3.
La identificación de nucleótidos en los extremos y las
secuencias previamente aisladas permitieron la asignación de
la identidad de la NCSAm1 y NCSAm2 (Fig. 3.8 A y 8).
A 251 260 270 280 290 300

·--------+---------+---------+---------·---------1
- 57 GGGGRTGGAGGTGTTGGTRCTGTTC~R
6. ( 18jun7 GRRRRGCTRGRTGTGRTTGRGGGCRRTGGTGGTGTTGGRRCTGTTC T A
21jun7 GRRRRGCTRGRTGTGRTTGRGGGCRRTGGTGGTGTTGGRRCTGTtC T R
3· ( 111ar
211ar
301 310 320 330 340 350
l--------+---------·---------·---------·---------1
CRTTGTTTTCCCTCCRGGTGCTGTGCCCC TTGT RCRRRGRGRRRTTCR
- 57
6 . ( .18jun7 CRTTGTTTTCCCTCCRGGTGCTGTGCCCC TTGT R
2i.Jun7 CRTTGTTTTCCCTCCRGGTGCTGTGCCCC TTGT A
3. ( 1"ar TTTTCCCTCCAGGTGCTGTGCCCC TTGT RCAAAGRGARATTCA
2"ar TTTTCCCTCCAGGTGCTGTGCCCC TTGT ACRARGRGRRATTCR
B 251 260 270 280 290 300

·--------+---------+---------·---------+---------1
55 GGGGRTGGRGGTGTTGGTRCTGTTC~
6. [ 25jun GRRRRGTTRGRTGTGRTCGRGGGCRRTGGTGGTGTTGGRRCTGTTC C R
26Jun GRRRRGTTRGRTGTGRTCGRGGGCRRTGGTGGTGTTGGRRCTGTTC C
3. [ 261iay
27Hay
-
301 310 320 330 340 350
55
1--------+---------·---------·---------+---------l
CRTTGTTTTCCCTCCAGGTGCGGTGCCCgRRGRCRAGGAGRRRTTTG
25Jun CRTTGTTTTCCCTCCRGGTGCCGT
26Jun CRTTGTTTTCCCTCCRGGTGCCGT
26Hay TTTTCCCTCCRGGTGCTGTGCCC RGR CRRGGRGRRRTTTG
27Hay TTTTCCCTCCRGGTGCTGTGCCC RRGR CRAGGRGRRRTTTG
Figura 3.8. Empalme de las secuencias de la NCSAm1 (A) y de la NCSAm2

(B). Las flechas señalan las secuencias internas obtenidas previamente, y
los corchetes los productos de las reacciones 5'-RACE y 3'-RACE de las
NCS de A. mexicana. Los recuadros indican los nucleótidos
correspondientes a las secuencias comunes.
El empalme de las secuencias parciales de la NCSAm1 y

NCSAm2 con sus respectivos extremos permitió identificar las
secuencias completas, las cuales fueron de 1035 y 927 pb
respectivamente (Fig. 3.9).
67
,. ..
:
1 1 1
~~:::~~:~~~:~~:~ ~~:~~:~~~~::::::~:~~:~~~~~: ~g~:~~i~i:::~i:

NCSAm1
..
NCSAm2
Co nsens us ATCAAATCATCTATCAT • TACOACOTOAAAAAAOAOTATQ • COA • ocTATOTCTAAA • TA
1 1 1
NCSAm1 AT ~ ACAACCA~ACC~TTOAAATC ~ATOTC ~ OAAO ~ CATCOCTAATTACOTTCTTAAOAA~ 120
NCSAm2 AT m ACAACCPCACC.TTGAAATCCATOTCQCAAOACATCOCTAATTACOTTCTTAAOAA~ 119
Conse1s us AT•ACAAcc •• AcC • TTOAAATC•ATOTC•oAAO•cATCOCTAATTACOTTCTTAAOAA•
'"" 1 1 1
~::~~~~~~~::~:::~~~:~~~:6:~:i~::~i~~::~i:~6::~:i6:~6i~:ii6:
NCSAm1 160
NCSAm2 179
Consensus CAATCTOT•ATAAQ • AAOQ • AOTTACATATOAATTOOAAOTACCA • CATCAOCTOATTCA
200
1 1 1
NCSAm1 ATTTOOOCAOTTTAtiAGTTCACCCAACATTCCTACACTTCTAAOAOATGTTCTACTTCCT ~O
NCSAm2 ATTTOOOCAOTTTA~AGTTCACCCAACATTCCTACACTTCTAAOAOATGTTCTACTTCCT ~9
...
Consensus ATTTGOOC AOT TTA * AOTTCAC CCAA CATTC CT A CA CTTCT AA CA OATOTTCT AC TTC CT
1 1 1
~~~~~~~~~~::::~o~:~:~~~~:~~~:~~~~::~~~~~~~~~~~~::~~~~~~~ ~~:~
NCSAm 1 300
NCSAm2 299
Consensus OOTOTTTTTOAAAAO . TAOATOTOAT • oAOOOCAATOOTOOTOTTOOAACTOTTCT '"' OAC
NCSAm1 360
NCSAm2 359
Consens us
1 """1 1
~g~~ ::~a:~::~~~=~~::::~::~~=:~~:~~=~~~::~~~~~!~: ~~:~:~:~~~~:~~e:~~

Consensus AAC * AOAAO • O "' TTAAAAOAAOT .. ATTATOATCOAAOO• OC""* A .. TTAOACATOOOATO,...
1 1 ""'1
:~:~e~~:~-~~~:~:~~: ~~~:~~~::~:~:~::::~ct~~~::~ ~~ ~~~~~~ ~: ~~::: :~~
NCSAm1
NCSAm2
consensus
1
.,.
ACAT * TTAC • TQQA•AQOATCCATOT~ • T•a•aAAAAC*CCTAA•Tc*TOTOT*AT""*AA
1 1
NCSAm1 TCJ:TCTAT jfATTTACOA l:; OTOAAA'A;AAOACTATCCQ:OA O;li:TATOTCTAA-. -TAATCACA !540
NCSAm2 TCOTC0ATTATTTACOA40TOAAA AAAOAOTATCC ~ OA ~ O·MATOTCTAA~ TAATCACA ~9
Consens us TC • TC .. AT • ATTTACOA · OTOAAA "'AAOAOTATOC • cA ... O .... ATOTCTAA • • TAATCACA
000
1 1 1
NCSAm1 ACC ~ TACCTTTOAAATCCATOTC ~OAAOT ~ATCOCTAATTACOTTCT 6 AAOAA m cAAT ~ 000
NCSAm2 AC C0,TACCATTOAAATCCATCTCACAAOT ¡T'ATCOCTAATTACOTTCT AAOAA~CAATTC 599
Consensus ACC*TACC"'TTOAAATCCATOTC .. OAAOT"'ATCOCTAATTACOTTCT*AAOAA • cAAT"" ..
NCSAm1
1 ""1
CICAciTTT ATACTTCACCCAACATTCCTACAA TT CT CAO'iio~ T'iiT \"¡ CT OC:TTCC Í'i OOTOT T 720
1
NCSAm2 TOTTAT OTT:rG~T:_ A C g-T TOOi1"_1ATTCTCjlO O~T~T A) CTO ~ TT A C OOTCTT 701

Consensus o •'" • "' TTATAOTT "'"' •,.. '"A,.. C'"' • y • • • "' "''"' ATTCTC • o• O • T "' T"' CTO "' TT ,.. C .. OOTOTT
NCSAm1 780
NCSAm2 73~
Consensus
NCSAmt 840
NCSAm2 780
1 1
...
Consensus TCCCATCCAOOTA.ATTC '"'A ... o• A"' '"'A"' TA .. TT '"' TTT • CA'"' T"' TA •"' "' T • .. '"'TT"' • AT "' ""'
1
NCSAm1
NCSAm2 :~CAOCATACTAO~::~~:~~:~o::~~ É ~:;ATAOT~~~~O~~::~:~~~:::~~~~~~ 900
02e
Con sens us ATCACCATACTA . TAAC•ATOQ••AATT•c•"'ATAOTTC"'O*T ••• To • T • A•A."'•TTC •
NCSAm1 960
NCSAm2 864
Co nsens us
NCSAm1
1 1
dAAT ~ TAOXTT C AA ~ AATAA ~A~ATAA ~ TAA ~ACTATAe T o ~ AT TTT T TTO TTOCAA 1020
....
1
NCSAm 2 j] ATJSTAT TAA09,AAT~AOATTAA~ATAA ~ TAAAAAT.@TAc.-0C~ AA• • .... • • • • • ·AA 912

Consensus OAAT '" TA '"' •T ••"'"' A.A •• J4. • • • • • A.•ATAA'"'TAA"'A * T*TA.••o•A•TTTTTTOTTOCAA
NCSAm1 AAAAA.AAAAAAAAAA 1035

NCSAm2 AAAAAAAAAAAAAAA 927
Consensus AAAAAAAAAAAAAAA
Figura 3.9. Comparación de las secuencias de nucleótidos de la NCSAm1 y

NCSAm2 de Argemone mexicana. Los recuadros señalan las diferencias de
nucleótidos.
68
La clonación y análisis de los productos de las reacciones para
los extremos de la BBE revelaron la existencia de dos
secuencias diferentes, tanto para los extremos 5' como 3' (Fig.
3.1O). En ambos casos, las secuencias correspondieron a las
reportadas para otras BBE; sin embargo, estas diferencias
permitieron asignar identidades a dos posibles isoformas
denominadas BBEAm1 , (presuntamente aislada previamente),
y otra que designó como BBEAm2.
A
6"
3"
- ,..,
(
(
481
1
490 500 510 520
B8E8ft CTTGGIIGAACTCTRTTRTGCTRTCACTGRGTTGRCTGATTCRi
2Rll!l CTTGGAGIIACTCTRTTRTGCTRTCRCTGIIGllGRCTGATTCR TRG
37"11!1 CTTGGAGARCTCTRTTRTGCTRTCRCTGIIGTTGRCTGATTCII T
1abr
...
TTCR T
TTCR
530· 540
TlCRCfiGCRGGT
rrTCRCRGCRGG'T
TTCACRGCAGG'T
TTCRCAGCfiGGT
TTCRCRGCRGGl
1
-
550 560 570 580 590 &00
- - - -·- - - - - - 1
BBEatt GTCRTRTRRC¡l'GG TGGTGGTtTCGGTATGRlGTCG
2ttay GGGTCAlliTARGTGGTGGTGGTTTCGGTA TGRTG TCG
6"
[ 37itay
1abl-
TCRTRTAAGTGGTGGTGGTTTCGGTATGRTGTCG
TCAlATAAGTGGTGGTGGTTTCGGTRTGATGTCG
3"
[ 9abr """"._,......-TCRTRTARGTGGTGGTGGTTTCGGTATGATGTCG
B
481 490 500 510 520 530 540
6" ·-( BBEatt

41Aay
4ttay
1 ·-+----~---
CTTGGAGAACTCTATTATGCTATCACTGIIGTTGRCTGATTCR 1
GTTGGAGARCTCTRTTRCGCARlCAGTGAGTCARCTGRTTCR TCG TTCRCIIGCfiGGT
GTTGGAGARCTCTRTTRCGCARTCAGTGAGTCRRCTGATTCA TCG TTCRCRGCRGGT
1
TTCACAllCAGGT
3"
( 16abr
20.
TTCR TRG lTCACfiGCfiGGT
TT TTCACfiGCAGGl
6"
3"
- ( 4~
BBEatt
.._
[ 2o.br
16abr
-=~*
550 560 570
-·
580 5SO
TCRTRTRAGTGGTGGTGGTTTCGGTRTGRTG 1
TCG
RTRTAAGTGGTGGTGGTTTCGGTRTGRTGTCG
600
;r,GTCATATAACTr.GTGr.Tr.r.TTTr.r.r.TATr.ATr.Tr.r.
TCRTRTIIAGJ'GGTGGTGGTTTCGGTRTGRTGTCG
TCRlRTRRGTGGTGGTGGTTTCGGTRTGRTGTCG
Figura 3.10. Empalme de las secuencias de la BBEAm1 (A) y de la

BBEAm2 (B). La flecha señala la secuencia interna obtenidas previamente,
y los corchetes los productos de las reacciones 5'-RACE y 3'-RACE de las
BBE de A mexicana. Los recuadros indican los nucleótidos
correspondientes a las secuencias comunes.
El empalme de los productos de las reacciones de RACE con

la secuencia parcial, previamente aislada, permitió disponer de
las secuencias completas con tamaños de 1771 y 1718 pb para
la BBEAm1 y BBEAm2, respectivamente (Fig. 3.11 ).
69
.,
1
.,
1
.
1
8BEAm1 A CC T TTGAA TGC T TACT ACTGT AACCA TGGAAAC'CAAAATCACCAAAAA 1 TC TACT CA TC TT TGTT CATC
BBEAtn:l A ~ C CTTTGAAT G CTTACTAC TGTAACCATGGAAAtiAAAATCACCAAAAAT TCTACTCATCTTTOTTCATC TTCTT TCTGTGC a$
AACCT T T GA A TGCT T ACT AC TGT AACCATGGAAAC • AAAA TCACCAAAAAT • TC TACTCA TCTTTGTTCATCATCATCTTCT TCTTCTTCT T • TC TGTGC
IZ
' 1 1 1 1
BBEA.m1 T AACA TGCGCACT AAGTGATGA TA TCTT A TCA TGTTT AACT TCA.U, TGGAGTTCA TAACT A TACT ACACCATCA TCCGATTCAAA TTCTGA T TACC TT AG 1911
BBEAtn:l 1 AACA TGCGCACT AAGTGATGA 1 A TCTT A TCATGTTT AACTTCAAA TGGAGT TCA TAACT AT ACT ACACCATCA TC(I'GA TTCAAA TTCTGA T T ACC TT AG 185
eon......, 1 AACA TGCGCACT AAGTGATGA T A TCTT A TCA TGTTT AACT TCAAA TGGAGTTCA T AACT Al AC TACACCA TCATC • OA TTCAAATTCTGA TT ACCTT AG
1 1 "'
1 "'
1 ,.,
1
BBEAm1 ATTA T¡i"TCACC TCTCCA T CAAAACCCAT r A T T AAAAATCÍACAA T ATCAAAACeOTCiiCT AA reo TAT T ACec:CoT AACAAAOAAGAOT T A TC~AAi:f m
BBEAtn:l ATTA T TCACCTCTCCA T CAAAACeCAT T A T T"AAAAATC~ACAA T ATeAAAACeGTC,CT AA reo T ATT ACCCI_G T AAeAAAGAAGAGT T A TCQAA 285
ATTA T • TCACeTeTCCA T " CAAAACeCAT T ATT • • AAAAATC • ACAAT ATCAAAACCGTC • CT AA TCGT ATT ACCC • GT AACAAAGAAGAGT T ATC • AA •
1 1 "'
1 1
BBEAm1 ACCGTTAGA TG TTGCACAAGAGGA TC' TGGACCATT AGATT AAGAAGTGGTGC TCA T AGT T ATGAAGGA TT A TC{t T A T ACCGCAGAT ACAeCAT T TGTTC 3~
1
BBEAtn:l A eCO T T AGA TO TTGCACAAGAGGA TC TGGACCAT T AGATT AAGAAGTGGTGG TCAT AGT 1 ATGAAGGA TT A Te T A T ACCGeAGA T ACAeeAT TTGTTe 385
...
ACCGTTAOATO TTGCACAAGAGGATC • TGGACCATT AGA TT AAGAAGTGOTQOTCAT AOTT ATOAAOOA TT A TC • T A T ACCGCAOAT ACAeCATT TOTTC
1 1 1 1 1
BBEAm1
BBEAtn:l +:
~ ~: ~ :~: ~~~!: ~~:: +~~~:: ~~~~: +~ i~~: ii~: ~:~:~+~:~:::~:~~ ~+~~~+~~:: i~~~~~~g::~::++~~:~::g~gi: ii:~~g¡: ~ :::
1
...
1
...
TTATAGATTT • ATOAATTTGAATCGGATTTCTATTOATAT "GA • TCAGAAACAGCTTGOOTTGAATC"OGTOCAACA" TTGOAGAACTCTATTA • oc· AT
1 1 1
BBEAml CA'CTGAG TflACTGA T TCATT AGOA T TCACAGCAGGT TGGToeec T AeTOT TOO TA. TGGGGG TCA T AT AAGTGGTGG TGG T T TCGG T A TGA TG T CGAGA 589
BBEAtn:l CAQTGAG T ACTGA TTCAT T,GGGA TTCACAGCAGGT TGGTG CC T ACTGT TGG TA:C:TGGGGGTCA T A T AAGTGOTOOTGGT T TCGG 1 A TOA TG T CGAOA 585
ConltiiSUI CA • TOAG T • • AC TOA TTCAT T • OGA TTCACAGeAGGT TGGTO • CC T ACTOT TGG TA • TGGOGG TCA T A T AAOTGGTGOTGGT TTCGG TATG A TG T CGAGA
1 1 •1 *1 m1
BBEAtnl AAA T ACGGTCTCOCAGeeGA T AAeGTCGAAGA TGTÓAT TCT T A T ,_GA T AGT AAiGGTGCIATTC T AGA TCGT AAA ~ T AA TGGG TGAAOACGT TT T TTGGG M9
BBEAtn:l AAAT ACGGTeTCGCAGCeGAT AAeGTeGAAGATGTJ:A T TCT T A TAGA TAGT AA~OGTGCW,A TTC T AGA TeOT AAA, T AATGGGTGAAGACO T T T T T TGOG 685
AAA T ACGGTe TCGCAGCCOA TAACGTCGAAOATOT • A TTCTT ATAGATAOT AA • GGTOC • ATTCT AGA TCGT AAA • T AA TGGOTGAAOACGT TTT T TGGG
"'
1 1 1 "'
1
88EAm1 CGO T TeGCGO TOO TGGAGOTGO TG TTTGGGGTGeAA T T TACGCO TGGAAAA TCAAA TT AT T AeCeG TTCeAAAAAAGGTGAeGG T TT TTCGCGT AA i: GAA 791
BBEAtn:l CGGT TeGJjGG TGGTGGAGG TGG TG TT TGGGGTGCAAT TT lCGCG TGGAAAA TCAAATT Al TACCCG rteCAAAAAAGGTGACGGT TT T TCG CG T AAfrGAA 7a.5
..1
COOT reo· GGTGO TGGAGOTGG TG TTTGGOGTGeAAT TT AeGCOTGGAAAATCAAATT AT T ACCCO TTeCAAAAAAOGTGAeGGTTT TTCGCGT AA • GAA
"'
1 ...
1 1 1
BSEAm1 AAAeO T AAAT ATeGAAGAAGC T TeA TTT T T AATTCACAAATGOCAA TA TOT TGeAGA TOAACT AOA TGA TGA T T TJ ACtGT Af. CGA T TCTCGG:fGO TOCe 8~
1
BBEAtn:l AAAeG T AAAT ATCOAAGAAGC T T CATTT T T AAT T eACAAA TGOCAA TATGT TGCAOATGAA T T AGA TOA TOA T T T:G_AC GT A.:CGA T TCTCGGCGG TOCC 885
AAACG T AAAT ATCGAAGAAGCTTCATTT T T AA T TCACAAATGGCAA TATGT TGCAGATGAA • T AOA TOA TOA 1 T T • AC • Gl A • COA T TeTCGG • GG TGCC
~ 1~
1 1 1 1 1
SBEAm1 AA CGOAAACGIAGTGTGGlt ATATTCTT AGGTTTAeA TTTAGGATGTAAAACCGTTGCGAAATCTATAAT~GATAAAAA:GTTCCCGGAAT TAGGG TTAA m
- -
BBEAtn:l AACGGAAACGJlAGgATGGiiTAGTATTCTTAGGTTTACA TTTAGGA TGTAAAACCGTTGCGAAATeTAT AATIGATAAAA tGTTCCCGGAAT TAG GG TTAA 085
AACGGAAAeG • AG • • TOO • T • • T A TTeTT AGGTTTAeA TTT AGGA TGT AAAACCG TTGCGAAA TCT Al AA T • GAT AAAA • OT TeeCGO,.ATT AGGOTT AA
1 1 1 1
BSEAtn1 l(!OAGGAAGAATTT TTGGAAA TGAATT GGGOTGAA TC TTTGCTT ACTT ATCAGGATT AAAAAeAOTT AAOOAA TTOAA-eAA T AG O T T TTTGAAA[T TTOA 11m
BBEAtn:l T 'OA~GAAOAA TTT TTGGAAA TOAATTGGGGTGAA Te TTTGCTT ACTT A TCAGGATT AAAAACAG TT AAGGAA TTGAAJAA T AGO T T TTTGAAA ~ T TOA 1015
T • OA • GAAGAATT T TTGGAAA TGAATTOGGGTOAATe • TTTGeTT AeTT ATCAGOATT AAAAAeAOTT AAGOAA TTOAA • AA T AOO T T TTTOAAA • TTGA
~1
1 1 1 ""1
8SEAm1 T GAT AiAGCT T TT AAGACAAAAGT TOA TT TT AC T AAAGAAAeATT ACCA. TT A8AAGi:OATT8A TGGTTT AlTA GAGA T TTT A T CGAAAOAGCCACG TGGII 11tt
1
BBEAtn:l T GAT A@AOC T T TTAAGACAAAAO T TOA T T TT AC T AAAOAAACAT T ACCA T T A AAO OATT AA TOO TI T AT T AGAOA T TTT A TCOAAAOAGCCACO TOO~ 1185
TOAT A • AGCT T T T AAGACAAAAGT TGAT T TT ACT AAAGAAACATT ACCATT A • AAG • GATT • A TGOT • TAl T AOAGA TTTT A TCGAA~OAGCCACO TOO •
1220 1)40
1 1 1 1 1
88EAtn1 T TTATC GTTAAATiGT TT~GGAOGAAAAATGAGTAAAAT T AGTAA GATTTTAeTCCITTTeeTCATCGTA ~'QGGTA.CCAAATT A. TGGT GAATATA 129i
BBEAtn:l T TTATC GT TAAAT GTTTfGGAGGAAAAATGAGTAAAAT T AG T AA GATTTTAerccinreCTCATCGTAAJ¡GG T ACCAAATT~ATGG T GAATATA 1285
T T TATe • • GTT AAA T • GTT T • GGAGOAAAAATGAGTAAAATT AGT AA • OA TT TT ACTCe • TT TCC TCATCG T AA • GGT AeCAAATT • A TOGT • OAA TATA
1 ""
1 1 1
88EAm1 T AG T TGCTTGOAO T AAAGA TGAAGAA TCAAAGAGCGACGA.ATTCT T TGAT TGGT T ACOT AAT A T T T A OAT TATA TGOAA f.G T TCO T ATCGAAAAACCC 1Jtt
1
BBEAtn:l T AOT TfeTTGOAG T AAAGATGAAOAA TCAAAGAOCGACGAATTCT T TGAT TGG T T ACOT AAT A T T T A GAT TATA TOGAAG~G TTCG T A TCGAAAA A CCC 1385
T AOTT • CTTGQAG T AAAGATOAAOAATCAAAGAOCOACGAATTCTT TOA. T TGOT T AeOT AAT A T TT A • GATT A T ATOGAA • • GTTCO TATeGAAAAACCC
8BEAm1
1 1 1 1 1 ""
AGAG TGGGT TATO TT AAT,dA T A T TGATC TTGA TCTCGGAOGAA T AGAT TGGAG TIA f •AAAAA T AGTTCT AACAA ro ceA TTGAGA T TGC ~,A GAAA TTGG 1-49V
- - - - -
BBEAtn:l AGAG TGGGT TATO TT AA TAA T A T TGATC TTGA TCTCGOAOG.U T AGAT TGGAG TAAgAAAAA T AGTTeT AA AATOe i'AT TGAGA T TGC GAAA TTGG 1415
• AOAO TGGGT TATO TT AAT • Al AT TOA TC TTGATCTCGGAGOAAT AOATTGGAOT • A • AAAAA TAO TTeTAA • AATGC • A T TGAGA T TGC • AGAAA TTGO
1 1 1 1 1
BSEAm1 GG TGAAAAA T A T TT T T TATe AAA T T A TGAACOT TT AA TT AOGGC T AAAACAT TOA T TGATCCT AA T AA TITT T T T AA TCA TCCACAfJ'AGT A T AC C TC CAA 159V
BBEAm2 GOTGAAAAATATT T TTT ATCAAA T TATGAACG TT TAATTAGGGCTAAAACATTOA TTGATCCT AATAAT TTTTTAATCA T CCACA l AGT ATAC C TCCAA 1585
Consensus GO TOAAAAAT ATT T TTT ATeAAAT T ATGAACGTT T AA T T AGGGC T AAAACATTGA TTOATCCT AA T AA T • Tl 1 T T AA TeA tecA.eA • AGT A T ACCTCCAA
1CO 10«:1 •• ll'OO
1 1 1 1 1
BBEAm1 T GA TGAAA T~T T,A T AA TGT TGA TOA TGAGAAAA,TTTGAAG T TAC A TG~TGA TeAAOGAAATGT AAT T T TT T ~A • ••• TTG T AATT T AAT AAAT T ATTA 16DS
BBEAtn:l TGA TGAAATTiT,IATAATGTTGATGATGAG .... • TTTGAAOTTA • TG.fiTGATCAAGGAAATOTACTTTTTT AAT1ATTGT AATTTAATAAATTAT& G.I 187i
Conttnws TGA TGAAAT • T • ATAATG TT GATOATGAO" AAAATTTOAAGTTACATG" TGA TC AAGOAAATGTA • TTTTTT • AATTATTGTAATTTAATAAATTAJ• • •
1"'
88EAm1
BBEAtn:l
Con&ttl lü&
Figura 3.11. Comparación de las secuencias de nucleótidos de BBEAm1 y

BBEAm2 de A. mexicana. Los recuadros señalan las diferencias de
nucleótidos.
70
3.4. CONCLUSIONES
A partir del ARN de raíces de plantas maduras fue posible

obtener las secuencias completas de ADNcs correspondientes
a la NCS y la BBE de Argemone mexicana. Esta información se
obtuvo en dos etapas. En la primera, basados en secuencias
internas, conservadas para ambas enzimas en diferentes
especies, se diseñaron cebadores que permitieron aislar los
fragmentos específicos para las enzimas de A. mexicana. Con
dichas secuencias se diseñaron otros cebadores que
permitieron el aislamiento de los extremos 5, y 3,, por medio de
reacciones de RACE. Tanto para la NCS como la BBE se
lograron identificar dos isoformas con identidades entre sí
mayores del 70 y 90%, respectivamente y con una identidad
cercana al 80% con otras especies, como P. somniferum y E.
californica. Estos ADNc podrán usarse como sondas
moleculares para los siguientes estudios sobre la expresión de
los genes correspondientes en diferentes tejidos y condiciones.
3.5. REFERENCIAS
Altschul, A. , F. Stephen, T. Madden, A. Shaffer, J. Zhang, W.

Zhang, W. Miller, and D. Lipman (1997) Gapped BLAST and
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71
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Molecular characterization of berberine bridge enzyme genes
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Liscombe, D.K., B.P. Macleod, N. Loukanina, O. Nandi, and

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72
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Laboratory Manual. 3nd ed. Cold Spring Harbour Laboratory
Press, p. 215.
73
74
CAPITULO 4
CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE LA
NORCOCLAURINA SINTASA (NCS) Y LA ENZIMA
FORMADORA DEL PUENTE DE LA BERBERINA
(BBE) EN Argemone mexicana
4.1. INTRODUCCIÓN
Argemone mexicana (Papaveracea) es una planta utilizada en

la medicina tradicional para el tratamiento de diversas
afecciones. La presencia de alcaloides del tipo
bencilisoquinonolínico (ABis), como las benzofenantridinas
(sanguinarina) y protoberberinas (berberina), podrían explicar
las propiedades medicinales que se les atribuye (Chang et al. ,
2003; Willcox et al., 2007; Sánchez-Mendoza et al., 2008). Los
ABis, son compuestos con una distribución taxonómica
restringida que incluye cinco familias, entre ellas a las
Papaveraceas. En las plantas que los producen, algunos de
estos alcaloides participan en interacciones de defensa contra
herbívoros y patógenos debido a su actividad biológica
(Liscombe y Facchini, 2008).
Los diferentes ABis presentan patrones de distribución
característicos a través de los distintos tejidos de las plantas
que los producen. Por ejemplo, la sanguinarina es un alcaloide
que solamente se encuentra en las raíces, mientras que la
berberina se acumula principalmente, pero no de manera
exclusiva, en las partes aéreas (Facchini, 2001 ). La
acumulación de ciertos alcaloides en tejidos específicos puede
proporcionar claves acerca de sobre su función biológica. Más
aún, en P. somniferum y T. flavum los sitios de síntesis y
acumulación de los ABis pueden estar separados, tanto
temporal como espacialmente, formando una asociación
compleja (Samanani et al. 2005; 2006). De igual forma, la
biosíntesis de los ABis está controlada por el estado de
desarrollo y por factores ambientales (Facchini, 2001 ). Por
ejemplo, en P. somniferum la sanguinarina se encuentra sólo
75
en la raíz, mientras que la papaverina y la noscapina se han
detectado solamente en los órganos aéreos. En contraste, la
morfina y la codeína predominan en las partes aéreas, aunque
también se pueden encontrar en bajas cantidades en la raíz
(Huang and Kutchan, 2000). Más aún, estos alcaloides se
encuentran presentes desde etapas muy tempranas del
desarrollo (Facchini et al., 1996; Huang y Kutchan, 2000). Por
otro lado, el análisis de expresión de los genes involucrados en
síntesis de estos alcaloides en los diferentes tejidos, vincula la
presencia de los transcritos con las de los alcaloides. No
obstante, existen algunas notables excepciones. Por ejemplo,
en T. flavum la expresión de los genes que participan en la
síntesis de berberina ocurre principalmente en el rizoma,
mientras que la mayor acumulación del alcaloide sucede en la
raíz. Esto sugiere que algunos intermediarios de la síntesis de
la berberina son transportados del rizoma a este tejido
(Samanani et al., 2002a; 2005).
El objetivo de este capítulo es caracterizar los ADNc
previamente aislados de la NCS y BBE (Capítulo 3), así como
utilizarlos como sondas moleculares para estudiar la relación
entre la expresión génica y el contenido de ABis en plántulas
en desarrollo y en plantas maduras de A. mexicana.
4.2 MATERIALES Y MÉTODOS
Las plantas con flores y cápsulas de A. mexicana, fueron

colectadas en poblaciones silvestres localizadas en la periferia
de la ciudad de Mérida. Una vez identificadas, fueron
transportadas al laboratorio en bolsas de polietileno,
conservadas en hielo y procesadas como se describió
(Capítulo 2), conservadas a -80° C hasta su utilización.
Para los análisis de plántulas en desarrollo, se extrajeron las
semillas de las cápsulas dehiscentes, se esterilizaron con
hipoclorito de sodio 20 % (v/v) por 15 min y germinadas en
76
cajas Petri, sobre papel toalla saturado con una solución de
100 mg/L de ácido giberélico (Sigma Chemical Co, USA), en
condiciones de oscuridad y a temperatura ambiente (Karlsson
et al., 2003). Después de aproximadamente cuatro semanas,
se detectó la emergencia de la radícula y dos semanas
después, las plántulas, de entre 1.0 y 1.5 cm, fueron
transferidas, a medio PC (Phillips y Collins, 1979), pH 7,
suplementado con 25 g/L de sacarosa, a 25°C y bajo luz
continua entre 40 y 50 ¡Jmol m·2 s·1, suministrado por lámparas
fluorescentes de 39 W.
La extracción del ARN total se realizó a partir de 1g de los

diferentes tejidos de A. mexicana, utilizando N2 líquido. La
extracción se hizo con el reactivo Trizol de acuerdo a las
modificaciones publicadas por Rubio-Piña y Vázquez-Fiota
(2008).
4.2.3. Extracción de ADN genómico
La extracción de ADN genómico se realizó a partir de 1.0 g de
tejido foliar, las muestras fueron procesadas con N2 líquido y se
aplico el método con el amortiguador de bromuro de
hexadeciltrimetilamonio {CTAB) (1.4 M NaCI, 100 mM Tris-HCI
pH 8, 20 mM EDTA, 2 % CTAB; 0.2 % 2-mercaptoetanol) de
acuerdo a Murray y Thompson (1980).
4.2.4. Análisis de la expresión génica de la NCS y BBE a
partir de retrotranscritos (RT-PCR)
La síntesis de ADNc se realizó por transcripción reversa

utilizando como molde 5 ¡Jg de ARN total, 1O !JM de oligo-d(T) y
1O U/ !JI de transcriptasa reversa (M-MLV; lnvitrogen), de
acuerdo a las instrucciones del proveedor. La amplificación de
los fragmentos de ADNc de la NCS y BBE se llevó a cabo por
PCR utilizando 1O IJM de los cebadores específicos (Cuadro
4.1) y 2.5 U/IJI de Taq ADN polimerasa (lnvitrogen). El
programa de PCR utilizado para la NCSAm1 como para la
77
NCSAm2 consistió de 30 ciclos con dos etapas de 30 s cada
una a 94 y 65°C y otra de 1 min a 72°C, para la
desnaturalización, alineamiento y amplificación
respectivamente, precedido por una etapa de 3 min a 94°C y
finalizado con otra de 1O m in a 72°C. El programa de PCR para
la BBEAm1 y BBEAm2 consistió de 30 ciclos con dos etapas
de 30 s cada una a 94 y 66°C y otra de 1 min a 72°C, para la
respectivamente, precedido por una etapa de desnaturalización
de 3 m in a 94 oc y finalizado con otra de extensión de 1O m in a
72°C. La amplificación del ADNc de actina fue utilizado como
control de carga y de amplificación de la RT-PCR. El programa
de PCR utilizado consistió de 30 ciclos con dos etapas de 30 s
cada una a 94 y 66°C y otra de 1 min a 72°C, para la
respectivamente, precedido por una etapa de 3 m in a 94 y oc
finalizado con otra de 1O min a 72°C.
Cuadro 4.1.Cebadores empleados para la amplificación del ADNc parcial
de la NCS y la BBE en Argemone mexicana .
Cebador Secuencias 5' ~3· Producto (pb)

NCSAm1 F-GAGGGCAATGGTGGTGTTGG 423
R-GTAGTACATGGAATTACCTGGATGGG
541
NCSAm2 F-GAGGGCAATGGTGGTGTTGG
R-CAGTAAACCTCCGAGAATAACCAAAC
561
BBEFAm1 F-CATCTTTGTTCATCATCATCTTCTTCTTCT
R-ATCGGCTGCGAGACCGTATTT
549
BBEFAm2 F-CTCATCTTTGTTCATCTTCTTTTCTGTGC
R-ATCGGCTGCGAGACCGTATTT
467
ACT F- CACIACTACTGCTAAACGGGAAA
R-ACATCTGCTGGAAGGTGCTG
78
4.2.5. Determinación del número de copias de la NCS y
BBE por hibridación tipo Southern
El ADN genómico (20 IJg) fue digerido de manera

independiente con las siguientes endonucleasas de restricción;
BamHI, EcoRI, Hind/11, y Kpnl. Estas enzimas fueron
seleccionadas con base en el análisis de las secuencias de la
NCS y BBE de A. mexicana (Fig. 4.7). Los productos de la
digestión se separaron en un gel de agarosa al 0.8%, y se
transfirieron por capilaridad a una membrana de nylon N+
(Amersham), utilizando procedimientos estándares (Sambrook
et al., 1989). El ADN se fijó a la membrana por radiación UV,
(Stratalinker UV Crosslinker 2400; Stratagene, La Jolla, CA).
Como sondas moleculares para la detección de la NCS se
utilizaron los ADNc contenidos en las clonas pNCSAm1-5 y
pNCSAm1-3 (ver Capítulo 3 y Fig. 4. 7). Para la BBE se
utilizaron los ADNc contenidos en las clonas pBBEAm1-3;
pBBEAm1-5 (ver Capítulo 3 y Fig. 4.7). Estas fueron marcadas
con digoxigenina mediante PCR, de acuerdo a las
instrucciones del proveedor (Roche Applied Science ). Las
condiciones de hibridación empleadas fueron de 42° e por 24 h
en una solución Dig easy hyb de acuerdo a las instrucciones
del proveedor (Roche Applied Science ). Después de la
hibridación, las membranas se lavaron dos veces en SSC 1X
con 0.1% SOS a temperatura ambiente durante 5 min (SSC 1X
es 8. 7 g de citrato de sodio y 1 g de cloruro de sodio por litro,
pH 7), seguido de dos lavados en 0.5X SSC con 0.1 % SOS a
65°C por 15 min cada uno. La detección se realizó usando Dig
luminescent detection kit (Rache Applied Science) según las
instrucciones del fabricante.
4.2.6. Análisis de secuencias
Las secuencias obtenidas de la NCS (NCSAm1 y NCSAm2) y

la BBE (BBEAm1 y BBEAm2) de Argemone mexicana
(Capítulo 3; Fig. 3.9 y 3.11) fueron comparadas con las
depositadas en bases de datos del GenBank, utilizando el
79
paquete BLAST (Basic Local Alignmnent and Search Tool;
www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST). Para el análisis de dominios se
utilizó el paquete SMART (Simple Modular Architecture
Research Tool; http://smart.embl-heidelberg.de/), mientras que
para la comparación múltiple de las secuencias de ADN, se
utilizaron los programas Multialin
(http://bioinfo.genotoul.fr/multalin/multalin.html) y CLC Main
Workbench (CLCBio Software).
El análisis filogenético se realizó con el programa CLC Main
Workbench (CLCBio Software). La búsqueda del árbol se
realizó utilizando el método de neighbor joining, y se evaluó la
robustez con el método bootstrap, utilizando 1000 repeticiones.
Las secuencias utilizadas para los alineamientos, comparación
y análisis filogenético se presentan en el Cuadro 4.2 .
4.2.7. Extracción, identificación y cuantificación de

alcaloides
Los alcaloides se obtuvieron mediante una extracción ácido-

base de acuerdo a la metodología descrita por Monforte-
González et al (1992) con algunas modificaciones.
Brevemente, de 100 a 200 mg de tejido liofilizado fueron
homogenizados en 15 mi de metanol: HCI 5% (v/v) e incubados
a 45°C, con agitación durante 2 h. Después de este tiempo , el
extracto fue centrifugado, tomándose 500 !JI de la suspensión y
evaporando hasta sequedad a presión reducida. El residuo se
resuspendió en 100 1-11 de metanol y fue utilizado en los análisis.
La separación de los alcaloides se realizó mediante
cromatografía de capa delgada (CCD) sobre placas de sílice
(cromatofolios de gel de sílice 60F 254 , Merck), utilizando los
diferentes sistemas reportados (ver Resultados; Carrillo-Pech,
2006). Los alcaloides fueron identificados por comparación de
sus propiedades cromatográficas (valor de Rr y fluorescencia)
con los estándares de berberina y sanguinarina (Sigma-Aidrich
Chemical Co ). La cuantificación de los alcaloides se realizó por
densitometría in situ sobre las placas cromatográficas,
utilizando el método del estándar externo, en un densitómetro
80
Shimadzu CS-930 equipado con un graficador (DR-2). Las
lecturas en el densitómetro se hicieron por barrido lineal de
cada carril y la concentración se determinó comparando el área
del pico de las muestras contra el área de los picos obtenida
aplicando concentraciones conocidas de los estándares. Los
alcaloides fueron detectados por fluorescencia a una longitud
de onda (A) de 300 nm (Carrillo-Pech, 2006).
4.2.8. Análisis estadístico
Los datos del contenido de alcaloides (mg) fueron

estandarizados con el peso seco del tejido vegetal extraído,
utilizando el programa Microsoft Excel .2007 (Microsoft,
Redmond, WA, USA). Los gráficos fueron elaborados utilizando
el programa SigmaPiot v.1 O (Systat Software lnc., San Jose,
CA, USA). Se analizó la diferencia de medias de los contenidos
de alcaloides entre tejidos y tratamientos mediante el análisis
de varianzas (ANOVA de una vía) con la prueba de
comparación de Holm-Sidak, utilizando el programa SigmaStat
v. 3.1 (Systat Software lnc., San Jose, CA, USA).
81
Cuadro 4.2. Relación de secuencias utilizadas en los análisis de
comparación y filogenéticos.
Abreviatura No. de accesión Especie

NCSAm1 EU881891 Argemone mexicana
NCSAm2 EU881893 Argemone mexicana
PsNCS1 AY860500 Papaver somniferum
PsNCS2 AY860501 Papaver somniferum
TfNCS AY376412 Thalictrum flavum
CjNCS AB267398 Coptis japonica
PsPR10-1 AY861682 Papaver somniferum
PsPr10-2 AY861683 Papaver somniferum
CjPR10 AB267399 Coptis japonica
PmPR10 AY064193 Pinus monticola
PgPR10 AF197342 Picea glauca
PsmPR10 AF211850 Pseudotsuga menziesii
CaPR10 AY829648 Capsicum annuum
PcPR1 X12574 Petroselinum crispum
AoPR10 AJ132610 Asparagus officinalis
VqPR10 00396809 Vitis quinquangularis
FsPR1 AJ130889 Fagus sylvatica
StPR10 M25156 Solanum tuberosum
DcPR10 AB082377 Daucus carota
LePR10 Y15846 Lycopersicon esculentum
BvMAP AJ006912 Betula verrucosa
BpMAP AB046540 Betula platyphylla
AgMAP Z48967 Apium graveolens
AtMAP NM_122684 Arabidopsis thaliana
CaMAP X70997 Corylus avellana
CbMAP Z80169 Carpinus betulus
PcMAP AF057030 Pyrus communis
VrCSBP AB012218 Vigna radiata
LICSBP AF288708 Lupinus luteus
BBEAm1 EU881889 Argemone mexicana
BBEAm2 EU881890 Argemone mexicana
EcBBE S65550 Eschscholzia californica
PsBBE AF025430 Papaver somniferum
TfBBE AY610511 Thalictrum flavum
BsBBE AF049347 Berberís stolonifera
NtBBE AM851017 Nicotiana tabacum
OsFAD NM_001067570 Oryza sativa
AtFAD1 NM_102807 Arabidopsis thaliana
AtFAD7 NM 123803 Arabidopsis thaliana
82
Abreviatura No. de accesión Especie
AtFA08 NM_123805 Arabidopsis thaliana
GmFA02 00318817 G/ycine max
GmFA01 00318816 Glycine max
CdFAO AY451241 Cynodon dactylon
CsCBOAS AB292682 Cannabis sativa
CsTAS AB057805 Cannabis sativa
NICOX AF503442 Nicotiana langsdorffii
HaCOX AF364866 Helianthus annuus
AtCE NM 101049 Arabidopsis thaliana
4.3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.3.1. Análisis de los ADNcs de la NCS y BBE
Las secuencias completas de los ADNcs para la NCS y la BBE

obtenidas por PCR como se describió en el Capítulo 3 permitió
el análisis molecular y las caracterizaciones correspondientes
una vez que éstas estuvieron disponibles.
Análisis de las secuencias de las NCS de Argemone

mexicana
El ADNc de la NCSAm1 contiene un marco de lectura abierto

de 828 pb que corresponde a un péptido de 275 aminoácidos,
de una masa molecular predicha de 30.6 kDa. Por otro lado, la
NCSAm2 tiene un marco de lectura de 663 pb que corresponde
a un péptido de 220 aminoácidos, con una masa molecular
predicha de 24.3 kDa. Las secuencias de aminoácidos
deducidos de la NCSAm1 y NCSAm2 mostraron un 61% de
identidad entre sí. En ambos casos, las secuencias de
aminoácidos presentaron una región conservada entre los
residuos 26 al 182, relacionados con el dominio de la familia
Bet-v1, que constituyen el mayor grupo de proteínas
aeroalérgenicas y se encuentran entre los cuatro alérgenos
alimentarios más comunes en especies filogenéticamente
83
distantes (Schenk et al. , 2006) (Fig. 4.1 ). También se identificó
un posible dominio transmembranal , localizado hacia el
extremo e-terminal, entre los residuos 250 y 272 para la
NCSAm1 y entre los residuos 195 y 217, para la NCSAm2. En
ninguna de las dos secuencias se identificaron dominios
correspondientes a posibles péptidos señal, como se ha
reportado para la NCS de T. flavum (Samanani et al. , 2004).
20 40
1
NCSAm-1 MSKL I TTIP L KSMSE IANYVLK SVIRK IIVTYELEVPTSADSIWAVYS 50
NCSAm-2 MSKL 1 TT AP L KSMSE 1AN YVLK SV 1RK VTYE!LEVPASADS IWAVYS 50
NCSAm-1
NCSAm-2 L..::.:...:..:....:..:.....:..::...:.:..:..:....:...:.:.::...;:;;.::...:..::~.:...:....:....:..::==-:..;:...:...:-=..:...:..;:..:...:.-=.:~=~~
Figura 4.1. Comparación de las secuencias de aminoácidos deducidos a

partir de NCSAm1 y NCSAm2 de Argemone mexicana. La caja indica la
región conservada del posible dominio Bet-v1 . Las cajas punteadas señalan
posibles sitios transmembranales .
La comparación de las secuencias de aminoácidos deducidos

de la NCSAm1 y NCSAm2 con las secuencias depositadas en
el GenBank, utilizando el programa BLAST (Aitschul et al. ,
1997), mostró un porcentaje de identidad significativo, de entre
el 50 y 75%, con las NCS de P. somniferum (Liscombe et al.,
2005). De igual forma, presentaron una identidad significativa,
del 30 al 39 %, con la de T flavum , y algo menor, del 12-39 %,
con proteínas relacionadas con patogénesis (PR1 O). Estas
84
últimas incluyen a la subfamilia de proteínas alergénicas Bet V
(MAP) y a la de proteínas con unión a citocininas (CSBP) de
diferentes especies (Samanani et al., 2004; Pastemak et al.,
2005; 2006) (Cuadro 4.3; Fig. 4.3). No obstante, ninguna de
éstas ha demostrado actividad enzimática de NCS, a pesar de
la homología que comparten (Liscombe et al. , 2005). Cabe
mencionar que las dos NCS de A. mexicana, junto con las de
P. somniferum y la de T. flavum, forman polipéptidos mayores
que las proteínas PR1 O, CSBP y MAP debido a fragmentos
adicionales en los extremos N y C de las primeras. Esto se
relaciona con un presunto péptido señal, localizado en el
extremo N-terminal de la NCS de T. flavum y con los posibles
dominios transmembranales de las de P. somniferum
(Samanani et al., 2004; Liscombe et al., 2005) y que también
podrían ocurrir en la de A. mexicana (Fig. 4.3). Cabe resaltar,
que tanto la NCSAm1 como NCSAm2 poseen extremos e-
terminal prominentes, que se extienden mas allá de los
extremos e-terminal de las de P. somniferum y T. flavum
(Liscombe et al., 2005). En particular, la NCSAm1, presenta 51
residuos adicionales en el extremo e-terminal, en comparación
con la NCSAm2. Esta es la razón por la cual se observa un
menor porcentaje de identidad con las NeS ya reportadas. Por
el contrario, la NCSAm2 tiene el extremo e-terminal
conservado con respecto a las de P. somniferum (Cuadro 4.3).
85
Cuadro 4.3. Porcentaje de identidad de las secuencias de aminoácidos
deducidos de la NCSAm1 y NCSAm2 con secuencias reportadas para la
norcoclaurina sintasa (NCS) de P. somniferum (Ps) y T. flavum (Tf),
proteínas de patogénesis (PR1 0), proteínas con unión a citocininas (CSBP)
y proteínas alergénicas Bet V1 (MAP).
Proteína 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1. NCSAm1 61 50 50 30 31 27 25 14 13 14 12
2. NCSAm2 75 74 39 39 33 30 17 16 16 14
3. PsNCS1 89 38 37 31 28 15 15 17 15
4. PsNCS2 38 38 34 27 16 16 16 15
5. PsPR10-1 30 28 37 19 20 16 15
6. TfNCS 59 28 18 17 19 17
7. CjPR10 25 15 15 16 15
8. PsPR10-2 23 22 18 17
9. VrCSBP 62 22 22
10. LICSBP 22 21
11. VpMAP 91
12. BpMAP
Las abreviaturas y la lista de accesión se encuentran en el cuadro 4.2.
El análisis de las porciones centrales de la NCSAm1 y

NCSAm2, entre los residuos 26-182, que incluyen el domino
Bet v1 y que excluyen los extremos N- y e-terminales, reveló
una mayor identidad (80-86%) con las NCS de P. somniferum
que con las de T. flavum (50-56%). Por su parte, la similitud
con las proteínas PR1 O, CSBP y MAP fue significativamente
menor (Cuadro 4.3; Fig. 4.3). Más aún, tanto las NCS de A.
mexicana, P. somniferum, así como la de T. flavum,
presentaron un motivo G(D/N)GGXGT que ocurre en las
proteínas PR10, CSBP y MAP. Esta secuencia es muy
conservada en todo este grupo de proteínas, a pesar de sus
funciones ampliamente divergentes (Fig. 4.2). Este motivo
sugiere la presencia de una horquilla de unión a fosfato (P-
Ioop), la cual es precedida de una conformación laminar ~
seguido por una helice a que funcionan como un motivo de
unión del ATP/GTP (Berkner et al. 2008).
86
~ ~ ~
• 1 •
~.~:~.~;A~L:::::~:AN~~t = ==~:=:~ ::: : ~ : ~;~~~~~ = ~! : : =~

NCSAm.l
I<CSAm-"2 :::::::: ::
""'-NCSI M8KLITT&~LK8MA&V18NYAMKOO&V8&RNIPKKQ8LLRK~ ···· ··ITYE~EV-QT!·S 52
PtNCS"2 M8K~ITTB~LK8MABYI8NYVIOR&8~8ARNILNKN8LVKK& ···· · · IRYDI.EV - PT·S ~
Ps-1~1 M · ···•· ·• · ·· • • • • • • · · · · · · · · · · · · · · · · · · - -RY& · · · - · · INEFDV-OA·S 4
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•
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PsNC$1 AOS IWÑVYSSPDI PRI.I.RDVI.I.PGVFEKLOV 1 V L 'O·I FPLG - AVPRRYKEKF 111
PsloiCS2 AOSI~VYSQPOIPRI.I.RDVI.I.PGVF .QKLOV 1 E · VI.OIVFPPG - AVPR YKEKF 1 11
P.-10.1 AODVWAVYS&POL PRI. 1 V& •'- L PGVF"·KKI OV E VLHLVIWI Pt1G • • VP 'L .YKEKF 72
TrNCS AORIWTVYSWPOLAKHLPD L~ • GAF"EKL&I 1 • 1 L OMTFVPG - &~PH&YKEKF 11a
CU'\R10 AO&VW8VIiiQSP&LOLHLPOilLP ... G F"JU(F& 1 T• 1 L IOMTFPPQ - QFPHHYREKF 108
Ps~lO..~ AO&IWAVYfjiSI<DLPt!iL 1 1 • LAPGVFEKI OY 1' E 1 L'RI VIIAQG .. &PR~EKF 74
V.CSBP L&AC:WAVLS·KD~ITVVPKVL·PHlVKDVO lE 1 IFNn.; P V8~·-YORE&I 71
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PsNCSt - KL I TTEPLESMAEVI&GYVL. · • · · K:KRLO - - - FGFEIKPIKLRFNLL.LCLIICL · - ·YI 220
PJNCS2 - ~L 1 TTEPLESMA.V• 1 8GYVL • • • · KKIIILQV; . - ·J'GFE IK"K'-R~NLLL CL 1 1 CL • -· V 1 220
p~-1~1 - ~H 1 8VE.L:VDMARA 1 8KYII QJ)NJtK·N'SAiiDP'&TC81iEOHOKkHGHLHR IWI8LFG~ • • • 1e8
Tl'NCS - PL 1 TTGPLAAMADA 1 8KilVL - - · - • •. . - - •• •• - li.-.K8K8N80&1 &AAJ 1 TV • - • • • 210
Q.PR10 - PLIDT\olf>LAIM8EAIAK:W:VL · · · · · · · · · - · · · · · ENKHK88E - · · · · · · · · · · · · · · 1
P PR1~'2 • L.ITVOAMWGMAK 1 VOYVLD AKQ • • • · - - • • • • • • • • • • • ·- • • • • • • • • • • 161
VIC:SeP · I'TKT8Q8TLMY~RRL&RVL:8N · G8~··· · · ··· ··· - 1~
I,.IC$9P
~
~
~~~:::~::e;rt:i~=~~~t:~:~:.;;. ::::: : :::
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HC$Ann.1
NCSAm-2
PsNC$1
PsNCS2
p·-·~·
1TNCS 2-10
Qf'R10 1
P.-\~ 161
V.CSBP
L.JCSBP ·~
158
e.~ 160
6I:¡MAP 160

la NCSAm1 y NCSAm2 con secuencias reportadas para las norcoclaurina
sintasas (NCS), proteínas de patogénesis (PR1 0), proteínas con unión a
citocininas (CSBP) y proteínas alergénicas Bet V1 (MAP). El recuadro
indica la secuencia consenso P-loop. Las abreviaturas y la lista de accesión
se encuentran en el cuadro 4.2.
87
Análisis de las secuencias de las BBE de Argemone
mexicana
La secuencia de la BBEAm1 mostró un marco de lectura
abierto de 1665 pb, que corresponde a un polipéptido de 554
residuos con una masa molecular de 62.5 kDa. Por su parte, la
BBEAm2 tiene un marco de lectura abierto de 1611 pb, que
corresponde a un péptido de 536 residuos, con una masa
molecular de 60.1 kDa. Se debe hacer notar que A. mexicana
es la primera especie productora de ABis de la que se logran
aislar dos isoformas para la BBE. Si bien en P. somniferum se
han detectado al menos tres genes, aparentemente sola la
(bbe1) logra producir una proteína funcional (Facchini et al. ,
1996).
Las secuencias deducidas de aminoácidos para las dos BBEs

de A. mexicana (BBEAm1 y BBEAm2) mostraron un 90% de
identidad entre sí (Fig. 4.3). En términos generales, ambas
mostraron un porcentaje de identidad significativo (72%) con
las de E. californica y P. somniferum (Dittrich y Kutchan, 1991;
Facchini et al., 1996) y un tanto menor (60%), con las de B.
stolonifera y T. flavum (Chou y Kutchan, 1998; Samanani et al.,
2005). Este porcentaje fue bajo (35 y 40%), comparado con
otras flavín-oxidoreductasas (Cuadro 4.4; Fig. 4.4).
Es interesante hacer notar que ambas BBE de A. mexicana
presentaron un segmento en el extremo N-terminal con una
alta identidad a las secuencias equivalentes de P. somniferum,
E. californica (ambas Papaveraceas), así como con las de B.
stolonifera y T. flavum, que pertenecen a otras familias. Esto es
de relevancia puesto que los primeros 50 residuos del extremo
N-terminal de la BBE de P. somniferum son críticos para el
transporte de la proteína al retículo endoplasmático y a la
vacuo la (Bird y Facchini, 2001 ). Algo similar se ha sugerido
para la enzima de E. californica (Kutchan et al., 1994). Con
base en los análisis de la secuencias, un segmento de 36
aminoácidos para la BBEAm1 y de 31 para la BBEAm2 podrían
representar estos péptidos de tránsito (Fig. 4.3). De igual
forma, en ambas secuencias se observó un motivo NXS/T, (50-
88
53 y 45-48 para BBEAm1 y BBEAm2, respectivamente) que
corresponde a un presunto sitio de N-glucosilación, similar al
encontrado en las BBE de E. califomica y P. somniferum
(Ditrich y Kutchan, 1991; Facchini et al., 1996; Bird y Facchini ,
2001; Winkler et al., 2006). De hecho, la BBE de E. califomica
al ser expresada en células de insecto, resultó glucosilada en el
retículo endoplasmático, antes de ser excretada al medio
(Kutchan et al., 1994). En este sentido, la finalidad de la
glucosilación de la proteína BBE es el plegamiento correcto en
el retículo endoplasmático y su probable
compartamentalización (Winkler et al., 2006; 2007)
Cuadro 4.4. Porcentaje de identidad de las secuencias de aminoácidos

deducidos de la BBEAm1 y BBEAm2 con secuencias reportadas para la
enzima formadora del puente de la berberina (BBE) de E. californíca (Ec), P.
somniferum (Ps), T. flavum {Tf), y N. tabacum (Nt), proteínas dependientes
de FAD y oxidoreductasas
Proteína 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
1. BBEAm1 90 72 71 61 59 41 38 40 32 31 35 35
2. BBEAm2 71 71 31 32 36
3. EcBBE 66
4. PsBBE 60 57 42 42 33 36 36
5. BsBBE 68 43 32 34 36
6. TfBBE 42 40 43 31 35 37
7. NtBBE 46 45 31 34 38
8. OsFAD2 45 33 33 32 36
9. OsFAD1 35 37 36 39
10. AtFAD1 53 42 44
11. AtFAD2 39 40
12. CsCBDAS 45
13. NICOX
Las abreviaturas y la lista de accesión se encuentran en el cuadro 4.2.
89
4
~ 1° vvv ~
BBE.Am-1 ML TTVTMETKI TKNkYSSLF 111 FFFFFSVL TCALSDOI LSCL TSNGVHNYTTPSSDSNS 60
BBE.Am-2 ML IIYTMETK 1 TKNfXSSL F 1 • .... ffSYLTCALSPO 1LSC L TSNGVHNYTTPSSOSNS 55
~ 100
1 l
BBE.Am-1 OYLRL . HLS l QN PL FEKST 1SKPSL 1VL PJINKEELSN'TVRCCTRGSWTI R LR 20
BBE.Am-2 OYLRL HLS QNPLFKKSTI SKPSL IVLPgNKEELSNiTVRCCTRGSWTI RLR 15
~ ~ ~
1 . 1 1
BBE.Am-1 fi:SYTADTPFVL 1OLMNLNR 1SI O OSETAWVESGAT GELYYAI E TOS GFTAGWCPT 180
*
BBE.Am-2 ~YTAOTPFVLIOLMNLNRISIO OSETAWVESGAT GELYYAI E TOS GFTAGWCPT 175
~ m ~
1 1 1
BBE.Am-1 VGSGGH 1SGGGFGMMSRKYGLAAONVEOVI L 1DSKGAI LDRKLMGEOVFWAVRGGGGGVW 240
BBE.Am-2 VGTGGH 1SGGGFGMMSRKYGLAAONVEOV 1L 1DSNGA 1 L DRKLMGEOVFWAVRGGGGGVW 235
~ ~ ~
1 1 1
BBE.Am-1 GAIYAWKIKLLPVPKKVTVFRV KNVNIEEASFLIHKWQYVAOELODOFTVSILGGANGN 300
BBE.Am-2 GA 1YAWK 1K L L PVPKKVTVFRV KNVN 1EEASF L 1HKWQYVADELDOOF TV 1LGGANGN 295
m ~ ~
1 1 1
BBE.Am-1 EVWYI FLGLHLGCKTVAKS I I DKRFPELGL 1EEEFLEMNWGESFAYLSGLKTVKELN.NRF 360
BBE.Am-2 gAW FLGLHLGCKTV'AKSIMDKMFPELGL 1EEEFLEMNWGESFAYLSGLKTVKELNNRF 355
400 420
1 1
BBE.Am-1 LE ILSKEPRGF 1!LNGF.GGKMSK 1SNDFTPF PH 420
BBE.Am-2 LEILSKEPRGFI LN GGKMSK I SNOFTPFPH415
"0 400 400
1 1 , ..................................... ,
BBE.Am-1 Rl<GTKLMVEY 1V'AWSKOEESKSDEFFDWLRN 1YDYMENFVSKNPRVPYVN~ 1OLOLGG 1oj 480
BBE.Am-2 R,.GTKLMVEY 1VSWSKDEESKSDEFFDWLRN 1YDYME'~FVSKNPRVi3YVNN 1Ol DLGG 1o¡ 475
500 S20 '···································s;¡o
.l..........................
, ........................................................ .l.. ..................................................... 1
BBE.Atn-1¡ WSOKNSSNNA 1E 1ARNWGEKYFL SNY ERLI RAKTL 1OPNNVF NHPQS.I ~PMMK'II'lNVOOE 540
. '.
BBE.Am-21_.~~.~.~.~~.~.~.~.~.! ..~.!.~.~.~~.~~.~.r..~.~.~ .r..~.~.~ ~.~.~ .'!:.~..'..~.~.~.~.!.~.~.~.~.~.~ .!.~ PMM K NVo o E 535
Figura 4.3. Comparación de la secuencia de aminoácidos deducidos a partir

de BBEAm1 y BBEAm2 de Argemone mexicana. Los aminoácidos
subrayados muestran un presunto péptido señal. Los triángulos (del residuo
50 al 52) señalan el posible sitio de N-glucosilación. La caja (de 113 a 122
en BBEAm-1) indica la región del dominio de unión a FAD y los asteriscos
los residuos (histidina y cisteina) de unión. La caja punteada (de 467 a 529)
señala el posible dominio catalítico de la BBE.
90
B B EAm- 1 8 • eL TSNOVH
..
' 49
BBEAm_2 8 eLTSNOVH 44
EcBBE S .. eL T {e NOV.ft 37
P&B B E a l e LÑS'HOVH 41
TfBBE ~ ·eLT HOVH 33
B sBBE aaeLTSNOVJI 33
NtBBE CL c;:if:tÑVH 40
BBEAm-1
BBEAm_2
EcBBE
P e BBE
TfBBE
BsSBE
NtBBE
,..
BBEAm- 1 DSETAWVE80 ATLOELVVAI ' 164
BBEAm_2 DSETAWVESO AT OELVVAI 15 9
EcBBE SETAWVESO !JI TLOELYVAI 152
PeS BE SETAWVESO ATLOELVYA 1 1~
T fBBE D;"rCI TAWVESO ATLOE V'RAI 149
BaBBE
N tBBE
BBEAm-1 OHISOOOFOM M&RKYOLAAD

...' .&l(TAWVESG ATLGE Y,C.A 1
DS&TA~~Qg o AT O Q IVVAI
...'
lC OA 1 LDRKI M 2 24
14 8
1~
BBEAm_2 OHI&OOOFOM MSRKVOLAAD NOA 1 LDRKI:M 219

~~~: tg~:~= ~~ ~
EcBBE OHISQOOFOM MSRKVOLAAD
PaBBE OHISOOOFOM MSRKVOLAAD
OHI ~~ OOFOM MSRKVOLAAD
~~~~ tg~:= ~g:
TfBBE
...' ...'
BaBBE OHISOOOFOM M&RKYOLAAD
N tBBE OHISOOOFO SRK OL.AAD A Oft LDRK ~ M 2 20
BBEAm-1 OEDVFWA¡V RO AWKIKLLPVP KKVTVFRV K L HKWQVVAÓ 2 83

OEDV FWA ~ PtO
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BBEAm_2 AWKIKLLPV~ KKVTV~ft.VMK
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TfBBE AWK
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NtBBE
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320
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BBEAm- 1 &LbDDFT g a L --- ------ OCKTVAKSI DKKFPiiiLOL 3 31
BBEAm_2 E L'DDDFT &Ct.Jl L-- . - -- - - - OCKTVAKSIM DKMFPEL.OL. 3 26
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323
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TIBBE L -. - •• ---- 317
L- ---- - •- •
BaBBE A!L.DDFTLSV
NtBBE ~ L v;DDFTL - V
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...'
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31 6
339
362
B B EAm_ 2 ESP'AYLSOL · K•LNNRFLK DDitAF - KTKV OFTKE[lj LPL)t 377
E c BBE ESP'AYL ~ OL atiLNNR~LK~ o•JIÍi.AP-KTKV D TK&PL.- [¡I K 370
PoS BE E&MAJIL&OL - a•LNNRFLKF o•RAF - KTKV DFTK 1U~I PL.J!!I 374
TIBBE B~ A-· L~OL SIEL B QRI'L ll'i< DDfltAF ~ KTKV DP :P. KE~IPLE 368
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BeBBE
NtBBE
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...'
367
0 ~ \fiKKPVa.-Q 397
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~~=~:=~~=;
BBEAm- 1
BBEAm _ 2 VINOVLEIL& KE.-ROFI LN . QQKMSK 1 S OTKLMVEYIV {j(WJI KDE.SKS 437
Ec BBE APYO L: L&kLa KI!.-NOFIALN O,.OOc:iMSKIS - D~TPFPHR. OT"LMVEVIV AWNQ.EQKKM 430
PsBBE V.II!RHALEMLS IIQ .. CIGFIALN OFOOKM&. IS TDIE"TPFPHRK OTKLM)!; EYI AWNQDE.SK 434
TIBBE OIQOAL.ILK KliQRG~MV:MN OQOOIIMDit18 "'iD'X8PFPHR. OTLaMVIiVIV AWI:iKH&D 8 &428
BeBBE
NtBBE
BBEAm- 1
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EcBBE EFL~L .• K )t. Y•J!MISPFVSK NPR OYVNHI OLDL.O ~ O I O
PeBBE QEFa~LaKF VDV E~FVSK • . PRVOVVNH 1 DLD 0 - 0ID -
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BsBBE
N lB BE
BBEA.m-1
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BBEAm_2 IARNWOEKYF LSNYERLIRA KTL I DPNN F NH~QSIPPMM
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PaBBE IARNWOERY fl' jji SNYI!RLV A KTLID~NNV~ NH,.QSIPPMM
TfBBE IAR'i"WoEKYP IIIBNVQRLVRA KT~IDP:kNVF NHPQSIPP
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} :=~~=;~=
BsSBE
NtBBE L ,8 NYQRLV :8; A KTi;i iDP NVF l!jH.QSIPPML:

la BBEAm1 y BBEAm2 con secuencias reportadas para la enzima
formadora del puente de la berberina (BBE), proteínas dependientes de
FAD y oxidoreductasas. Los recuadros indican los residuos de unión bi-
covalente de FAD. Las abreviaturas y la lista de accesión se encuentran en
el cuadro 4.2.
91
Recientemente se ha determinado que la BBE pertenece a una
nueva familia de flavoproteínas, la cual presenta un sitio de
unión bi-covalente del cofactor FAD formando un enlace 8a-
histidii-6-S-cisteinii-FAD, que aumenta el potencial oxido-
reductor de la enzima. Estos sitios de unión alFAD se localizan
en los residuos H1o4 y e1 66 , (tomando la de E. californica como
referencia) embebidos en dos dominios característicos (Winkler
et al., 2006; 2007). En este sentido, las secuencias
SGGHSYEGLS, con residuos H en las posiciones 116 y 111, y
AGWePTV, con residuos e en las posiciones 178 y 173, en
BBEAm1 y BBEAm2 respectivamente, corresponden a dichos
sitios de unión (Fig. 4.3). Esto confirma la naturaleza de los
ADNc aislados de A. mexicana como flavín-oxidoreductasas
con el enlace bi-covalente, típico de las BBE (Dittrich y
Kutchan, 1991; Facchini et al., 1996; Winkler et al., 2006;
2007). Los residuos H y e de los dominios de unión al FAD
son semi-conservados en otras flavoproteínas y
oxidoreductasas (Fig. 4.4) y se han descubierto en otras
oxidasas, como la hexosa oxidasa de Chondrus crispus (Rand
et al., 2006), aclacinomicina oxidoreductasa (AknOx) de
Streptomyces gali/aeus (Aiexeev et al., 2007),
glucooligosacárido oxidasa (GOOX) de Acremonium strictum
(Huang et al., 2005) y quito-oligosacárido oxidasa (ChitO) de
Fusarium graminearum (Heuts et al., 2008). Aunque estas
enzimas están involucradas en diferentes procesos
metabólicos, comparten las propiedades comunes de las
flavoproteínas bi-covalentes, en las que este tipo de enlace no
sólo participa en la modulación del poder oxidativo del FAD,
sino que favorece la estabilidad de la estructura proteica,
facilita la transferencia de electrones y previene la pérdida del
FAD oxidado (Leferink et al., 2008; Heuts et al., 2008; Huang et
al., 2008). En la BBE, el enlace 8a-histidii-6-S-cisteinii-FAD es
crítico para generar el potencial de redox necesario para llevar
a cabo la transformación de la reticulina (el sustrato de la
enzima; Fig. 1.3), ya que al afectarlo se observó una drástica
disminución en la eficiencia catalítica de ésta (Winkler et al.,
2007).
92
Además de estos dominios, cercano al extremo e-terminal,
entre los residuos 467 al 529 y del 462 al 524 para BBEAm1 y
BBEAm2 respectivamente, se identificaron los presuntos
dominios catalíticos, de acuerdo con lo reportado en P.
somniferum, E. ca/ifornica y B. stolonifera (Dittrich y Kutchan,
1991 ; Facchini et al. , 1996; Chou y Kutchan, 1998) (Fig. 4.3).
4.3.2. Análisis filogenético de los ADNc de la NCS y BBE
Con el fin de analizar las posibles relaciones evolutivas, se

llevó a cabo un análisis filogenético con base en las secuencias
de nucleótidos de los ADNc, considerando únicamente los
marcos de lectura abierta, tanto de la NCS como de la BBE de
A. mexicana y enzimas relacionadas.
El diagrama filogenético de la NCS fue desarrollado utilizando
29 secuencias. Se incluyeron las NCS de diferentes especies,
así como otros tres grupos homólogos; proteínas relacionadas
con patogénesis (PR1 0), proteínas de unión a citocininas
(CSBP) y proteínas alergénicas Bet V1 (MAP) (Liscombe et al.,
2005; Fig. 4.5). El análisis mostró una relación estrecha entre
las NCSAm1 y NCSAm2 de A. mexicana con las secuencias
PsNCS1 y PsNCS2 de P. somniferum, y un poco menor con
TfNCS de T. flavum. Esto permitió agrupar dichas secuencias
en un mismo ciado, lo que sugiriere un ancestro común. Este
agrupamiento coincide con reportes previos que sugieren que
las NCSs de diferentes especies forman un grupo monofilético
(Samanani et al. , 2004; Liscombe et al. , 2005). Este análisis
también mostró que las PR-1 O de C. japonica y de P.
somniferum tuvieron una relación más cercana con el grupo de
la NCS que con otras PR-1 O de diferentes especies. Cabe
mencionar que el bajo soporte para el origen monofilético de la
NCS (con un valor de bootstrap de 433), abre la posibilidad de
topologías alternativas para el cladograma, (Liscombe et al.,
2005).
93
CbMAP
' - - - - - - - - AtMAP
LICSBP
VrCSBP
PsNCS1
.-------"''::.:.¡' PsNCS2
NCSAm2
NCSAm1
50S
TfNCS
CjPR10
PsPR10-1
PsPR10-2
40
' - - - - AoPR10
LePR10
CaPR10
StPR10
AgMAP
DcPR10
PcPR1
VqPR10
PcMAP
FsPR1
BpMAP
BvMAP
CaMAP
Figura 4.5. Árbol filogenético obtenido mediante la aplicación del método

neighbor-joining (método del vecino más próximo) utilizando la secuencia de
nucleótidos codificantes de la NCSAm1 y NCSAm2 de A. mexicana y 29
proteínas relacionadas (las abreviaturas y la lista de accesión se encuentran
en el cuadro 4.2). Los números internos indican el soporte Bootstrap de
cada ciado.
Se debe hacer notar que la presunta NCS de C. japonica

(CjNCS), no se agrupó con las NCS de las especies incluidas
en este análisis. De hecho, esta secuencia no mostró ninguna
relación significativa con los tres grupos de proteínas
analizadas (Fig. 4.5). En contraste, la PR-10 de esta misma
especie (CjPR1 O) se agrupó estrechamente con la NCS de T.
flavum (Fig. 4.5). La secuencia de CjNCS no comparte similitud
significativa con las NCS de otras especies, no obstante que
tiene la actividad catalítica para la formación de (s)-
norcoclaurina a partir de 4-HPAA y dopamina Minami et al.,
94
2007). Es interesante notar que CjNCS pertenece a la familia
de las dioxigenasas dependientes de 2-oxoglutarato, mientras
que las demás NCS aquí analizadas pertenecen a la familia de
las hidro-liasas (Minami et al., 2007). En este sentido, es
remarcable que dos proteínas que pertenecen a familias
distintas tengan la capacidad de catalizar la misma reacción in
vitro. Por su parte, la CjPR1 O, con un 65 % de identidad con la
NCS de T. flavum, tiene actividad catalítica para la formación
de (s)-norcoclaurina (Minami et al., 2007). De este modo, la
interpretación de los resultados obtenidos con la NCS y la PR-
1O de C. japonica presentan algunas interrogantes y deben ser
tomados con cautela (Minami et al., 2007; Facchini y De Luca,
2008).
El diagrama filogenético de la BBE fue desarrollado utilizando
28 secuencias. Éstas incluyeron las BBE de diferentes
especies, así como diversas flavoprote ínas relacionadas
(Liscombe et al. , 2005; Fig. 4.6). El análisis mostró que la
BBEAm-1 y BBEAm-2 presentan una relación cercana con las
BBE de E. californica, P. somniferum, T. flavum y B. stolonifera,
permitiendo agruparlas en un mismo ciado. Esta agrupación
tuvo un soporte elevado (valor bootstrap de 1000), sugiriendo
un grupo monofilético (Liscombe et al., 2005). La relación más
cercana de este grupo resultó con una presunta BBE de N.
tabacum, que aun no ha sido caracterizada, y en la cual
presenta un dominio de unión a flavina (Goossens et al., 2003).
Un aspecto interesante de notar es que la CsTAS y la
CsCBDAS (involucradas en el metabolismo secundario) de C.
sativa, no están directamente relacionadas con la BBE
(Liscombe et al. , 2005). Sin embargo, ambas presentan los
dominios de unión al FAD, que permitirían el enlace bi-
covalente, necesario para el funcionamiento correcto de la
proteína, lo que sugiere un origen ancestral común con la BBE
(Liscombe et al., 2005; Heuts et al. , 2008). ·
95
CsTAS
CsCBDAS
AtFAD4
AtFAD1
' - - - - - - - - AtFAD2
' - - - - - - - - - - AtCE
•nM i r - - - - - BsBBE
' - - - - - - TfBBE
BBEAm2
BBEAm1
' - - - - - EcBBE
' - - - - -- PsBBE
L---======-- NtBBE
' - - - - - - - - - - - - OsFAO
' - - - - - - - - - - - - CdFAD
' - - - - - - - - - - - - HaCOX
.----- AtFAD9
.----"'=i ' - - - - AtFAD6
2C1 ' - - - - AtFAD10
' - - - - - - - AtFAD3
GmFAD1
GmFAD2
' - - - - - -- - NICOX
1000 AtFAD7
AtFAD6
r - - - - AtFAD12
' - - - - - AtFAD11
' - - - - - - AtFADS
Figura 4.6. Árbol filogenético obtenido mediante la aplicación del método
neighbor-joining (método del vecino más próximo) utilizando la secuencia de
nucleótidos codificantes de la BBEAm1 y BBEAm2 de A. mexicana y de 28
proteínas relacionadas (las abreviaturas y la lista de accesión se encuentran
en el cuadro 4.2). Los números internos indican el soporte Bootstrap de
cada ciado.
4.3.3. Redundancia génica de la NCS y BBE en Argemone

mexicana
El ADN genómico de A. mexicana se digirió con diferentes

enzimas y se sometió a un análisis tipo Southern blot, con el fin
de establecer los posible redundancia génica de la ncs y la bbe
en esta planta. Se seleccionaron las enzimas BamHI, EcoRI,
Hind/11, y Kpnl, de acuerdo al análisis de restricción de las
secuencias completas de los ADNcs de la NCS y BBE (Fig.
4. 7). Las sondas moleculares utilizadas para la NCS fueron,
pNCSAm1-5 y pNCSAm1-3 (Fig. 4.7).
96
pNCSAml-3
pNCSAml-5 , - - - - - - - - - - ,
Bam HI Eco RI
1 1
ú NCSAml L----!
' l~.--------------~~ •
BamHl
1
~ NCSAm2
pBBEAml-3
- -lSOpb
Figura 4.7. Análisis de restricción de los ADNcs de la NCS (NCSAm1 y

. NCSAm2) y BBE (BBEAm1 y BBEAm2) de Argemone mexicana. Los
corchetes indican los fragmentos de ADNc utilizados como sondas para el
análisis tipo Southern blot.
El análisis con las sondas correspondientes a los extremos 5' y

3 ' de la NCSAm1 (Fig. 4.8) mostró bandas de hibridación para
las distintas enzimas utilizadas que fueron comunes entre sí,
así como algunas diferencias interesantes. Estos patrones de
hibridación sugieren la presencia de un bajo número de copias.
Por ejemplo, analizando detenidamente el patrón de hibridación
obtenido para el ADN digerido con EcoR/, se observó la
ausencia de dos bandas de alrededor de 3 y 6 kb con la sonda
pNCSAm1-3, en comparación con la sonda pNCSAm1-5 (Fig.
4.8). pNCSAm1-3 contiene un fragmento de 731 pb en el
extremo 3' con un sitio EcoR/, ausente en NCSAm2 (ver Fig.
4.7). De este modo, de no existir intrones en esta región, la
presencia de dos copias del gen correspondiente generaría un
patrón de tres bandas. Con la sonda pNCSAm1-5, de 340 pb y
sin sitios de EcoRI, se detectaron cinco bandas de hibridación
97
(Fig. 4.8). Este patrón sugiere la presencia de más de una
copia para este gen, ya que la sonda utilizada abarca un
segmento corto (menos de 400 pb) y si bien el gen
correspondiente a la NCS P. somniferum (ncs1; Acc.
FJ2000359 GenBank) tiene un intrón en la región cercana al
extremo 5,, éste es de solamente 160 pb. No es raro que
genes para enzimas relacionadas presenten una estructura
similar. Por ejemplo, dioxigenasas dependientes de 2-
oxoglutarato involucradas en el metabolismo de secundario en
Atropa, Catharanthus y Hyosciamus tienen la misma estructura
génica en cuanto al número y posición de intrones (Kanegae et
al. , 1994; Vázquez-Fiota y De Luca. , 1997). De este modo, es
posible que el gen de la ncs de A. mexicana presente un intrón
en la misma posición y tamaño similar que el de P. somniferum.
De ser así, sería poco probable la ocurrencia de más de dos
bandas de hibridación de EcoRI con una sonda que cubre una
región corta.
Estos datos, junto con el aislamiento de dos ADNc de la NCS

(Capítulo 3), sugieren la presencia de un número reducido de
copias para este gen, posiblemente dos. En caso de ser así, el
patrón de hibridación con Kpnl, que no tiene sitos de cortes en
ninguna de las sondas utilizadas y que produjo una señal
prominente cercana a los 12 kb y bandas de mucha menor
intensidad entre los 6 y 8 kb, sugiere que los genes de la ncs
podrían estar organizados en forma de grupos o tándem (Fig.
4.8). No obstante, en tanto que no se aíslen los respectivos
genes, la posibilidad de que los distintos ADNc aislados
correspondan a productos transcripcionales alternos, no puede
descartarse. Se debe mencionar, que en T. flavum, se ha
sugerido la presencia de una pequeña familia de entre tres y
cinco miembros para la NCS, (Samanani and Facchini, 2002;
Samanani et al., 2004). Esto es similar a lo encontrado en P.
somniferum, de donde se han aislado dos ADNc,
correspondientes a distintas NCS (Liscombe et al. , 2005).
98
Extremo 5' Extre mo 3'
12
7.0
6.0
5.0
3.0
2.0
1.6
1.0
0.6
0.5
Figura 4.8. Análisis tipo Southern blot de la NCS de Argemone mexicana.

Se utilizaron como sondas los fragmentos de ADNc correspondientes a los
extremos 5' y 3' de la NCSAm1. El ADN genómico {20 !Jg) fue digerido con
BamHI, EcoR/, Hind 111, y Kpn/1. Las sondas utilizadas fueron marcadas con
digoxigenina. Los números de la izquierda indican el marcador molecular en
kilobases (kb).
Para la bbe se emplearon como sondas las clonas pBBEAm1-

5, que incluye un fragmento de 622 pb del extremo 5' y sin
sitios de corte para las enzimas utilizadas, y pBBEAm1-3, que
incluye un fragmento de 1253 pb del extremo 3 · (ver Fig. 4. 7).
Estas sondas generaron patrones de hibridación con
diferencias notables entre sí (Fig. 4.9). Así, la detección de dos
bandas con la sonda 5' tanto para BamHI como Kpnl, además
de la detección de cuatro y tres bandas con EcoRI y Hind/11
respectivamente sugiere la presencia de un número reducido
de copias, posiblemente dos considerando que dos ADNc
99
fueron aislados (Capítulo 3) y la posible presencia de intrones
(Fig. 4.9). No obstante, como se mencionó anteriormente, esto
tendrá que ser confirmado mediante el aislamiento de los
genes correspondientes.
Por su parte, la sonda del extremo 3, que incluye sitios Hind/11,
Kpnl y EcoRI detectó, en general, un número mayor de bandas
de hibridación que la sonda 5' (Fig. 4.9). Estos resultados en
conjunto apoyan la presencia de al menos dos copias para el
gen de la bbe. Cabe mencionar, que la intensa banda Kpnl
detectada con las sonda 3' sugiere la presencia de un arreglo
en tándem de estas presuntas copias. En E. californica
solamente se ha detectado un gen para la bbe,
correspondiente a una enzima funcional (Dittrich y Kutchan,
1991 ), mientras que en P. somniferum posiblemente exista una
pequeña familia de dos o tres miembros, de los cuales
solamente uno (bbe1) , correspondería a una enzima funcional
(Facchini et al., 1996).
100
Extremos· Extremo 3'
12
7.0
6.0
5.0
3.0
2.0
1.6
1.0
0.6
0.5
Figura 4.9. Análisis tipo Southern blot de la BBE de Argemone mexicana.

Se utilizaron como sondas los fragmentos de ADNc correspondientes a los
extremos 5' y 3' de la BBEAm1. El ADN genómico (20 ¡.Jg) fue digerido con
BamHI, EcoR/, Hind 111, y Kpnl. Las sondas utilizadas fueron marcadas con
digoxigenina. Los números de la izquierda indican el marcador molecular en
kilobases (kb).
4.3.4. Análisis de la expresión génica de la NCS y BBE en

Argemone mexicana
Con el fin de estudiar la posible relación entre la expresión
génica y el contenido de ABis en A. mexicana, se analizó la
expresión tejido-específica de la NCS y BBE, así como el
contenido de alcaloides en plantas maduras y en plántulas en
desarrollo.
101
4.3.4.1 Análisis de la expresión de la NCS y BBE en
Argemone mexicana
La sanguinarina y berberina son los alcaloides mayoritarios en
esta planta. La sanguinarina se detectó en la raíz y en la
semilla madura, en cantidades de 1.0 y 1. 7 mg g-1 de PS ,
respectivamente (Fig . 4.1 OA). En las cápsulas completas, sin
semillas, sólo se observaron algunas trazas de sanguinarina.
La berberina, por su parte, se detectó en todos los tejidos
analizados, a excepción de la semilla madura, siendo el brote
floral y la raíz los que mostraron mayores cantidades (2 y 3 mg .
g-1 PS ; respectivamente) (Fig . 4.1 OA). Estos resultados son
similares a reportes previos (Lozoya y Lozoya, 1982; Willcox et
al. , 2007). Un aspecto importante de resaltar es la distribución
de estos alcaloides durante la maduración de la semilla, ya que
en este proceso se observa un cambio de berberina a
sanguinarina. La capacidad de A. mexicana para acumular
sanguinarina (benzofenatridina) en dos tejidos diferentes (raíz y
semilla madura) y berberina
- .. (protoberb!3JjoaLen.
, .., ' .- '\ .-- - --
hoja, raíz, semilla inmadura y brote floral de plantas maduras
de A. mexicana. En este estudio no se incluyeron semillas
maduras debido a que no se pudo obtener el ARNm.
En los diferentes tejidos, los transcritos para la NCS y 88E
mostraron, en general, un patrón de expresión relacionado con
la acumulación de los alcaloides. Sin embargo, también se
observaron algunas diferencias (Fig. 4.1 08). La NCSAm1 se
expresó en menor medida en hojas, en comparación con los
demás tejidos. En contraste, la NCSAm2 se detectó con la
misma intensidad en todos los tejidos analizados (Fig. 4.1 08).
Por su parte, el nivel de expresión de los genes representados
por 88EAm1 fue menor en hojas, raíces y no se detectó en la
semilla inmadura mientras que la BBEAm2 se detectó en todos
los tejidos, con niveles bajos en raíz y semilla inmadura (Fig.
4.108). De esta manera, ncs y bbe se expresan
diferencialmente en los tejidos, siendo abundantes en cápsula,
tallo y brote floral , mientras que en hoja, raíz y semilla
inmadura se detectó una expresión variable. Esto puede
relacionarse con la participación de las distintas isoformas de la
NCS (NCSAm1 y NCSAm2) y 88E (88EAm1 y 88EAm2) en la
síntesis de alcaloides de los diferentes grupos. En este sentido,
tanto la NCS y como la 88E son enzimas involucradas en la
formación de intermediarios comunes para la síntesis de tanto
benzofenantridinas (sanguinarina) como protoberberinas
(berberina) (Sánchez-Mendoza et al., 2008; Schwarzbach y
Kadereit, 1999; Fig 4.1 OA). Esto sugiere la existencia de un
grado de coordinación que permite la síntesis de ambos
alcaloides. En este momento, no es posible discernir si las
diferentes isoformas aisladas de la NCS y la 88E participan de
manera específica en la formación de alguno de los alcaloides
en los diferentes tejidos de A, mexicana. No obstante, esta
posibilidad existe ya que la distribución tejido específica de
transcritos correspondientes a diferentes isoformas de la
TYDC, SOMT y COR en P. somniferum, sugiere que puede
estar relacionada con los diversos tipos de alcaloides
103
producidos en los distintos tejidos (Facchini y De Luca, 1995;
Unterlinner et al. , 1999; Ounaroon et al. , 2003).
Comparando los patrones de expresión de ncs (NCSAm1 y
NCSAm2) y bbe (88EAm1 y 88EAm2) de A. mexicana con los
observados en T. flavum, y P. somniferum, se notan diferencias
con la primera y similitudes con última. Por ejemplo, la 88E de
P. somniferum se expresa principalmente en el tallo , hoja,
capsula con en niveles bajos en la raíz (Facchini y Park, 2003;
Sama na ni et al. , 2005,) al igual que en Argemone (Fig. 4.1 08).
Por otro lado, la expresión de NCS de T. flavum es abundante
en el rizoma (tallo modificado) (Huang y Kutchan, 2000), en
contraste con lo que sucede en A. mexicana donde hay otros
tejidos con una acumulación abundante del transcrito además
del tallo (Fig. 4.1 08).
104
A d
c=J Sanr:ulnarina
- Berberina
2..5
11'1 2.0
o.
bo
ti.O 1.5
E
1.0
0.5
0.0
e T H R SI B Sm
Teji dos
B
e T H R SI B
NCSAm1
~-- -- --
_____..... -- .,..,
NCSAm2
BBEAm1
BBEAm2
Actlna
Figura 4.10. Acumulación de ABis y análisis de expresión de la NCS y BBE

en plantas maduras de Argemone mexicana. A) acumulación de
sanguinarina y berberina. Las barras representan las medias ± DE de tres
experimentos independientes. Las letras (mayúsculas: sanguinarina;
minúsculas: berberina) señalan diferencias significativas entre medias
(ANOVA P < 0.001). B) expresión de mensajeros de la NCS y BBE por RT-
PCR. La actina se utilizó como control de carga y amplificación.
Abreviaturas: C, cápsula; T, tallo; H, hoja; R, raíz; Si, semilla inmadura; B,
brote floral; Sm, semilla madura.
105
Es interesante hacer notar que en algunos casos se
observaron diferencias entre el nivel de acumulación de
alcaloides (Fig. 4.1 OA) y el nivel de expresión tanto ncs como
de la bbe. Por ejemplo, las cápsulas, que mostraron el menor
contenido de alcaloides (solamente bajas cantidades de
berberina; Fig. 4.1 OA), tuvieron un alto nivel de expresión de
ambos genes (Fig. 4.108). Por otra parte, las raíces, que
acumulan la mayor cantidad de alcaloides (Fig. 4.1 OA), fue el
tejido con la menor expresión de bbe (Fig. 4.1 08). De este
modo, aunque la raíz parece ser el principal productor de
alcaloides, es posible que los intermediarios hasta (S)-
escoulerina, el producto de la 88E (Fig . 1.3), no sean formados
únicamente en este tejido, sino que también se importen de
otros, como sucede en P. somniferum (Steffens et al., 1985;
Facchini et al. , 1996). Por otro lado, también es posible que en
el estado de desarrollo en que se encontraban las raíces
analizadas no fuera el de mayor expresión de estos genes
(Huang y Kutchan , 2000; Facchini, 2001 ). Es importante tener
presente que las rutas biosintéticas tanto de la sanguinarina,
como de la berberina involucran numerosos pasos enzimáticos
(alrededor de seis reacciones) que aún faltan por ser
analizados (Fig. 1.3; 1.4 ).
Los diferentes niveles de regulación (bioquímicos, moleculares
y celulares) pueden afectar la síntesis de los alcaloides y
explicar las diferencias observadas entre la expresión génica y
la acumulación de A81s en algunos tejidos (Fig. 4.1 O).
Complejos mecanismos regulatorios operan sobre la síntesis
de alcaloides en las diferentes especies productoras de estos
compuestos. Por ejemplo, en P. somniferum y T. flavum la NCS
despliega una cooperatividad positiva en la que la unión de la
dopamina facilita la unión del 4-HPAA (Samanani y Facchini,
2001, 2002). Sin embargo, estos resultados no concuerdan con
el análisis estructural del sitio catalítico, por lo que es necesario
un mayor estudio (llari et al. , 2008; 8erkner et al. , 2008). Por su
parte, los factores ambientales y de desarrollo también pueden
modificar el contenido de alcaloides. En dos cultivares de P.
106
somniferum, productores de ABis, se observó una expresión
diferencial de bbe1 en los tejidos analizados (Facchini y Park,
2003).
Estas diferencias en los patrones de expresión no solo ocurren
a nivel tisular, sino también celular. En T. flavum, la expresión
máxima de la ncs se encuentra en el rizoma y el peciolo, pero
estos tejidos no corresponden a los sitios de la actividad
enzimática que se han localizado en la raíz, seguido del rizoma
y por último en peciolo. Estos datos sugieren que la proteína
con actividad de NCS es trasportada entre los diferentes tejidos
(Samanani y Facchini , 2002). En este sentido , la NCS de T.
favum presenta un péptido señal que podría funcionar como un
péptido de tránsito (Samanani et al. , 2004).
La expresión y actividad de la BBE en la raíz, tallo y brotes de
P. somniferum sugiere que intermediarios de la síntesis de
sanguinarina pueden ser transportados desde la parte aérea a
la raíz (Facchini, 2001 , Facchini y Park, 2003). De igual modo,
la propia enzima puede ser transportada entre diferentes
compartimentos celulares. Esto ha sido demostrado con la
fusión del péptido señal de la BBE de P. somniferum con una
proteína reportera, observando el trasporte de la misma al
retículo endoplasmático y la vacuola (Bird y Facchi, 2001 ).
La complejidad celular involucrada en la síntesis de ABis ha
quedado demostrada en los últimos años y se ha descrito que
los. sitio de síntesis y el lugar de acumulación de los ABis
puede variar en diferentes especies. Por ejemplo, en P.
somniferum los alcaloides morfinanos y benzofenantridinas
(morfina y sanguinarina) se localizan en las células laticíferas
adyacentes a los tubos cribosos, mientras que los transcritos
involucrados (6'0MT, CNMT, NMCH, 4'0MT, BBE, SAT, COR;
Fig. 1.3) y las enzimas correspondientes se encuentran en la
células acompañantes y en los tubos cribosos del floema,
respectivamente (Samanani et al., 2006). Estos resultados
sugieren que las proteínas con actividad enzimática son
ensambladas en las células acompañantes y que
posteriormente son transportadas a los tubos cribosos para la
107
síntesis de los alcaloides, que por último son acumulados en
las células laticíferas (Samanani et al. , 2006). Por otro lado, en
T. flavum los alcaloides de tipo protoberberina (berberina) se
localizan en la endodermis de la raíz y en la corteza y medula
del tallo, mientras que los transcritos para TYDC, NCS, 6'0MT,
CNMT, 4 ' 0MT, BBE, SOMT se encuentran en la endodermis
inmadura de la raíz y en la protodermis de los primordios
florales del rizoma (Samanani et al., 2005).
En A. mexicana, la localización por fluorescencia de los
alcaloides de tipo benzofenantridina y protoberberinas en la
raíz y tallo, muestra que estos compuestos se acumulan en el
periciclo y en la endodermis de la raíz, mientras que en el tallo
se observan principalmente en el tejido vascular, seguido de
células en la corteza y en la endodermis (Fig. S3, datos
complementarios). Ahora bien, PCR in situ de los mensajeros
correspondientes a la NCS (NCSAm1 y NCSAm2) y BBE
(BBEAm1 y BBEAm2) sugieren que los transcritos se
encuentran en el periciclo de la raíz y en floema del tejido
vascular del tallo (Rubio-Piña y Vázquez-Fiota, datos en
preparación). Estos resultados en conjunto sugieren que los
sitios de síntesis y acumulación de alcaloides están temporal y
espacialmente separados y apuntan hacia una organización
que implica un transporte intra e inter-celular de intermediarios,
productos y enzimas biosintéticas.
De esta manera, considerando la estrecha relación filogenética
encontrada entre las enzimas biosintéticas de los ABis en las
diferentes especies analizada, (Fig 4.5; 4.6), la localización de
estas mismas enzimas en diferentes tipos celulares en estas
especies, sugiere que las rutas biosintéticas pudieron migrar
completas, pero que adquirieron características regulatorias
propias en las diferentes especies (Facchini y De Luca, 2008).
Finalmente, es interesante hacer notar el alto contenido de
sanguinarina en la semilla madura. La presencia de este
alcaloide podría explicarse como el trasporte de la raíz hacia
las partes aéreas, a través del tejido vascular. No obstante, la
síntesis de este alcaloide también podría ocurrir en otros
108
tejidos, como la propia cápsula o en la semilla durante su
maduración. En este sentido, trabajos previos de nuestro
laboratorio han reportado la ausencia de sanguinarina en el
látex y en tallos de A. mexicana (Carrillo-Pech, 2006) al igual
que en dos cultivares de P. somniferum (Frick et al., 2005). De
este modo, es probable que los alcaloides detectados en la
semilla no hayan sido transportados desde la raíz, sino que la
cápsula haya participado en su formación, para que
posteriormente, se acumulen en la semilla. La presencia de
niveles importantes de los transcritos de NCS y BBE en las
semillas inmaduras (Fig. 4.1 0), sugiere que este tejido tiene la
capacidad de participar en la síntesis, al menos parcialmente,
de este alcaloide. Como alternativa, intermediarios posteriores
a la acción de la BBE, podrían ser transportados de la semilla
inmadura hasta la cápsula en los que se llevarían los pasos
subsiguientes. Es interesante notar que las enzimas, tanto
anteriores como posteriores a la acción de la BBE, (4'0MT y
SAT; Fig. 1.3 y 1.4), se han inmunolocalizado en los carpelos
de cápsulas de P. somniferum, lo que indica que este tejido
tiene una capacidad biosintética (Weid et al., 2004).
4.3.4.2. Análisis de la expresión de los mensajeros de

plántulas en desarrollo (post-emergencia)
Durante el desarrollo de plántulas de P. somniferum, ocurre un

incremento en la acumulación de ABis (Huang y Kutchan,
2000; Facchini y Park, 2003). Con el fin de conocer los
patrones de síntesis de alcaloides en plántulas de A. mexicana,
se realizó un análisis temporal, durante 21 días de desarrollo
post-emergencia de plántulas (Fig. 4.11; 4.12). Se debe
mencionar que, en las condiciones ensayadas, fueron
necesarias cuatro semanas antes de la emergencia de la
radícula.
El análisis cromatográfico de extractos obtenidos de las
plántulas completas, mostró la presencia de sanguinarina
desde los primeros días después de la emergencia de las
radículas. Este alcaloide se mantuvo en niveles altos, cercanos
109,
a los 3.6 mg g-1 PS durante los primeros 6 días (Fig. 4.11A).
Posterior a éste, se observó una ligera disminución (3.0 mg g- 1
PS) al día 15, para aumentar nuevamente. En contraste, la
presencia de berberina, en niveles de 0.45 mg g- 1 PS, sólo de
observó hasta 18 días después del inicio del experimento (Fig.
4.11 A). La aparición de la berberina y la disminución de la
sanguinarina, estuvo asociada con la elongación del hipocotilo
y el desarrollo de la parte aérea. En plántulas de P. somniferum
también ocurre un cambio en el patrón de acumulación de A81s
durante los primeros 20 días de desarrollo (Huang y Kutchan,
2000).
Los transcritos correspondientes a las dos NCS (NCSAm1 y
NCSAm2), así como de las dos 88E (88EAm1 y 88EAm2) se
mantuvieron elevados durante los primeros 6 días (Fig. 4.118).
Al noveno día, se observó un cambio interesante ya que
solamente se pudieron detectar los transcritos
correspondientes a la NCSAm2 de manera abundante (Fig.
4.118). Sin embargo, al día 12, junto con la emergencia de los
cotiledones (Fig. 4.118, panel superior) nuevamente se
pudieron detectar los cuatro transcritos analizados (Fig. 4.118,
panel inferior). La amplificación de la actina fue utilizada como
control de carga y amplificación, lo que sugiere que estos
resultados no son producto de un artefacto y confirman la
disminución diferencial de los transcritos detectada al noveno
día (Fig. 4.118). De igual forma, se realizó la amplificación
combinada de la 88EAm2 y actina, así como del gen
correspondiente al ARN ribosomal 18s, corroborando estos
resultados (Fig. S4, datos complementarios).
La disminución del contenido de sanguinarina entre los días 6 y
15, además del desarrollo de la parte aérea de las plántulas,
puede estar asociadas con los niveles bajos de expresión de la
NCS y 88E al día 9 (Fig. 4.11 ). En este sentido, la variación de
la acumulación de alcaloides y los transcritos son consistentes
con lo reportado en plántulas de P. somniferum (20 días
después de la germinación) donde se ha demostrado que
ocurren cambios en el contenido de alcaloides conforme
110
aumenta el desarrollo (Facchini y Park, 2003; Samanani et al.,
2006). De igual modo, en P. somniferum, la acumulación de los
transcritos precede a la presencia de enzimas biosintéticas de
ABis, donde la máxima acumulación de estas se encuentra al
día 7 manteniéndose hasta el día 16 (Samanani et al. , 2006).
Para profundizar estos resultados, se realizó otro análisis con

plántulas en etapas más avanzadas, con los cotiledones
abiertos. Para esto, las plántulas fueron separadas en radículas
y parte aérea (hipocótilos y cotiledones) y se analizó la
acumulación de alcaloides en ambas partes (Fig. 4.12A).
En estas etapas, se pudo detectar la acumulación de berberina,
tanto en la parte aérea como en la radícula. Conforme las
plántulas se desarrollaron aumentó la acumulación de los dos
alcaloides analizados (Fig. 4.12A). Estos aumentos
coincidieron con la expansión de los cotiledones y la formación
del primer par de hojas verdaderas (Fig. 4.128). Es interesante
hacer notar que, aunque la berberina se distribuyó por toda la
plántula, la acumulación fue mayor en las partes aéreas. Por su
parte, la sanguinarina solo se detectó en la radícula (Fig.
4.12A).
111
A c:::J s~neu in;or in~
-lle rber ín ~
4.0
1Z 15 18
Días después de la cerminación
---
3 6 9 12 15 18
NCSAm1
- --
NCSAm2
----- -..---
BBEAm1
--·-·- - -· .
BBEAm2
Actlna
--- ---
-------
después de la germinación de semillas de Argemone mexicana. A)
acumulación de sanguinarina y berberina. Las barras representan las
medias ± DE de tres experimentos independientes. Las letras (minúsculas :
sanguinarina) señalan diferencias significativas entre medias (ANOVA P <
0.001 ). El análisis se realizó de 1 a 18 días después que la radícula
emergió. B) expresión de mensajeros de la NCS y BBE por RT-PCR. La
actina se utilizó como control de carga y amplificación .
112
En estas plántulas, los transcritos correspondientes a la NCS y
88E mostraron un comportamiento similar al previamente
detectado (Fig. 4.11 8). Se mantuvieron elevados durante los
primeros 7 días, disminuyendo al día 14, para aumentar de
nuevo más tarde (Fig. 4.128). La amplificación de la actina fue
utilizada como control de carga y amplificación , lo que sugiere
que estos resultados no son producto de un artefacto, como se
comentó anteriormente (complementarios Fig. S4 y 4.11 8).
Cabe mencionar que solamente la NCSAm2 se logró detectar
al día 14. De este modo, entre los transcritos analizados,
solamente la NCSAm2 parece mantener sus niveles de
expresión constantes, independientemente del estado de
desarrollo de las plántulas (Fig. 4.11 8 y 4.128). No obstante, el
posible significado fisiológico de este comportamiento aún no
puede ser establecido. La síntesis de alcaloides en otras
especies, como la de vindolina en plántulas en desarrollo de C.
roseus muestra un comportamiento similar, ya que la actividad
de la triptófano descarboxilasa (TDC) alcanza su máximo
dentro de los primeros cinco días de germinación, desaparece
para después volver a ser detectada, una vez que el primer par
de hojas verdaderas ha emergido (Vázquez-Fiota y Miranda-
Ham, 2006). Es de notar que al día 14 del análisis el primer par
de hojas verdaderas está surgiendo (Fig. 4.12).
De esta manera, los resultados combinados de estos cursos

temporales, sugieren que la síntesis de sanguinarina puede
ocurrir completamente en la radícula, ya que este alcaloide se
detectó desde muy temprano en las plántulas, antes del
desarrollo de las partes aéreas (Fig. 4.11 ). Por su parte, la
síntesis de berberina aparentemente requiere la participación
de la parte aérea ya que solamente se pudo detectar en las
plántulas una vez que los cotiledones se habían desarrollado
(Fig. 4.11 y 4.12). Es interesante hacer notar que los niveles
altos de sanguinarina, detectados durante estas etapas, no
coinciden con lo observado en plántulas de P. somniferum,
que, en fases tempranas del desarrollo, sólo acumulan bajas
proporciones de este alcaloide, en comparación con los de tipo
113
morfina (Huang y Kutchan, 2000; Facchini et al., 1996, Facchini
y Park., 2003). De este modo, nuestros datos sugieren que los
primeros estadios de desarrollo de las plántulas de A.
mexicana podrían estar dirigidos principalmente hacia la
síntesis de sanguinarina, apareciendo la capacidad de síntesis
de berberina en etapas tardías.
Por otro lado, también la acumulación de berberina, tanto en la
parte aérea como en la radícula de las plántulas de Argemone
mexicana, difiere de lo encontrado en otras Papaveraceas, ya
que éstas no acumulan este alcaloide (Facchini, 2001 ). La
berberina se acumula principalmente en plantas de las familias
Berberidaceas y Ranunculaceas (Facchini , 2001 ). Sin
embargo, los niveles de berberina y la acumulación de los
transcritos de la NCS y BBE en las plantas de A. mexicana
concuerdan con lo reportado para T. flavum, donde se observó
la presencia de berberina y la expresión de los genes
biosintéticos en toda la planta, siendo más abundantes en el
rizoma (tallo modificado) (Samanani et al., 2002a; Samanani et
al. , 2005).
114
A
~ 3
......
";'
E 2
o
4 7 14 21
4 7 14 21
NCSAm1
1
NCSAm2
~-- --
BBEAm1 --- -. -·
BBEAm2
Actlna
1
1
--__ --__ -
, .....,_ __ . .........,.
en plantas en desarrollo de Argemone mexicana (post-emergencia). A)
acumulación de sanguinarina y berberina. Las barras representan las
medias ± DE de tres experimentos independientes. Las letras (mayúsculas:
sanguinarina; minúsculas: berberina) señalan diferencias significativas entre
medias (ANO VA P < 0.001 ). El análisis se realizó de 1 a 21 días después
que las plántulas emergen 8) expresión de mensajeros de la NCS y BBE
por RT-PCR. La actina se utilizó como control de carga y amplificación.
115
Trabajos previos de nuestro laboratorio han reportado niveles
altos de berberina en el látex de A. mexicana alrededor del 6
mg g-1 PS (Carrillo-Pech , 2006). En este sentido, la localización
de los ABis en el látex de las células laticíferas asociadas al
tejido vascular de plantas y plántulas de P somniferum sugiere
que estos alcaloides son transportados atreves del floema
durante el desarrollo de la planta (Samanani et al., 2006). La
localización de los alcaloides de tipo protoberberina en el haz
vascular de los tallos y en el periciclo de la raíz en A. mexicana
sugiere que la berberina es transportada a través del tejido
vascular (Fig. S3, datos complementarios). De esta forma, es
posible que la síntesis de la berberina en A. mexicana ocurra,
al menos parcialmente en las partes aéreas, de donde podría
movilizarse a la raíz. En este sentido, los sitios finales de
síntesis y acumulación de este alcaloide en C. japónica y T.
flavum pueden diferir, indicando la participación de sistemas de
transporte (Yazaki et al. 2008). Más aún, los sitios de
biosíntesis y de acumulación de los alcaloides de tipo
protoberberina, están temporal y espacialmente separados en
la raíz y el rizoma de C. japonica y T. f/avum (Fujiwara et al.,
1993; Samanani et al., 2002).
4.4. CONCLUSIONES
Este estudio representa el primer análisis transcripcional y de

acumulación de ABis en plantas de A. mexicana. El aislamiento
y caracterización de dos isoformas tanto de la NCS como de la
BBE nos sugiere familias génicas pequeñas que presentan
motivos conservados con NCS y BBE de otras especies, como
P. somniferum, E. californica y T. flavum. Sin embargo, la
presencia de dos isoformas de la BBE de A. mexicana difiere
de lo reportado en otras especies donde se describe solo una
enzima funcional. La relación filogenética estrecha de la NCS y
BBE con las enzimas correspondientes en especies
productoras de ABis ha permitido agruparlas en un mismo
ciado, sugiriendo un ancestro común.
116
El análisis de plántulas y plantas maduras mostró que las
benzofenantridinas (sanguinarina) y protoberberinas
(berberina) son los alcaloides mayoritarios y que se acumulan
desde etapas muy tempranas. Además, se observaron cambios
en el contenido de alcaloides conforme aumenta el desarrollo
de la planta. Un considerable grado de coordinación de los
transcritos correspondientes a las enzimas biosintéticas (NCS y
BBE) y la acumulación de los alcaloides (sanguinarina y
berberina) fue observado en plántulas y plantas maduras de A.
mexicana. Así, la expresión de la NCS y BBE mostró una
relación en general con la acumulación de los alcaloides. No
obstante, también se observaron algunas discrepancias. Por
ejemplo, la acumulación elevada de los alcaloides en la raíz
difiere de los los niveles bajos de expresión detectados para la
BBE (BBEAm1 y BBEAm2). Esto puede deberse a que existen
diferentes niveles de regulación (moleculares, bioquímicos y
celulares). En este sentido, la localización de las
benzofenantridinas y protoberberinas, así como de los
transcritos correspondientes a la NCS y BBE en distintos tipos
celulares en la raíz y tallo, sugiere el transporte intra e ínter
celular de intermediarios, productos y enzimas biosintéticas.
Más aún, la diferencia temporal y espacial de los transcritos y
alcaloides de A. mexicana indica la participación de
mecanismos parcialmente conservados con respecto a otras
especies (Papaveraceas y Ranunculaceas).
4.5. REFERENCIAS
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126
CAPÍTULO 5
EFECTO DEL JASMONATO DE METILO Y DEL

ÁCIDO SALICÍLICO SOBRE LA EXPRESIÓN DE
LA NCS Y LA BBE EN SUSPENSIONES
CELULARES DE Argemone mexicana
5.1. INTRODUCCIÓN
En su hábitat natural, las plantas frecuentemente están

expuestas a condiciones que afectan su crecimiento y
desarrollo. Estas condiciones pueden ser de origen biótico,
impuesto por otros organismos, o abiótico, que se origina por
un cambio físico o químico en el ambiente. Para responder a
estas condiciones, las plantas desencadenan un amplio rango
de reacciones que abarcan desde alteraciones de la expresión
génica, metabolismo celular, hasta cambios en la tasa de
crecimiento (Mahady et al., 1998). Entre estas respuestas,
frecuentemente se incluye la activación de las rutas de
biosíntesis de diversos metabolitos secundarios que pueden
participar en la defensa química contra microorganismos o
herbívoros (Schmeller et al., 1997). Dichas respuestas,
involucran distintas líneas de acción. En algunas de éstas,
todos los elementos necesarios se encuentran a nivel celular.
Por ello, la aplicación de condiciones de estrés, tanto biótico
como abiótico, a cultivos celulares in vitro se ha utilizado como
estrategia para incrementar la producción de metabolitos
secundarios. Esta estrategia se conoce como inducción.
La inducción de la biosíntesis de los alcaloides de tipo
benzofenantridina se ha demostrado en cultivos celulares de
Papaveraceas (P. somniferum, P. bracteatum, S. canadensis, y
E. californica) los cuales acumulan sanguinarina en respuesta a
la exposición a diferentes agentes, como los extractos fúngicos,
ácido araquidónico y a las llamadas hormonas de estrés (lgatov
et al., 1996; Schumacher et al. , 1987; Eilert et al., 1984;
Gundlach et al., 1992). El proceso de inducción de la síntesis
127
de los alcaloides involucra incremento de la expresión génica y
la actividad enzimática general. Así, las enzimas asociadas a
microsomas, como la BBE, así como citosólicas como TYDC,
NCS y DBOX son inducidas en respuesta a tratamientos
específicos (Huang y Kutchan, 2000; Ziegler y Facchini, 2008).
Por lo tanto, esta activación requiere de ciertos estímulos
externos que deben ser transportados al interior celular.
Recientemente, considerables progresos se han realizado en la
identificación de proteínas involucradas en la percepción de
señales, segundos mensajeros, así como de factores de
transcripción involucrados en la síntesis de ABis (Li et al.,
2006; Heinze et al. , 2007; Schwartze y Roos, 2008, Apuya et
al. , 2008).
En general, se ha establecido que la cadena de señalización de
eventos relacionados con la inducción del metabolismo
secundario incluyen la percepción del estímulo inicial en la
membrana celular, la internalización de éste y la participación
de mediadores químicos que conducen a la activación
transcripcional. Entre estos mediadores se encuentran
diferentes hormonas e intermediarios de cascadas de
señalización bioquímica, como los jasmonatos (JAS) y el ácido
salicílico (SA) (Zhao et al. , 2005). De este modo, la respuesta
de defensa contra patógenos (acumulación de alcaloides)
puede ser simulada mediante la administración exógena de
estos compuestos, permitiendo analizar su función como señal.
Tanto el SA como los JAS han sido empleados para el análisis
de diferentes procesos de regulación en la inducción de los
alcaloides benzofenantridina (Facchini, 2001 ; Farber et al. ,
2003 Cho et al. , 2007). Así, en los últimos años se ha logrado
demostrar que la inducción de la biosíntesis de sanguinarina en
cultivos de E. californica está mediada por los JAS y por la
acidificación del citosol , con la participación de dos posibles
rutas de señalización independientes (Roos et al., 2006). Por
su parte, el SA se ha utilizado menos para inducir la síntesis de
los ABis. En cultivos de E. californica produce la acumulación
de sanguinarina promoviendo la actividad de las enzimas
128
biosintéticas (lgnatov et al., 1996; Cho et al., 2007), lo que
sugiere podría actuar como molécula señal incrementando la
expresión génica de estas enzimas. En general, la capacidad
del SA para inducir la síntesis de los ABis es menor de lo
reportado para los JAS, sugiriendo que estos dos compuestos
actúan mediante mecanismos diferentes (Cho et al., 2008). Por
su parte, la aplicación de JAS a cultivos de P. somniferum no
conduce a la acumulación de sanguinarina, aunque sí activa la
transcripción de algunos genes biosintéticos, proponiendo que
esta molécula actúa como señal solamente para algunos de los
pasos biosintéticos (Facchini et al., 1996a; 1996b).
El objetivo de este capítulo es evaluar el efecto del jasmonato
de metilo (MEJA) y del ácido salicílico (SA) sobre la síntesis de
sanguinarina y la expresión génica de la norcoclaurina sintasa
(NCS) y la enzima formadora def puente de la berberina (BBE)
que son dos de las enzimas propuestas como puntos
regulatorios para la síntesis de ABis (Fig. 1.3).
5.2 MATERIALES Y MÉTODOS
Las suspensiones celulares que se utilizaron corresponden a la

línea AmMiF y fueron inducidas a partir de callos friables de
hoja y se han mantenido en medio PC (Phillips y Collins, 1979),
a pH 5.5, adicionado con 25 g/L de sacarosa y con 1.5 mg/L de
ácido naftalénacetico (ANA) y 0,. 5 mg/L de 6-bencilaminopurina
(BAP) en condiciones de cuarto de cultivo a 25°C y bajo luz
continua entre 40 y 50 ¡.Jmol m·2 s· 1 (lámparas fluorescentes de
39 W), con una agitación continúa de 100 rpm (Campos-
Tamayo, 2002).
La extracción del ARN total se realizó a partir de 1 g (PF) de

células, molidas en presencia de N2 líquido, con el reactivo
129
Trizol, de acuerdo a las modificaciones publicadas por Rubio-
Piña y Vázquez-Fiota, (2008).
5.2.3. Análisis de la acumulación de los transcritos para

NCS y BBE por hibridación tipo northern.
El análisis tipo northern blot se realizó utilizando 15 IJg de ARN

total de los diferentes tejidos y tratamientos utilizados (Rubio-
Piña y Vázquez-Fiota, 2008). El ARN fue fraccionado en un gel
desnaturalizante de agarosa al 1% con formaldehído al 15%,
utilizando MOPS 20 mM como amortiguador (MOPS es ácido
3-(morfolino) propanosulfónico ), 50 mM acetato de sodio, 1O
mM EDTA, pH7). La separación electroforética se llevó a cabo
empleando 50 V durante 4 h (Sambrook et al., 1989).
Posteriormente, el ARN se transfirió por capilaridad a una
membrana de Nylon N+ (Amersham) usando SSC 20X (SSC
1X es 8.7 g de citrato de sodio y 1 g de cloruro de sodio, pH 7)
y se fijó a la membrana usando un Stratalinker UV Crosslinker
2400 (Stratagene, La Jolla, CA). Como sonda se utilizaron las
clonas NCSAm1 (340 pb) y BBEAm1 (1260) marcadas con
digoxigenina (ver Capítulo 4). El marcado de la sonda se llevó
a cabo por PCR. Para la hibridación, las membranas fueron
incubadas con las sondas a 42° C durante 24 h en una solución
Dig easy hyb, de acuerdo a las instrucciones del proveedor
(Roche Applied Science). Después de la hibridación, las
membranas se lavaron dos veces en SSC 1X con SOS 0.1% a
temperatura ambiente por 5 min, y dos veces con 0.5X SSC
con 0.1% SOS a 65°C por 15 min. La detección se realizó
usando el paquete Dig Juminescent Detection Kit (Roche
Applied Science) según las instrucciones del fabricante.
5.2.4. Inducción de la síntesis de alcaloides en cultivos in

vitro de Argemone mexicana
Estos experimentos se realizaron en dos etapas. La primera de

ellas fue un análisis dosis-respuesta evaluando un tiempo fijo
de 24 h para los cultivos celulares expuestos tanto a jasmonato
130
de metilo (MEJA) como ácido salicílico (SA) (ambos de Sigma-
Aidrich Chemical Co). Para esto, se utilizaron cultivos de 10
días después del sub-cultivo que fueron expuestos a
tratamientos con O (testigo), 100, 250 y 500 IJM de cada
inductor. Los testigos recibieron los disolventes
correspondientes (HzO y ETOH para SA y MEJA,
respectivamente). Una vez transcurrido el tiempo del
tratamiento, los cultivos fueron cosechados por filtración y
almacenados a -aooc hasta su análisis. Estos experimentos
permitirían definir la concentración óptima para la inducción. La
segunda etapa consistió en utilizar la concentración a la cual el
inductor produjo el aumento máximo en la acumulación de
alcaloides. En este caso, se realizó un curso temporal
aplicando dicha concentración a cultivos de la misma edad
durante un periodo máximo de 120 h. Las muestras se
colectaron a las O, 6, 12, 24, 48, 72, 96 y 120 h. Los cultivos
fueron cosechados por filtración y almacenados a -aooc hasta
su análisis.
5.2.5. Extracción, identificación y cuantificación de_

alcaloides
Los alcaloides se obtuvieron mediante una extracción ácido-

base de acuerdo a la metodología descrita por Monforte-
González et al., (1992), con algunas modificaciones.
Brevemente, (100-200 mg) de tejido liofilizado fue
homogenizado en 15 mi de metano!: HCI 5% (v/v) e incubado a
45°C, con agitación durante 2 h. Después de este tiempo el
extracto fue centrifugado, tomando 500 !JI de la suspensión y
evaporando a sequedad a presión reducida. El residuo se
resuspendió en 100 !JI de metano l. La separación de los
alcaloides se realizó mediante cromatografía de capa delgada
utilizando placas de sílice (cromatofolios de gel de sílice 60Fzs4.
Merck), utilizando los diferentes sistemas reportados (Carrillo-
Pech, 2006). Para la identificación de los alcaloides separados
se utilizaron estándares de berberina y sanguinarina (Sigma-
Aidrich Chemical Co ). La cuantificación de los alcaloides se
131
realizó por densitometría in situ sobre placas cromatográficas,
utilizando el método de estándar externo y un densitómetro
Shimadzu CS-930 equipado con un graficador (DR-2). Las
lecturas en el densitómetro se hicieron por barrido lineal de
cada carril y la concentración se determinó comparando el área
del pico de las muestras contra el área de los picos obtenida
aplicando concentraciones conocidas de los estándares. Los
alcaloides fueron detectados por fluorescencia a una longitud
de onda (,\) de 300 nm (Carrillo-Pech , 2006).
5.2.6. Análisis estadístico
Los datos del contenido de alcaloides (mg) fueron

estandarizados con el peso seco del tejido vegetal extraído ,
utilizando el programa Microsoft Excel 2007 (Microsoft,
Redmond, WA, USA). Los gráficos fueron elaborados utilizando
el programa SigmaPiot v.1O (Systat Software lnc. , San Jose,
CA, USA). Se analizó la diferencia de medias de los contenidos
de alcaloides entre tejidos y tratamientos mediante el análisis
de varianzas (ANOVA de una vía) con la prueba de
comparación de Holm-Sidak, utilizando el programa SigmaStat
v. 3.1 (Systat Software lnc., San Jose, CA, USA).
5.3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Las suspensiones celulares se obtuvieron a partir de callos

friables, previamente obtenidos de hoja (Campos-Tamayo,
2002). El cultivo presentó una fase de adaptación hasta el
quinto día y posteriormente se observó una ganancia de peso
seco, con un crecimiento continuo y con una acumulación de
sanguinarina de alrededor de 0.5 mg/g PS durante el ciclo de
cultivo (Fig. 5.1 ). La capacidad de la suspensión para producir
este alcaloide, sin ser expuesta a condiciones de inducción,
contrasta con lo reportado para otros cultivos celulares de
Papaveraceas, que solamente lo hacen en respuesta a la
exposición a ciertos agentes (Eilert et al., 1986; Schumancher
et al., 1987; Mahady y Beecher, 1994; Cline y Coscia, 1988).
132
1.0 , - - - - - - - - - - - - - - ,
1 • PSAWWif 1
0.8
1.5
K'
~ o.e
~
"
rJJ .E 1.0
~
a.
0.4 ~
·s
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~ 0.5
02
0 .0 +----.---..--~----.-------.-.,.----,---..-----l
o 8 tl ~ ~ ~ ~ ~ ~
10 15 20 30
Usmpo (días)
Tiempo (dlas)
Figura 5.1. Curva de crecimiento y acumulación de sanguinarina de la

suspensión celular AmMiF de A mexicana durante un ciclo de cultivo.
El efecto inductivo de MEJA y SA es dependiente de la fase de

crecimiento en la que se encuentra un cultivo celular. Esto
quedó demostrado al cuantificar el contenido de alcaloides
totales en suspensiones celulares de E. californica al ser
inducidas con MEJA y SA observando que la máxima
respuesta de inducción fue dada en los primeros días de la
fase exponencial de crecimiento (Cho et al., 2007). Esta
respuesta es similar en cultivos de Catharanthus roseus y
Taxus canadensis (Ketchum et al. , 1999).
Con base en lo anterior se evaluaron los efectos de MEJA y SA
sobre la acumulación de sanguinarina en suspensiones
celulares de A. mexicana a los 1O días de cultivo, que es
alrededor del inicio de la fase de crecimiento exponencial (Fig.
5.1A). Para ello, se realizó un primer experimento de dosis-
respuesta utilizando la línea AmMiF. Los cultivos fueron
expuestos a distintas concentraciones de cada inductor (MEJA
y SA) durante 24 h, tiempo al que fueron cosechados y
analizados (Fig. 5.2). No se observaron cambios aparentes en
el aspecto entre el testigo y los cultivos tratados con ambos
inductores. En cuanto a la acumulación de alcaloides, no se
detectaron aumentos significativos, sin embargo, el tratamiento
de 100 ~M de MEJA produjo apenas un aumento de 20% de
sanguinarina con respecto al control (Fig. 5.2A). Por su parte,
133
en los cultivos expuestos a las concentraciones mayores de
MEJA y SA (250 y 500 !JM), el contenido de alcaloides se
redujo en comparación con los testigos (Fig. 5.2).
A b
B
2.5 a
u
(/)
Q. ~ 2.0
":' •.,.
"' Ir u
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..
e
'1:;
e ~1.0
lo.s 1!'
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.
(/)
.:1 0.5
0.0 o.o
o 1~ 2~ ~ o 1~ 2~ 5~
MEJAIOM SAIOM
Figura 5.2. Acumulación de sanguinarina en suspensiones celulares de A.

mexicana expuestas a jasmonato de metilo (A) y ácido salicílico (8). Las
suspensiones fueron tratadas con O, 100 IJM, 250 IJM y 500 IJM de MEJA y
SA durante 24 h. Las barras representan las medias ± DE de tres
experimentos independientes . Las letras (minúsculas : sanguinarina) señalan
diferencias significativas entre medias (ANOVA P < 0.001 ).
En cultivos de E. californica y S. canadensis se ha observado

que la exposición a concentraciones de 100 1-1M de MEJA
durante un curso temporal de 136 h, produce la acumulación
de sanguinarina a partir de 6 h de tratamiento y continua
aumentando a lo largo del experimento (Gündlach et al., 1992;
Farber et al., 2003). No obstante, en estos cultivos solamente
se detectaron trazas del alcaloide antes de la inducción, a
diferencia de la línea AmMiF de A. mexicana, la cual tiene
niveles importantes de sanguinarina en condiciones de
mantenimiento. De este modo, es posible que la baja respuesta
de la línea AmMiF se deba a que en ausencia de un estímulo
externo, es capaz de mantener un metabolismo activo para los
alcaloides.
134
Con el fin de confirmar esto, se analizaron diferentes tiempos
de exposición, hasta las 120 h, utili:z;ando 100 ~M de ambos
inductores (Fig . 5.3). Las condiciones fueron similares a las
anteriores y se incluyeron cultivos expuestos a etanol (ETOH) y
agua (H 2 0) como testigos. En estas condiciones se observaron
efectos mínimos sobre el crecimiento de los cultivos (datos no
mostrados). No obstante, la exposición a 100 ~M de MEJA
produjo la inducción de sanguinarina, alcanzando una
acumulación máxima de 2.15 mg g·1 PS después de las 48 h
(Fig. 5.3A). Estos valores son aproximadamente el doble del
contenido de los cultivos, antes de ser expuestos al inductor.
Estas cantidades se encuentran entre las max1mas
concentraciones reportadas para cultivos inducidos de E.
californica, P. somniferum y S. canadensis (Gundlach et al.,
1992; Eilert et al., 1985; Mahady et al. , 1998). Por el contrario,
los cultivos expuestos a 100 ~M de SA presentaron cambios en
la acumulación de sanguinarina sólo después de las 72 h con
respecto a los testigos (Fig. 5.3A) y en menor medida que en
los cultivos expuestos a MEJA. Esto es similar a lo encontrado
en cultivos de E. californica y S. canadienses (lgnatov et al. ,
1996, Cho et al., 2007). El bajo nivel de inducción producido
por este compuesto, sugiere que posiblemente se deba a un
efecto indirecto.
135
B Curso temporal MEJA (h)
o 6 12 24 48 72 96
Ncal
A
111
_, 1 J J 1 J J J ]
2 .5 Cuf!O tempora.l SA (h)
o 6 12 24 48 72 96 120
2.0 Nca l
V) P=================~
-- -
Q,.
111
":'
...
-----------
'"'1 .5
.E
e: Curso tempora.l ETOH (h)
~--
·~ 1.0 o 6 12 24 48 72 96
...
·:;
e:
~ 0.5
0.0
o 20 40 eo ao 100 120
Tlempo(h) o 6 120
NCa l
~==============9
- ----·-----
111
...... ...... ...... ---

....... ..,._. ._... ~,....
Figura 5.3. Acumulación de sanguinarina y análisis de expresión de la NCS

y BBE en suspensiones celulares de Argemone mexicana inducidas con
jasmonato de metilo y ácido salicílico. A) Cuantificación de sanguinarina.
Las barras representan las medias ± DE de tres experimentos
independientes. Un asterisco (sanguinarina) señala diferencias significativas
entre medias (ANOVA P < 0.001 ). B) expresión de mensajeros para NCS y
BBE. Las suspensiones fueron tratadas con 100 1-1M de MEJA y SA durante
120 hr. Los transcritos fueron detectados por northern blot, utilizando
sondas marcadas con digoxigenina. El ARN ribosomal se utilizó como
control de carga.
Los niveles de los transcritos para NCS y BBE fueron

consistentes con la acumulación de sanguinarina, ya que en los
cultivos expuestos a MEJA se observó un aumento de éstos
(Fig. 5.3). Por otro lado, ocurrió una diferencia en los patrones
de expresión de estos genes. Los transcritos para la NCS
mostraron su nivel máximo entre las 24 y 96 h, mientras que
los de la BBE los alcanzaron desde las 6 h, para disminuir
136
posteriormente. Estos patrones son similares a los obtenidos
en otros sistemas (Dittrich y Kutchan, 1991; Kutchan y Zenk,
1993), si bien no de la misma magnitud. Se observó un ligero
aumento en los niveles de los transcritos de la NCS y BBE
entre las 12 y 48 ·h en los cultivos expuestos a SA. Este lígero
aumento coincidió con el también ligero aumento en el
contenido de sanguinarina a las 72 h (Fig. 5.3). Los testigos por
su parte, no presentaron aumento en los transcritos, a lo largo
del experimento.
En conjunto, estos resultados indican que MEJA fue capaz de
producir la inducción de la síntesis de sanguinarina, causando
la activación transcripcional de genes relacionados con este
alcaloide. El SA por su parte, también parece tener un efecto
sobre la síntesis de este alcaloide. Sin embargo, esta molécula
señal parece estar involucrada principalmente con otros
mecanismos de defensa, como la resistencia sistema adquirida
(SAR) (Zhao et al., 2005). Por otro lado, los niveles de los
transcritos detectados (NCS y BBE) en los testigos a lo largo
del curso temporal, son consistentes con la acumulación de
sanguinarina en los cultivos aun en condiciones de
mantenimiento (Fig. 5.1; 5.3). En este sentido, la presencia de
los transcritos correspondientes a enzimas biosintéticas de
ABis en cultivos de A. mexicana bajo estas condiciones difiere
de lo reportado en P somniferum y E. californica, donde la
presencia de estos genes es nula y se requiere la aplicación de
un estímulo (Haider et al., 1997; Facchini y Park 2003).
Algunos cultivos responden de manera diferencial a los
tratamientos de inducción que promueven la acumulación de
sanguinarina. Así, en E. californica, MEJA puede inducir la
acumulación del alcaloide mientras que en P. somniferum, no
lo pueden hacer, aunque éstos sí responden a los
homogenados fúngicos (Farber et al., 2003, Gundlach et al.,
1992; Facchini et al., 1996a; 1996b). De igual forma, en cultivos
de E. californica y S. canadiensis el SA logró inducir la síntesis
de ABis sin embargo, la respuesta fue menor comparada con
MEJA (Cho et al. , 2007; lgnatov et al., 1996). La combinación
137
de SA y MEJA tiene un efecto sinérgico sobre la síntesis de
sanguinarina en cultivos de E. californica, en los que se
propone que la combinación de inductores afecta distintas rutas
de señalización (Cho et al. , 2007). La combinación de
resultados sugiere que los cultivos de A. mexicana conservan,
al menos parcialmente, el mecanismo de inducción por MEJA.
No así el mecanismo en que participa SA. La inducción de la
biosíntesis de ABis en cultivos de E. californica ocurre a
concentraciones de 0.2 a 1 ¡.Jg/ml extracto de levadura. Esta
concentración es menor que el umbral requerido para estimular
los eventos asociados a la respuesta hipersensible (Roos et al.,
1999). De esta manera, dicho aumento en la síntesis de
alcaloides parece relacionado con una acidificación del citosol,
estableciendo dos posibles rutas de señalización que no
relacionan directamente al SA (Roos et al. , 1998).
Por su parte, análisis de los promotores de la TYDC y BBE de
P. somniferum y E. californica han mostrado secuencias
conservadas, que son necesarias para su activación
coordinada durante la inducción (Park et al., 1999; Hauschild et
al. , 1998). Además, se ha descrito la existencia de un regulador
transcripcional común (WRK1) que podría controlar la
expresión de múltiples genes de la síntesis de berberina en
cultivos de C. japonica (Kato et al., 2007). Esto podría sugerir la
existencia de secuencias y factores de transcripción maestros,
como ocurre para la síntesis de alcaloides del tipo monoterpén-
indólicos de Catharanthus roseus (Van der fits y Memelink J,
2000). En este sentido, los factores de transcripción pueden
influir en la expresión de varios genes relacionados en una ruta
de síntesis aumentando el flujo hacia un metabolito
determinado.
5.4. CONCLUSIONES
Los cultivos in vitro son un modelo ventajoso para el estudio de

la biosíntesis de metabolitos, los cuales permiten analizar los
factores que participan en una vía de señalización. El
establecimiento de suspensiones celulares de A. mexicana,
138
permitieron el estudio de la producción de alcaloides de tipo
benzofenantridina y de las moléculas que podrían participar
como segundos mensajeros en el proceso. La línea AmMiF de
células en suspensión de A. mexicana acumula sanguinarina
en condiciones de mantenimiento y esto podría estar asociado
con la presencia de los transcritos de la NCS y BBE. Esto
difiere de lo reportado para las suspensiones de P. somniferum
y E. californica, las cuales acumulan este alcaloide sólo
después de haber sido inducidas.
Por su parte, los compuestos relacionados con rutas de

señalización (como MEJA y SA) presentaron un efecto
diferencial en la acumulación de sanguinarina y de los
mensajeros analizados. Los resultados sugieren que MEJA
estimula la producción de sanguinarina, lo cual fue confirmado
por incremento en la expresión de los genes correspondientes
a las enzimas biosintéticas NCS y BBE. Sin embargo la forma
de acción de MEJA no ha sido detallada, aunque requiere la
acumulación de los transcritos para la NCS y la BBE. En este
sentido, aún falta por descubrir cuáles son los eventos que
participan desde la percepción del estímulo en la membrana
celular y los factores transcripcionales que están involucrados
en la síntesis de ABis.
5.5. REFERENCIAS
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144
CAPÍTULO 6
DISCUSIÓN GENERAL Y PERSPECTIVAS
Se estima que aproximadamente el 20% de las especies de

plantas superiores producen alcaloides y estos compuestos
presentan una enorme diversidad estructural, a pesar de que
son prácticamente derivados de un número limitado de
aminoácidos (Buchanan et al., 2000). Desde el descubrimiento
de la morfina en 1806, se ha establecido la estructura y
actividad biológica para más de 12,000 alcaloides (Facchini,
2001 ). En términos generales, se conocen las rutas de síntesis
para algunos alcaloides de relevancia, como la morfina, la
nicotina y la vinblastina, entre otros. En consecuencia, muchas
de las enzimas que intervienen en estos procesos han sido
identificadas, aisladas, caracterizadas y en muchos casos
clonadas. No obstante, muchas de estas rutas biosintéticas
siguen estando incompletas y la comprensión de los
mecanismos que controlan el inicio y el flujo de la biosíntesis
de los alcaloides es relativamente escasa, debido a que las
plantas que los producen son , en muchos casos, silvestres, y
por lo tanto, de acceso limitado temporal o geográficamente.
Sin embargo, en el caso de los alcaloides, muchas rutas
comparten similitudes, dentro de una misma familia taxonómica
(Wink, 2003). Esto permite aplicar el conocimiento que ya se
tiene en una especie para el análisis en otra. Tal es el caso
entre A. mexicana y P. somniferum, ya que ambas pertenecen
a la familia Papaveraceas. No obstante, estas dos especies se
han desarrollado en hábitats diferentes, A. mexicana es
originaria de América y se considera una planta silvestre,
mientras que P. somniferum es nativa del oriente medio y ha
sido sujeta al mejoramiento para la producción de morfina.
A. mexicana es una planta capaz de sintetizar ABis que han
sido utilizados para el tratamiento de diferentes afecciones. En
las zonas rurales, su uso aún se recomienda para el
tratamiento de malaria, infecciones cutáneas y dolor en general
145
(Willcox et al. 2007, Sánchez-Mendoza et al. 2008). No
obstante, a pesar de que se conoce gran parte de su
composición química, así como los efectos farmacológicos de
los alcaloides que contiene, poco se sabe del proceso que
involucra el balance entre la capacidad de síntesis y
degradación de los mismos (Lozoya y Lozoya, 1982). El interés
de este trabajo estuvo centrado en proporcionar las bases para
realizar estudios moleculares que nos permitan entender el
proceso de síntesis de los ABis en una planta de importancia
en la medicina tradicional mexicana, con el fin de establecer el
conocimiento que nos permita proponerla como un modelo de
estudio para el uso adecuado de A. mexicana como fuente de
compuestos médicos.
Argemone mexicana expresa dos transcritos de NCS y

BBE
La elucidación de las rutas de síntesis de los alcaloides se ha
enfrentado a muchas dificultades, principalmente por la
concentración baja de las enzimas, la limitada disponibilidad de
sustratos o cofactores para el desarrollo de ensayos
enzimáticos y porque estos compuestos no son producidos por
las plantas modelo empleadas par en estudios genómicos. De
esta manera, los genes que codifican para estas enzimas se
aislaron a través del conocimiento previo de las secuencias de
péptidos determinada a partir de las enzimas purificadas. Una
estrategia alternativa, es la clonación de genes de interés
basados en la homología con secuencias reportadas
previamente (Hashimoto y Yamada, 2003).
Siguiendo esta estrategia, se diseñaron cebadores basados en

dominios conservados para secuencias previamente
reportadas, en P. somniferum, E. californica y T. f/avum, para
las enzimas norcoclaurina sintasa (NCS) que sintetiza la (S)-
norcoclaurina, el primer precursor central de los ABis y la
enzima formadora del puente de la berberina (BBE), que
cata liza la formación de ( S)-escoulerina, punto de ramificación
146
de estos alcaloides (Fig. 1.3; 3.2). El empleo de la metodología
de RT-PCR utilizando ARNm de raíz, nos permitió aislar
fragmentos de ADNcs de 305 y 1125 pb correspondientes a la
NCS y BBE respectivamente (Fig 3.4; 3.6). Estas secuencias,
tuvieron una identidad alta con las reportadas para otras
especies productoras de ABis, en base a estas se diseñaron
cebadores que permitieron la amplificación de los ADNcs
completos (extremos 5, y 3 ') de la NCS y BBE utilizando la
metodología RACE (Fig. 3. 7). Con las secuencias de A.
mexicana, se lograron identificar dos isoformas de la NCS de
1035 y 927 pb llamadas NCSAm1 y NCSAm2,
respectivamente. El marco de lectura abierta correspondiente
es de 275 y 220 residuos (Fig. 3.9; Capitulo 4). De igual modo,
se aislaron dos isoformas de la BBE de 1771 y 1718 pb
denominadas BBEAm1 y BBEAm2, respectivamente. El marco
de lectura abierta correspondiente es de 554 y 536 residuos
(Fig. 3.11; Capítulo 4).
En estas secuencias se identificaron todas las regiones

regulatorias características de las NCS y BBE reportadas (Figs.
4.1 y 4.3). Así, la comparación de la secuencia de aminoácidos
de las NCS de Argemone, reveló de un 50 a 75 % de identidad
con las de P. somniferum (Cuadro 4.3). De igual forma, se
observó homología con proteínas relacionadas con
patogénesis PR-1 O y alergénicas Bet-v1.
Por su parte, las secuencias de la BBE mostraron entre el 60 y

el 75 % de identidad con las de P. somniferum, E. californica,
B. stolonifera y T. f/avum (Cuadro 4.4). Más aun, de acuerdo a
su característica como flavoproteínas, las BBE aisladas
presentaron homología para diversas proteínas dependientes
de FAD.
147
Un origen monofilético para la NCS y la BBE de Argemone
mexicana
Un análisis filogenético , utilizando en cada caso más de 25

secuencias, sugirió un origen evolutivo monofilético, tanto para
las NCS y BBE de A. mexicana, debido a que la topología de
los ciados correlacionó con las de P. somniferum, E. californica,
B. stolonifera y T. flavum (Figs. 4.5 y 4.6). Estos resultados han
sido reportados por Liscombe et al. (2005) en la caracterización
de secuencias de la NCS y BBE de P. somniferum y así como
con los de Samanani et al (2004) en T. flavum. En ambos
casos se propuso un origen ancestral común. Se debe hacer
notar que las secuencias de la NCS mostraron relación con
proteínas de defensa (Fig . 4.2), mientras que las BBE
mostraron similitud con distintas proteínas dependientes de
FAD (Fig. 4.4) lo cual sugiere que la actividad de estas dos
enzimas es el resultado de la transformación de un carácter
ancestral.
En este sentido, es interesante notar que el tratamiento con

jasmonato de metilo en cultivos in vitro de A. mexicana
promovió la acumulación de los transcritos de la NCS y BBE
(Fig. 5.3), lo que sugiere que la relación entre éstas enzimas y
las proteínas de defensa, no sería únicamente a nivel
estructural, sino que podría incluir aspectos regulatorios. Es
posible que la afinidad de algunas proteínas para interactuar
con metabolitos secundarios específicos, así como con
moléculas pequeñas, eventualmente haya conducido a la
evolución de varias funciones, como la actividad de la NCS y
BBE (Liscombe et al. , 2005). De igual forma , en el genoma de
Arabidopsis thaliana se han encontrado secuencias con
similitud con enzimas biosintéticas de ABis, que incluyen a la
NCS, BBE y N-metiltransferasas, sugiriendo que la alteración
de las rutas biosintéticas y de las enzimas que las forman,
podría conducir a la inactivación o modificación de éstas
(Facchini et al., 2004). Más aún, se ha propuesto la evolución
de la ruta biosintética de los ABis a partir de distintas familias
148
de plantas, ya que se ha detectado la actividad de la NCS en
especies que no acumulan estos alcaloides (Liscombe et al.,
2005). De esta manera, se ha sugerido que mutaciones en
genes que codifican para enzimas estructurales y reguladoras
dio lugar a la inactivación de la vía en distintas especies. Tales
cambios pudieron haber surgido como resultado de la
alteración de células especializadas o por los cambios de las
interacciones entre proteínas (Wink, 2003).
· Southern blots confirman que NCS y BBE forman

pequeñas familias génicas
El uso de los ADNcs aislados como sondas moleculares

permitió, determinar que en el genoma de A. mexicana se
encuentra un número reducido de copias para tanto NCS como
BBE (Fig. 4.8 y 4.9), probablemente dos en ambos casos, lo
cual corresponde al número de distintas clonas aisladas (Fig.
4.1 y 4.3). Este resultado es similar a lo encontrado en P.
somniferum, donde se ha identificado un número reducido de
copias para el gen de la ncs y bbe (Facchini et al., 1996;
Liscombe et al 2005). A diferencia de lo anterior, en E.
californica y T. f/avum solamente se ha identificado una copia
de cada gen (Ditrich y Kutchan, 1991; Samanani et al., 2005).
Cabe mencionar que este es el primer reporte descrito de dos
transcritos para la BBE que sugieren la presencia de dos genes
transcripcionalmente activos en A. mexicana. Por su parte, en
P. somniferum se han descrito tres secuencias genómicas que
presuntamente codifican para la BBE (Facchini et al., 1996). No
obstante, aparentemente sólo una de éstas es funcional.
Posiblemente el proceso de selección al cual ha estado sujeta
esta planta productora de morfina, ha llevado a que se
mantenga sólo un gen de la bbe, lo que ha dado lugar a la
inactivación de las demás isoformas redirigiendo la síntesis de
los ABis hacia la síntesis del alcaloide de interés, en este caso
la morfina (Fig. 1.3; 1. 5).
149
Expresión tejido específica de NCS y BBE
Uno de los objetivos de este trabajo fue la caracterización del

contenido de alcaloides de la planta de A. mexicana y su
relación con la expresión génica de enzimas biosintéticas (NCS
y BBE). El análisis de los tejidos de plantas maduras demostró
la presencia mayoritaria de dos alcaloides; sanguinarina y
berberina (Fig. 4.1 O, 6.1A). La berberina se encontró presente
en todos los tejidos, mientras que la sanguinarina sólo se
detectó en raíz y semilla madura. La acumulación de
mensajeros de la NCS y BBE mostró en general una relación
con la presencia de los alcaloides (Fig. 4.1 0). Sin embargo, se
pudo observar variación en los trascritos, principalmente en
hoja, raíz y semilla inmadura (Fig. 4.8). Si bien existen reportes
previos sobre el perfil de alcaloides de A. mexicana, se
observaron diferencias cualitativas y semi-cuantitativas, que al
parecer pueden estar relacionadas con las condiciones de los
cultivares analizados (William y Schubert, 1961; lsrailov y
Yunusov, 1986; Carrillo-Pech, 2006). En este sentido, el
contenido de alcaloides de Chelidonium majus presenta
variaciones que pueden ser debidas a la combinación de efecto
de la luz y temperatura durante distintos días del año (Tome y
Colombo, 1995). Estas variaciones podrían relacionarse con
efectos sobre la síntesis y degradación de los alcaloides, más
que a la traslocación. De igual modo, algunas enzimas que
participan en la síntesis de alcaloides monoterpen-indólicos en
Catharanthus roseus pueden ser reguladas por la luz,
promoviendo cambios en la acumulación de los alcaloides (De
Luca et al., 1988; De Luca y Laflamme, 2001).
150
0
Bcrbcrina
San¡uinarina
Sanguinarina
Figura 6.1. Esquema de la acumulación de alcaloides de tipo

benzofenantridina (sanguinarina) y protoberberina (berberina) durante el
desarrollo de plantas de Argemone mexicana . A) acumulación de berberina
en todos los tejidos de la planta madura; la sanguinarina solo se detectó en
la raíz y en semillas maduras. B) Posible participación del carpelo de la
cápsula en la síntesis de berberina y sanguinarina durante la maduración de
las semillas . C) Acumulación diferencial de los alcaloides durante la
germinación y desarrollo de la parte aérea de plántulas . Las flechas indican
el posible transporte de intermediarios y alcaloides en los diferentes tejidos
de la plata .
Expresión de la NCS y BBE en plántulas en desarrollo
El análisis en plántulas en desarrollo y post-emergencia mostró

cambios en la acumulación de alcaloides (Fig . 4.11; 4.12;
151
6.1 C). Las plántulas en desarrollo tienen la capacidad de
producir sanguinarina, desde etapas muy tempranas. Sin
embargo, la berberina solo fue detectada a partir del día 18,
relacionándose con el desarrollo del tallo y los cotiledones (Fig.
4.11 ). Por su parte, las plántulas post-emergencia acumularon
sanguinarina y berberina. El contenido de los alcaloides
aumentó conforme al desarrollo de los tejidos de las plántulas
(Fig. 4.12; 6.1A; 6.1C). Estos resultados se encuentran
asociados con la presencia de los transcritos relacionados
(NCS y BBE), los cuales se coordinan con la acumulación de
los alcaloides.
La comparación entre los tejidos maduros y las plántulas

permite observar que tanto la expresión de estos genes (NCS y
BBE), como la acumulación de los alcaloides, se modificaron
durante el desarrollo (Fig. 4.1 O; 4.11; 4.12; 6.1 ). Aunque la
proporción de la planta es diferente, en general se observó un
cambio en la acumulación de los ABis en ciertos tejidos. De
igual modo, estudios en P. somniferum y C. roseus sugieren
que la presencia de los alcaloides y la expresión de genes
biosintéticos continua cambiando durante el desarrollo de las
plantas (Facchini et al., 2003; Facchini y De Luca, 2008).
Los cultivos en suspensión de Argemone mexicana

producen sanguinarina, pero no berberina
Finalmente, se logró desarrollar un sistema in vitro de

suspensiones celulares, en los cuales se pudo identificar la
presencia de sanguinarina (0.5 mg g- 1 PS), pero no de
berberina, la cual sí se encontró en los tejidos de la planta (Fig.
5.1 ). Esto se ha observado en cultivos celulares de P.
somniferum y C. roseus, los cuales pierden la capacidad de
sinterizar morfina y vindolina respectivamente (Facchini, 2001 ).
De este modo, la falta de capacidad de síntesis de berberina
sugiere la necesidad de algún tipo de organización celular que
se pierde como resultado del cultivo in vitro. Alternativamente,
esto también se podría explicar por alguna enzima con
152
participación en el flujo de intermediarios a través de la ruta de
síntesis, ausente en los cultivos.
Es interesante notar que los cultivos de A. mexicana con que

disponemos son capaces de acumular cantidades significativas
de sanguinarina, aún en ausencia de estímulos externos, lo
cual difiere de los cultivos de P. somniferum y E. ca/ifornica
(Eilert, et al., 1984; Gundlach et al., 1992).
El análisis del efecto del MEJA y SA sobre la acumulación de

los alcaloides y la expresión de la ncs y bbe, mostró que las
suspensiones celulares de A. mexicana son susceptibles de
aumentar cerca del doble del contenido inicial (2.15 mg g- 1 PS)
de sanguinarina, en respuesta al MEJA, no así con SA (Fig.
5.3; 6.2). Por su parte, tanto la expresión génica de la ncs y
bbe aumentaron durante las primeras 72 h, presentando una
correlación con el incremento del alcaloide (Fig. 5.3). No
obstante, la magnitud de esta respuesta fue menor de lo
reportado para cultivos inducidos de E. ca/ifornica y P.
somniferum (Eilert, et al., 1984; Gundlach et al., 1992; Cho et
al. , 2007). Sin embargo, las mayores cantidades detectadas de
sanguinarina (2.05 mg g-1 PS) fueron similares a las
encontradas en los cultivos inducidos de A. mexicana (2.15 mg
g- 1 PS) (Fig. 5.3).
153
--·
In ducció n de las
enzimas biosintéticas
de ABi s
•
Acumula ci ón d e
Sanguinarina
Figura 6.2. Modelo hipotético de la cascada de señales en respuestas a

jasmonato de metilo y ácido salicílico en suspensiones celulares de
Argemone mexicana. El jasmonato de metilo conduce a la activación
transcripcional correspondientes a enzimas biosintéticas de sanguinarina . El
ácido salicílico tiene un efecto en la expresión génica de las enzimas
biosintéticas de la sanguinarina, sin embargo la magnitud del estimulo es
menor, lo que sugiere que podría estar involucrado principalmente en
mecanismos de defensa, como la respuesta sistémica adquirida .
Recapitulación final
Los resultados obtenidos sugieren que la síntesis de

sanguinarina , ocurre principalmente en las raíces y cápsulas,
ya que en ambos se detectaron tanto el alcaloide como los
transcritos de NCS y BBE (Fig. 4.1 O y 6.1 ). Si bien no podemos
descartar la participación de sistemas de transporte entre la
raíz y la cápsula, el hecho de que este alcaloide haya estado
ausente en el tallo y en el látex (Fig. 4.1 O) no apoya la
154
existencia de un transporte y dan soporte a la idea de que las
cápsulas tienen la capacidad de biosíntesis. Más aun, la
presencia de ambos transcritos en las semillas inmaduras (Fig.
4.1 O y 6.1 B) fue consistente con la acumulación de
sanguinarina durante la maduración de ésta. En este sentido,
se debe mencionar que en P. somniferum se han
inmunolocalizado enzimas de la síntesis de ABis en el carpelo
de la cápsula (Weid et al., 2004; Bird et al., 2003; Samanani et
al., 2006). Por su parte, la berberina parece ser sintetizada
principalmente en la parte aérea, y posteriormente ser
transportada a toda la planta, incluyendo la raíz (Fig. 6.1A).
Esto puede ser sugerido, debido a que la presencia de este
alcaloide solo fue evidente durante desarrollo del hipocótilo y la
parte aérea de la plántula (Figs. 4.11; 4.12; y 6.1 ).
Con nuestros resultados es posible proponer, como modelo de
trabajo, que la ruta de síntesis de los alcaloides en A. mexicana
podrían diferir respecto a la distribución tisular encontrada de T.
f/avum y P. somniferum (Samanani et al., 2005). En este
sentido, la capacidad de A. mexicana de sintetizar sanguinarina
desde etapas muy tempranas después de la germinación y de
acumular berberina con el desarrollo de la parte aérea, difiere
de estas dos especies, donde se ha encontrado que estos
alcaloides se sintetizan y acumulan en distintos· tejidos
(Samanani et al., 2005; 2006). Más aun, es interesante hacer
notar que A. mexicana combina alcaloides presentes en
Thalictrum, pero no en Papaver, como berberina; con otros
presentes en Papaver y ausentes en Thalictrum, como la
sanguinarina (Fig. 4.1 O; Samanani et al., 2002; Facchini et al
1996).
La identificación de distintos tipos celulares involucrados en la
síntesis y acumulación de los alcaloides en plantas maduras de
A. mexicana sugiere la presencia de sistemas de transporte
(Fig. S3; datos complementarios y en preparación). En este
sentido, la síntesis de ABis en diferentes tipos de células
especializadas, tanto en P. somniferum como en T. f/avum,
implican la posible migración de rutas de síntesis (Samanani et
155
al. , 2006). Más aun , la separación espacial de la síntesis y
acumulación de los alcaloides en estas especies indica un
transporte intra e inter-celular de intermediarios, productos y
enzimas biosintéticas (Ziegler y Facchini , 2008). El intercambio
celular de intermediarios puede involucrar transportadores
específicos, como los transportadores tipo ABC (ATP binding
cassette), los cuales se encuentran ligados íntimamente con el
flujo de metabolitos secundarios como terpenos y fenoles en
diferentes especies (Yazaki , 2006). La participación de estos
transportadores en el movimiento de alcaloides
monoterpenindólicos en C. roseus y ABis en C. japonica abren
las puertas para establecer un análisis más detallado en el flujo
de alcaloides en A. mexicana (McCaskillet al., 1988; Shitan et
al. , 2003).
Por otro lado, la complejidad de los mecanismos que controlan

la síntesis de ABis necesariamente implica la operación de
sistemas coordinadores en un nivel jerárquico superior. El
establecimiento de dos vías de señalización independientes
reguladas por JAS y el pH citosólico para la síntesis de
sanguinarina en E. californica (Roas et al., 2006), dan paso a
un estudio más profundo en las suspensiones de A. mexicana.
De esta forma , el análisis realizado con hormonas relacionadas
con mecanismos de defensa nos permitió determinar que los
jasmonatos están involucrados en la síntesis de los ABis en
suspensiones celulares de A. mexicana, no así, el SA que
aunque tuvo un cierto efecto en la expresión génica, no
presentó una verdadera respuesta de inducción, como la
exposición a MEJA, sugiriendo que podría estar involucrado en
otros sistemas de defensa, como la respuesta sistémica
adquirida (Fig. 5.3; 6.2).
La relación entre las rutas de señalización inducidas por JAS y

SA forman un sistema de defensa muy elaborado que puede
estar regulado a través de genes maestros, como el factor
transcripcional WRKY (Li et al. , 2006). La participación de
WRKY como punto de convergencia, después de la percepción
156
de un estímulo, se ha identificado en plantas de A. thaliana en
las que promueve cambios en los mecanismos de defensa,
mediados por JAS y SA (Li et al. , 2006). En este sentido, la
participación de WRKY en la síntesis de ABis en P.
somniferum, y C. japonica abre la posibilidad de su intervención
en A. mexicana también (Apuya et al., 2008; Kato et al. , 2007).
La identificación de factores transcripcionales, así como de
elementos cis (promotores) que regulan la expresión de los
genes en Argemone, permitiría establecer los procesos de
regulación de la síntesis de ABis. Esto se ha demostrado en
Arabidopsis y en C. roseus, donde la existencia de controles
maestros coordinan la expresión de los genes involucrados de
la síntesis de flavonoides (Proteínas MYB) y alcaloides terpen-
indólicos (proteínas ORCA) (Gantet y Memelink, 2002).
Tomando estos datos en conjunto, es posible proponer a
Argemone mexicana como un modelo versátil para el estudio
de la síntesis de ABis. Podemos decir que el proceso de
síntesis de alcaloides en esta planta tiene características
particulares, distintas a las ya reportadas de P. somniferum y E.
californica. Esto sugiere que una ruta metabólica, formada por
genes ortólogos, puede estar sujeta a diferentes mecanismos
regulatorios.
El entendimiento de los procesos biológicos que permiten la
síntesis y acumulación de los alcaloides en las plantas ha
avanzado a lo largo de la última década. Este progreso se ha
visto facilitado por la disponibilidad de una impresionante
colección de genes cuyos productos catalizan diferentes tipos
de reacciones. Aunado a éstos, un número importante de
genes reguladores, involucrados en el control de síntesis y
degradación de alcaloides, se han aislado mediante
acercamientos de genómica de plantas (Ziegler y Facchini,
2008).
De igual forma hemos aprendido que la biosíntesis de estos
compuestos en plantas es más que una mera curiosidad
metabólica. La síntesis de estos compuestos ' está regulada por
la participación de diferentes tipos de células y tejidos, el grado
157
de desarrollo y el medio ambiente. Muchos aspectos de la
biosíntesis de alcaloides, como la compartimentación
subcelular de las enzimas y la translocación intercelular de
intermediarios, revelan nuevas variaciones en la complejidad
del metabolismo de las plantas. La expansión de herramientas
moleculares, así como las estrategias de ingeniería genética,
promoverá la capacidad para identificar los reguladores
asociados con el desarrollo de células que pueden acumular
los alcaloides. Nuestro conocimiento de la bioquímica, biología
molecular y celular también dará lugar a interesantes
oportunidades para desarrollar ingemena metabólica
permitiendo incrementar la producción de alcaloides con
importancia farmacológica . La novedad inherente y la
importancia socioeconómica de los productos obtenidos de
estas plantas modificadas, permitirá fomentar un mayor interés
en A. mexicana, un recurso con un gran potencial.
Perspectivas
Este trabajo representa uno de los primeros acercamientos de

tipo molecular sobre la síntesis de alcaloides en Argemone
mexicana, una planta de la medicina tradicional de nuestro
país. La disponibilidad de las secuencias de A. mexicana
permitirá abordar nuevos aspectos sobre el proceso de síntesis
de ABis en esta planta. Por ejemplo, la localización en tipos
celulares específicos de las distintas enzimas involucradas. No
obstante, debido a que en Papaver el sitio de acumulación de
los transcritos no corresponde al de las enzimas, es necesario
localizar, por inmunocitoquímica, el sitio de acumulación de
éstas en A. mexicana. Para ello, se deberán obtener los
anticuerpos específicos. La disponibilidad de las secuencias
completas de la NCS y la BBE permitirá la construcción de
vectores para la expresión heteróloga, con los cuales podrán
obtenerse cantidades suficiente de los antígenos. Más aún, los
parámetros cinéticos, y la especificidad para los sustratos, y las
posibles diferencias entre las isoformas, también podrían
establecerse utilizando la proteína recombinante.
158
Por otro lado, los alcaloides de A. mexicana, además de tener
propiedades médicas, son causa de serias intoxicaciones
debidas al consumo de sus semillas (Lozoya y Lozoya, 1982).
Debe hacerse notar que estas son fuente de aceites de buena
calidad que no pueden ser empleados debido a la presencia de
alcaloides que pueden ser tóxicos en altas concentraciones,
como la sanguinarina. De este modo, las secuencias de la NCS
y BBE nos podrían permitir la generación de plantas
transgénicas en las que se reduzca o elimine compuestos con
fines comerciales.
Finalmente, los cultivos in vitro han provisto de una poderosa
herramienta para el estudio de los procesos involucrados en la
síntesis de ABis. El avance en el entendimiento de los
mecanismos de señalización implicados en la activación de la
síntesis de los alcaloides en respuesta al ataque de patógenos
puede proveer información invaluable para determinar la
naturaleza de la relación entre la percepción del estímulo y la
biosíntesis de estos compuestos.
Las herramientas moleculares y conocimientos generados en el

presente estudio para la NCS y BBE de A. mexicana (Capitulo
3, 4 y 5) representan pasos importantes hacia la realización de
estos objetivos.
6.1. REFERENCIAS
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164
DATOS COMPLEMENTARIOS
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Figura. 51. Secuencias nucleotídicas correspondientes a los ADNcs parciales de la

NCS de Argemone mexicana. Los recuadros corresponden a las secuencias de los
cebadores empleados para la amplificación por RT-RCP para en análisis de la
expresión génica.
165
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Figura. 52. Secuencias nucleotídicas correspondientes a los ADNcs parciales de la

BBE de Argemone mexicana. Los recuadros corresponden a las secuencias de los
cebadores empleados para la ampl ificación por RT-RCP para el análisis de la
expresión génica.
166
Figura. 53. Localización de alcaloides de tipo benzofenantridinas y protoberberinas
en tejido de raíz y tallo de plantas maduras de Argemone mexicana por microscopía
y fluorescencia. La figura de A-D corte transversal de raíz; F-G corte transversal de
tallo. B) Localización de benzofenantridinas y protoberberinas en el periciclo y
endodermis de la raíz; D) localización de benzofenantridinas y protoberberinas en la
endodermis de la raíz; G) localización de protoberberinas en tejido vascular, corteza
y endodermis del tallo. La autofluorescencia de los alcaloides fue detectada con un
grupo de filtros Zeiss Filter (Exc. BP = 365/12 nm, FT = 395 nm, Em. LP = 397 nm
para protoberberinas; Exc. BP = 470/40 nm, FT = 510 nm, Em. LP = 520 nm para
benzofenantridinas). La barra= 100 ¡.Jm
167
A M 1 3 6 9 12 15 18
BBEAm2
549pb
Actina
467pb
B M 1 3 6 9 12 15 18
lBS
187pb
Figura. 54. Amplificación de los transcritos correspondientes a la BBEAm1 y genes

constitutivos después de la germinación de semillas de Argemone mexicana. A)
Amplificación combinada de los transcritos de la BBEAm1 y actina. B) Amplificación
del gen constitutivo ARNr 18s. Las flechas en blanco indican el tamaño del marcador
molecular; las flechan en negro indican el gen amplificado y el tamaño esperado. El
análisis se realizó con las muestras descritas en el apartado 4.3.4.2, figura 4.11 .
168
Anexo 1
Electronic Joumal of Biotechnology ISSN: 0717·3458 Vo1.11 No.4, lssue of October 15, 2008
Q 2008 by Pontificia Universidad Católica de Valparolso Chile ReceNed March 11. 2008 ' Accepted May 22 , 2008
OOJ · 10 V.2f)fvol1 1-is.!lue-1-fulnext~ 13 TECHNICAL NOTES
lsolation of functional total RNA from Argemone mexicana tissues

Jorge A . Rublo·PII\a
Unidad de BioquírWc.a y BiologU. Molecular de Plww
Progranu de Posgndo en Ciertc~l y Bi.ot~logb de Planta.s
Ctatto de lnYesti¡aciOO C1t11tifica de: Yuc.at3n
Calle 43 No. 130. Colouia Cbubumá deo. Hidal¡o
M~ri<b. Yucat:ic, Mixico.
Fax: 999 981 3900
E·ma1l: jrubio@cicy.DlX
Felipe A. Vázquez-Fiota•
Unidad ck Bioquúruca y Biotogí;a Mole-eubr de Planlas
Cmtnl dc- lD\'Hhgación C1e:utif•ca de YucMin
Calle43 No. 130, ColomaChubwni de Hidalgo
Mérida 97200, Yuc.alin. Mb.ic:o
Tel: 999 9<42 8330
:Fa~~: : 999 981 3900
E:·tuail: fcbpc@dcy.mx
Fla aadal suppon: Nariou:d Council for Sciew:e and Technolo¡y (CONACYT), Mt_xico.
Abbn\1aUOD.I: CT AB: bcudecyltn~thybmmoaium brotWde

DEPC: diethyl pyrocarbonate
PVPP: poly\inylpolypyrrol.idooe
RT -PCR: ~rse trna.teripuon polyntffase cbain t'UctJOn
SOS: sodium dodecyl t.ulfate
RNA tl:ft'a<'.tlon Ct·om recalc.ltrant plant tlssues ts cytotoxic :\Jld a.nümicrobial prope11ies (Villinski et al. 2003;
rrequr.ntly co mplica t~d by tbt prtSf ll('f':. or st rondary Beuria et al. 200S). The wide rauge of potential medicinal
metabollt~s. polysarchal'ldes and p olyp h~ nob. T hen uses of this plant is oue of the reasons for the ~Will$
co m¡lonnds may co pnrfp it at~ \\ith Rl~A. ofita attention it is receiving. However, molecular investigations
n n d~ t1 n g tt uusuttablt tor t-Uber cDNA syntbests or on tbis plant are limited.
l•~· brt dlzat1on tu no•·tht l·n blot analysts a nd tberdol'tt
tutu te1·lug wtth the gt nt aualysts t l:presstou In sur b A pre-requísite to conduct. sucb researcb is obfailting high
tlssuts. \V~ luwe dr.vrloped au effidtnt R~A extt·auttou quality uucleic acids. espi!<ially RNA (cardillo et al. 2006).
mttbod from A. mtxlcntrn ttssues. Tbt procedurt However, this may be complicated in cettain risS\1es due to
loclud<s l b< USt of pol)•\•lu)·JpoJyp )TrOlldout (PVPP), lo RNA susceptibility to deg.ration by RNAses. Plant tissues
nmovt- secondary m~ tab olltts, pt·ottins aud are cbo.racterized for a highly variable cowposition, rutd
}lolyp11tnols, and a m·o -step p rrctpitatio n wil b LjCl, to some tissttes may probe especially difficult for RNA
tllmtna te poJyu rcbaridf's, au d t bus tnn"f'astn g Rl""A extraction (Geuna et al. 1998). Tissues of A. . mexicana
yteld. Tite quallty of tbe nsu ltin& RNA was t\l'aluart d contain high ruuounts of yellow latex. which on exposure to
sprru·opbo tomt.tt1rally aud b ~~ agar ost gtl Rir, rapidly nm.ts browu due to oxidation of pheuolic
tltc ll·o¡Jbonsb. l.\1o t•e.O\'tl·, th t RNA obtatned by this compotmds aud otber secondi\J'}' metnboHtes that interfere
mttbod, could be ustd dtrutly for bo th RT-PCR and with any RNA e:o<trnction procedtu·e . Furthenuore. Wgh
uo t·tbt i'D blot analysts, w lth out •uy tur tb tt' puriflratlon. awoWlts of polysaec:harides ofteu co· p!'edpitale wíth R.>.JA,
thereby affectiug the yield and quality of tite isolated RNA
Argeurone me:ricnun (Papaveraceae). commonly known as (\Vang et al. 2007). These substances bind to Rl"JA and
priekly poppy is used in rural arens of Meotieo as a render it tmsuitable for either cONA synthe~is or
medicinal plant. The occl.UTeuce of diverse alkaloids, bybridizatiou in northeru blot analysis.
flavonoids aud fatty acids in its tissues may explain these
prope11ies (Sbaukat et al. 2002; Chaug et al. 2003). In fae t, Different merhods for RNA isolalion hnve been desctibed.
berbedne aud sanguinarine, t\\'O of tite maiu alkaloids lu nt.'UlY C3ses: these iuvolve borh the use of detergents
is;olated fi:om .A.rgemoue tisúes . display significant (CT AB, soS) and hot. phenol. or density gmdient
Thls p41 per ls :t~ V :t~ llable on lln• at http:l/www.ej blot ec hno logy.ln foleontent/vo l11/luu..Uful l/13/
169
Rublo·Pifta, J.A. and Vhqu ez..floto1, F.A.
e S L R Ce
-- 28SrRNA
18SrRNA
Flgure 1. Elec:trophoretlc: ana lysls of RHA lsolated from Arvemon• mexkano1 d ssues . The arrows indicate the 28S and 185 units of
rRNA. C: capsule, S: stem, l : leat1 R: root, Ce: cell culture. Total RNA samples were analyzed on an 1.5% agarose gel stained with
ethidium brornide
ceutrifugariou (Logemauu et nl 1987). However the anunouinm flúocyauate, 0. 1 :vi sodium acerare (pH
efficiency of such melhods vnries depending ou the 5). 5o/o glycerol 0.1 o/o phenol red.
composilion of lhe employed tissues and had been
inadequate in reducing polysaccbarides contamiuation. The CWoroform: isoamylic alcohol {24:1; v/v).
addi tion of acidic gnanidiniluu thiocyannte or TRizotTv (In
Vin'O Life Teclurologies, Carlsbad CA) is widely employed 3 M aud 8 M LiCl solutious.
to inhibit Rl\Ase ncliviiy (Chomczyusld and Saccbi. 1987;
3 M sodilun aceta te (pH 5.2).
Va leuzuela-A,·eodar)o et al 2005). O~anic solvents ill:e
phenol and chlorofom1 are utilized ro separare RNA from
70%, 100% etbanol.
proreins into two different phases. Tire use of lithium
cbloride to precipitare RNA at certaio coucentrations is au Pol)"oinylpolyp)'ITOlidone {PVPP).
effective approach for selective precipitatioo. However.
standard procednres that mnke use of these reagents Dietbyl p}Tocarbonate (DEPC) ·treated water.
seldomly resu1ts in RNA with enough integrily or puriry
when applied ro lissues witlr high contents of latex aud Atl solutious were prepnred wilh DEPC· treated wnrer.
sec:oodaty me tabol.ites. such as those of A.. me.,icmta.
FurtltellllOre. tbese procedures are frequeu rly modified ro RNA extractlon protocol
suit specific tissues and conditions . Here, we present a
reproducible method for !he isolatiou of total RNA from Trnnsfer 1 g of frozeo tissue to a mortar containing
differeut lissues of A . me.ricmra. TI1e yield and qualiry of liquid uitrogen aud 250 m~ PVPP. pulverize tl1e
the RNA so obtaiued were consistently hi!lh, as coufumed tissue usin!' a pestle uutil a fure powder is
both by spectropbotometric nua lysis aod sepRrntiou on obtained.
agarose gel. and w•s suitnble for RT·PCR.
Add 5 ml extrnctiou buffer nud homogeuize with
MATERlALS ANO MI!THOOS cold peslle uuril rissue has thawed. Trnnsfer
samples to sterile ceotrifuge tubes aud incubare at
Plant material
room temperarure for 10 miu.
P1auts of -~· me.r/cana were collected from wild
Remove insoluble material from the bomogeuale
popnlations. '" ·apped in polyethylene bags aud kept in ice
upoo transfer ro the laborn tory. On arriva l, plauts were. by centriftrgatiou Rt 14.000 g for 10 miu ar room
thoroughly washed with cold tap water, dissected imo iemperanrre.
leaves. stems, roots nud capsules, nud theu slored at ·SO'C
uutil RNA extraction. Tmnsfer the resulting supenlatam to uew sterile
mbes nnd add 1 m.l of n mi.xntre chlorofom1:
Solutlons requlred isonmylic alcohol (24:1}.
Extraction buffer: 38% pheuol SRtllrated buffer Shake the tube vigorously with a vot1e..x for lS sec.
(vtv), 0.8 M guauidine thiocyanare, 0.4 M and incubare nt room tempet·antre for 2 miu. After
170
lso l;¡tfon of funetlonal total RNA from Argemone mexlc~n ;¡ tfn uu
further shnkin¡¡, separare dte phases by treaunent).

ceotrifuging rhe mbes at 14,000 g for 10 mio at
4'C. Estlmatlon of RNA quallty
Transfc:r tbe aqueous phase- to a uew tt1be. and Tite recovered RNA was qnautified by 00 (Lewiuso1w et
repea1 the cllJorofonn: isoamylic alcohol ttl . 1994), by tl..ic scandard p~cdlu"C. COucaw.inn cion due to
exrrnction. pheooVcarbohydrates or proteins was detemtined by
recording the OD ratios; A¡6t/Am aud Auo/Au•.
Trarufer tite aqueo os phase to a uew nlbe. and mix respectively. In order to verify RNA iotegricy, extrncts were
with 0.625 vohunes of 8 M LiCI aod incubare ar subjected to 1o/o agarose electrophoresis. Oels were stained
4°C for 3 lu-s (if RNA yield is 1ow. incubare with etltidium brootide, and \~sualized under UV light
ovemight).
Reverse transcrlptlon PCR
Separare RNA precipitated total RNA by
ceotrifugio¡¡ at 17,000 g for 30 min at 4•c. Single-stranded cONA was prepared from 2 .5 1'~ total
Eliminare !he supemataut. theu carefully wash the RNA using AMV reYerse traoscript:Jse lllld oligo (dD,
pellet, fit!.t wilh 3 mi of 3 M LiCI and titen, widt 1 following the mauufacrurer's instructious (lnvitrogeu). The
ml of 70% ethauol. Centrifugo samp1es at 17,000 g syuthesized cONA was used for PCR in order lo estimale
at 4'C for 10 min. tite expressiou level of actin gene. Actin-specific ptimers
were used F (5'CACL.O.CTACTOCTAAACOOOAAA3)
Discard !he supemaraut aod dry up the pellet at and R ( S'ACATCTOCTOOAACiOTOCT03 '). PCR
room temperature. The pelle! is resuspeoded in sequence was as foUows : DNA denamring at 94'C for 3
300 ¡t1 OEPC-water. min, followed by 35 cydes of 1 min at 94°C for ONA
denanuiug, 1 min at 55•c for primer alUlealiog, aod 1 mio
RNA pmified by precipitatiou once 0.1 volumes of at 7:ZOC for extensiou. The pro¡¡ram was tenninated with a
3 M sodüuu aceta te aud 2 volnmes of 100% 10 min exlensioo at 720C. The amplified products were
ethano1 are added aod incuba red at -SO'C for 1 hr. separaled on a !.So/o agnrose ¡td aud vi""'lized after
ethidituu bromide stailling.
Centrifuge samples at 17,000 g al 4'C for 20 mio.
Eliminare supematant and then wash !he pelle! Northern blot analysls
twice with 1 nd 70% ethaool at -20'C.
Samples coutai.ttiug 1~ ~g total RNA were lteat deuatured.
Ory rhe pellet ar room iemperantre and suspend io separated by e lectrophoresis in an 1.5% agarose gel
SO· 100 ¡t1 OEPC· water. coutaining 1So/o fonnaldehyde. and trnnsferred by
capillariry to a nylon membrane (Hybond N+, Amersbam
(If RNA is to be used for PCR methods, perfonn a ONAse I Biosciences; Piscatay NJ) using standard procedures
Table 1. RNA. yltld from dltrerent tissues of A. m•xle• na, uslng the dtscrl btd e x tr ;~~ c tlon proctdu re.
2
TleltiiM oc' r8lloe Total RNA
llaJIIFW
2601230 260/280
Capsute 2.05 1.88 155 (36)
Slem 1.89 1.94 123 (22)
Leal 1.91 1.92 126 (27)
Root 1.83 1.75 174 (57)
Cett cunures 1.87 1.70 192 (29)
'OD. Optical density.

2
Average or three independent repetitions , \..,;th standard deviauon between bf'ackets.
171
Rublo.Pifta, J.A. and Vbquoz.flota, F.A.
a e S L R Ce
1
1
......... -· .................. ---
b
Figure 2. RT ·PCR and northern blot Nsults showlng the lntegrlty of RNA i so l ~ted . C: capsule , S: stem , L:
leaf, R: root, Ce: cell culture .
(a) Agarose electrophoresis anatys1s of the RT-PCR assay with actin primers.
(b) Northern blot analysis of tlle actin gene expression usi09 a specific DIG-Iabele<l probes.
(Sambrook and Russel, 1989). The blot was bybridized by 2003). This method was developed after uusuccessful
iucubating the membrane witb a DNA probe corresponding attempls witb otber RNA isolation protocols for
to tbe actiu gene labelled witb digoxigenin (Di~ easy hyb polysaccbaride-ricb tissues (Valeuzuela-Avendaiío et al.
solutiou; Rocbe Applied Science, Indianapolis IN) at 42'C 200S). We noticed that tbe resulted after tissue griuding in
ovemigbt. TI1e probe was prepared usiug tlle PCR DIO !he presence of buffer, rapidly tumed bro\\11 perhaps, as a
Probe Synthesis kit (Roche Applied Science), following the consequeuce of polysaccharide binding oxidized pheuol.
mrumfacturer's iustructions. ..t\fter incubation, the This darkening effect was reduced but not completely
membrane was washed tv.-i ce at room temperanue in 2X avoided. adding 250 mg of PVPP per gran1 of fresb tissue.
ssc with 0.1% SDS S min each, and twice with O. LX SSC RNA precipitation with LiCl, followed by washing the
with 0.1% SDS for 20 min at 65"C (20X SSC is 3 M resollting pellet with an etbanoi/LiClmi.xture produced uot
sodiUlll cWoride with 0.3 M sodium citrate, pH 7). just a cleM, wªter soluble precipitate. b1ot also siguificantly
Hybridized probes were detected usiug the Dig increased RNA yielding.
Luminescent Detection kit (Roche Applied Science) and
exposing membranes to chemilul.lliuescence seusitive films In conclusion, we llave developed a method for Rl'IA
(Kodak Eastman. Rochester NY). extractiou from tissues presenting high contents of both
polysacchalides aud polyphenols, sucll as tbose from A.
RESULTS ANO DlSCUSSlON me:ricmw. RNA obtained by this method can be utilized for
01e detection of specific &'IA's, as showu in Figure 2.
Most A. mexicana tissues contain high amounts of latex, Altl!ough yields can be in1proved by precipitating Rl'IA
which besides being rich in polysacchatides, represen! a witl! LiCl overui~t , sllorter incubation periods (3 lu'S) also
source of polypbenols (Chaug et al. 2003), that rapidly resulted in good RNA recoveries, which allowed
oxidize during gti uding. This method produced a white, perfonning tbe extraction procedure of 8 samples withiu a 6
water soluble &'lA precipitare wilh a significan! yield (en hrs period. It. is wortb noticing lhat, RNA yields are similar.
150 ¡og per gram o.f fresb weight, (Table 1). OD ratios despite tbe tissues being extracied: Jeaves. roots, stems, or
(260/230 and 2601280) were 1.9 and 1.8, rebpect.ively capsules. This point to an importan! difference witb respect
sug~es ting Low quamities of polysaccharides, polyphenols to ofuer reponed metbods, which are frequently designed
and proteins. RNA int.egtity, as observed in agarose gels for specific tissues.
(Figtu·e 1), and yield (Table 1) were comparable to
previous1y reponed methods for tissues wilh high coutents REFERENCES
of polysacchatides and secoudary metabolites (Chao et al.
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semiquantitative RT-PCR (Figure 2b). Moreover, fue CARDILLO, A.B.; GIULIETTI. A.M. and MARCONI.
method can a1so be applied to A . mexicaua cell cultures, P.L. Analysis and sequencing of h6hmRNA, 1ast euzyme in
which also aJ"e ric:h in pheuols and sugars (Chang et al. the tropane alknloids pathway from anthers and haity root
172
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!kll)pl'lf'-' by Uto/ :S(!() f lrii!HCIJt Mlli!Ot.
173

PCBP D Tesis 2008 Jorge Rubio Pina

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POSGRADO EN CIENCIAS Y BIOTECNOLOGÍA DE

Estudios moleculares sobre la síntesis de

Tesis para obtener el grado de Doctor en Ciencias

JORGE ALBERTO RUBIO PIÑA

Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C.

Mérida, Yucatán, México

Declaro que la información contenida en la sección de

IBQ. Jorge Alberto Rubio Piña

Este trabajo se realizó en la Unidad de Bioquímica y Biología

Se agradece al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por

Este trabajo fue financiado con fondos de los proyectos 52062

Esta tesis doctoral, si bien ha requerido de esfuerzo y mucha

Agradezco enormemente a mis padres Carlos y Judith, por su

A mis hermanos (Giadys, Carlos, Gabriela y Judith) que

A mi esposa Yolanda por ser mi compañera de viaJe, la

Al doctor Felipe Vázquez Flota, mi asesor de tesis, quiero

De igual manera mi más sincero agradecimiento a la M.C.

Especialmente agradezco al Dr. José Ramírez Benítez por el

Agradezco particularmente a los miembros de mi comité tutoral

A mis compañeros y amigos con los que comparto las mismas

Deseo extender un reconocimiento a los profesores del

En general quisiera agradecer a todas y cada una de las

A Laura Yolanda de la Vega Bias

Solo tú, solo yo, en un mundo incierto de sensaciones dulces,

A mis padres Carlos y Judith

Sin embargo ...

CAPÍTULO 3 AISLAMIENTO DE LOS ADNcs 51

CAPÍTULO 5 EFECTO DEL JASMONATO DE 127

CAPÍTULO 6 DISCUSIÓN GENERAL y 145

FIGURA 1.1. Argemone mexicana 1O

CUADRO 1.1. Enzimas involucradas en la síntesis de 24

Cardo santo (Argemone mexicana L, Papaveraceae) es una

Por otro lado, el análisis de la expresión de la NCS y BBE en

Estos datos, en conjunto, sugieren que la síntesis de alcaloides

Argemone mexicana L, (Papaveraceae) is known with the

8oth, NCS and 88E transcripts accumulated in the alkaloid

Los alcaloides son compuestos nitrogenados, de naturaleza

El nitrógeno de los alcaloides proviene de ciertos aminoácidos,

Muchos de los ABis presentan actividad farmacológica y

La biosíntesis de estos alcaloides se ha estudiado debido a que

La familia Papaveraceae incluye plantas cuyos compuestos

Argemone mexicana es una planta anual que contiene un látex

1.1.2. USOS TRADICIONALES

A esta planta se le ha llamado "fábrica de alcaloides" debido a

Las semillas de Argemone contienen un 93% de ácidos grasos

1.2. ALCALOIDES BENCILISOQUINOLÍNICOS (ABis)

Desde el descubrimiento y caracterización de los

1.2.1. RUTA DE SÍNTESIS DE LOS ABis

De manera general, la ruta de biosíntesis de los ABis se puede

Figura 1.2. Representación de la ruta de biosíntesis de los ABis.

1.2.2. Formación de norcoclaurina

Las reacciones iníciales de la biosíntesis de los ABis, consisten

La ( S)-norcoclaurina se convierte en ( S)-reticulina mediante

1.2.4. Formación de benzofenantridinas y protoberberinas

El primer paso en la síntesis de sanguinarina y berberina

Por su lado, la conversión de la protopina a sanguinarina

En cuanto a la formación de berberina, en algunas familias de

4-H idro x1f emlacetald eh1d o

HO 1 ""'• ~--··•••••••• HO "H CHo

O1h1d ro sang uinanna

Figura 1.3. Síntesis de los alcaloides tipo benzofenantridina (sanguinarina) .

Figura 1.4. Síntesis de los alcaloides tipo protoberberina (berberina).

1.2.5. Síntesis de alcaloides morfinanos

En algunas especies del género Papa ver, la conversión de (S)-