ÍNDICE

ÍNDICE 1

INTRODUCCIÓN 2

OBJETIVOS 2

1. PRINCIPIOS TEÓRICOS 3
1.1. Cinética de microorganismos 3
1.1.1. Crecimiento de biomasa 3
1.2. Modelo matemático 4
1.2.1. Cálculo de la tasa de crecimiento específico 4
1.2.2. Cálculo del rendimiento 4
1.3. Método del peso seco 5
1.4. Determinación de proteínas 5
1.4.1. Método del espectrofotómetro 5
1.4.2. Método de Kjeldahl 5

2. DETALLES EXPERIMENTALES 6

3. DISCUSIÓN DE RESULTADOS 7

4. CONCLUSIONES 7

5. REFERENCIAS 8

6. APÉNDICE 9
 INTRODUCCIÓN

La producción de proteína se hace mundialmente a través de la extracción de

concentrados de productos altos en contenido proteico como la soya a nivel mundial o el

tarwi en Perú. Sin embargo, otras fuentes de obtención son posibles gracias a los

microorganismos, ya sean bacterias, levaduras u hongos.

La producción de proteína celular (contenido proteico en la pared celular y en la

misma célula) se hace mediante el cultivo industrial de población microbiana con un sustrato

y condiciones específicas. Para cada tipo de sustrato, existe un microorganismo que mejor se

desenvuelve en su aprovechamiento. Es posible describir el comportamiento del crecimiento

microbiano gracias a las ecuaciones cinéticas y en base a ello encontrar condiciones óptimas

para su cultivo.

La extracción de los cultivos de Kluyveromyces marxianus (género usado para la

producción comercial de la enzima lactasa) y su posterior tratamiento permite la extracción o

determinación de la proteína presente en la biomasa.

La presente práctica tiene como objetivo usar los microorganismos para la producción

de proteína celular en cultivo batch

OBJETIVOS

- Usar los microorganismos para la producción de proteína celular en cultivo batch

 1. PRINCIPIOS TEÓRICOS

1.1. Cinética de microorganismos

La cinética microbiana se encarga de estudiar la velocidad de crecimiento de una

población de microorganismos, esto incluye el estudio de su adaptación al medio, consumo

de nutrientes, crecimiento, supervivencia, muerte y formación de productos. El estudio de la

cinética microbiana es importante pues permite tener un control de la biomasa en base a los

factores que determinan su crecimiento mediante variaciones del medio.

1.1.1. Crecimiento de biomasa

Es el aumento de los componentes celulares de un microorganismo y lo que

significa el incremento de su tamaño, población o ambos. Es posible tener una población

limitada si se tiene un sistema cerrado; en cambio, en un sistema abierto, se mantiene la

población microbiana por varias generaciones mediante la adición de nutrientes y la

eliminación de residuos. Es posible medir el crecimiento mediante métodos directos e

indirectos.

-Cuenta directa
Número de células
-Cuenta en placa

Métodos directos -Peso seco: filtración,

centrifugación
Masa celular
-Turbidez: DO de una
suspensión de células

-Consumo de sustratos: carbohidratos

-Formación de productos: etanol, ácido láctico

Métodos indirectos
-Componentes celulares: proteínas, lípidos

-Actividades enzimáticas
 Cuadro 01. Métodos de determinación de crecimiento de biomasa. El cuadro muestra los

métodos usados para calcular las variables y constantes cinéticas en base a diversos factores.

1.2. Modelo matemático

El siguiente modelo matemático es usado para determinar la población de un cultivo

de microorganismos.

𝑛
𝑋 = 𝑋02
-𝑋:número o masa de individuos.
-𝑋0:número o masa de individuos en un tiempo inicial.
𝑡
-𝑛:número de generaciones; 𝑛 = 𝑡𝑑

Es posible trabajar la ecuación y obtener una relación aritmética .

𝑛
𝐿𝑛(𝑋) = 𝐿𝑛(𝑋02 )
𝑡
𝑦 = 𝐿𝑛(𝑋0) + 𝑡𝑑
𝐿𝑛(2)
𝑡
𝑦 = 𝐿𝑛(𝑋0) + 0. 693 𝑡𝑑
0.693
𝑦 = 𝑏 + 𝑚(𝑡), donde la pendiente 𝑚 = 𝑡𝑑
𝐿𝑛(𝑋)−𝐿𝑛(𝑋0) 1 𝑋
𝑛= 𝐿𝑛(2)
→𝑛 = 0.693
𝐿𝑛( 𝑋 )
0

1.2.1. Cálculo de la tasa de crecimiento específico

En una gráfica exponencial X vs t, es posible calcular la velocidad

específica tomando dos puntos de la gráfica semilogarítmica o a través de la
linealización de la curva y obteniendo el valor de pendiente general.
𝑦2−𝑦1
𝑚= 𝑥2−𝑥1
, estos valores se toman de la gráfica aritmética.

También puede calcularse a través de la integración de la siguiente expresión:

𝑑𝑥
𝑑𝑡
= 𝞵𝑥

De donde se obtiene:
𝑚= 𝞵
1.2.2. Cálculo del rendimiento

Para calcular el rendimiento de la biomasa, se usa la siguiente

ecuación:
 𝑋𝑓−𝑋
∆𝑋 0
𝑌𝑥/𝑆 = ∆𝑆
= 𝑆0−𝑆
𝑓

1.3. Método del peso seco

Este método se basa en el peso de una muestra seca de un cultivo de microorganismos

(m.o.). Se debe tomar muestras cada cierto tiempo y llevarlas a la centrífuga. Lo obtenido se

lleva a una estufa overnight, se lleva a una desecadora y luego se pesa hasta obtener peso

constante.

1.4. Determinación de proteínas

Para determinar la cantidad de proteínas totales, es necesario, primero, calcular el

contenido de nitrógeno total en la biomasa. Para ello, puede usarse dos métodos conocidos.

1.4.1. Método del espectrofotómetro

Para este método, se usa una longitud de onda de 280 nm y se mide la

absorbancia. Luego, se grafican los puntos y se traza una recta de tendencia para

calcular la concentración y finalmente se calcula la cantidad de nitrógeno total.

Finalmente, se multiplica por el factor 6.25 para la determinación de proteínas (N x

6.25).

1.4.2. Método de Kjeldahl

En este método se basa en la conversión del nitrógeno celular en amoniaco

para su valoración. Se digieren las proteínas y otros componentes orgánicos con ácido

sulfúrico en presencia de catalizadores, se obtiene sulfato de amonio. La mezcla

digerida se neutraliza con una base y se destila posteriormente. El amoniaco destilado

se recoge sobre una solución de ácido bórico. La sal de borato se estandariza con HCl

y se calcula su concentración. Las reacciones se muestran a continuación.

𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 + 𝐻2𝑆𝑂4 + 𝑐𝑎𝑙𝑜𝑟 → (𝑁𝐻4) 𝑆𝑂4

2
 (𝑁𝐻4) 𝑆𝑂4 + 2𝑁𝑎𝑂𝐻 → 2𝑁𝐻3 + 𝑁𝑎2𝑆𝑂4 + 2𝐻2𝑂
2

−
𝑁𝐻3 + 𝐻3𝐵𝑂3 → 𝑁𝐻4 + 𝐻2𝐵𝑂3

− +
𝐻2𝐵𝑂3 + 𝐻 → 𝐻3𝐵𝑂3

- Este método falla cuando la concentración de compuestos nitrogenados no proteicos es

relativamente grande, pues varía la concentración de compuestos nitrogenados proteicos.

2. DETALLES EXPERIMENTALES

Se muestran los detalles experimentales de la producción de cerveza en un diagrama

de flujo.
 Esquema 01. Detalles experimentales. Se muestran los procedimientos experimentales para

calcular el porcentaje de proteína en la especie Kluyveromyces marxianus.

3. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

- La cantidad de microorganismos (biomasa) depende de los factores del medio, como el pH

y la temperatura. Además, la concentración de sustrato es también importante, pues de esta

depende el crecimiento de la población microbiana.

- La cinética microbiana indica que cuando se tiene un proceso continuo y abierto, es posible

tener mayor número de generaciones. En el caso de un proceso batch, las generaciones son

limitadas, pues se tiene una cantidad determinada de sustrato, además, los residuos producto

del metabolismo van aumentando.

- El método del peso seco permitió obtener la biomasa para su determinación de contenido

total de nitrógeno y en base a este parámetro se calculó la composición promedio de proteínas

en el microorganismo Kluyveromyces marxianus.

- El porcentaje de ácidos nucleicos en las proteínas celulares obtenidas es importante y se

debe evaluar para determinar si es factible realizar un proceso de separación. Actualmente se

usan métodos enzimáticos con la adición de nucleasas como la ribonucleasa pancreática

(Rnasa A), pero su costo es elevado. De ahí que se debe elegir un método adecuado para la

obtención de proteína celular.

- Otro método de obtención de proteínas celulares es la extracción alcalina a elevadas

temperaturas. Con este método se obtiene menor cantidad de ácidos nucleicos, pero se

obtienen aminoácidos tóxicos como la lisinoalanina.

4. CONCLUSIONES

- Se determinó el crecimiento de la biomasa del microorganismo Kluyveromyces marxianus

en un cultivo batch en condiciones adecuadas.

 5. REFERENCIAS

Berg, J., Tymoczko, J., Stryer, L. Biochemistry. Sixth ed.. New York, USA: W. H.

Freeman and Company; 2007.

Bhalla, T., Sharma, N.N., Sharma, M. (2007). Production of Metabolites, Industrial

enzymes, Amino acid, Organic acids, Antibiotics, Vitamins and Single Cell Proteins.

Ferrier, D. Biochemistry. Sixth ed. Maryland, USA: Lippincott Williams

& Wilkins; 2014.

Nelson, D., Cox, M. Principles of Biochemistry. Sixth ed. New York, USA:

W. H. Freeman and Company; 2013.

Nguyen, T., Fleet, G., Rogers, P. Composition of the cell walls of several yeast

species. Appl Microbiol Biotechnol (1998); 50: p. 206–212.

Overland, M., Karlsson, A., Torunn-Mydland, L., Helge-Romarheim, O., Skrede, A.

Evaluation of Candida Utilis, Kluyveromyces marxianus and Saccharomyces cerevisiae

yeasts as protein sources in diets for Atlantic salmon (Salmo salar). Aquaculture (2013);

402-403: p. 1-7.

Reed, G., Nagodawithana, T. Yeast technology. Second edition. New York, USA: Van

Nostrand Reinhold.
 6. APÉNDICE

Figura 01. Composición química de carne de pescado (FM), Candida utilis (CU),
Klyveromyces marxianus (KM) and Saccharomyces cerevisiae (SC) en (g/g). Se muestra la
composición entre tres fuentes de proteína. Se observa que la composición de ácidos
nucleicos en Kluyveromyces marxianus es de 10.86% aproximadamente.