ANÁLISIS DE LIPIDOS POR HPLC

HPLC: análisis de TGs y fosfolípidos. Moléculas pequeñas como FA y

esteroles: GC.
Preparación muestra: líquida (inyección directa de aceites). Sólidos:
extracción con solvente apolar (aislar TGs) y clean-up.
Triglicéridos: interés para procesado y control alimentos
Grasas: mezclas complejas de TGs, esteroles y vitaminas
Formación hidroperóxidos enranciamiento

HPLC: - contenido en TGs, esteroles, vitaminas e hidroperóxidos

(UV-DAD), para diferenciar entre TGs saturados e insaturados
- perfil de TGs específico a cada tipo de aceite, permite
detectar adulteraciones
Detección: índice refracción (isocrático). Gradiente con detectores UV y
ELSD.

-Separación lípidos sencillos: determinar fracciones de ésteress de

esteroles, ácidos grasos libres, TG, DG, esteroles libres,
monoacilgliceroles, ceras. Tradicionalmente análisis cromatografía
adsorción columnas sílice y ELSD.

-Cromatografía reparto: RP y NP. Separación TGs con RP y fase móvil

no acuosa (acetonitrilo:acetona) permite separación en función número
C.
Análisis de perfil de TGs en aceite de girasol envejecido.
Detección entre 200-215 nm: TGs
Detección a 240 nm: hidroperóxidos
Detección a 280 nm: TGs fragmentados
 ANÁLISIS DE VITAMINAS POR HPLC

- Liposolubles: A, D, E
- Hidrosolubles: C, B6, B12, B2, B1
- Importancia: legislativa, etiquetado, asegurar calidad alimentos
suplementados, estudiar cambios durante procesado, almacenamiento,
etc.
Dificultad análisis:
- bajas concentraciones
- en presencia de otros compuestos en elevadas
concentraciones y con propiedades químicas similares
- se degradan con luz, O2, elevadas Tª

HPLC: - información cualitativa y cuantitativa (UV-DAD y

electroquímica)

Vitaminas hidrosolubles: problemas análisis de estas vitaminas

relacionados con preparación muestra antes del análisis por HPLC
debido a que estas vitaminas se encuentran a menudo ligadas a otros
constituyentes como carbohidratos y proteínas.

Vitamina C: 2 vitámeros, ac. Ascórbico y dehidroascórbico.

Actúan en otras funciones, previniendo cancer, hipertensión, etc.
Problema: baja estabilidad. Extracción utilizando ácidos
(metafosfórico).
Análisis HPLC fase inversa con agua a bajos pH. Detección: UV a 254
nm (AA) y 210-230 nm (DHAA)
Detección fluorescencia después derivatización
Vitamina B1 (tiamina): 4 vitámeros, la forma no fosforilada (tiamina)
mayoritaria en plantas y formas fosforiladas mayoritarias en
productos animales. Deficiencia tiamina asociada a beri-beri.
Extracción: hidrólisis ácida para liberar vitámeros de matrices
alimentarias. A veces es necesaria hidrólisis enzimática para eliminar
exceso de almidón y proteínas.
Clean-up con SPE C18 o columnas intercambio iónico
Análisis HPLC: par iónico
Detección: fluorescencia (excitación 365-375 nm y emisión 425-435
nm) después derivatización.

Análisis vitaminas hidrosolubles en una bebida y espectros vitaminas.

Fase inversa, DAD, Fase móvil: A: agua, B: ACN. Gradiente.
Preparación muestra (reales): extracción, hidrólisis, oxidación, clean-up,
etc.
- Vitaminas liposolubles: se pueden dividir en 4 grupos dependiendo de
su actividad biológica: vitamina A (retinol y carotenoides), vitamina D
(colecalciferol y ergocalciferol), vitamina E (tocoferoles y tocotrienoles)
y vitamina K (filoquinona y menaquinona).

- Vitamina A: esencial visión, crecimiento, sistema inmune. Fuentes

naturales vitamina A derivan de carotenoides (provitamina A)
sintetizados por plantas superiores y organismos fotosintéticos
- Vitamina A sintética se utiliza como suplemento.

-Análisis: - saponificación (liberar retinol esterificado)

- extracción
- o extracción directa (hexano) p.ej. vitamina A total leches
- análisis HPLC: fase normal o inversa
- inversa mejor cuando muestra contiene bajas concentraciones de
triglicéridos
- detección: UV (328 nm) (fluorescencia nativa baja)

- Vitamina D: prevención raquitismo y osteomalacia (reblandecimiento

óseo). Imprescindible organismos no expuestos a luz solar (dietary
intake). Vitamina D esta presente en alimentos solo a niveles traza.
- Estructura parecida a otros lípidos que se encuentran en
concentraciones muy elevadas: exhaustivo tratamiento muestra previo
análisis.
-Etapas: saponificación, extracción con disolventes y purificación para
eliminar esteroles, carotenoides, etc.
- Vitaminas D2 y D3 sólo se pueden separar en fase inversa utilizando
como f. Móvil metanol:agua o acetonitrilo:agua
- Detección: 264 nm
-Vitamina E: se encuentra en aceites vegetales y otros alimentos como
frutos secos, semillas y frutas. 8 formas (tocoferoles y tocotrienoles) con
diferente actividad. Vitamina E: antioxidante lipídico.
- Extracción directa o saponificación previa (dependiendo matriz).
- Aceites y grasas: disolución en hexano y análisis directo por HPLC
fase normal con sílice o fases polares. Es posible separar las 8 formas de
vitamina E en isocrático.

- Detección fluorescencia: nativa muy fuerte (elevada sensibilidad y

selectividad)
- Otros sistemas detección: UV (280 nm) y electroquímica (mayor
sensibilidad (ha permitido la detección de pmoles de vit E en plasma
humano)
Figure 2. HPLC of Vitamin E. (A) Standards of vitamin E vitamers. Column, 5-
µm Supelcosil LC-Si (250 x 4.6 mm ID); mobile phase, isooctane/ethyl acetate
(97.5:2.5), 1.6 ml/min; fluorescence detection, excitation 290 nm, emission 330
nm. Peaks: (1) α-tocopherol; (2) α-tocotrienol; (3) β-tocopherol; (4) γ-
tocopherol; (5) β-tocotrienol; (6) γ-tocotrienol; (7) δ-tocopherol; (8) δ-
tocotrienol. (B) Saponified rice bran sample. Chromatographic conditions as in
(A) except for mobile phase: isooctane/ethyl acetate/2,2-dimethoxypropane
(98.15:0.90:0.85:0.1). Reproduced with permission of AOCS Press.
Análisis vitaminas liposolubles (tocoferoles). Separación en fase normal.
Fase móvil: hexano/isopropanol. Isocrático. Concentración de
tocoferoles en extracto de margarina, detección fluorescencia: long. exc.
295 nm, long. em: 330 nm.

Análisis vitaminas liposolubles (tocoferoles). Fase inversa, detección

electroquímica.
-Vitamina K: actividad antihemorrágica.
- Preparación muestra: hidrólisis enzimática y clean up. Análisis HPLC
en fase normal o inversa.
- Deteccción UV a 270 nm.

-Múltiples vitaminas liposolubles: A, E, D2 y D3

- Fase inversa con metanol:agua y detección UV a 263 nm después
saponificación.
- Fase normal también se ha utilizado (aceites semillas).
- A veces es necesario utilizar varios detectores (UV y fluorescencia)
 ANÁLISIS DE AMINOÁCIDOS, PÉPTIDOS Y PROTEÍNAS
POR HPLC
- Análisis importante desde punto vista nutricional, control de calidad y
control en el desarrollo de nuevos productos (fracción proteica).
Importante para asegurar autenticidad de alimentos (separación e
identificación enantiómeros).
Aminoácidos
-La composición en aminoácidos de proteínas puede usarse para
determinar el origen de carnes: detectar adulteraciones.
-Preparación muestra distinta si AA libres o totales: AA ligados a
proteínas, es necesaria hidrólisis ácida o digestión ácida previa HPLC.
Posterior etapa clean-up para eliminar interferencias/concentrar muestra
(SPE con cartuchos C18 capaces de retener lípidos y proteinas grandes).
-Análisis HPLC (intercambio iónico) o fase inversa previa
derivatización con OPA (aumentar hidrofobicidad).
-Habitualmente la detección se lleva a cabo después de la formación de
derivados (UV y fluorescencia)
-Derivatización on-line (OPA) puede ser: precolumna o postcolumna
-Análisis aminoácidos en cerveza después derivatización on-line con
OPA.

-Fase inversa, fluorescencia, Fase móvil: A: acetato sódico, B: ACN.

Gradiente.
Péptidos
-Preparación muestra 2 etapas: extracción y eliminación proteínas (UF)
que permite fraccionamiento de péptidos. Clean-up SPE C18.
-Análisis columnas RP con cromatografía de par iónico (ácido
trifluoroacético), intercambio iónico, exclusión molecular.
-Detección: UV (AA aromáticos como tirosina y triptófano) y despueés
derivatización con cloruro de dansilo.
-Avances detección y análisis de péptidos: LC-ESI-MS, permite
identificación de biopolímeros de elevado PM generando iones de
múltiple carga.
-También MALDI-TOF-MS: permite medida precisa masa de péptidos y
proteínas con una gran sensibilidad (subpicomol).
-Bases de datos que permiten caracterización péptidos y secuenciación.
Proteínas
-Habitualmente después de aislamiento utilizando diálisis, UF,
precipitación con disolventes orgánicos o sales.
-Análisis RP-LC, IEC, SEC.
-Separación proteínas utilizando rellenos peliculares, rellenos perfusión
y columnas monolíticas.
-Diferentes aproximaciones al problema de baja difusividad proteínas en
poros de rellenos convencionales: ensanchamiento y pérdida de eficacia.
-Rellenos peliculares, de perfusión y columnas monolíticas.
-Polymeric monolithic stationary phases offer an alternative to the
classical microparticulate sorbents, bringing important advantages to
sample analysis. In contrast to the traditional stationary phases, which
consist of packed particles, the monolithic separation medium is made of
a continuous, rigid polymeric rod with a porous structure. The lack of
intraparticular void volume improves mass transfer and separation
efficiency, which allows for very fast separations of biopolymers.

Capillary LC/MS separation of 13 digested proteins. Up to 150 peptides separated in less

than 15 min.
 ANÁLISIS DE CARBOHIDRATOS POR HPLC
Interés análisis carbohidratos:

- relación carbohidratos-salud
- control productos bajo contenido calorías/dietéticos/diabéticos
- industria-control calidad y de adulteraciones, ej: contenido lactosa en
alimentos sin lactosa, contenido fructosa siropes, etc.
Análisis carbohidratos:
- métodos químicos
- métodos enzimáticos
- GC (baja volatilidad, derivados cuantitativos)
- HPLC (mínima preparación muestra, desarrollo nuevos detectores:
amperométricos, MS, etc.)
- HPLC, detectores más utilizados: índice refracción
short wavelength UV
fluorescencia después de
formación derivados
amperométrico
Extracción con agua previa análisis HPLC, clean-up SPE.
HPLC con fase ligada a sílice amino, diol, ciano, C18, etc.ó intercambio
iónico con resinas aniónicas y catiónicas, SEC
Análisis de carbohidratos en limonada. Detector índice refracción,
Intercambio iónico
 CONSERVANTES
Autorizados por la CEE 64/54/CEE de 5/11/63 y post.:
ac. sórbico, cítrico, acético, propiónico, succínico, fosfórico, láctico,
málico, tartárico, fumárico, etc.
ACIDULANTES: - agentes saborizantes para intensificar ciertos
sabores y enmascarar algunos otros
- control pH (tampón) durante el procesado y
conservación
- prevenir crecimiento µorg
- sinergia con antioxidantes para prevenir
enranciamiento y oscurecimiento
- modifican viscosidad
- modifican punto fusión

PREPARACIÓN MUESTRA: f(matriz)destilación, SPE

Intercambio iónico
Fase móvil: 0.003 M H2SO4
Longitud onda: 192 nm

Intercambio iónico
Fase móvil: 0.007 M H2SO4
DAD
 ANTIOXIDANTES
Retardan enranciamiento oxidativo (adición grasas y aceites en 200
ppm)
ac. ascórbico, tocoferoles, galato propilo (PG), galato octilo (OG),
butilhidroxianisol (BHA), butilhidroxitolueno (BHT), etc.

En los paises donde está permitido su uso debe determinarse el máximo

nivel de estos compuestos en el alimento.

HPLC: técnica más idonea para determinación antioxidantes de

naturaleza fenólica

PREPARACIÓN MUESTRA: f(matriz)bajas grasa: L/L

complejas: SPE, L/L,
detilación

Fase inversa. Fase móvil: A: agua, B: ACN gradiente

DAD
 COLORANTES
Color: característica influye directamente rechazo o aceptación
producto
Antigüedad: colorantes naturales (clorofilas, carotenoides, flavonoides,
antocianos plantas, minerales como óxidos de hierro, etc.)

Actualidad: colores sintéticos. Clasificación según estructura química:

- azo (mono, di, tris)
- indol
- trifenilmetano

Métodos HPLC: par iónico e intercambio iónico

Absorción UV: longitud onda característica

 EDULCORANTES
Edulcorantes no nutritivos: - sustitutivos sacarosa
- más utilizados: sacarina
aspartamo
ciclamatos
acesulfamo potásico

Investigación para detectar la toxicidad de estos compuestos (seguridad

para consumo). Regulación de su concentración en alimentos y bebidas
para evitar un consumo excesivo

Aspartamo: derivatización en columna (OPA) + análisis HPLC fase

inversa. Fase móvil: A: acetato sódico, B: metanol. Gradiente.
Detección UV 338 nm
ANÁLISIS DE RESIDUOS Y CONTAMINANTES POR HPLC
Elección método análítico:
- especificidad
- sensibilidad
- precisión
- reproducibilidad
- rapidez

Residuos productos zoosanitarios: substancias destinadas al

diagnóstico, prevención o tratamiento de las enfermedades de los
animales que pueden dar lugar, por su mal uso o abuso, a repercusiones
desfavorables para aquellos o para la salud pública

Clasificación según finalidad uso:

- promotores crecimiento
- productos para tratamiento terapéutico o
profiláctico de enfermedades

Tipos de residuos: - anabolizantes (estrógenos, andrógenos, etc.)

- tireostáticos
- antibióticos (cloranfenicol, tetraciclinas)
- sulfamidas (bacteriostáticos)
- beta-agonistas (clembuterol)
- plaguicidas (carbamatos, piretrinas, herbicidas)

Necesidad análisis residuos:

- existencia riesgo potencial salud (hormonas producen alteraciones)
- efecto sobre procesos industriales (antibióticos: bacterias resistentes.
Problemas en la elaboración yogur/queso)
- ventajas comerciales no legales (tireostáticos: fraude)
- aspectos toxicológicos
Características residuos:

- presencia muestra prohibida: el residuo o sus metabolitos deben

buscarse en el tejido donde se acumula (ej: tireostáticos en tiroides)
- concentración por debajo niveles autorizados: tomar muestra
representativa de la totalidad
Análisis residuos
bajas concentraciones (ppm, ppb, ppt) en muestras complejas

Esquema operativo:
1) extracción
2) purificación y concentración
3) detección e identificación
4) cuantificación
Análisis residuos de fármacos en huevos. Fase inversa, DAD. Fase
móvil: A: acetato sódico, B: ACN/agua. Gradiente.
Análisis de micotoxinas: compuestos tóxicos producidos por hongos.
Análisis esencial para garantizar seguridad de cereales, aceites semillas,
especias, etc.
Detección ppb: concentración muestra y detección con suficiente
sensibilidad. Fase inversa, DAD y detector fluorescencia. Fase móvil:
metanol:agua.

Análisis de plaguicidas en muestras de ensalada. Fase inversa, UV, Fase

móvil: A: agua, B: ACN. Gradiente.