3 Manual de Prácticas de Bioquimica

FUNDAMENTOS TEÓRICOS Y
PRACTICOS
BIOQUIMICA
JOSE ANTONIO VALERIANO ZAPANA

INDICE
Presentación.................................................................................................................................4
Normas de seguridad en el laboratorio de bioquímica..................................................................6
CAPÍTULO 1. PH Y SOLUCIONES AMORTIGUADORAS..............................................10
1. Introducción.......................................................................................................................10
2. Ley de acción de masas y equilibrio químico.....................................................................10
3. Ácidos y bases....................................................................................................................12
4. Concentración de iones hidrogeno y pH.............................................................................14
5. Medición del pH.................................................................................................................18
6. pH de ácidos, bases y soluciones salinas............................................................................25
7. Curvas de valoración..........................................................................................................27
8. Soluciones amortiguadoras y su capacidad de amortiguación............................................32
9. Cuestiones prácticas sobre curvas de titulación..................................................................36
10. Parte experimental............................................................................................................38
CAPÍTULO 2. COLORIMETRÍA Y FOTOMETRÍA.........................................................40
1. Introducción.......................................................................................................................40
2. Energía radiante..................................................................................................................40
3. Leyes de absorción.............................................................................................................41
4. Rangos adecuados de concentración...................................................................................47
5. Cálculo de la concentración de una muestra problema.......................................................47
6. Fotocolorímetros................................................................................................................49
7. Espectrofotómetros.............................................................................................................51
8. PARTE EXPERIMENTAL................................................................................................52
CAPÍTULO 3. ARACTERIZACION Y CUANTIFICACION DE CARBOHIDRATOS. .58
1. Introducción...........................................................................................................................58
2...........................................................................................................Hidrólisis de carbohidratos
...................................................................................................................................................58
3. Parte experimental..................................................................................................................59
EXPERIMENTO N° 1. FORMACION DE FURFURALES.................................................59
EXPERIMENTO N° 2. REACCIONES DE REDUCCIÓN: PRUEBA DEL HIDRÓXIDO
CÚPRICO..............................................................................................................................60
EXPERIMENTO N° 3. CUANTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS TOTALES EN
ALGAS POR EL METODO DE DUBOIS............................................................................62
EXPERIMENTO N°4. EXPERIMENTO HIDROLISIS ACIDA DEL ALMIDÓN..............64
EXPERIMENTO N° 5. HIDROLISIS ENZIMATICA DEL ALMIDÓN..............................66
CAPÍTULO 4. ANALISIS DE LIPIDOS...............................................................................68
1. Introducción...........................................................................................................................68
Fundamentos teóricos y prácticos en Bioquímica Ambiental 2

EXPERIMENTO N° 1. SOLUBILIDAD DE LOS LIPIDOS................................................69
EXPERIMENTO N° 2. DETERMINACIÓN DEL VALOR DE ACIDEZ DE UNA GRASA
...............................................................................................................................................70
EXPERIMENTO N° 3. CARACTERIZACIÓN DE LOS TRIACILGLICEROLES DE
ACEITES...............................................................................................................................71
EXPERIMENTO N° 4. HIDROLISIS DEL ACEITE DE OLIVA POR LA LIPASA
PANCREATICA....................................................................................................................72
CAPÍTULO 5. ARACTERIZACION DE AMINOACIDOS................................................75
1. Introducción...........................................................................................................................75
2. Determinación del punto isoeléctrico en los aminoácidos......................................................75
3. Aislamiento y separación de aminoácidos..............................................................................77
4. Reacciones químicas de los aminoácidos...............................................................................78
EXPERIMENTO N° 1. REACCION CON NINHIDRINA...................................................81
EXPERIMENTO N° 2. REACCION XANTOPROTEICA...................................................82
EXPERIMENTO N° 3. REACCION DE MILLON...............................................................83
EXPERIMENTO N° 4. REACCIÓN CON ACETATO DE PLOMO....................................84
EXPERIMENTO N° 5. REACCIÓN MCCARTHY-SULLIVAN.........................................86
EXPERIMENTO N° 6. REACCION DE HOPKINS-COLE.................................................87
CAPITULO N° 6. CARACTERIZACION Y CUANTIFICACION DE PROTEINAS I....89
1. Introducción...........................................................................................................................89
2. Desnaturalización de las proteínas..........................................................................................90
EXPERIMENTO N° 1. REACCIONES DE COLORACIÓN................................................91
EXPERIMENTO N° 2. REACCIONES DE PRECIPITACIÓN............................................91
EXPERIMENTO N° 3. DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELECTRICO Y
SOLUBILIDAD DE LA CASEINA.......................................................................................93
EXPERIMENTO N° 4 ESTIMACIÓN CUANTITATIVA DE PROTEÍNAS A PARTIR DE
ALGAS MARINAS POR EL MÉTODO DE BIURET DE LAYNE.....................................94
CAPITULO 7. ESTUDIO DE LOS PRINCIPALES FACTORES CINETICOS DE LA
FOSFATASA ACIDA DE QUINUA.......................................................................................97
1. Introducción...........................................................................................................................97
2. Factores cinéticos...................................................................................................................97
EXPERIMENTO N° 1. EFECTO DEL TIEMPO..................................................................99
EXPERIMENTO N° 2. EFECTO DE LA CONCENTRACION DE ENZIMA...................100
EXPERIMENTO N° 3. EFECTO DEL PH..........................................................................101
EXPERIMENTO N° 4. EFECTO DE LA TEMPERATURA..............................................103
EXPERIMENTO N° 5. EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO..............104

CAPÍTULO 8. CICLO DE KREBS......................................................................................107
1. Introducción.........................................................................................................................107
2. Estudio del succinato deshidrogenasa...................................................................................107
3. Parte experimental................................................................................................................108
EXPERIMENTO N° 1. ESTUDIO DE LA ACCIÓN ENZIMÁTICA DEL SUCCINATO
DESHIDROGENASA..........................................................................................................108
CAPÍTULO 9: FOTOSINTESIS...........................................................................................110
1. INTRODUCCIÓN...............................................................................................................110
2.CENTROS DE REACCION.................................................................................................110
3. PARTE EXPERIMENTAL..................................................................................................112
EXPERIMENTO N° 1. AISLAMIENTO DE CLOROPLASTOS Y FRAGMENTOS DE
CLOROPLASTOS...............................................................................................................112
EXPERIMENTO N° 2. DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE CLOROFILA.........114
EXPERIMENTO N° 3. REACCION DE HILL...................................................................116
CAPÍTULO 10. EXTRACCION E IDENTIFICACION DE DNA.....................................120
1. Introducción.........................................................................................................................120
EXPERIMENTO N° 1. PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE DNA DE
CEBOLLA...........................................................................................................................121

Presentación
El presente manual de laboratorio es para la asignatura de Bioquímica como curso
básico que se imparte en todas las áreas tales como la Ingenierías (Ingeniería
Ambiental, Ingeniería Agroindustrial, Ingeniería Alimentaria, Ingeniería Pesquera)
tiene como objetivo familiarizar al estudiante con el manejo de sustancias químicas y su
aplicación, metodologías analíticas, el manejo de equipos; darle experiencia personal en
algunas técnicas y ponerlo en contacto con el método científico y seguir estimulando su
interés por esta rama de la ciencia, para lograr este objetivo es necesario que el
estudiante tenga presente lo siguiente:
 Qué debe leer las practicas propuestas antes de realizarlos, poniendo énfasis a la
introducción que se propone en cada uno de las practicas.
 Qué debe recurrir a sus libros de consulta, internet (paginas como la que propone el
CONCYTEC en su biblioteca virtual), normas técnicas, instructivos de
funcionamiento, etc., para aclarar dudas y comprender el fundamento de cada
práctica.
 Qué debe realizar su practicas guardo un criterio lógico e interpretativo, buscando
argumentos que permitan discutir sus resultados.
 Qué debe entender que la parte básica y el principio permite modificar algunos
protocolos establecidos en este manual de prácticas.
 Qué debe anotar sus observaciones y buscar la explicación científica, validada de
fuentes científicas.
Cada una de las prácticas contiene la metodología necesaria para el desarrollo y el
cumplimiento de los objetivos, así como los antecedentes teóricos presentes en la
introducción, necesarios para la comprensión de cada una de las prácticas y poder
reforzar los aspectos teóricos del curso.
En el caso de algunos aspectos teóricos complejos, éstos pueden ser aclarados a través
de la lectura suplementaria de la bibliografía recomendada al final del presente manual
o bien la bibliografía consultada por cada uno de los alumnos.
El manual está integrado por prácticas representativas y secuenciales de las unidades del
curso teórico. Los criterios que se tomaron en cuenta para seleccionar el material
incluido en este manual fueron:
 Que el experimento ilustrara un principio fundamental teórico para relacionar con

otras ramas como la Microbiología, Edafología, Biología Molecular, Biotecnología
y otras a fines tanto en el campo de la Ingenierías como en el campo de la Salud.
 Que conozca la importancia de la Biología y la Química en la explicación de
algunos fenómenos que se presentan en la vida cotidiana
 Que fuera lo más simple posible permitiendo al alumno llevarlo a cabo en un tiempo
de 3,0 h
 Que fueran de utilidad para sus cursos posteriores.
Esta primera edición del Manual de Bioquímica no pretende ser definitiva, si no ser
objeto de revisiones y mejoras sistemáticas por parte de los miembros de la Academia

de Bioquímica, este Manual no sustituye a la participación y guía de los profesores en el
desarrollo experimental, ni a la discusión de los resultados obtenidos.
Agradecimientos a mis profesores, amigos y colegas al Prof. Dr. Luis Alberto Ponce
Soto (UNSA-PERU), al Prof. Dr. Ronal Navarro Oviedo (UNSA-PERU) y al Prof.
Sergio Marangoni (UNICAMP-BRASIL)

Normas de seguridad en el laboratorio de bioquímica
Cada laboratorio debería tener un código profesional. Habitualmente este identificara
al supervisor del laboratorio como la persona responsable de la seguridad de los
individuos que se encuentra en el laboratorio. El termino supervisor se orientará el
papel que cumple el docente dentro del laboratorio Por lo tanto tomará las decisiones
en asuntos tales como si la capacitación la conducta el comportamiento de los
alumnos dentro del laboratorio o al mantenimiento de un entorno seguro dentro del
mismo. Se confía en un comportamiento responsable. Pero si este no fuera el caso el
docente tendrá que imponer la disciplina.
Las medidas de Seguridad en Laboratorios son un conjunto de medidas preventivas
destinadas a proteger la salud de los que allí se desempeñan frente a los riesgos
propios derivados de la actividad, para evitar accidentes y contaminaciones tanto
dentro de su ámbito de trabajo, como hacia el exterior. Las reglas básicas aquí
indicadas son un conjunto de prácticas de sentido común realizadas en forma
rutinaria.
Código de manejo dentro del laboratorio de Bioquímica
a) El uso del mandil (bata) es obligatorio.
b) Antes de empezar el trabajo en el laboratorio tienes que familiarizarte con los
elementos de seguridad disponibles.
c) Es necesario localizar las salidas principales y de emergencia por si se diese el
caso de una evacuación por fuego o por cualquier otro incidente, así como conocer la
localización exacta de extintores, duchas de seguridad y duchas de ojos.
d) En el laboratorio no está permitido la comida, la bebida ni el tabaco.
e) Todas las disoluciones de reactivos deben estar claramente etiquetados con
nombre y la concentración del reactivo y el nombre de la persona responsable.
f) La transferencia de pipeta se debe realizar utilizando peras de gomas o pipetas
automáticas, nunca aspirando con la boca.
g) Se deben limpiar todos los derrames, así como secar los pavimentos húmedos
inmediatamente
h) Sólo los residuos solubles en agua y baja toxicidad se pueden verter por la
fregadera (arrastrándola con cantidades copiosas de agua) para su desecho el resto de
los desperdicios químicos se deben guardar en botellas para residuos.
i) Los disolventes clorados no se deben nunca mezclar con otros disolventes ser
añadido a los mismos
j) Lávese las manos antes de abandonar el laboratorio.
k) Si un producto químico te salpica los ojos, utiliza inmediatamente una ducha de
ojos y lava completamente el ojo afectado durante 15 minutos sin interrupción. Actúa
siempre con urgencia, en menos de 10 segundos. No dirijas una corriente de alta

presión de agua de un grifo directamente al ojo porque podrías lesionarlo. Informa al
encargado del laboratorio de lo que ha sucedido y si es necesario pide asistencia
médica.
l) El uso de bata (preferentemente de algodón) es obligatorio, ya que por mucho
cuidado que se tenga al trabajar, las salpicaduras de productos químicos son
inevitables.
m) Así mismo se recomienda llevar zapatos cerrados y no sandalias.
n) Los recipientes del laboratorio nunca deben utilizarse para el consumo y
conservación de alimentos y bebidas; tampoco las neveras u otras instalaciones
destinadas al empleo en los laboratorios.
o) Lavarse siempre las manos después de hacer cualquier análisis y antes de salir
del laboratorio.
p) Procure quitarse la bata hasta que salga del laboratorio.
q) Cerrar herméticamente los frascos de productos químicos después de utilizarlos.
r) Cuando se calienten tubos de ensaye hágalo siempre en la parte superior del
líquido y con agitación suave, nunca por el fondo del tubo, y debe estar inclinado y
no apuntar hacia ninguna persona.
s) No deben transportarse innecesariamente los reactivos de un sitio para otro del
laboratorio. Si tuviese que hacerlo, tenga cuidado con las botellas, las cuales deben
ser siempre transportadas cogiéndolas por el fondo, nunca por la boca de la botella.
t) El área de trabajo tiene que mantenerse siempre limpia y ordenada, sin libros,
abrigos, bolsas, productos químicos vertidos.
u) La conducta en el laboratorio debe ser seria, sin bromas, sin correr, jugar,
empujar, gritar, etc.
v) No se puede hacer ningún experimento no autorizado.
w) No utilices nunca un equipo o aparato sin conocer perfectamente su
funcionamiento.
x) No utilices material de cristal en mal estado ya que aumenta el riesgo de
accidentes.
y) El material y los aparatos utilizados tienen que dejarse siempre limpios y en
perfecto estado de uso.
z) Todos los productos químicos tienen que ser manejados con mucho cuidado de
acuerdo con las Hojas de Seguridad de cada una de las sustancias.
1. MEDIDAS GENERALES EN CASO DE ACCIDENTE

2.1 PLAN GENERAL DE EMERGENCIA:
• Dar la alarma.
• Ponerse a salvo.
• Ayudar a las personas.
• Luchar contra el fuego.

• Avisar al responsable del departamento.
• Evacuación del edificio en caso necesario.
• Avisar a ambulancias, bomberos.
2.2 QUEMADURAS:
• Las pequeñas quemaduras producidas por material caliente, baños, placas, etc., se
tratarán lavando la zona afectada con agua fría durante 10-15 minutos.
• Las quemaduras más graves requieren atención médica inmediata.
• No utilices cremas y pomadas grasas en las quemaduras graves.
2.3 FUEGO EN EL LABORATORIO:

• Evacuar el laboratorio, por pequeño que sea el fuego, por la salida principal o
por la salida de emergencia, si la principal está bloqueada.
• Avisar a todos los compañeros de trabajo sin que se extienda el pánico y
conservando siempre la calma.
• Si el fuego es pequeño y localizado, apagarlo utilizando un extintor adecuado,
arena o cubriendo el fuego con un recipiente de tamaño adecuado que lo ahogue.
• Retirar los productos químicos inflamables que estén cerca del fuego. No utilices
nunca agua para extinguir un fuego provocado por la inflamación de un
disolvente.
• Para fuegos grandes aislar el fuego, utilizar los extintores adecuados, si el fuego
no se puede controlar rápidamente accionar la alarma de fuego, avisar al servicio
de extinción de incendios y evacuar el edificio.
2.4 CORTES:
• Los cortes producidos por la rotura de material de cristal son un riesgo común en
el laboratorio.
• Las cortadas se tienen que lavar bien, con abundante agua corriente, durante 10
minutos como mínimo.
• Si la cortada es pequeña y deja de sangrar en poco tiempo, lávala con agua y
jabón y tápala con una venda.
• Si la cortada es grande y no deja de sangrar, requiere de asistencia médica
inmediata.
2.5 DERRAME DE PRODUCTOS QUÍMICOS SOBRE LA PIEL:
• Los productos químicos que se hayan vertido sobre la piel han de ser lavados
inmediatamente con agua corriente abundantemente, como mínimo durante 15
minutos.

• Las duchas de seguridad instaladas en los laboratorios serán utilizadas en
aquellos casos en que la zona afectada del cuerpo sea grande y no sea suficiente
el lavado en una pila.
• Es necesario sacar toda la ropa contaminada de la persona afectada lo antes
posible mientras esté bajo la ducha.
• Recuerda que la rapidez en el lavado es muy importante para reducir la gravedad
y la extensión de la herida.
• Proporcionar asistencia médica a la persona afectada.
2.6 CORROSIONES EN LA PIEL POR ÁCIDOS Y ÁLCALIS:
• Cuando ocurre una corrosión por ácidos, corta lo más rápidamente posible la
ropa, lave con agua abundantemente la zona afectada, neutralice la acidez con
bicarbonato de sodio durante 15-20 minutos, sacar el exceso de pasta formada,
seca y cubra la parte afectada con linimento óleo-calcáreo o parecido.
• Cuando se produce una corrosión por álcalis, lave la zona afectada
abundantemente con agua corriente y aclárala con una disolución de ácido
acético al 1%, seca y cubre la zona afectada con una pomada de ácido tánico.
2.7 CORROSIONES EN LOS OJOS:
• En este caso el tiempo es esencial (menos de 10 segundos), cuanto antes se lave
el ojo, menos grave será el daño producido.
• Lava los dos ojos con agua corriente abundantemente durante 15 minutos como
mínimo en una ducha de ojos, y, si no hay, con un frasco de lavar los ojos.
• Es necesario mantener los ojos abiertos con la ayuda de los dedos para facilitar
el lavado debajo de los párpados.
• Es necesario recibir asistencia médica, por pequeña que parezca la lesión.
2.8 INGESTIÓN DE PRODUCTOS QUÍMICOS:
• Antes de cualquier actuación pide asistencia médica.
• Sí el paciente está inconsciente, ponerlo en posición lateral de seguridad, con la
cabeza de lado, y estirarle la lengua hacia fuera.

CAPÍTULO 1. PH Y SOLUCIONES
AMORTIGUADORAS
1. Introducción
Los procesos celulares son sensibles a los cambios de pH y se realizan en un medio
cuyo pH está controlado. Por ello, el estudio de los mismos y su reproducción "ïn
vitro" requiere el uso de medios que regulen el pH.
Debido a que el agua constituye más del 50% de la mayoría de los tejidos tanto de
plantas como de animales, las reacciones bioquímicas se verifican en medio acuoso,
y la mayor parte en un medio que se mantiene cercano a la neutralidad. Por lo tanto,
es fundamental conocer a fondo las propiedades de los ácidos y las bases de un
sistema amortiguador.
Puesto que el agua no solo es el componente celular más abundante, sino que tiene
además carácter de compuesto indispensable para la vida, es conveniente hacer notar
que esta sustancia presenta muchas propiedades excepcionales que la facultan para
desarrollar su tarea de solvente de la vida. De estas propiedades, las que permiten
explicar el rol biológico del agua, son las siguientes: punto de ebullición, calor de
vaporización y punto de fusión más alto que los correspondientes a otras sustancias
relacionadas (H2S, etanol, metanol, HF, etc.) y además, capacidad calórica y calor
de fusión elevados.
2. Ley de acción de masas y equilibrio químico

En 1864 GULDBERG y WAAGE establecieron una relación entre la velocidad de
una reacción química y las concentraciones moleculares de las sustancias
reaccionantes, llamada ley de acción de masas, que dice: "La velocidad de una
reacción química en un tiempo dado, es proporcional a la concentración molecular
(moléculas / unidad de volumen) de las sustancias reaccionantes presentes en ese
tiempo".
Considerando la reacción química reversible siguiente:
A+ B ↔C + D
donde para la reacción de ida, los reaccionantes son A y B y los productos que se
originan son C y D.
La velocidad para esta reacción será proporcional a las concentraciones moleculares

de A y B
V α [ A ] [B ]
Introduciendo una constante de proporcionalidad (k1) que mida la afinidad química

propia de la reacción, la ecuación anterior puede escribirse:
V 1=c [ A ] [B ]
Para la reacción de vuelta, en forma análoga, se tendrá:
V 2=k 2 [ C ] [ D]
donde k2 es la constante de proporcionalidad que mide la afinidad química de la

reacción de derecha a izquierda.
Cuando la reacción alcanza el equilibrio, las concentraciones de las cuatro sustancias
ya no se modifican, lo que quiere decir que la velocidad de la reacción de ida, se hace
igual a la velocidad de la reacción de vuelta.
Por tanto,
V 1=V 2
k 1 [ A ][ B ] =k 2 [ C ] [D]
lo que también puede escribirse así:
K=k 1 / k 2 = [C][D]/[A][B]
donde K es otra constante, que expresa la relación k 1 /k2 y que se conoce como
constante de equilibrio, que expresa matemáticamente la relación entre las
concentraciones de las sustancias reaccionantes en el estado de equilibrio. Cuando la
constante de equilibrio se aplica a reacciones de ionización recibe el nombre de
constante de ionización.
Aplicación de la ecuación de equilibrio. - El valor numérico de K es específico y
característico para reacción, sea cuales fueren las concentraciones relativas, siempre
que la temperatura se mantenga constante. Cuando K es alta, las concentraciones de C

y D son altas en el equilibrio en relación a las concentraciones de A y B, indicando que
la afinidad entre A y B es grande y que la reacción hacia la derecha predominará. Por
otro lado, un valor pequeño de K, indica un predomino de la reacción hacia la izquierda
y una afinidad grande entre C y D.
3. Ácidos y bases
3.1 Definiciones
Por costumbre se define a un ácido como aquella sustancia que en solución aporta
hidrogeniones (H+) al medio y base aquella que al disolverse da iones oxidrilos
(OH-).
El concepto moderno de ácidos y bases de BRÖNSTED, LOWRY y otros, define
un ácido como un donador de protones y una base como un aceptor de protones.
Por lo tanto, cada ácido tiene una base conjugada.
Acido Base + H+
El concepto de BRÖNSTED es idéntico al concepto clásico en lo que se refiere a

los ácidos, puesto que un protón es lo mismo que un hidrogenión H + (es decir un
átomo de hidrógeno sin su electrón orbitario) pero es muy diferente en lo que se
refiere a las bases.
De acuerdo con esta teoría, un ácido se disocia en un protón y una base. Esta
última puede regenerar al ácido al reaccionar con un protón. Un ácido y su base se
llaman conjugados.
Álcali.- El término álcali se reserva para aquellos compuestos que al disociarse
generan iones hidroxilo:
KOH K+
+ OH-
Se comprende fácilmente que las bases clásicas, como el KOH, NaOH, etc. no
pueden ser consideradas como tales según la teoría de BRÖNSTED puesto que no
aceptan protones; sin embargo, funcionan como bases porque al disociarse en K + y
OH-, el grupo oxidrilo OH-, que es la verdadera base, acepta un protón H + para
formar H2O. Es decir, el ion OH- es base, pero la molécula de KOH no lo es.
Anfolitos. - Son especies iónicas que pueden actuar como ácidos y como bases;
por ejemplo, el agua y los aminoácidos (Tabla N° 1). Se dice también que son
anfóteros.

Aun cuando es cómodo escribir el equilibrio ácido-base en la forma indicada
arriba, el protón no existe como tal, sino que está solvatado. Por ejm., en medio
acuoso el hidrogenión existe como hidronio (H3O+).
H+ + H2O
H3O+
Tabla N° 1. Ejemplos de acidos y bases brönsted
ACIDO BASE CONJUGADA
HCl H+ + Cl-
CH3COOH H+ + CH3COO-
NH4+ H+ + NH3+
H2CO3 H+ + HCO3-
HCO3 H+ + CO3—
H2O H+ + OH-
H3O+ H+ + H2O
3.2. Fuerza de ácidos y bases

Se deben distinguir dos términos: concentración que es la cantidad de ácido o
base disuelto en un determinado volumen de agua (mol / litro) y fuerza de un
ácido o una base es la medida de la efectividad con que un compuesto se comporta
como ácido o como base.
3.2.1. Fuerza de un ácido.
La fuerza de un ácido está dada por su capacidad para ceder protones. Por ejemplo,
los ácidos clorhídrico y nítrico se disocian casi completamente en solución acuosa
y por lo tanto serán ácidos fuertes. Por el contrario, los ácidos acético y fórmico,
que están solo ligeramente disociados en solución, serán ácidos débiles. De otro
lado, se considera que un ácido es fuerte cuando tiene una constante de equilibrio
superior a 10-2 (Ka mayor que 10-2). O en otras palabras, puesto que pKa = - log
Ka, es evidente que cuanto menor es el valor de pKa de un ácido, más fuerte es el
mismo (Ka = constante de disociación de un ácido).
Ácidos fuertes:
Ácido nítrico HNO3 H+ + NO3-
Ácido clorhídrico HCl H+ + Cl-

Ácidos débiles:
Ácido acético CH3COOH H+ + CH3COO-
Acido fórmico HCOOH H+ + HCOO-

3.2.2. Fuerza de una base.
La fuerza de una base está dada por la magnitud en que se disocia en solución
acuosa para dar lugar a iones hidroxilo o por la capacidad para aceptar protones.
Por ejemplo, el NaOH y el KOH que están completamente ionizados en solución
acuosa (de manera que la concentración de OH- es la misma que la de la base), son
bases fuertes y tienen alta afinidad por los protones. Por el contrario, la anilina
que esta sólo ligeramente disociada en solución, será una base débil; tiene escasa
afinidad por los protones (Ejm. el Cl- del HCl):
C6H5NH2 + H+ C6H5NH3+
Base débil (anilina)
Se considera bases fuertes aquellas que tienen una constante de equilibrio superior
a 10-12 (Kb mayor de 10-12).
La capacidad del solvente de combinarse con el hidrogenión afecta la capacidad de
disociación de un ácido o una base y así, un mismo compuesto puede actuar como
un ácido débil en un solvente y como ácido fuerte en otro.
Es importante, también, señalar que la fuerza de un ácido depende de qué tan
fuerte es su base conjugada, así como de la constante dieléctrica del medio. En un
ácido fuerte, como el HCl, su base conjugada (base débil, Cl -) tiene escasa afinidad
por los protones, prefiriendo estos combinarse con el solvente y determinar un alto
grado de disociación del ácido.
En el caso de los ácidos débiles sus bases conjugadas (base fuerte) tienen gran
afinidad por los protones, prefiriendo estos seguir combinándose con el solvente y
determinan un escaso grado de disociación del ácido.
4. Concentración de iones hidrogeno y pH
4.1. Definición de pH
La concentración de iones hidrógeno da el grado de acidez de una solución, de allí
que la forma más racional de expresar la acidez de una solución sea en función de

la concentración de hidrogeniones expresada en normalidad, es decir, en
equivalentes gramo de hidrogeniones/litro. Por ejm., una solución con 1 g. de
hidrogeniones/litro, tendrá una acidez 1 N. Sin embargo, en los líquidos biológicos
las concentraciones de hidrogeniones son muy bajas y su manejo es fastidioso y
expuesto a errores y difíciles de memorizar; así la concentración de hidrogeniones
en el plasma es de 0.0000000389 N. Si omitimos un solo cero, la concentración de
hidrogeniones se alterará 10 veces.
Por estas consideraciones, Sörensen en 1909 introdujo el término pH (potencial de
hidrogeniones) como una forma adecuada de expresar la concentración de
hidrogeniones, utilizando solo el exponente con signo positivo. Así, una solución
con una concentración 0.0000001 de hidrogeniones, en vez de escribir esa cifra,
Sörensen propuso escribirla como 10-7 y utilizar solo el exponente con signo
positivo, es decir 7 como la medida de iones hidrógeno.
El pH se define entonces, como el logaritmo negativo de la actividad de
hidrogeniones, pero en la práctica se le denomina concentración de
hidrogeniones, ya que la concentración y la actividad son prácticamente las
mismas, excepto en soluciones fuertemente ácidas.
pH = -log 10 [H+ ]
Ejm. La concentración de hidrogeniones del plasma es 0.0000000398 N. Esta

cantidad puede escribirse, también, de esta otra forma 398 x 10-10. Por lo tanto, el
pH del plasma será:
pH = -log 10 [ 398 x 10 -10 ]

pH = -log [398+10]
pH = -2.59988 +10
pH = 7.40012
4.2. DISOCIACION DEL AGUA

4.2.1. Derivación de Kw
El agua purísima prácticamente no es conductora, pero en realidad tiene una
pequeñísima conductividad, reveladas por las medidas de conductividad. Esta débil
conductividad indica que el agua debe estar ligeramente disociada en iones H + y
OH-.
H2O H+ + OH-

Sin embargo, puesto que el H+ (el protón) está hidratado, podemos escribir más
correctamente como:
2H2O H3O+ + OH-
(el H3O+ se conoce como ion "hidronio"). el propio H 3O+ se halla hidratado
mediante el establecimiento de más enlaces de hidrógeno formando el ion H3O4+.
La pequeña disociación del agua se debe a que el átomo de hidrógeno tiene una
masa pequeña, y a que su único electrón se halla fuertemente retenido por el átomo
de oxígeno. Por esto el átomo de hidrógeno difícilmente puede disociarse del
átomo de oxígeno al que se halla unido covalentemente en una molécula de agua y
"saltar" al oxígeno de la molécula de agua adyacente a la cual se halla unido por
enlace de hidrógeno. En esta reacción se producen dos iones el ion hidronio (H 3O+)
y el ion hidroxilo (OH-).
En un litro de agua pura, a 25 °C, existen solo 1 x 10 -7 mol de iones de H3O+ y una
cantidad igual de iones OH-, según muestran las medidas de conductividad
eléctrica. El agua destilada común contiene impurezas que la hacen mucho más
conductora. Una buena agua destilada, recientemente obtenida por destilación con
contacto del aire, puede tener una conductividad específica de 0.7 x 10 -6 l/ohm cm
(esto es 20 veces mayor que el valor mínimo hallado 0.038 x 10-6 l/ohm cm).
La constante de equilibrio para la disociación del agua está dada por:
[ H + ][ OH - ]
K=
[ H 2O ]
Como un litro de agua pura contiene 55.5. moles de agua (1000/18 = 55.5) esto es,
número de gramos de agua en un litro dividido por el peso molecular gramo) y solo
0.0000001 mol (= 1 x 10-7 a 25 °C) se halla disociado, es natural que podrían variar
enormemente los valore de [H+] y [OH-] sin que la [H2O] se altere perceptiblemente.
Por ejm., si la concentración de estos iones aumentara en 1'000,000 de veces, los
moles de agua no disociados por litro descendería de 55.5 55.4. De manera que sin
incurrir en error apreciable, se admite que la concentración de las moléculas (H 2O)
es constante y su actividad es 1. Según esto, la constante de equilibrio para el agua
puede escribirse:
[ H + ][ OH - ]
K=
[ 55.5 ]

[ 55.5 ][ K ] = [ H + ][ OH - ]
y el término [55.5][K] puede sustituirse por una constante "global" Kw llamada
producto iónico del agua, entonces:
Kw= [ H + ][ OH - ]
En el agua pura [ H + ] =[ OH - ] puesto que al disociarse el agua produce iguales

cantidades de ambos iones (neutra) como [H + ] = 10 -7 será también [OH- ] = 10 -7,
de donde se deduce que para el agua pura a 25 °C el producto iónico es 10-14.
Kw=[H + ][OH-] = 10 -7 x 10 -7 = 10 -14
10 -14 = [H + ][OH-]
Puesto que 10-14 = 10-7 x 10-7, se comprende que al aumentar la [H+] la [OH-] debe
disminuir y viceversa. Por ejm., si al agua pura añadimos HCl hasta aumentar la
[H+] a 10-3, la [OH-] disminuirá a 10-11, así:
10 -14 = 10 -3 x 10 -11
Para evitar dificultades en el uso de números decimales, aplicando los logaritmos

negativos correspondientes, tenemos:
-log 10 -14 = (-log [H + ]) + (-log[OH - ])
donde se observa que el producto de la igualdad se convierte en una suma y así, al

tomar el logaritmo negativo:
14=7+7
y para el ejemplo:
14=3+11
En conclusión, la suma de los logaritmos negativos de las concentraciones de iones

H+ y OH- en una solución acuosa es una constante de valor 14 a 25 °C. Así el pH del
agua pura a 25 °C es 7 (neutra).

4.2.2. Temperatura y Kw
El pH neutro no es 7 a cualquier temperatura, puesto que Kw cambia con la
temperatura y otros factores. Por ejm., el cambio de temperatura de 37 °C a 40 °C,
causa un incremento de 8% en iones H+ y en iones OH-. Esto indica que cualquier
elevación o descenso de la temperatura puede producir un cambio biológico
profundo en los organismos vivos sensibles a la [H+] (Tabla N° 2).
Tabla N° 2. Producto iónico del agua Y pH de neutralidad a diferentes temperaturas.

°C Kw pH de neutralidad
0 0.12 x 10 = 10-14.94
-14
7.97
25 1.03 x 10-14 = 10-14.00 7.00
37 2.51 x 10-14 = 10-13.60 6.80
40 2.95 x 10-14 = 10-13.53 6.77
75 16.90 x 10-14 = 10-12.77 6.39
100 48.00 x 10-14 = 10-12.32 6.16
5. Medición del pH
El pH puede determinarse por mediciones catalíticas, espectrofotométricas, de la

tensión superficial y de la conductividad. Pero estos procedimientos no se usan. En
cambio, describiremos los métodos colorimétricos y electrométricos.
La determinación del pH es uno de los procedimientos analíticos más importantes y
utilizados en bioquímica, ya que el pH determina muchas características de la
estructura y la actividad de las macromoléculas biológicas y, por tanto, de la
conducta de las células y de los organismos.
5.1. Métodos colorimétricos
Si se desea tener una medida aproximada del pH de una solución se puede usar los
llamados indicadores.
5.1.1. Teoría de los Indicadores
Los indicadores son base o ácidos débiles cuyo color depende del pH de la solución.
Este otro. Si se considera el indicador como un ácido, como sucede con los
compuestos nitrados, fenolftaleína, etc., al disociarse en una solución acuosa,

desprenderá iones H+:
HI H + + I-
Ácido Débil Base Conjugada
Color A Color B
y según la ley de acción de masas:

[ H + ][ I - ]
K=
[ HI ]
Si usamos la ecuación de Henderson-Hasselbalch, como para cualquier ácido débil:
log 10 [ I - ]
pH= pK in+
[ HI ]
Cada indicador tiene su constante de disociación Kin y su (-logKin) pKin. Cuando el

pH de la solución es igual al pKin del indicador, la relación [I-]/[HI] es igual a 1, por
lo tanto, existen en igual medida los dos colores.
Las dos formas del indicador tienen colores diferentes y como parecerá claro al
observar la última ecuación, el color de la solución dependerá del pK in y del pH. El
mayor cambio de color se obtiene alrededor del pK in y este es el intervalo de pH
donde el indicador es más útil. Por ejm., si una solución tiene un pH aproximado de
6, entonces el púrpura de bromocresol, que tiene un pKin de 6, es el mejor indicador
para el caso. Pero debido a que el cambio de color ocurre en un rango amplio de pH,
los indicadores tan solo dan una medida aproximada del pH. Otra desventaja de los
indicadores se debe a que son afectados por agentes oxidantes, agentes reductores,
concentraciones de sal y de proteína. Además, al usarlos, se debe agregar solo
pequeñas cantidades a la solución que se examina, o de lo contrario, el equilibrio
ácido-base de la muestra puede desplazarse y el pH cambiar.
El uso más importante de los indicadores es la determinación del punto final de una
titulación.
En las titulaciones, se selecciona un indicador que cambie de color en el punto de
equivalencia, el cual, depende de la titulación que se efectúa. Por ejm., cuando se
titula ácido acético con NaOH el ácido es transformado totalmente en sal alrededor
de pH 9; por l tanto debe usarse fenolftaleína como indicador. En la misma forma, el
rojo de metilo se usa cuando se titula amoniaco con HCl, puesto que el punto final

de titulación es pH 5.
En la Tabla N° 3 se consignan los indicadores más usados, sus valores de pK in y los
límites de pH entre los que se produce el cambio de color. Los límites de viraje de
un indicador determinan la llamada zona útil o zona de viraje, que corresponde a
dos colores diferentes que evidencian el predominio de la forma ácida o alcalina del
colorante para un determinado pH. Como ya se menciona, la zona de viraje varía
según los colorares, puesto que la constante de disociación pKin varía según su
naturaleza. Comparando el color obtenido con la solución desconocida con el color
"estándar" correspondiente, se tiene el pH de la solución desconocida.
En la práctica, se cuenta con series de colorantes para la determinación del pH,
como la propuesta por Clark y Lubs que permite el estudio de sustancias cuyo pH
estén comprendidos entre 1 y 10; los colorantes de la serie de Clark y Lubs son
derivados de la Sunfonftaleína y son amarillos del lado ácido, y rojos o azules del
lado alcalino. Los colorantes de la serie de Michaelis son monocromáticos, es decir,
va del incoloro al coloreado, o viceversa, y comprenden colorantes nitrados o
fenolftaleína.
El pH aproximado de una solución cuya concentración de iones H + es totalmente
desconocida, se puede determinar con el llamado indicador universal o de Bogen,
que es una mezcla de varios colorantes, los cuales, a medida que el pH aumenta en
la solución de estudio, van apareciendo los colores como del espectro. Así; pH 2,
rojo; pH 4, anaranjado; pH 6, amarillo; pH 8, verde; pH 10, azul; pH 12, violeta.
Una vez establecido el pH aproximado de la solución, se recurre al colorante de la
serie de Clark o de Michaelis cuyo viraje se produce en esa zona y de esta manera se
puede precisar más exactamente el pH de la solución.
La determinación del pH utilizando soluciones buffer, consiste en comparar el
color que toma el indicador en la solución cuyo pH se quiere conocer, y e color que
toma este mismo indicador agregado a soluciones buffer, como por ejm., del tipo de
McIlvaine, de pH conocido. El pH de las soluciones buffer se determina
exactamente mediante el método electrométrico.
Papeles impregnados con determinados indicadores toman las coloraciones
correspondientes cuando se mojan en la solución cuyo pH se quiere conocer. El tono
adquirido por el papel depende del pH de la solución y se puede comparar con los
colores estándar que llevan los tubos portapapeles. Los papeles a utilizar deben
variar dentro del pH de la solución. Así, por ejm., el papel impregnado con rojo de
fenol cuya zona de viraje está entre 6.8 y 8.4 permite determinar el pH de una
solución comprendido dentro de estos valores.
5.1.2. Errores del Método Colorimétrico

La adición de un colorante a una solución puede modificar el pH de esta, dada la
naturaleza ácida o básica del indicador y por la presencia de sales o proteínas que

modifican su viraje.
En las soluciones coloreadas o turbias, la coloración que da el indicador no es la
misma que en una solución clara e incolora; por ello, en tales casos se usan
comparadores; es decir, cajas especiales donde se disponen los tubos que contiene la
solución de pH desconocido, una solución coloreada estándar y el agua. La
turbiedad o el color del medio que se ensaya se superponen en los tres campos de
visión, y por sustitución de los tubos de colores estándar se llega a un tono que
coincide con el tubo central y que establece su pH.
El método colorimétrico no es rigurosamente exacto, y su precisión es de 0.1 pH,
que puede llegar a 0.03 pH si se procede con técnicas cuidadosas.
Tabla N° 3. Indicadores de pH
INDICADOR PKin LIMITES CAMBIO DE
DE pH COLOR
Acida Alcalina
Violeta de metilo 0.8 0.1 - 1.5 Amarillo Azul
Rojo cresol ácido 1.0 0.2 - 1.8 Rojo Amarillo
Púrpura de metacresol 1.5 0.5 - 2.5 Rojo Amarillo
Azul de timol 2.0 1.2 - 2.8 Rojo Amarillo
Tropeolina 2.2 1.3 - 3.0 Rojo Amarillo
Violeta de metilo 2.4 1.5 - 3.2 Azul Violado
Amarillo de metilo 3.5 2.9 - 4.0 Rojo Amarillo
Azul de bromofenol 3.8 3.0 - 4.6 Amarillo Azul
Anaranjado de metilo 3.4 3.1 - 4.4 Rojo Amarillo
Rojo congo 4.1 3.0 - 5.2 Azul Rojo
Verde de bromocresol 4.7 3.8 - 5.4 Amarillo Azul
Azul de bromocresol 5.0 4.2 - 5.8 Amarillo Azul
Rojo de metilo 5.2 4.2 - 6.2 Rojo Amarillo
Tornasol 6.4 4.5 - 8.3 Rojo Azul
Rojo de clorofenol 5.9 5.1 - 6.7 Amarillo Rojo
Púrpura de bromocresol 6.0 5.2 - 6.8 Amarillo Azul
Azul de bromotimol 6.8 6.1 - 7.7 Amarillo Azul
Rojo de fenol 7.6 6.8 - 8.4 Amarillo Rojo
Rojo de cresol 8.0 7.2 - 8.8 Amarillo Rojo
Púrpura de metacresol 8.2 7.4 - 9.0 Amarillo Violeta
Azul de timol 8.8 8.0 - 9.6 Amarillo Azul
Fenolftaleína 9.1 8.2 - 10.0 Incoloro Rojo
Amarillo de alizarina 11.3 10.4- 12.2 Amarillo Rojo
Sulfo naranja 11.8 11.0 - 12.6 Amarillo Naranja
Carmín de índigo 12.8 11.6 - 14.0 Azul Amarillo

Tabla N° 4. Composición de los indicadores universales I y II
INDICADOR CANTIDAD (g)
I II
Azul de timol 1.0 -
Azul de bromotimol 0.8 0.4
Dimetilaminoazobenceno 0.6 -
Rojo de metilo 0.4 0.2
Fenolftaleína 0.2 0.8
Alcohol etílico 1000.0 1000.0
Tabla N° 5. Coloración de los indicadores universales I Y II

INDICADOR I INDICADOR II
pH COLOR pH COLOR
1 rojo 4 rojo
4 naranja 5 naranja
6 amarillo 6 amarillo
8 verde 7 verde
10 azul 8.5 azul
10.0 violeta
5.2. METODO POTENCIOMETRICO

Es el método más conveniente y confiable para medir el pH. Requiere de un
instrumento llamado potenciometro o pHmetro, que permite determinar la
concentración de iones hidrógeno midiendo la fuerza electromotriz (f.e.m.) de una
celda formada por un electrodo de referencia, la solución problema, y un electrodo
de vidrio sensible a hidrogeniones.

Un pHmetro de lectura directa, consta de dos electrodos:
a) El electrodo de referencia externa, el más usado es el electrodo de calomel; en
este, la solución acuosa que está en contacto con mercurio metálico y cloruro de
mercurio sólido se halla saturada con cloruro de potasio.
b) El electrodo de referencia interna, es el de vidrio, específicamente de
membrana de vidrio. Consta de un bulbo de vidrio especial de paredes muy finas
sensibles a la actividad del ion hidrógeno, que se halla soldado a un tubo de vidrio
ordinario. En el interior del bulbo se halla un alambre de plata recubierto de cloruro
de plata, sumergido en una solución de HCl 0.1 M. El tubo de vidrio se halla lleno
de una resina que sirve para el contacto eléctrico con el circuito externo.
La membrana de vidrio consta de dos capas de vidrio concéntricas hidratadas:
externa e interna que encierran una capa de vidrio seca.
5.2.1. Electrodo de Vidrio

Este electrodo en combinación con el de calomel, al ser introducido en la solución
problema proporciona una celda galvánica útil para las mediciones prácticas de pH;
el esquema de una celda es el siguiente:
Medidor de pH
(instrumento para medir la
f.e.m.)
Ag.AgCl HCl(0.1 mol/l) Membrana Solución

de vidrio problema KCl (sat.) Hg2Cl2.Hg
Electrodo de vidrio Electrodo de referencia de Calomel
Cada línea vertical indica un límite de fases a través del cual se desarrolla una fuerza
electromotriz total constituida por 5 partes a la que se suma un potencial de
asimetría. Los diferentes potenciales son los siguientes:
1. El potencial del electrodo Ag - AgCl
2. El potencial entre la solución de HCl en el interior del electrodo de vidrio y la
pared interna de la membrana.
3. El potencial entre la pared externa de la membrana de vidrio y la solución de

pH desconocido.
4. El potencial de contacto líquido entre la solución de pH desconocido y el
electrodo de calomel saturado.
5. El potencial del electrodo de calomel saturado y el potencial de asimetría.
Los potenciales 1, 2 y 5 son invariable, debido a que la composición de la solución
en el interior del electrodo de vidrio se mantiene constante y la f.e.m. del electrodo
de calomel tiene un valor fijo.
El desplazamiento de la f.e.m. total observado en la celda galvánica, cuando se
introduce una solución de pH desconocido se debe a las variaciones de los
potenciales 3,4 y asimétrico.
El potencial del electrodo de vidrio (Ev) en relación con el electrodo de referencia
externa (Eref), se relaciona con el pH en la siguiente ecuación:
Ev - Eref
pH= a 25 ℃
0.0591
La respuesta del electrodo de vidrio debe calibrarse frente a soluciones

amortiguadoras de pH conocido, como las de la Tabla N° 6.
Tabla N° 6. Soluciones de pH conocido para la calibración de un medidor de pH

pH A 25
SAL pH A 37 °C
°C
1. Tartrato monobásico de potasio saturado 3.56 -
2. Ftalato monobásico de potasio 0.05 M 4.01 4.02
3. Fosfato de potasio monobásico 0.025 M
Fosfato de sodio dibásico 0.025 M 6.86 6.84
4. KH2PO4 0.0087 M
Na2HPO4 0.304 M 7.41 -
5. Tetraborato sódico (bórax) 0.01 M 9.18 9.06
5.2.2. Cuidados del Electrodo de Vidrio

Debe ser lavado bien después de cada determinación de pH, especialmente después
de trabajar con soluciones de proteínas, pues estas, al adsorberse en la superficie de
la membrana de vidrio causan serios errores. Otro motivo de errores puede
presentarse por deshidratación parcial de las soluciones no acuosas sobre la
membrana de vidrio, lo que determina cambios en la diferencia de potencial. Las

soluciones amortiguadoras se deben agitar vigorosamente durante las mediciones, a
fin de evitar que se forme una delgada capa de solución en la interfase entre el vidrio
y la solución.
6. pH de ácidos, bases y soluciones salinas
6.1. pH de ácidos fuertes y de bases fuertes

Los ácidos fuertes, como el HCl, en disolución acuosa se ionizan completamente,
por tanto, la concentración de hidrogenión es igual a la concentración del ácido. En
consecuencia, sus valores de la constante de disociación (Ka) se aproxima al infinito
y todos tiene una fuerza aproximadamente igual. El pH de una disolución acuosa de
un ácido fuerte, es el logaritmo negativo de su concentración.
pH=−log 10 [ Acido]
El pH de una solución 1N de ácido monobásico fuerte es cero y la solución aumenta

en una unidad de pH por cada décuplo de dilución del ácido.
Similarmente, las bases fuertes tales como NaOH, se ionizan completamente en
solución y por tanto la concentración del ion OH- es igual a la concentración de la
base. El pH de una solución 1 N de una base monobásica es 14, y el pH decrece e
una unidad por cada décuplo de dilución. El pH se calcula según la siguiente
ecuación:
pOH =−log 10[OH - ]
pH=14− pOH
6.2. pH de ácidos y bases débiles

Los ácidos débiles se disocian solo en pequeñas proporciones en las soluciones muy
diluidas. El grado de ionización y la [H+] y la [OH-] están determinados por su
constante de ionización. El pH de los ácidos débiles está dado por:
pKa=−log 10 Ka
pKa−log 10 [ Acido ]
pH=
2
o puede calcularse el pH a partir de:
[ H + ] =√ Ka x C
donde:
C = Concentración total del ácido
Y el pH de las bases débiles se calcula a partir de:

pKb+ log10 [ Base ]
pH=14−
2
el pH de una solución 1 N de base débil = 14 - pKb/2, decreciendo e una unidad de

pH por cada céntuplo (cien veces) de dilución de la base. De igual modo el pH =
pKa/2 para una solución 1 n de un ácido débil monobásico y el pH aumenta en una
unidad por cada cien veces de dilución del ácido.
6.3. pH de soluciones salinas
Los iones de iones de ácidos y bases débiles reaccionan con el agua para formar el
ácido o la base no disociados. Esto altera la concentración de iones H + del agua y a
menudo las soluciones salinas no poseen pH 7.
6.3.1. pH de sales de ácido fuerte y de base fuerte
Estas soluciones salinas, como la de NaCl, dan reacción neutra con el tornasol.
Ninguno de los iones presentes reacciona con el agua y por tanto la concentración
del ion hidrógeno del agua permanece inalterada (pH 7).
6.3.2. pH de sales de ácido fuerte y base débil
Estas soluciones salinas, como la solución de NH4CL, dan reacción ácida con el
tornasol. El catión reacciona con el agua y forma l base débil no disociada; esto
causa un exceso de iones H+ en la solución.
Si consideramos una solución de una sal formada a partir de un ácido fuerte y una
base débil. Por ejm., la solución de NH4Cl:
NH4Cl NH4+ + Cl- (la sal está completamente ionizada)

NH4+ + H2O NH4OH + H+ (hidrólisis de la sal: [NH4OH] = [H+])
[ NH 4 OH ] [ H + ]
K H=
[ NH 4 + ]
(KH = constante de hidrólisis. El agua es constante por eso se le omite).
Kw [ NH 4 + ] [ OH - ]
K H= Kw= [ H + ][ OH - ] ; Kb=
Kb [ NH 4 OH ]
Kw [ H + ] 2 Kw [ Sal ]
= [ NH 4 + ] =[ Sal ] ; [ H + ] 2=
Kb [ Sal ] Kb

pKw − pKb−log 10 [ Sal ]
pH=
2
esta ecuación da el pH de una solución de sal formada a partir de un ácido débil y

una base débil.
El pH de este tipo de soluciones salinas se incrementa en una unidad de pH por cada
céntuplo de dilución de la sal
6.3.3. pH de sales de base fuerte y ácido débil
Estas soluciones salinas, como el acetato de sodio, dan reacción alcalina con el
tornasol. El anión experimenta hidrólisis para formar el ácido débil no disociado;
esto causa un exceso de iones OH- en la solución.
El pH de una solución de una sal formada a partir de un ácido débil y de una base
fuerte está dado por:
pKa+ log 10 [ Sal ]

pH=7+
2
EL pH de este tipo de soluciones salinas decrece e una unidad de pH por cada

céntuplo de dilución de la sal.
6.3.4. pH de sales de ácido débil y de una base débil
Estas soluciones salinas, como el NH4CN, pueden dar reacción neutra, ácida o
alcalina con el tornasol. Tanto el anión como el catión experimentan hidrólisis, el
grado de la cual depende de la fuerza relativa del ácido y de la base a partir de los
cuales se deriva la sal. Si Ka = Kb, la solución dará reacción neutra; si Ka > Kb, la
solución salina tendrá pH menor de 7; a la inversa se Ka < Kb, la solución salina
tendrá un pH mayor de 7.
El pH de una solución de una sal formada a partir de un ácido débil y de una base
débil está dado por:
pKw + pKa+ pKb

pH=
2
El pH de este tipo de soluciones salinas es independiente de la concentración.
7. Curvas de valoración

Si se va añadiendo poco a poco una base, a una solución de ácido, el pH de la
solución se incrementará con cada adición de base. Si se representa gráficamente el
pH en función de la cantidad de base añadida, se produce una subida brusca en el
punto de equivalencia; en el que el ácido está neutralizado exactamente.
14
Punto medio de titulación = pKa
12
Punto de equivalencia
10
del ácido acético
+
pH = 9
HCN H + CN
8
pKa = 9.1
Punto de equivalencia
pH
- + del HCl pH = 7
6 H2PO 4
H + HPO4
pKa = 7.2
4
+ -
CH3COOH H + CH3COO
pKa = 4.7
2
Punto final de titulación
HCl
0
0 5 10 15 20
NaOH 0.1N (ml)
Figura. 1. Curvas de titulación para 20 ml de soluciones de algunos ácidos 0.1 N.

La región de subida brusca se llama punto final y el conjunto del proceso de
adición de la base y determinación del punto final se llama valoración. El diagrama
que representa la variación del pH durante la valoración se llama curva de
valoración. En la figura 1 se ha dibujado diversas curvas de valoración de 20 ml de
algunos ácidos 0.1 N, con NaOH 0.1 N. Obsérvese que, aunque el punto final se
produce exactamente al añadir 20 ml de NaOH, las curvas difieren en su forma y
también en el pH del punto final. La curva tiene una subida más brusca en la
valoración de un ácido fuerte (HCl) con una base fuerte (NaOH) y menos brusca en
la valoración de un ácido débil (CH3COH) con base fuerte (NaOH).
7.1. Neutralización de un ácido fuerte con una base fuerte

La naturaleza del proceso de neutralización, se entiende mejor por la forma en que
cambia el pH cuando se titula una disolución acuosa de ácido fuerte (HCl) con una
base fuerte NaOH). El NaOH actúa con una concentración equivalente de iones
OH-. Por lo tanto, la interacción del HCl con el NaOH puede representarse por:
HCl + OH- H2O + Cl-

(Acido) (Base) (Acido conjugado) (Base conjugada)
Los productos de la neutralización son el ácido excesivamente débil H2O y la base

infinitamente débil Cl-. Por tanto, la neutralización será completa, ya que la reacción
inversa ocurrirá en una magnitud no significativa y la ecuación de neutralización
será:
HCl + OH- H2O + Cl-
Esto indica que:

1. Cuando se haya añadido menos de una cantidad equivalente de NaOH la
concentración de iones H+ será igual a la concentración de HCl que queda sin
neutralizar, ya que el HCl está completamente disociado en agua.
2. En el punto de equivalencia, el pH de la mezcla será 7, ya que contiene además
de agua, solo iones Na+ y Cl- que son insignificantemente ácidos o básicos (el
pH 7 es, por tanto, el pH de una disolución acuosa de cloruro de sodio).
3. Cuando se añade más de un equivalente de NaOH, la concentración de iones
H+ residual es inversamente proporcional a la concentración de NaOH
presente en exceso.
La forma de la curva indica que al ir añadiendo base se producen tan solo pequeños
cambios en el valor de pH hasta cuando se obtiene la neutralización completa; pero
en este punto un exceso de base causa un cambio brusco en el pH. En efecto, el
ácido fuerte está impidiendo el cambio en el pH, en otras palabras, está actuando
como una solución amortiguadora. La zona donde adiciones grandes de álcali
produce cambios pequeños de pH, se denomina zona de tampón ácida.
7.2. Neutralización de un ácido débil con una base fuerte

Si titulamos ácido acético con NaOH, el proceso de neutralización se escribe:
CH3COOH + OH- H2O + CH3COO-

(Acido) (Base conjugada)
El otro producto de la neutralización, a parte del agua, es el ion acetato (CH 3COO-),
es la base conjugada del ácido débil CH3COOH, o sea:

CH3COO- + H+ CH3COOH
Es decir, el pH de una disolución de ácido acético, a la que se le añadió menos de un

equivalente de NaOH, dependerá o solo de la cantidad de ácido acético que queda
sin disociar, sino también de la magnitud en la que se disocia, la cual está dada por
la concentración del ion CH3COO- en la solución. Por tanto, el curso del cambio del
pH durante la titulación reflejará:
1. la eliminación, por neutralización del ácido acético, con la consiguiente
producción de CH3COO-,
2. el progresivo incremento de la represión de la disociación del ácido acético
residual debido a la progresiva subida de la concentración del ion CH 3COO-
producida por (1).
El efecto cuantitativo, de estos acontecimientos sobre el pH durante la
neutralización se puede calcular a partir de la ecuación que define la constante de
disociación de un ácido débil:
HA H+ + A-
De acuerdo con la ley de acción de masas, la constante de disociación Ka se define

como:
[ H + ][ A - ]
Ka=
[ HA ]
[ HA ]
[ H + ] =Ka
[ A-]
Sacando los logaritmos negativos,
[ HA ]
−log [ H + ] =−logKa+(−log )
[ A -]
ó
[ A -]
pH= pKa+log
[ HA ]
En términos generales:

[ Base conjugada ]
pH= pKa+log
[ Acido ]
Esta es la llamada ecuación de Henderson-Hasselbalch. En la práctica significa que

la curva de titulación de ácido débil-base fuerte tendrá la forma mostrada en la
figura anterior para la titulación de ácido acético con NaOH.
En esta curva se observa que el pH del punto de equivalencia es mayor de 7. En
segundo lugar, la zona de cambio rápido del pH alrededor del punto de equivalencia
tiene una extensión menor que en la titulación de un ácido fuerte con NaOH. Pero el
hecho más notable es que esta curva de titulación tiene forma sigmoidal en el lado
ácido de la equivalencia con una inflexión en el punto medio de este brazo. En este
punto, la mitad del ácido inicial se ha convertido en su base conjugada y la mitad
queda sin neutralizar. Por tanto, en este punto [base conjugada] = [ácido], y el pH es
igual a (pKa + log 1) = pKa (ya que el Log de 1 = 0). Por tanto, midiendo el pH en
el punto de media equivalencia, cuando se titula un ácido débil con álcali, se obtiene
un valor experimental (aparente) para el pKa del ácido.
El pH en esta curva cambia sólo lentamente por la adición de álcali (o de ácido
fuerte) aunque cerca del principio y cuando se aproxima a la equivalencia el pH
cambia más rápido. Es decir, las mezclas en medio del margen de pre-equivalencia
tienen una mayor capacidad tamponante que las situada en los extremos. La forma
sigmoidal de la curva de titulación obedece a la ecuación de Henderson-
Hasselbalch. El cambio de pH por adición de álcali depende solo del cambio
ejercido por esta adición en el valor de la relación [base conjugada]/[ácido], puesto
que pKa es constante en cualquier titulación. En el punto de media equivalencia
[base conjugada]/[ácido] es 1, y la adición de una décima parte de un equivalente d
álcali a esta mezcla, solo producirá un pequeño cambio en la proporción, y por
tanto, un ligero incremento en el pH (la proporción sería 1.5 log de 1.5 = 0.176). Por
otra parte, la adición de esta cantidad de álcali a mezclas en las que [base
conjugada]/[ácido], es inicialmente de 10 o de 1/10 producirá un cambio mucho más
grande en la proporción y por tanto en el pH. Entonces, la alteración del pH
producida por una pequeña cantidad de álcali (o de ácido fuerte) es mínima en el
punto de mínima equivalencia y aumenta cuando más difiere de la proporción [base
conjugada]/[ácido]; de aquí la forma sigmoidal de la curva de titulación. de igual
modo se puede concluir que:
a) una mezcla en la que la proporción [base conjugada]/[ácido] es 1, y el pH e
igual al pKa del ácido componente, es la mezcla tampón más eficiente.
b) la capacidad tamponante de una mezcla disminuye cuanto más difiere su pH
del pK del ácido débil componente.
En la práctica, se considera que una mezcla de un ácido débil y su base conjugada
forman un tampón satisfactorio en el margen de pH que va desde pH=( pKa−1) a

pH=( pKa+1 ). De la curva de titulación, se puede hacer predicciones bastante
exactas respecto a la capacidad relativa tamponante de mezclas que tienen iguales
concentraciones del mismo ácido débil y su base conjugada. Estas son:
1. La mezcla cuyo pH es igual al pKa del ácido débil, en la que la proporción
[base conjugada]/[ácido] es 1, es la mezcla tampón óptima en el sentido que
hace mínimo el cambio de pH por la adición de una pequeña cantidad de álcali
o ácido fuerte.
2. Una mezcla cuyo pH se igual a (pKa - 1), en la que la proporción [base
conjugada]/[ácido] es 0.1, es un tampón efectivo "contra" un álcali, pero poco
efectivo "contra" un ácido fuerte.
3. La mezcla cuyo pH es igual a (pKa + 1) y cuya proporción [base
conjugada]/[ácido] es 10, es un tampón efectivo "contra" ácidos fuertes, pero
poco efectivo "contra" álcalis.
No obstante, la capacidad real tamponante de una disolución sólo está determinada
por la proporción inicial [base conjugada]/[ácido], sino también por la magnitud real
de estas concentraciones. Se nota también que la misma curva de titulación de "pre-
equivalencia" se obtendrá si se titula una disolución de acetato sódico con un ácido
fuerte, aunque ahora el pH descenderá.
Para el cálculo de pH, en la práctica, no es deseable generalmente aplicar la
ecuación de Henderson-Hasselbalch a disoluciones acuosas de pH menor de 4 o
mayor de 10, pues esta ecuación solo da valores aproximados.
8. Soluciones amortiguadoras y su capacidad de

amortiguación
Solución amortiguadora es aquella que se opone a los cambios de pH cuando se

agrega álcali o ácido. Los mejores tampones en el margen de pH de 4 a 10 son los
que contiene un ácido débil con su base conjugada; o una base débil con su ácido
conjugado. Son importantes las siguientes propiedades de los tampones:
(a) aquella mezcla que tenga una proporción [base]/[ácido] = 1, tiene el máximo de
tamponamiento contra ácidos fuertes y bases fuertes y su pH es igual al pKa del
ácido componente;
(b) las mezclas con una proporción [base]/[ácido] entre 0.1 y 10, tiene un
tamponamiento significativo y su pH cae entre 1 unidad por arriba y por debajo
del pKa del ácido componente;
(c) el pH de cualquier mezcla de este tipo se calcula aplicando a la fórmula de
Henderson-Hasselbalch, pH = pKa + log [base]/[ácido], donde pKa es el valor de
pKa del ácido componente.

En la elección de un tampón para estabilizar el pH de una mezcla de reacción, se
debe cuidar que sus componentes no interfieran con la reacción de ninguna forma.
De varias mezclas tampón no perjudiciales, se escogerá aquella cuyo componente
ácido posea, a la temperatura de trabajo, un valor de pka muy cercano al pH
requerido.
Para preparar una mezcla tampón, en vez de neutralizar parcialmente un ácido débil
con álcali, es más conveniente mezclar una determinada cantidad de ácido débil en
solución, con una cantidad de su sal cuyo anión es su base conjugada y cuyo catión
sea neutro La composición real de un tampón requerido se calcula a partir de la
ecuación de Henderson-Hasselbalch y la concentración de sus componentes elegidos
para dar una mezcla con capacidad tampón lo suficientemente grande como para
mantener un pH constante durante el tiempo que dura el experimento.
8.1. Acción buffer
Si consideramos la acción buffer de un ácido débil (HX) y su sal (NaX):
HX H+ + X- (Reacción 1: ionización del ácido)
NaX Na+ + X- (Reacción 2: ionización de la sal)
El ácido se ioniza solo en una cantidad muy limitada y la sal se considera
completamente ionizada. Por tanto, si consideramos un tampón formado por ácido
acético y acetato de sodio, la concentración de ácido es casi la misma que se agregó
a la mezcla, y de igual modo la concentración del ion acetato puede ser considerado
igual a las concentraciones de la sal añadida.
En este caso, los iones H+ son absorbidos por la sal y los iones OH- son absorbidos
por el ácido.
La adición de iones H+ (como HCl, que se disocia completamente), produce la
reacción 1 "en la dirección inversa"; los iones H+ se combinan con los aniones
CH3COO- (X-) procedentes de la sal para formar el ácido no disociado (HX) o
CH3COOH y, por esto, la concentración del ion H+ permanece más o menos
constante.
Cl- + H+ HCl
CH3COO- + H+ CH3COOH
Inversamente, la adición de OH- (como NaOH) hace que la reacción 1 vaya hacia la
derecha; los iones OH- se combinan conos iones H+ para formar agua y por tanto, la

concentración del ion H+ permanece más o menos constante. (En buffer de una base
débil y su sal, es la base la que tampona frente a los iones H + y la sal frente a los
iones OH-).
CH3COOH CH3COO- + H+ (poco disociado, equilibrio a la izquierda)
+ +
NaOH Na+ + OH- (muy disociado, equilibrio a la derecha)
CH3COON a H2O
Como el NaOH se disocia en forma completa, por ser bases fuertes, su OH- forma
H2O con el H+ del ácido acético. La mayor parte del ácido acético no está disociado
porque es débil, pero como sus H+ son captados inmediatamente por el OH- para
formar agua, esto permite que la disociación del ácido acético continúe y continúe
hasta que finalmente todo el ácido acético es convertido e acetato de sodio.
El constituyente del buffer que absorbe iones H+ es frecuentemente referido como
"reserva alcalina" y el constituyente que absorbe los iones OH- es la "reserva ácida".
Los buffers tienen una capacidad tamponante limitada. Cuando se añade una
cantidad equivalente de ácido a la "reserva alcalina", la acción tamponante es pobre
en la región ácida. A la inversa, cuando se añade una cantidad equivalente de base a
la "reserva ácida" la acción amortiguadora es baja en la región alcalina.
8.2. Capacidad tampón

Las soluciones amortiguadoras difieren en su capacidad para resistir los cambios de
pH, por lo que Van Slyke introdujo el término capacidad tampón, que se define
como los equivalente gramo por litro de ácido fuerte o base fuerte que se requieren
para alterar 1 unidad de pH a 1 litro de amortiguador 1 N. Está dad por la reacción:
dB
C . T .=
dpH
siendo dB el incremento (en equivalente gramo por litro) de base o ácido fuerte
añadido a la solución tampón; y el dpH el incremento resultante de pH. Una
solución tiene una capacidad tampón de 1 cuando un litro de la misma necesita 1
equivalente gramo de un ácido o de una base fuerte para experimentar un cambio de
pH en una unidad.
8.3. Fuerza iónica y amortiguadores

La constante Ka (constante de ionización del ácido) depende en gran parte de la
concentración total de iones en la solución. Los iones tienden a atraer iones de carga
opuesta. Alrededor de un ion dado existe una "atmósfera iónica" formada por iones
de carga opuesta. Por tanto, el pKa varía según la fuerza iónica (I).
La fuerza iónica se define como:
I =½ Σ CiZi 2
donde Ci es la concentración de la variación iónica i y Zi es la carga de este ion. Por

tanto, para sales monovalentes, la fuerza iónica es igual a la concentración molar de
la sal.
Ejm. Prepare amortiguador acetato de sodio, de pH 5 con una fuerza iónica de 0.1.
Método 1: Disuelva 0.1 mol de NaOH o de acetato de sodio en 800 ml de agua
aproximadamente. Añada ácido acético hasta pH 5. Afore a 1 litro.
Método 2:
[Sal]
pH− pKa=log
[ Acido ]
[ Sal]
5−4.7=log
[ Acido ]
[ Sal]
0.3=log
[ Acido ]
[Sal]
antilog 0.3=
[ Acido ]
[Sal]
2=
[ Acido ]
En vista de que sal = 0.1 M, ácido = 0.05 M. Añada 0.1 mol de acetato de sodio,
0.05 mol de ácido acético, y afore a un litro.
Ejm. Prepare un amortiguador fosfato de pH 7.4 con una fuerza iónica de 0.05.
I =½ Σ CiZi 2

½ [ Na+ ] +½ [ H 2 PO 4 - ] + 4/2[ HPO 4 =]=0.05
Como el pKa del fosfato es 6.8, para una fuerza iónica de 0.05,
[HPO 4 =]
pH− pKa=0.6=log
[ H 2 PO 4 - ]
tomando antilogaritmos:
[ HPO 4 = ]
=4
[ H 2 PO 4 - ]
Para que se respete la neutralidad eléctrica:
[ Na+ ] = [ H 2 PO 4 - ] + 2[HPO 4 =]
Introduciendo estas dos últimas ecuaciones en la primera:
½ [ H 2 PO 4 - ] + 4 [ H 2 PO 4 - ] + 8 [ H 2 PO 4 - ] =0.05
13 [ H 2 PO 4 - ]=0.05
por tanto, [H2PO4-] = 0.00385. Empleando la tercera ecuación se despeja [HPO4=].

Para obtener un amortiguador que tenga la fuerza iónica buscada, diluya hasta 1 litro
0.00385 mol de NaH2PO4 y 0.0154 mol de Na2HPO4.
9. Cuestiones prácticas sobre curvas de titulación
9.1. Limites prácticos de las curvas de titulación

Si en la titulación se usan ácidos fuertes o bases fuertes 0.1 M, las curvas se
aproximan asintóticamente al pH 1 o a pH 13, después de producirse la
neutralización completa. En forma similar, los límites para las soluciones 0.01 M
serán pH 2 o pH 12 y por tanto, valores de pKa por debajo de 2 o por encima de 12
no pueden ser determinados usando soluciones 0.01 M.
9.2. Corrección por solvente
Se deben corregir las curvas experimentales de titulación para tomar en cuenta la
cantidad de ácido o base usados en la titulación del solvente, que generalmente es

agua destilada. esto se hace de la siguiente manera:
a. Dibuje las curvas de titulación para los mismos volúmenes de muestra.
b. Seleccione un valor cualquiera de pH en la curva para la muestra y anote el
volumen de ácido o base usado; denomine esto Xml. En la misma forma, anote la
cantidad de ácido o base consumida para llevar el agua al mismo valor de pH;
denomine esto Yml.
c. La cantidad neta de ácido o base consumida en la titulación de la muestra está
dada por (X - Y) ml. Repita esto para varios valores de pH y haga la curva
correcta de titulación.
9.3. DETERMINACION DE pKa
Es esencial el conocimiento del pKa de un ácido, para su debido uso como tampón.
Los valores de pKa pueden obtenerse por varios métodos, a partir de la curva de
titulación:
a. El pH en el punto de inflexión en una curva de pH frente a equivalentes de base o
ácido añadidos, es igual al pKa y se puede leer directamente. Una forma más
conveniente consiste en hacer el gráfico de dB / dpH, que es el valor
amortiguador en función del pH y cuando se obtiene un máximo este corresponde
al pKa.
b. El pKa es igual al pH al cual se ha titulado la mitad de ácido, es decir [HA] / [A -]
= 1 . Este punto de titulación medio se obtiene fácilmente de la curva de
titulación si puede determinarse o calcularse el punto final (conociendo los
equivalentes de ácido añadido, o superponiendo 2 unidades de pH por encima del
punto aproximado de inflexión).
c. El pKa se puede calcular de cualquier punto de la curva de titulación sustituyendo
los valores experimentales de pH, [HA] y [A-] en la ecuación:
[HA ]
pKa= pH +log
[ A-]
ó
[Sal ]
pKa= pH +log
[ Acido ]
Estos cálculos pueden hacerse para diferentes puntos de la curva de titulación, y

tomarse para pKa la medida de estos valores. A valores extremos de pH (por encima
de 10 y por debajo de 3) el ácido o base requerido para titular el disolvente solo a
cada pH debe respetarse la cantidad añadida a la solución.
d. El cociente sal / ácido puede calcularse experimentalmente y se puede hacer un
gráfico de log10 sal / ácido en función de pH. La intersección en el eje es el valor de

pKa.
10. Parte experimental
PRACTICA No 1. Determinación del pH
OBJETIVOS.
1. Determinar el pH de soluciones utilizando los métodos colorimétricos (indicadores
de pH) y poteciométricos.
2. Reconocer la capacidad amortiguadora de aminoácidos y proteínas.
3. Relacionar los conocimientos adquiridos del funcionamiento de los tampones de
importancia biológica.
REACTIVOS
 Soluciones tampón de pH 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10
 Indicador universal
 Hidróxido de sodio o,1 M
 Acido clorhídrico 0,1M
METODO DE TRABAJO
a) ESCALA PATRÓN
Preparar una batería de 8 tubos de ensayo y colocar en cada tubo 1 ml de solución
tampón de pH 3 hasta 10, Adicionar 5 gotas de indicador universal y 9 ml de agua
destilada.
b) EXPERIMENTO I
Preparar una batería de 4 tubos de ensayo:
TUBO 1: 5 gotas de indicador universal + 10 ml de agua
TUBO 2: 5 gotas de indicador universal + 10 ml de tampón de pH 7,0
TUBO 3: 5 gotas de indicador universal + 10 ml de agua
TUBO 4: 5 gotas de indicador universal + 10 ml de tampón de pH 7,0
Determinar el pH de cada solución y anotar el resultado en la tabla.

c) EXPERIMENTO II
TUBO 1: adicionar 1 gota de NaOH 0,1 M
TUBO 2: adicionar 1 gota de NaOH 0,1 M

Observar, determinar el pH y anotar el resultado en la tabla.
Soplar el aire expirado, por 15 segundos en el tubo 1 y por 1 minuto en el tubo 2.
Observar, el cambio de color, y determinar el pH y anotar el resultado en la tabla
TUBO 3: adicionar 1 gotas de HCl 0,1 M
TUBO 4: adicionar 1 gotas de HCl 0,1 M
Observar el cambio de color, determinar el pH y anotar el resultado en la tabla.
Continuar la adición de HCl al tubo 4, gota a gota, hasta obtener el color del tubo 3.
Determinar cuántas gotas de HCl deben ser adicionadas para obtener la misma
coloración que el tubo 3.
pH
Tubos Muestra Inicia NaOH HCl Nº

Aire
l 0,1M 0,1M gotas
Tubo 1 Agua destilada + 1 gota de NaOH 0,1 M +

aire expirado por 15 segundos
Tubo 2 Tampón de pH 7,0 + 1 gota de NaOH 0,1M +

aire expirado por 1 minuto
Tubo 3 Agua destilada + 2 gotas de HCl 0,1 M

Tubo 4 Tampón de pH 7,0 + 2 gotas de HCl 0,1 M
Nº de gotas de HCl para obtener el pH del

tubo 3
CUESTIONARIO
1) Colocar en orden decreciente la acidez de las siguientes soluciones: ácido acético 1
M, agua pura, hidróxido de sodio 1 M y ácido clorhídrico 1 M.
2) Colocar en orden decreciente de acidez las siguientes soluciones: ácido acético 100
mmol, hidróxido de amonio 10 mmol, ácido clorhídrico 10 M y agua.
3) Calcular cuantos iones H+ y iones OH- están presentas en una solución de HCl 0,001
M.
4) Calcular la concentración de protones, en moles por litro en una solución 1 M de
ácido acético, sabiendo que la Ka del ácido acético a 25ºC es de 1,86 x 10-5.
5) Calcular el punto isoeléctrico de la glicina sabiendo que pKa1 = 2,4 y pKa2 = 9,7.

6) Calcular el valor del pH de una solución de a) 0,001 M de ácido sulfúrico y b) 0,001
M de hidróxido de sodio, asumiendo que ambos solutos están completamente
ionizados. ¿Cuál será el valor de pH de la solución resultante de la mezcla de 25 ml
de la solución de ácido sulfúrico con 20 ml de la solución de hidróxido de sodio?.

CAPÍTULO 2. COLORIMETRÍA Y
FOTOMETRÍA
1. Introducción
Muchos experimentos en bioquímica dependen de la absorción de la luz
monocromática, de una solución, en la región visible y ultravioleta del espectro
electromagnético. Muchas moléculas de interés biológico absorben la luz en la
longitud de onda comprendida entre 200 - 800 nm ó 2000 - 8000 Å. Por ejm.,
purinas, pirimidinas y ácidos aromáticos, así mismo los ácidos nucleicos y las
proteínas. Otros ejm., son las hemoproteínas (citocromos, hemoglobina y
mioglobina) carotenoides y esteroides.
Muchos compuestos, sean o no coloreados, tienen la capacidad de absorber luz de
una determinada longitud de onda; pero en otros casos es necesario transformar la
sustancia a un derivado coloreado, usando un reactivo adecuado.
Tanto el color (colorimetría) como la transmitancia (fotometría) de la luz de una
solución pueden usarse como medida de su concentración.
La colorimetría es un procedimiento por el cual una solución coloreada de un
material de concentración desconocida se compara, mediante el color, con un
estándar que contiene una concentración conocida del mismo material. Hoy se usa
poco esta técnica. La mayor parte de procedimientos analíticos usan el principio
fotométrico, es decir, la medida de potencial transmisor de luz de una solución
coloreada, a una longitud de onda espectral específica. Muchos aparatos llamados
"colorímetros" son realmente fotómetros según la estricta definición. Si la longitud
de onda puede seleccionarse a lo largo de un intervalo continuo, interponiendo un
prisma o una red de dispersión, entre la fuente de luz y la muestra, el instrumento se
denomina "espectrofotómetro".
En fotometría o en espectrofotometría se compara la transmitancia de la luz a través
de una solución que contiene materiales absorbentes con la transmisión de la misma
luz a través de otra solución que solo contiene disolvente. Esta última se denomina
solución de referencia o reactivo blanco o simplemente blanco; debe ser idéntica
a la primera excepto en que carece de los materiales absorbentes de la luz que han
de estudiarse. Ambas soluciones deben medirse bajo idénticas condiciones de
longitud de onda, intensidad de luz incidente y anchura de cubeta (longitud de paso
de luz).
2. Energía radiante
Las radiaciones electromagnéticas, conocidas corrientemente como luz, están

compuestas por paquetes de energía llamados fotones o cuantos. De acuerdo a la
longitud de onda, se conocen tres zonas: a) Ultravioleta (UV), comprende
radiaciones de 100 a 300 nm de longitud; b) Luz Visible (color), está constituida
por radiaciones electromagnéticas de 390 a 770 nm de longitud de onda y c) El
Infrarrojo, entre 2000 a 30000 nm.
Una onda de luz posee campos eléctricos y magnéticos oscilantes que están en fase,
pero son perpendiculares a la dirección de propagación. La longitud de onda, de la
luz, se da en cm y se relaciona con la velocidad de luz en el vacío, en cm/seg, y con
la frecuencia, en ciclos/seg:
c
λ=
v
Longitud de onda (), es la distancia entre los nudos de dos ondas de radiación
adyacente. Se mide en cm, nm, mm, mm, Å.
La velocidad (c), de propagación en el vacío es de 3 x 1010 cm/seg y algo
menor al atravesar sustancias transparentes.
La frecuencia (v), es el número de oscilaciones por segundo. Se expresa en
ciclos/seg.
La luz interacciona con la materia principalmente a través del campo eléctrico
oscilante. Para fines de absorción debe tenerse en cuenta que la luz es un paquete de
energía o fotón hv, donde h es la constante de Planck, 6.627 x 10-27 ergios segundo,
y v es la frecuencia. De aquí se desprende que la energía de la luz es directamente
proporcional a la frecuencia.
E=hv
y según la ecuación anterior inversamente proporcional a la longitud de onda. Hay

absorción de luz cuando la energía del fotón, hv, corresponde a la diferencia entre
los niveles de energía de la molécula.
3. Leyes de absorción
En Química Biológica se emplea la fotometría principalmente para regular o
controlar la concentración de diversas especies en mezclas de reacción. La absorción
de luz a una longitud de onda dada, está relacionada con la concentración de
especies absorbentes por medio de dos leyes.
2.1. LEY DE LAMBERT

Lambert estudió la cantidad de luz monocromática absorbida por un cuerpo y
enunció la ley que dice: "la fracción de luz absorbida es proporcional al espesor del
absorbente x, e independiente e la intensidad de luz", o en otros términos, "la

proporción de luz incidente, absorbida por el medio, es independiente de su
intensidad y cada sucesiva capa unidad de medio, absorbe una fracción igual de la
luz que pasa a través de él". Por ejm., si la luz incidente es 100% y cada capa unidad
de espesor x, absorbe el 20% de la luz incidente, la luz transmitida es el 80%. Para
otras capas unidad de espesor x, la luz transmitida disminuirá como sigue: 64%,
51.2%, etc. que es la secuencia (0.8)0, (0.8)1, (0.8)2, (0.8)3, etc. Lo que conduce a la
expresión matemática:
I =I 0 x e - α x
Donde:
I0 = Intensidad e la luz incidente
I = Intensidad de la luz transmitida
x = grosor de la capa en cm
α = coeficiente de absorción del medio
En forma logarítmica tenemos:
I0
ln = =αx
I
Al pasar al sistema logarítmico de base 10, el coeficiente de absorción c, se

convierte en coeficiente de extinción molar k
α =2.303 k
o sea
I0
log 10 =2.303 kx=Kx
I
por tanto
I0
log 10 =Kx
I
log I0/I es la densidad óptica (D.O.) o absorbancia (A). A es directamente

proporcional a x.

2.2. LEY DE BEER
Beer estudió la influencia de la concentración de la solución de una sustancia
coloreada sobre la transmisión de la luz monocromática y halló la misma relación
entre la transmisión y el espesor de la capa atravesada. Teniendo en cuenta que la
luz se absorbe solamente cuando un fotón choca con una molécula, la ley de Beer
puede anunciarse como sigue: "cuando un rayo de luz monocromática pasa a través
de un medio absorbente, la cantidad de luz absorbida o la probabilidad de absorción
es proporcional al número de moléculas c, contenidas en el haz de luz".
I =I 0 e -Kc
donde: c = concentración en mol/l.

Cuando en la ley anterior, la transmitancia disminuye exponencialmente con el
número de moléculas absorbentes. Por ejm., en el caso anterior se hizo variar el
espesor de la capa, ahora si hacemos que el espesor de la capa sea constante, es decir
que sea 1 cm y variamos la concentración de la solución de la sustancia coloreada
tenemos que: si consideramos la Io como 100% y la absorbancia de cada una de las
concentraciones c, es 50% de la luz incidente, la luz transmitida es 50%. Para otras
concentraciones c, la luz transmitida disminuirá como sigue: 25%, 12.5%, 6.25%,
3.13%, etc.
La ley de Beer es exacta sólo para luz monocromática y en muchos casos no se
cumple sobre todo a concentraciones altas.
2.3. LEY DE BEER - LAMBERT

Es evidente que pueden combinarse las leyes de Beer y Lambert, ya que tanto c
como K incluyen un factor de concentración, de donde:
E c=K
E = coeficiente de extinción molar

c = concentración en moles/litro
De aquí se deduce:
I =I 0 e -Ecx
I0
log 10 =Ecx
I

I0
log 10 =A
I
por consiguiente:
A=Ecx
La ley combinada de Beer - Lambert nos dice que: "la fracción de luz incidente
absorbida por una disolución, a una determinada longitud de onda, está relacionada
con el espesor de la capa absorbente x, y con la concentración c, de la especie que
absorbe". La Ley de Beer-Lambert supone que la luz incidente es paralela y
monocromática, y que las moléculas del disolvente y del soluto están orientadas al
azar.
2.4. COEFICIENTE DE EXTINCION MOLAR
Por definición, el coeficiente de extinción molar E, es la densidad óptica (log10 I0 /
I) de una solución 1 M de la sustancia con un recorrido luminoso de 1 cm y
generalmente se escribe E 1cm 1mol/l. La densidad óptica carece de dimensión, por
lo que E se expresa en términos de litros (concentración x longitud). E se expresa en
unidades de litros moles-1cm-1; es decir, en cm2 / milimol y es numéricamente
equivalente a la densidad óptica de una solución milimolar de la sustancia con un
recorrido luminoso de 1 cm. Con frecuencia se utiliza el término E 1cm 1%, que es
la extinción de una solución al 1% (1 g/100 ml) cuando el camino recorrido por la
luz es igual a 1 cm.
2.5. COEFICIENTE DE EXTINCION ESPECIFICA
En muchas ocasiones no se conoce el peso molecular de algunos compuestos tales
como proteínas y ácidos nucleicos presentes en una mezcla y entonces se
acostumbra expresar la concentración en g/l. En estos casos, se emplea el coeficiente
de extinción específico. Se le define como la densidad óptica de una solución al
10% (10g/l) del compuesto cuando el recorrido de la luz es 1 cm, E 1cm 10g/l.
2.6. TRANSMITANCIA (T)
Es la capacidad de una solución para transmitir la luz. Se define como la relación
entre la intensidad de la luz que sale de la solución y la intensidad de luz entra a ella.
I
T=
I0
Si la solución es absolutamente transparente I = 1, y su transmitancia será 1; este
valor es tanto menor de 1 cuanto mayor sea la luz absorbida por la solución. Se
acostumbra, también, expresar la transmitancia como porcentaje, es decir,

porcentaje de luz transmitida:
I x 100
T %=
I0
Por tanto, los valores de T % van de 0 a 100%. Como la transmitancia va de 0 a

100%, la expresión de Beer - Lambert será:
I0 100
A=log =log =Ecx
I T%
2.7. ABSORBANCIA (A) o DENSIDAD OPTICA (D.O) o EXTINCION (E)

Es la cantidad de luz absorbida por una solución, equivalente al logaritmo negativo
de la transmitancia y se mide en unidades de 0 a 2 en la escala de absorción; 2 es el
logaritmo de 100% de transmitancia. Este es A=−logT ó A=−logI / I 0 puede
también calcularse restando a 2 el logaritmo del porcentaje de transmitancia;
I0 I
A=log =log =Ecx
I T
Si se construye una gráfica de A en función de c, se obtiene una recta, pues la
absorbancia es directamente proporcional a la concentración. La pendiente de la
recta es Ex, y el valor de la ordenada para c = 0 se considera cero.
Ejm. En un espectrofotómetro se ha ajustado al 100% la transmitancia de luz con

agua (blanco); la lectura de una solución de K2Cr2O7 en el mismo espectrofotómetro
indica que T% = 50 y la absorbancia es 0.301.
Solución: Hemos dicho que -log T ó -log I/I0 se denomina absorbancia. En este
ejemplo:
I =50
I 0=100
Como:
I I0
A=−log =log
I0 I
Tenemos:
A=logI 0−logI

Reemplazando tenemos:
A=log 100−log50
A=2−1.69897
A=0.301
Ya que, en la práctica, siempre se ajusta la transmitancia a 100% (cuyo log = 2), la

absorbancia se puede calcular a partir de:
A=2−logT %
2.8. LIMITACIONES DE LA LEY DE BEER – LAMBERT

Aunque la ley de Lambert se cumple en todos casos hasta hoy estudiados, la de Beer
tiene algunas alteraciones. Algunas veces la relación lineal entre la absorbancia y la
concentración predicha por la ley de Beer, no se cumple. Los tres tipos de
desviaciones son: a) instrumentales, que pueden ser ópticos, mecánicas o ambas, b)
las relacionadas con las muestras y; c) experiencia del investigador.
2.8.1. Desviaciones Instrumentales
La ley de Beer solo se cumple para luz monocromática. En la práctica nunca se
obtiene luz totalmente monocromática. La monocromaticidad puede variar
cambiando el ancho de la rendija.
Para la región visible del espectro se usan los fotocolorímetros. Difieren de los
espectrofotómetros en que usan filtros para obtener luz monocromática en lugar de
un prisma o red y una rejilla. Los filtros dejan pasar una ancha banda de luz; por
ejm., un filtro de 540 nm deja pasar una luz que oscila entre 525 y 555 nm. Por el
contrario, las rendijas de los espectrofotómetros ayudan a seleccionar mejor la
longitud de onda a usarse, por lo cual se puede suponer que con estos aparatos la ley
de Beer tiene una menor desviación. También, la ley de Beer se desvía con la luz no
paralela.
2.8.2. Desviaciones Debidas a la Naturaleza de la Muestra
Se deben al cambio en la concentración efectiva de la especie absorbente o la
interferencia debida a los productos de alguna reacción secundaria.
Muchas especies absorbentes contienen grupos ácidos o básicos. Puesto que los
conjugados del par ácido-base tienen una absorción diferente, si no se controla el pH
habrá desviaciones. De igual modo, si el equilibrio de la especie depende de la
temperatura, habría desviaciones si la temperatura sufre cambios. Si las moléculas
del absorbente se absorben a las paredes de la celda durante el curso de la
observación, disminuyen la concentración efectiva en la disolución y producen
desviaciones aparentes de la ley de Beer, Los disolventes también pueden cambiar
las características de absorción. Las soluciones muy concentradas, que originan un

color muy intenso, también originaran desviaciones ya que la ley se cumple solo
hasta cierto límite máximo de concentración, característico para cada sustancia.
2.8.3. Desviaciones Debidas al Investigador
Principalmente se deben a una mala elección de longitud de onda. La longitud de
onda de la luz empleada debe coincidir con el máximo de absorción de la solución.
Esto permite también conseguir la sensibilidad óptima.
4. Rangos adecuados de concentración
Es muy difícil medir la concentración de las soluciones con exactitud por

espectrofotometría, ya que en algunos casos la intensidad de radiación transmitida I,
es muy pequeña, mientras en otras es muy alta. En la práctica, I debe de estar entre
el 10% y el 90% de Io (es decir, la absorbancia debe de estar entre 1.0 y 0.05), pero
las medidas más seguras se realizan cuando I» 50% de Io (es decir, absorbancia =
0.3). estas condiciones pueden conseguirse modificando la concentración del
compuesto, el espesor de la célula o cambiando la longitud de onda de la radiación
(es decir, variando E). El primer procedimiento es el que se realiza con más
frecuencia.
5. Cálculo de la concentración de una muestra

problema
Existen tres formas de cálculo.
4.1. Mediante el factor de calibración (Fc)
Resulta de dividir la concentración del estándar entre la absorbancia del estándar:
Cst
Fc=
Ast
el factor obtenido se multiplica por la lectura o absorbancia del o de los tubos que
contienen la solución problema, obteniéndose así la concentración de la muestra o
muestras. Para expresar la concentración en porcentaje, se toma en cuenta el
volumen utilizado 100/V.
Según la Ley de Beer - Lambert tenemos que:
Ast =Kst . Xst .Cst

Am=Km . Xm .Cm
donde:

Ast = absorbancia del estándar o patrón
Am = absorbancia de la muestra problema
Cst = concentración del estándar o patrón
teniendo en cuenta que el espesor X es constante y que la tratarse de soluciones de la

misma sustancia el coeficiente de extinción K, será el mismo. Relacionando las dos
expresiones tenemos:
Ast Cst
=
Am Cm
despejando:
Cst
Cm=Am .
Ast
Ya que tanto la lectura del problema como del patrón son equivalentes a la
absorbancia, se tiene:
Cst
Cm=lectura de m .
lectura st
Nótese que Cst / Ast es un constante y puede usarse como un factor sobre todo
cuando se va a determinar la concentración de una serie de muestras. Por tanto, la
ecuación anterior se puede reducir a:
Cm=Am . Fc
donde: Fc = factor de calibración (Fc = Cst/Ast); esta expresión referida a porcentaje

se escribe:
Cst 100
Cm= . . Am
Ast v
v = volumen de la muestra utilizada para la determinación.
4.2. Mediante la curva de calibración

En este caso se utilizan varios patrones de concentraciones progresivas y un blanco

(el blanco contiene todos los componentes de la muestra menos la sustancia a
determinar). Luego se realiza la lectura (de absorbancia) usando el filtro o la
longitud de onda para la cual la sustancia tiene la máxima absorción. Se registra los
valores de absorbancia en una tabla.
Luego se construye una gráfica en un sistema de coordenadas, colocando las
lecturas correspondientes a los patrones en el eje de las "y" (eje de ordenadas) y las
concentraciones de los mismos en el eje de las "x" (eje de abscisas), con lo cual se
obtiene una recta, que pasa por cero si la sustancia obedece la ley de Beer - Lambert.
La muestra problema dará una lectura o absorbancia determinada que se busca en el
eje de las ordenadas de la gráfica anterior, luego por este punto se traza una
perpendicular a dicho eje hasta encontrar la curva (trazada con la lectura y
concentración de los patrones). En seguida, por este punto de intersección se traza
una paralela al eje de ordenadas hasta tocar el eje de abscisas (eje de concentración).
Por lo tanto, la concentración de la muestra problema está dada directamente por
este punto del eje de abscisas.
En la curva de calibración puede observarse que hay una parte de la curva dentro de
la que se cumple perfectamente la ley de Beer - Lambert, es la parte recta que
corresponde a una función lineal. Sin embargo, puede también aplicarse a valores
superiores por extrapolación siempre que las desviaciones con respecto a la recta no
sean muy grandes. Además, el uso de la gráfica elimina los errores que podrían
aparecer como consecuencia del uso del cálculo de proporcionalidad en una región
donde no se cumple la ley de Beer - Lambert. Esto último corrobora la norma
general que preconiza el uso de soluciones patrón para las comparaciones
colorimétricas cuyas densidades ópticas sean lo más cercanas posible al valor del
problema.
4.3. Mediante la ecuación A = Ecx
Ecuación obtenida de la combinación de las leyes de Beer - Lambert (en la que x es
un valor constante por ser los tubos uniformes, o por usarse un solo tubo para hacer
la lectura). Para esto se calcula una E relativa mediante E=A /c, para los patrones,
(los valores hallados deben ser iguales si la sustancia cumple la ley de Beer).
El coeficiente de extinción debe mantenerse constante para un intervalo de
concentraciones de patrones y problemas. Una vez obtenido un valor E, la
concentración de la muestra se determina mediante la ecuación que sigue:
A
c=
E
6. Fotocolorímetros
Son instrumentos para medir la absorción de luz. Tienen un filtro coloreado para
producir luz monocromática. Estos filtros producen una ampplia banda de luz.
En estos aparatos la luz blanca de una lámpara de tungsteno para a través de una

rendija, luego a través de un lente condensador, hasta obtener un rayo paralelo que
incide sobre la solución que se investiga, la cual se ha colocado en una celda de
absorción o cubeta. La cubeta es generalmente de vdrio y las paredes por las que
pasa el haz de luz son paralelas.
Después de la cubeta se halla el filtro. Algunos fotocolorímetros se hallan antes de
la cubeta, por ejm., en el Klett-Summerson. El filtro produce bandas angostas de
transmisión y, por tanto, da luz aproximadamente monocromática.
A continuación, la luz llega a una fotocélula que genera una corriente eléctrica en
proporción directa a la intensidad de la luz incidente. Esta señal eléctrica pequeña se
incrementa mediante un amplificador y la señal amplificada pasa a un
galvanómetro calibrado en una escala logarítmica que da directamente medidas de
absorbancias. Las fotocélulas usadas en fotocolorímetros no muy fino tienen una
precisión de aproximadamente 0.5%. La solución blanca se coloca primero en el
fotocolorímetro y se ajusta el galvanómetro a una absorbancia de cero. Luego se
coloca la muestra y se lee directamente la absorbancia.
5.1. Elección de los filtros
Los filtros se seleccionan de modo que cumplan la ley de Beer. Para esto se suelen
emplear soluciones de la sustancia problema de diferentes concentraciones
determinándose con qué filtro se obtiene un máximo de absorbancia para un mínimo
de diferencia en la concentración entre 2 soluciones. Este filtro es el de máxima
sensibilidad y el seleccionado para trabajar.
Por lo común, el máximo de absorción de las soluciones coloreadas ocurre en la
región del color opuesto (Tabla 1).
Tabla N° 1. Relación entre el color de la solución estudiada y el filtro escogido para el

análisis colorimétrico
COLOR DE LA SOLUCION FILTRO

Rojo - naranja Azul-Azul verdoso
Azul Rojo
Verde Rojo
Púrpura Verde
Amarillo Violeta
El fotocolorímetro de Klett - Summerson, usa comúnmente 3 filtros:

- Filtro azul (N° 42) que transmite luz entre 400 y 465 nm.
- Filtro verde (N° 54) que transmite luz entre 500 y 570 nm.

- Filtro rojo (N° 66) que transmite luz entre 640 y 700 nm.
El fotocolorímetro de Klett y Summerson da la lectura en unidades Klett que son

proporcionales a la absorbancia. Si se desea trabajar con absorbancia, se puede
transformar a partir de las unidades Klett, ya que:
1000 x A
UK =
2
2 x UK
A=
1000
7. Espectrofotómetros
Estos aparatos miden la absorción o la transmisión de la luz. Un espectrofotómetro
usa una rejilla o un prisma par obtener la luz monocromática.
En general consta de: a) una fuente de radiación (UV, luz visible, infrarrojo); b) un
monocromador, que mediante un prisma o red de difracción dispersa la luz en un
espectro, y luego selecciona una longitud de onda o un cierto intervalo de ese
espectro y lo dirige hacia la sustancia problema y ; c) un sistema de detección que
transforma la energía luminosa que recibe, en energía eléctrica. En resumen, la luz
monocromática pasa por un tubo que contiene la solución problema y la luz
transmitida es medida empleando una célula fotoeléctrica. La corriente eléctrica
producida por la luz transmitida es proporcional a su intensidad, y se lee la corriente
en un galvanómetro. Con estos aparatos es posible obtener un espectro de absorción,
determinando la absorbancia a diferentes longitudes de onda.
7.1. Espectros de absorción
Se llama espectro de absorción a la gráfica que representa la absorbancia en función
de la longitud de onda. Muchos compuestos contienen espectros característicos de
absorción en la región visible y ultravioleta, lo cual hace posible la identificación de
dichos materiales en una mezcla.
7.2. Valoraciones espectrofotométricas
El curso de una reacción química o la posición de un equilibrio puede determinarse
en forma rápida con un espectrofotómetro si puede medirse la absorción de uno de
los componentes. Como ejemplo tenemos las curvas de valoración de los
indicadores:
¿ -+ H + ⇌ InH

donde las formas protonizadas o no protonizadas (o ambas) son coloreadas. Los
máximos de absorción para las dos formas suelen estar separados, por lo que se
puede medir la concentración de cualquiera de las formas. Si se disuelven
cantidades iguales del indicador en tampones de diverso pH y se mide la
absorbancia en uno de los máximos de absorción, se puede calcular el pK. La
determinación espectrofotométrica del pK es el mejor método. El pK se debe
determinar a diversas concentraciones para comprobar las desviaciones de la ley de
Beer.
7.3. Espectrofotometría y enzimas

Por las grandes ventajas de comodidad, sensibilidad, amplio espectro espectral y una
selección fina de longitud de onda, el espectrofotómetro se utiliza en enzimología,
principalmente, en tres tipos diferentes de determinaciones: a) se puede determinar
la concentración de un compuesto midiendo la densidad óptica a una longitud de
onda bajo condiciones en que no ocurran cambios y suponiendo que el coeficiente
de extinción del compuesto es conocido; b) se puede seguir el curso de una reacción
en un sistema completo de ensayo, midiendo la velocidad de formación o
desaparición de un compuesto absorbente de luz. Para este tipo de medidas se
dispone de espectrofotómetros que representan gráficamente la densidad óptica
frente a tiempo; c) un tercer tipo de medida interesante para la identificación de
compuestos requiere la determinación de la densidad óptica en función de la
longitud de onda. También este caso se dispone de instrumentos que trazan la curva
automáticamente
8. PARTE EXPERIMENTAL
EXPERIMENTO N° I. ESPECTROS DE ABSORCIÓN Y LONGITUD DE

MÁXIMA ABSORBANCIA DE DOS COLORANTES
OBJETIVO:
Hallar la curva espectral de dos colorantes indicadores.
FUNDAMENTO
Si se mantiene constante el espesor (x) y la concentración (c), la absorbancia (A)
dependerá de la longitud de onda (λ); esto permite hallar la curva espectral, así
como la longitud de onda de máxima absorción del colorante.
Puesto que los compuestos coloreados presentan espectros de absorción
característicos, la selección cuidadosa de las longitudes de onda de máxima
absorción permitirá analizar los componentes de una mezcla de estas sustancias.

MATERIAL
1. Aparatos: Fotocolorímetro Klett-Summerson o Espectrofotómetro.
Tubos de ensayo
Fiolas
Gradillas
Pipetas
2. Reactivos: Azul de bromofenol 10 mg/ml.
Anaranjado de metilo 10 mg/ml.
Mezcla problema de los colorantes.
MÉTODO DE TRABAJO
Calibrar el fotocolorímetro o espectrofotómetro a cero utilizando agua destilada
como blanco. Luego, determinar la extinción de cada colorante, usando los
diferentes filtros del fotocolorímetro (si se usa espectrofotómetro se puede
seleccionar a voluntad el intervalo de longitud de onda). Para esto utilizar 5 ml de
cada solución colorante (azul de bromofenol y anaranjado de metilo 10 mg/ml).
Recordar que cada vez que se cambie de filtro o de longitud de onda es necesario
graduar el aparato a cero con agua destilada en la cubeta o tubo Klett.
Anote en forma tabular las absorbancias para cada filtro o para cada longitud de
onda y para cada solución, teniendo especial cuidado de anotar la longitud de onda
de máxima absorbancia (si se desea puede cambiar las UK en A).
Mezcla de
Azul de bromofenol Anaranjado de metilo
ambos
UK Ab UK Ab UK Ab
Filtro azul
Filtro
verde
Filtro rojo
Para obtener el espectro de absorción y la longitud de máxima absorbancia, utilizar

papel milimetrado y grafique los valores de absorbancia de cada solución
(corregidos para la absorción del disolvente, si se usó otro en vez de agua) en las

ordenadas en función de la longitud de onda que se coloca en las abscisas. Luego
uni los puntos con un trazo suave.
Anotar en la gráfica, la longitud de onda de máxima absorbancia para cada
colorante.

EXPERIMENTO N° 2. DEMOSTRACIÓN DE LA LEY DE BEER Y
CONSTRUCCIÓN DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN
PARA DOS COLORANTES.
OBJETIVOS:
Poner en evidencia la ley de Beer - Lambert haciendo uso de concentraciones
progresivas de un colorante.
FUNDAMENTO
Si se mantiene constante la longitud de onda de máxima absorción, la absorbancia
dependerá de la concentración.
MATERIALES
1. Aparatos: Fotocolorímetro Klett-Summerson o Espectrofotómetro.
Tubos de ensayo
Fiolas
Gradillas
Pipetas
2. Reactivos: Azul de bromofenol 10 mg/ml.
Anaranjado de metilo 10 mg/ml.
Mezcla problema de los colorantes.
METODO DE TRABAJO
Preparar varias concentraciones de cada uno de los colorantes como se indica a
continuación:
TUBO N° Bl 1 2 3 4 5
Azul de bromofenol o Anaranjado de metilo -- 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

10 mg/ml
5 4.9 4.8 4.7 4.6 4.5
Agua destilada (ml)
Coloque el filtro que dio la máxima absorbancia (580 nm para azul de bromofenol y
460 nm para anaranjado de metilo) y lleve el fotocolorímetro a cero con agua
destilada (tubo Bl). Enseguida lea la extinción de cada solución. Anote las lecturas
en forma tabular (transforme las unidades Klett en absorbancias).

Calcular la concentración de azul de bromofenol y anaranjado de metilo de cada
tubo, expresada en mg/ml.
Tubo Concentración
UK Ab Fc
N° (mg/ml)
Bl
1
2
3
4
5
Haga una gráfica colocando la absorbancia en las ordenadas y la concentración del

colorante en las abscisas (curva de calibración). Hallar el factor de calibración.

CUESTIONARIO
1. ¿Cuál es la finalidad y el fundamento de la técnica espectrofotmétrica?
2. Conceptúe: banda de sensibilidad del método espectrofotométrico
3. Un determinado compuesto presenta un máximo de absorción a 660 nm. Para una

concentración 0.75 mol/ml se obtuvo una absorbancia de 0.4. Sabiendo que el
límite de sensibilidad del método utilizado es de 0.1 mol/ml a 3 mol/ml, calcule
la concentración de este mismo compuesto correspondiente a una absorbancia de
0.85.
4. Tres mililitros de una solución de azul de metileno (sol. A) fueron diluidos a 7.5 ml
con agua destilada (sol. B). La absorbancia de la solución B a 550 nm fue de 0.4.
¿Cómo determinaría Ud. la concentración de la solución A?

CAPÍTULO 3. ARACTERIZACION
Y CUANTIFICACION DE
CARBOHIDRATOS
1. Introducción
Los carbohidratos son compuestos polifuncionales que contiene grupos carbonilo
(aldehído o cetónico) y grupos hidroxilo alcohólicos. Por esto; poseen propiedades de
aldehídos y cetonas y de alcoholes polihidroxílicos. Los carbohidratos se dividen en
monosacáridos, oligosacáridos y polisacáridos.
Los monosacáridos pueden unirse entre sí mediante un proceso denominado síntesis
por condensación o deshidratación. En dicho proceso se unen dos o más monosacáridos
para formar un disacárido, trisacárido, tetrasacárico, etc. liberándose una molécula de
agua. La fórmula general de los carbohidratos es (CH2O)n. Todos los monosacáridos
naturales que tienen átomos de carbono asimétrico, son ópticamente activos y desvían
el plano de la luz polarizada.
Los oligosacáridos y los polisacáridos son carbohidratos complejos, los cuales, al ser
calentados con ácidos diluidos o hidrolizados por enzimas, se desintegran en
monosacáridos. Los polisacáridos poseen una masa molecular muy elevada, son
insolubles en agua y la mayoría de ellos forman soluciones coloidales.
Los carbohidratos están muy difundidos en la naturaleza, sobre todo en el reino vegetal.
Constituyen los productos finales de la fotosíntesis en las plantas verdes. Los animales,
incapaces de tal acumulación de energía solar, aprovechan las sustancias acumuladas
por las plantas. Los carbohidratos participan en la construcción de las estructuras del
organismo vivo, sirve como material para la biosíntesis de otro tipo de compuestos y
juega un papel importante en la bioenergética de la célula. Los carbohidratos entran a
formar parte de los ácidos nucleicos las glicoproteínas, glicolípidos y de algunas
vitaminas y coenzimas. Como integrantes de las glicoproteínas, participan en la
formación de la capa externa adyacente a la membrana, que desempeña un papel
importante en la protección de las células contra la penetración en ellas de
microorganismos y virus. Estos carbohidratos están relacionados con las propiedades
inmunoquímicas de los tejidos.
2.Hidrólisis de carbohidratos
FUNDAMENTO:
HIDROLISIS ÁCIDA
Por calentamiento de una solución de almidón en presencia de HCl, se hidrolizan los

enlaces glicosídicos. En función del tiempo de hidrólisis se encuentran como productos
dextrinas y oligosacáridos, siendo el producto final de la hidrólisis acida la glucosa. Las
dextrinas dependiendo de su tamaño y complejidad molecular dan lugar a diferentes
coloraciones con el yodo: las dextrinas mayores pueden dar un color azul o purpura, las
de tamaño intermedio dan un color rojizo, y las más pequeñas no dan color en
presencia de yodo. La reacción de hidrólisis del almidón puede ser seguida por la
reacción con ácido 3,5-dinitrosalicilico o con otros reactivos que determinen la
concentración de azucares reductores que se forman durante el curso de la hidrólisis.
HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA
Las amilasas son enzimas que catalizan la hidrólisis de almidón y están ampliamente
distribuidas en la naturaleza: la alfa amilasa de la saliva y del jugo pancreático, la beta
amilasa de la malta, la gama amilasa de los hongos, etc. La clasificación de las
amilasas se realiza de acuerdo a su modo de acción sobre los homoglicanos, es decir,
las amilasas son endoenzimas, es decir, actúan en el interior de la molécula, las beta y
gama amilasas son exoenzimas, actúan a partir de los extremos no reductores del
polímero. La alfa amilasa salival y pancreática, catalizan la hidrólisis de los enlaces
glicosídicos (14) de la amilosa, amilopectina y del glucógeno produciendo
inicialmente oligosacáridos de 6 a 7 unidades de glucosa, los que posteriormente son
degradados a maltotriosa y maltosa.
La maltosa no es sustrato para la enzima. La glucosa puede aparecer entre los
productos finales de la reacción, siempre que el tiempo de acción de la enzima sobre
los glucanos sea prolongado. Debido a que el almidón está constituido por un polímero
lineal (amilosa) de glucosa, que contiene enlaces  (14) y un polímero ramificado
que contiene enlaces  (14) y  (16) (amilopectina), y debido a que la amilasa es
una enzima específica para enlaces  (1 4), su acción sobre el almidón también
producirá oligosacáridos resistentes a la acción enzimática a causa de la presencia de
los enlaces  (16).
REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE LOS CARBOHIDRATOS
EXPERIMENTO N° 1. FORMACION DE FURFURALES

FUNDAMENTO
Esta reacción es general para los hidratos de carbono y se aplica para detectar su
presencia en los materiales biológicos. Por acción del ácido sulfúrico concentrado se
forma furfural a partir de pentosas 5-hidroximetilfurfural a partir de las hexosas.
Cuando estos se combinan con el a-naftol aparece un color violeta característico, y al
combinarse con timol da una coloración roja.

MATERIAL
1. Aparatos: Tubos de ensayo
Pipetas
Gradillas
2. Reactivos: Timol al 1% en alcohol etílico
a-Naftol al 0.2% en alcohol etílico
Ácido sulfúrico concentrado
Soluciones al 1% de almidón, glucosa, maltosa, sacarosa, etc.
METODO DE TRABAJO
En cada uno de los tubos de ensayo colocar 2.0 ml de solución de carbohidrato.
Añadir 4 gotas de a-Naftol o Timol. Luego añadir, por las paredes del tubo, 2.0 ml de
ácido sulfúrico concentrado teniendo cuidado que no se mezcle con la capa acuosa. En
la interfase aparecerá una coloración violeta (a-Naftol) o roja (Timol).
Anote sus resultados en la siguiente tabla:
Carbohidrato Glucos Sacarosa Almidó

a n
¿Anillo de color
rojo?
¿A qué se debe la coloración en la interface?
¿Cuál es la importancia o cómo aplicaría este experimento?
EXPERIMENTO N° 2. REACCIONES DE REDUCCIÓN: PRUEBA DEL

HIDRÓXIDO CÚPRICO.
FUNDAMENTO
Los carbohidratos que en su molécula poseen un grupo carboxilo libre, se llaman
reductores. Estos azúcares, en un medio alcalino tienen la capacidad de oxidarse,
reduciendo a su vez las sales de óxido cúprico (Cu+2) a sales de óxido cuproso (Cu+).
Esta es la base para una serie de métodos de determinación cualitativa y cuantitativa de
carbohidratos. En solución alcalina los monosacáridos y disacáridos reductores reducen
el hidróxido cúprico (II) en óxido cuproso (I).
°T
C6H12O6 + 2Cu(OH)2 C5H11-COOH + 2CuOH + H2O
Glucosa Ac. Glucónico

H2O
Cu2O
MATERIAL
Pipetas
Gradillas
Baño maría
2. Reactivos: Reactivo alcalino de cobre
Soluciones al 1% de almidón, glucosa, maltosa,sacarosa, etc.
MÉTODO DE TRABAJO
En los tubos de ensayo vierta 2.0 ml de solución de carbohidratos; luego añada
2.0 ml del reactivo de cobre, agite. Colocar en baño maría hirviente. La aparición de un
precipitado de color rojo (óxido cuproso) indica la presencia de carbohidratos
reductores.
En otro tubo de ensayo colocar 2.0 ml del reactivo alcalino de cobre. No se añade
carbohidrato. Al calentar esta solución, se forma un precipitado negro de óxido cúprico.
Por esta razón en esta reacción se debe evitar el exceso de hidróxido cúprico o sulfato
cúprico ya que la reacción entre el glúcido reductor y el Cu(OH)2 se da
cuantitativamente. El exceso del último durante el calentamiento pierda agua y se
transforma en óxido cuproso, lo cual oscurece la reacción principal y constituye un
defecto del método.
Cu(OH)2 CuO + H2O
Anote sus resultados en la siguiente tabla:
Carbohidrato Glucos Sacarosa Almidó

a n
¿Anillo de color

rojo?
¿A qué se debe la formación del precipitado de color rojo ladrillo?
¿Cuáles de los carbohidratos utilizados son reductores y por qué?
¿Cuál es la importancia o la aplicación de este experimento?
EXPERIMENTO N° 3. CUANTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS TOTALES

EN ALGAS POR EL METODO DE DUBOIS
El método de fenol ácido sulfúrico de Dubois y colaboradores (1956) es un

procedimiento colorimétrico simple para carbohidratos disueltos. Los azucares simples,
oligosacaridos, polisacáridos y compuestos derivados que tienen grupos reductores
libres o potencialmente libres dan un color anaranjado – amarillo cuando se trata de
denol y ácido sulfúrico concentrado. La reacción es sensible, estable y también poco
costosa. Los carbohidratos insolubles (como la celulosa) pueden determinarse por
sustracción después de determinar las proteínas, lípidos, cenizas y carbohidratos
solubles.
PROCEDIMIENTO:
1. Pese 5 mg de las algas secas homogenizadas y colóquelas en un tubo de
centrífuga de 10 ml.
2. Llene con 10 ml de TCA al 5% (ácido Tricloroacetico) en agua(al nivel de la
marca del tubo para retornar el volumen original después de calentar la muestra).
3. Caliente en baño maría caliente durante 3 horas de (80 a 90 °C) Agite
moderadamente los tubos al menos dos veces para asegurar una adecuada extracción.
Este paso debe estandarizarse para todas las series.
4. Saque los tubos del baño maria, enfrielos y ajustelos al volumen (de la marca)
original con agua destilada. Centrifuge durante 10 minutos a la mayor velocidad en
una centrifufa estandar.
5. Pipetee 0.2 ml de la alícuota en un tubo de prueba. Coloque uno de los dedos de
su mano sobre la pipeta e inserte el tubo a través de la supreficie antes de tomar la
muestra para evitar que se forme espuma.
6. Añada 1 ml de fenol al 5% y mezcle golpeando el tubo de prueba.
7. Añada rápidamente 5 ml de H2SO4 concentrado y mezcle golpeando el tubo.
Esta es una reacción exotermica.
8. Deje que se enfrie el tubo (durante 30 minutos) y lea a 490 nm (Filtro azul)

9. Haga los calculos con la siguiente formula:
mgdecarbohidratos
% deCarbohidratos= mgdet ejidoutilizado x 100
Nota: mg de carbohidratos = (mg de carbohidratos en 0.2 ml ) x ( 50). Los mg de

carbohidratos en 0.2 ml se obtienen a partir de la curva estandar.
CURVA ESTANDAR DEL GLUCÓGENO
1. Pese 25 mg de glucógeno (de grado analitico)
2. Diluya en una fiola de 50 ml con TCA al 5%
3. Haga una serie de diluciones:
Solución estandar TCA al 5% Glucógeno resultante

(ml) (ml) (mg)
0.20 0.00 0.100
0.15 0.05 0.075
0.10 0.10 0.050
0.05 0.15 0.025
0.00 0.20 0.000
4. A cada tubo (con 0.2 ml) añada 1.0 ml de fenol al 5%.

5. Añada 5 ml de H2SO4, espere 30 minutos y lea a 490 nm.
6. Trace una curva estándar con lo mg de carbohidratos
contra la densidad óptica.

CUESTIONARIO
1. Dibuje las proyecciones de Haworth de lo siguiente:
a) β-D-N-Acetilglucosamina
b) -D-Fructofuranosa
c) β-D-Glucopiranosa
d) β-D-Glucosa-1-fosfato
e) Acido N-acetilmurámico
2. Cuál es el principio de la formación de furfurales.

3. ¿Cuál es el principio de la reacción de reducción de los carbohidratos?
4. ¿Explique, porque la sacarosa es un carbohidrato no reductor?
5. ¿Explique, porque la glucosa, maltosa y lactosa son carbohidratos reductores?
6. Analice la estructura de la molécula de almidón y explique si éste puede exhibir
poder reductor frente al ion Cu++.
EXPERIMENTO N°4. EXPERIMENTO HIDROLISIS ACIDA DEL ALMIDÓN

OBJETIVOS:
1. Demostrar la hidrólisis del almidón
2. Verificar los diferentes tipos de hidrólisis: por acción de ácido y enzimática
3. Verificar a través de reacciones especificas la desaparición de almidón y la aparición
de azucares reductores durante la hidrólisis.
FUNDAMENTO
Durante el calentamiento del almidón con HCl diluido, este se descompone en
fragmentos de diferente tamaño llamados dextrinas. Estas se distinguen entre sí por la
masa molecular y por el color que dan en presencia de yodo. A continuación, se da un
esquema de la hidrólisis ácida del almidón:
Almidón + I2 Azul
Amilodextrinas + I2 Violeta azul
Eritrodextrinas + I2 Pardo rojiza
Acrodextrinas + I2 Incolora
Maltodextrinas + I2 Incolora
Maltosa + I2 Incolora

Glucosa + I2 Incolora
MATERIAL
Pipetas
Gradillas
Baño maría
2. Reactivos: Almidón al 1%
Solución de Lugol (20 gr de ioduro potásico y 10 gr de yodo en 100 ml de
agua)
Reactivo alcalino de cobre
HCl concentrado
METODO DE TRABAJO
Vierta 10.0 ml de solución de almidón en un tubo de ensayo; añadir 4 gotas de
ácido clorhídrico concentrado. Tomar 0.5 ml de la muestra y colocarla en 5.0 ml de
agua destilada, agite y añada 1 gota de lugol. Anote el color que aparece. Luego
coloque la muestra en baño maría hirviente. Después de 1 minuto se toma una muestra
para la reacción con yodo. Para esto se extrae 0.5 ml de solución y se vierte en un tubo
de ensayo que contiene 5.0 ml de agua destilada, se agita y se añade 1 gota de lugol. El
color azul violeta indica la presencia de amilodextrinas en la solución. Se repita la
misma operación cada minuto, hasta que la prueba de lugol nos dé negativa.
Para comprobar que lo que ha quedado en el tubo es glucosa, tomar 2.0 ml de muestra
y añadir 2.0 ml del reactivo de cobre. Colocar en baño maría hirviente hasta observar
un precipitado rojo ladrillo.
En la siguiente tabla anote los cambios de color observados:
Tiempo
0 1 2 3
(minutos)
Color observado

¿A qué se deben los cambios de color observados?
¿Cómo se puede aplicar este experimento en la industria alimentaria?
EXPERIMENTO N° 5. HIDROLISIS ENZIMATICA DEL ALMIDÓN

FUNDAMENTO
Por acción de la amilasa el almidón se hidroliza para dar lugar al disacárido maltosa,
que luego se hidroliza por acción de la maltasa hasta glucosa.
MATERIAL
Pipetas
Gradillas
Baño maría
2. Reactivos: Almidón al 1%
Solución de Lugol (20 gr de ioduro potásico y 10 gr de yodo en 100 ml de
agua)
Reactivo alcalino de cobre
Solución de saliva diluida (1:5)
METODO DE TRABAJO
Verter en un tubo de ensayo 5.0 ml de la solución de almidón; añadir 1.0 ml de
solución de saliva diluida. Tomar 0.5 ml de la muestra y colocarla en 5.0 ml de agua
destilada, agite y añada 1 gota de lugol. Anote el color que aparece. Luego coloque la
muestra en baño maría a 37 °C. Después de 3 segundos se toma una muestra para la
reacción con yodo. Para esto se extrae 0.5 ml de solución y se vierte en un tubo de
ensayo que contiene 5.0 ml de agua destilada, se agita y se añade 1 gota de lugol. Se
repita la misma operación cada minuto, hasta que la prueba de lugol nos dé negativa.
Para comprobar que lo que ha quedado en el tubo es glucosa, tomar 2.0 ml de muestra
y añadir 2.0 ml del reactivo de cobre. Colocar en baño maría hirviente hasta observar
un precipitado rojo ladrillo.
En la siguiente tabla anote los cambios de color observados:
Tiempo (minutos) 0 1 2 3

Color observado
¿A qué se deben los cambios de color observados?
¿Cómo se puede aplicar este experimento en la industria alimentaria?
CUESTIONARIO
1. Con relación a la naturaleza de los productos de la hidrólisis, diferenciar la acción
de un ácido mineral y la alfa amilasa salival sobre el almidón.
2. Cuál es el fundamento del método del ácido 3,5 Dinitrosalicilico para el dosaje de
azucares reductores.
3. Cuál es el fundamento del método del reactivo alcalino de cobre para el dosaje de
azucares reductores.
4. Explicar los resultados obtenidos en las hidrólisis acida y enzimática del almidón, en
función de la evolución de los colores obtenidos (A los 0, 5, 10, 20, 40 minutos)
con el yodo.
5. Suponiendo que la hidrólisis acida del almidón fuera parcial al punto de permitir el
aislamiento de disacáridos, cuál sería la estructura de los mismos (Tipos de enlaces
glicosídicos)?. Recordar que el almidón esta constituido por dos tipos de
polisacáridos.

CAPÍTULO 4. ANALISIS DE
LIPIDOS
1. Introducción
Los lípidos son un grupo heterogéneo de compuestos emparentados, con los ácidos
grasos. Son constituyentes importantes de la alimentación no solo por su elevado
valor energético, sino también por las vitaminas liposolubles y los ácidos grasos
esenciales contenidos en la grasa de los alimentos naturales.
SOLUBILIDAD
Es importante tener presente que la solubilidad de los lípidos, en general, dependen
de la relación numérica entre el número de grupos hidrófilos de hidrófobos de los
ácidos grasos, mientras que los grupos hidrófobos están representados por el resto
de la cadena hidrocarbonada. De esto se desprende que, cuanto más larga sea la
cadena hidrocarbonada del ácido graso, la relación entre los grupos mencionados
será tanto menor y menos soluble, en agua, será el ácido graso. La solubilidad en
los solventes orgánicos, por el contrario, depende de la afinidad del solvente por la
cadena carbónica no funcional.
INDICE DE ACIDEZ
Se define como el número de mg de KOH necesarios para neutralizar 1 gr. de
grasa. Está en relación con la cantidad de ácidos grasos libres presentes en la grasa.
Tiene interés porque nos indica el estado de conservación y el grado de
ranciamiento de una grasa, puesto que todo tipo de grasa tiene una cantidad
característica de ácidos grasos libres, más allá del cual significa alteración.

EXPERIMENTO N° 1. SOLUBILIDAD DE LOS LIPIDOS

FUNDAMENTO
Los grupos principales de los lípidos tienen características de solubilidad diferentes y
esta propiedad se usa en su extracción y purificación a partir de materiales biológicos.
La mayoría de los lípidos son solubles en etanol al 95%, pero forman una emulsión de
gotas pequeñas cuando se les agrega agua. Esto da a la suspención una apariencia
lechosa característica y constituye una prueba muy sencilla para grasas.
MATERIAL
1. De Vidrio: Tubos de ensayo
Pipetas
2. Reactivos: Alcohol
Acetona
Eter Dietílico
Cloroformo
Aceite de Oliva
METODO DE TRABAJO
Prepare el siguiente sistema de tubos:
5
TUBOS 1 2 3 4 Solubilidad
Agua destilada (ml) 2.0 - - - - …………………

..
Alcohol frío (ml) - 2.0 - - -
…………………
Alcohol caliente (ml) - - 2.0 - -
..
Eter (ml) - - - 2.0 -
…………………
Acetona (ml) - - - - 2.0 ..
Aceite de oliva (gotas) 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 …………………

..
…………………
..

…………………
..
Agitar enérgicamente, dejar en reposo. Observar y anotar los resultados obtenidos en

cada uno de los tubos.
EXPERIMENTO N° 2. DETERMINACIÓN DEL VALOR DE ACIDEZ DE UNA

GRASA
FUNDAMENTO
Las grasas almacenadas pueden sufrir enranciamiento debido a la oxidación de los
dobles enlaces para formar peróxidos y a su hidrólisis por microorganismos con
liberación de ácidos grasos. La cantidad de ácidos grasos libres da, por lo tanto, un
índice de la frescura y calidad de la grasa.
El presente experimento consiste en disolver la muestra con un solvente neutralizado

y en titular la acidez con una solución de KOH de normalidad conocida. Es decir, se
titulan los ácidos grasos libres.
MATERIAL
1. De Vidrio: Matraz
Beaker
2. Reactivos: Cloroformo
Alcohol al 95%
Fenolftaleína al 1%
KOH 0.1 N
Aceite de Oliva
METODO DE TRABAJO
Proceder de la siguiente manera:
1. Neutralización de los solventes.- En un matraz se mezclan 25 ml de cloroformo y 50
ml de alcohol, se agregan 4 gotas de fenolftaleína, seguidamente se titula con KOH,
hasta que aparezca un leve color rosado que persista durante 30 seg.
2. En un beaker previamente tarado, pesar 10 g. de grasa (aceite de oliva u otra grasa),
agregar la mezcla alcohol-cloroformo neutralizado, mezclar bien la grasa con los

disolventes. Se agrega 4 gotas de fenolftaleína y se valora inmediatamente con
KOH, hasta que el color rosado pálido permanezca por más de 30 seg. Anote el
número de mililitros gastados de álcali y calcule el índice de acidez de la grasa.
Aceite de oliva
Gasto de KOH
(ml)
( n )( 0.056 )( 1000 ) ( n ) ( 5.6 )

I . A= =
P P
Donde:
I.A. = Índice de Acidez
n = ml de KOH 0.1 N usados en la titulación.
1 ml de esta solución es igual a 0.0056 g. de KOH.
P = Peso de la muestra problema
Si se desea expresar en términos de % de ácidos grasos libres, referidos a ácido

oleico, con los mismos datos tendremos:
( n ) ( 0.0282 ) ( n )( 2.82 )
% de Acidez= x 100=
P P
0.0282 = 1 g. de ácido oleico (PM = 282).
¿Qué indica este valor, respecto al estado de conservación y aptitud para el consumo de
la grasa utilizada?
EXPERIMENTO N° 3. CARACTERIZACIÓN DE LOS

TRIACILGLICEROLES DE ACEITES
OBJETIVOS
- Caracterizar triacilgliceroles a través de la hidrólisis alcalina (reacción de
saponificación)
- Evidenciar la formación de lo productos de la hidrólisis (jabones) por sus

propiedades
REACTIVOS
- Solución de potasa alcohólica: 1 volumen de hidróxido de potasio al 40% y 1
volumen de etanol al 95%
- Aceite de pescado
- Acido acético concentrado
- Solución saturada de cloruro de sodio
PROCEDIMIENTO
1. En un tubo de ensayo grande colocar 15 gotas de aceite de pescado y 5 ml de
solución de potasa alcohólica. Adicionar perlas de porcelana para evitar la ebullición
tumultuosa. Calentar en baño María hirviente durante 30 minutos. En estas
condiciones, el aceite es saponificado obteniéndose una solución opalescente de sales
de potasio de ácidos grasos (jabones) y glicerol.
2. Repartir la solución de jabones en cuatro tubos de ensayo y realzar las siguientes
pruebas:
a) Disminución de la tensión superficial: agitar la solución de jabones y verificar la
formación de espuma,
b) Precipitación de ácidos grasos: al segundo tubo adicionar, gota a gota, ácido acético
concentrado hasta notar la aparición de un precipitado blanco de ácidos grasos, que
son insolubles debido a su bajo grado de disociación,
c) Precipitación de jabones de calcio: al tercer tubo adicionar cloruro de calcio al 10%,
gota a gota, hasta notar la aparición de u precipitado de jabones de calcio,
d) Precipitación por exceso de electrolitos: al cuarto tubo adicionar igual volumen de
solución saturada de cloruro de sodio, Observar la formación de un precipitado de
jabón por exceso de sales neutras, debido al efecto del ion común, que impide la
disociación de los jabone haciendo que las micelas pierdan la carga y precipiten.
Tubo 1 2 3 4
Disminución de la tensión superficial
Precipitación de ácidos grasos
Precipitación de jabones de calcio
Precipitación por exceso de electrolitos
CUESTIONARIO
1. Escribir la reacción de hidrólisis alcalina de un triglicérido diferente de la trioleína
2. ¿Porque se utiliza etanol e la reacción de saponificación?
3. Explicar la acción detergente de los jabones.
4. Explicar la precipitación de los jabones por exceso de electrolitos.

EXPERIMENTO N° 4. HIDROLISIS DEL ACEITE DE OLIVA POR LA
LIPASA PANCREATICA.
FUNDAMENTOS
Gran parte de los alimentos que ingiere un individuo está constituído por grasas, en
los cuales los triglicéridos constituyen un 90%. Los triglicéridos a nivel del intestino
proximal, se hidrolizan en sus componentes debido a la acción de la LIPASA
PANCREATICA, cuya acción se incrementa por la presencia de sales biliares que
favorecen su emulsión. La lipasa pancreática actúa en un rango de pH de 7.8 a 8.0.
Los triglicéridos se hidrolizan en ácidos grasos, glicerol, monoglicéridos y
diglicéridos. todos estos componentes son emulsionados hasta pequeñas micelas que
se absorben fácilmente.
Los aceites son lípidos constituidos básicamente de ácidos grasos insaturados, como
el palmítico, esteárico y el ácido mirístico.
La hidrólisis de los triglicéridos del aceite de oliva usando pancreatina (extracto de
enzimas pancreáticas) liberará ácidos grasos que podrán ser titulados.
MATERIALES
1. Aparatos:
Tubos de ensayo
Baño maría
Pipetas
2. Reactivos:
Buffer fosfato pH 8.0: A 100.00 ml de fosfato monopotásico 0.2 M, se le agrega
93.6 ml de NaOH 0.2 M y se completa a 400.00 ml con agua destilada.
Solución de sales biliares al 1% en buffer fostato pH 8
Solución de pancreatina al 1% en suero fisiológico o buffer fosfato pH 8.0
Fenolftaleína al 0.1%
Hidróxido de sodio 0.01 N.

Emulsión de aceite: Agregar 5 gotas de fenolftaleína a 100.00 ml de aceite de oliva
y la cantidad suficiente de hidróxido de sodio 0.01 N para neutralizar. Se detiene la
titulación cuando aparece un color rosa tenue.
METODO DE TRABAJO
Tubo N° 1 2 3 4 5 6
Emulsión de aceite 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
Buffer fosfato pH 8.0 2.0 2.0
Sol. de sales biliares 2.0 2.0
Sol. pancreatina 2.0 2.0 2.0
Sol. pancreatina hervida 2.0 2.0 2.0
Agua destilada 2.0 2.0
Mezclar y colocarlos en baño maría a 37 °C durante 30 min, agitando los tubos a
intervalos. Al finalizar el tiempo de incubación, retirar los tubos del baño maría y
agregar a cad uno 3 gotas de fenolftaleína y realizar la titulación de ácidos grasos
liberados, por acción d ela lipasa sobre las grasas, con NaOH 0.01 N hasta que
aprezca una coloración rosada. Anotar el volumen de álcali gastado en cada tubo.
Calcular el númeo de equivalentes de ácidos presentes en cada tubo.
1 2 3 4 5 6
ml de NaOH gastados
Equivalentes de ácido
CUESTIONARIO
1. Explique cuál es la función de las sales biliares en la actividad de la lipasa
pancreática.
2. Explique como es afectada la actividad de la lipasa cuando en el medio de reacción

no existen sales biliares.
3. Describa brevemente el macanismo de acción de la lipasa sobre los triacilglicéridos.
4. Investigue acerca de los factores que afectan la actividad de la lipasa pancreática

(pH óptimo, inhibidores, activadores, temepratura óptima, etc).
5. Investigue acerca de la presencia de lipasa en los peces y otros organismos

acuáticos.

CAPÍTULO 5. ARACTERIZACION
DE AMINOACIDOS
1. Introducción
Los aminoácidos son los sillares de construcción de las proteínas. El número de

aminoácidos comunes se reduce a 20. Todos con excepción de la prolina, tiene un
grupo carboxilo libre y un grupo amino libre no sustituido unido al carbono a.
Difieren unos de otros en la estructura de su cadena lateral que se denomina grupo
R. Siendo su estructura general:
H
|
HOOC - C - R
|
NH2
Los aminoácidos son importantes en la alimentación humana. En forma de proteínas
los aminoácidos realizan una multitud de funciones estructurales, hormonales y
catalíticas esenciales para la vida. Por lo tanto, no sorprende que defectos genéticos
en el metabolismo de los aminoácidos pueden conducir a transtornos graves como el
retraso mental y muerte temprana. Además de sus actividades como proteínas, los L-
aminoácidos y sus derivados participan en funciones intracelulares tan diversas
como transmisión nerviosa, regulación del desarrollo celular y en la biosíntesis de
porfirinas, purinas y pirimidinas así como urea.
2. Determinación del punto isoeléctrico en los

aminoácidos
Los aminoácidos presentan propiedades eléctricas por lo que son considerados como
anfolitos, puesto que poseen un grupo ácido y un grupo básico. En solución existen
como moléculas cargadas. En su punto isoeléctrico, existen en forma de zwitterion o
ion dipolar (sal); a pH menor que el punto isoeléctrico existen como cationes, que
actúan como ácidos; y a un pH mayor, existe como un anión, que actúa como base.
Estas formas no tienen una acción buffer buena o total y la adición de pequeñas
cantidades de H+ ó OH- alteran rápidamente el pH de la solución. Cuando el
aminoácido existe como una mezcla de la sal y la forma ácida o básica en
concentraciones aproximadamente equimolares (en la región de sus valores de pK),

el sistema actúa como un buffer estable.
Como se mencionó anteriormente el punto isoeléctrico es el pH al que el
aminoácido no lleva carga neta; es en esta forma que los aminoácidos no poseen
acción buffer. La acción tamponante es más grande cuando la concentración de la
forma de la sal iguala a la concentración de la forma ácido o de la forma de base.
Considere la reacción:
Acido Sal
[ Sal ] [ H + ]
Ka=
[ Acido ]
[ Acido ]
[ H + ] =Ka
[ Sal ]
[ Sal ]
pH= pKa+log
[ Acido ]
El pK = pH cuando la [sal] = [ácido]. Esto en el rango de pH ácido para la mayor

capacidad tamponante.
Similarmente para la reacción:
Sal Base
[ Base ]
pH= pKb+log
[ Sal ]
El pKb = pH cuando la [base] = [sal]. Esto en el rango de pH alcalino para la mayor

capacidad tamponante.
En el punto isoeléctrico la concentración de ácido iguala a la concentración de base:
[ H + ][ Sal ] [ H + ] [ Sal ]
Ka= [ Acido ] =
[ Acido ] Ka
[ H + ][ Base ] [ Sal ]
Kb= [ Base ] =Kb x
[ Sal ] [ H+]
Por lo tanto:
[ H + ] [ Sal ] [ Sal ]
=Kb
Ka [ H +]
[ H + ] 2=Ka x Kb

pKa+ pKb
pH ( pI )=
2
Si disponemos de una solución que contiene 1 mol de un aminoácido
monocarboxílico y monoaminado a un pH de 0 y le agregamos progresivamente
alícuotas de una solución de NaOH con el objeto de hacer variar el pH de la
solución, se podrá obtener una gráfica como la que muestra la Fig. 1.
12
10
pKb
8
pH
6 Punto
isoeléctrico
4 pKa
ml de ácido 0 ml de álcali
Figura 1. Curva de titulación de la glicina.

Se puede notar dos sectores en donde la curva tiende a la horizontalidad, es decir en
donde ocurren las menores variaciones en el pH, no obstante que la cantidad de
NaOH añadida, es la misma que para otros sectores de la curva. Si reparamos en que
pH ocurren estos sectores de casi horizontalidad de la curva, notaremos que están
muy próximos a 2.3 y 9.6; lo que quiere decir que en las proximidades del pK de sus
grupos ionizables, el aminoácido tendrá una mayor acción amortiguadora del pH.
Esto nos permite anotar que, de los diferentes aminoácidos, la histidina (por su
núcleo imidazol) es el más importante en el control del pH de los líquidos
extracelulares, que como se sabe es de aproximadamente 7.4.
En el punto isoeléctrico los aminoácidos son menos solubles en agua y no migran a
ningún electrodo bajo la influencia de una corriente eléctrica.
3. Aislamiento y separación de aminoácidos

Los aminoácidos pueden ser separados por Cromatografía de intercambio iónico, en
este procedimiento las moléculas de las soluciones son separadas por diferencias en
sus propiedades ácido-base. Para tal fin, se usan columnas con resinas sintéticas, la
cual tiene grupos químicos con una carga determinada. Una de las más usadas
corresponde al poliestireno, con grupos de ácido sulfónico (SO3-) unidos

coovalentemente a los anillos bencénicos. Esta resina, por intermedio de sus grupos
sulfónicos puede captar cationes e intercambiarlos con otros cationes (resina de
intercambio catiónico).
En virtud de la propiedad de los aminoácidos de adoptar determinada forma

eléctrica según el pH del medio en que se encuentren, los aminoácidos pueden ser
separados fácilmente por Electroforesis. La técnica consiste en suspender a los
aminoácidos en un medio de pH determinado y colocar la solución sobre un soporte,
que puede ser simplemente papel y someterlo a la acción de un campo eléctrico.
Según la intensidad de carga y secundariamente según su tamaño, los aminoácidos
migrarán a uno u otro polo y con mayor o menor velocidad.
Existe otro método muy usado para la separación de aminoácidos y que no está
basado en sus propiedades eléctricas sino en la diferente solubilidad que tienen en
una mezcla de solventes no miscibles.
Cuando un aminoácido se disuelve en una mezcla de solvente no miscible se reparte
entre ellos de acuerdo a su grado de solubilidad, que en la práctica corresponde a su
coeficiente de partición o de reparto. Este principio se aplica en la técnica
denominada Cromatografía de Papel y Cromatografía de Capa Fina.
4. Reacciones químicas de los aminoácidos

Los aminoácidos presentan reacciones de significación biológica que evidencian su
capacidad de interactuar coovalentemente entre sí mediante el grupo a-carboxilo de
una molécula y el a-amino de otra molécula para formar un enlace peptídico.
Los aminoácidos participan además en una gran variedad de reacciones químicas
que incluyen la alquilación, arilación y acilación del grupo amino, la formación de
ésteres y anhídridos que implican al grupo carboxilo y reacciones similares en las
que interviene los grupos reactivos de las cadenas laterales. El conocimiento de
estas reacciones es útil en varios aspectos importantes de la química proteica:
a. Para identificar y analizar los aminoácidos en un hidrolizado proteico.
b. Para identificar la secuencia de los aminoácidos en las proteínas.
c. Para la identificación de los residuos específicos de aminoácidos requeridos para
la función biológica de las proteínas.
d. Para producir cambios en la actividad biológica de la proteína mediante
modificaciones químicas de los residuos de los aminoácidos constituyentes.
e. Para la síntesis química de los polipéptidos.

Dentro de las principales reacciones podemos mencionar:
4.1. Reacción con ácido nitroso

El ácido nitroso reacciona con los grupos amino primarios alifáticos con
liberación de nitrógeno para formar alcoholes. Esta reacción puede ser usada
para estimar cuantitativamente los aminoácidos midiendo la cantidad de

nitrógeno liberado.
4.2. Reacción con ninhidrina

Usada para la determinación cuantitativa de los aminoácidos y péptidos. Los
aminoácidos reaccionan con la ninhidrina para dar un característico color azul
violáceo llamado azul de Ruheman con una absorción máxima a 540 nm a
excepción de la prolina e hidroxiprolina que dan un color amarillo, con una
absorción máxima a 440 nm. La ninhidrina es reducida y el aminoácido es
desaminado y descarboxilado. La determinación cuantitativa puede hacerse
también midiendo el CO2 desprendido.
4.3. Reacción con el dinitrofluorobenceno (DNB)

El grupo amino reacciona con el DNB en condiciones alcalinas para formar un
derivado amarillo. Esta reacción es importante en la determinación del grupo
amino terminal en proteínas, lo que permite identificar el aminoácido iniciador

de la cadena polipeptídica. Ya que al realizar la hidrólisis ácida de la proteína se
libera el aminoácido N-terminal arilado; pudiendo ser identificado por
cromatografía en papel o capa fina.
4.4. Reacción con cloruro de dansilo
Un grupo amino libre reacciona con el cloruro de dansilo para formar un

compuesto fluorescente que puede detectarse y medirse en cantidades pequeñas,
mediante métodos fluorimétricos.
4.5. Reacción con fenilisotiocianato
Es la reacción de Edman para determinar el N-terminal de una cadena

polipeptídica. El fenilisotiocianato reacciona con los a-aminoácidos para dar los
ácidos feniltiohidantóicos correspondientes. Estos ácidos al ser tratados con
solventes no hidroxilados, como el nitrometano; se ciclan para dar las
feniltiohidantoínas; las cuales son reconocidas por cromatografía de gas-
líquido, de papel o de capa fina.

4.6. Reacción con cloruro de triofluoroacetilo
Se utiliza en la cromatografía de gas-líquido. Los derivados trifluoroacéticos se

volatilizan fácilmente sin descomponerse para separarse por cromatografía gas-
líquido mientras que los aminoácidos libres se descomponen.
Las reacciones antes señaladas son comunes a todos los aminoácidos. Pero los
aminoácidos presentan reacciones que dan color y dependen de su cadena
lateral y por lo tanto, son más específicas en la identificación de aminoácidos.
Entre las reacciones químicas que se usan para la detección o estimación de
algunos aminoácidos específicos tenemos: reacción xantoproteica, reacción de
millon, reacción del acetato de plomo, reacción de sakaguchi, etc. Cuyo
fundamento se explica en la parte experimental.
EXPERIMENTO N° 1. REACCION CON NINHIDRINA

FUNDAMENTO
Los aminoácidos reaccionan con la ninhidrina dando un color azul violáceo. En
eta reacción la ninhidrina es reducida y el aminoácido es desaminado y
descarboxilado.
MATERIAL
1. Aparatos:
Tubos de ensayo
Pipetas
Gradillas
Baño maría
2. Reactivos:
Solución de aminoácidos 0.1 M (glicina, metionina, cisteína, histidina, arginina,
tirosina, triptofano y cistina)

Ovoalbúmina 0.1% (o Clara de huevo 5%)
Ninhidrina 0.1% en etanol de 95%
METODO DE TRABAJO
Color
TUBO N° 1 2 3 4 5 6 7 8
observado
Glicina 0.1 M 0.5 - - - -- - - - ……………
Metionina 0.1 M .
- 0.5 - - - - - -
Cisteina 0.1 M
……………
Histidina 0.1 M - - 0.5 - - - - -
.
Arginina 0.1 M
- - - 0.5 - - - -
……………
Tirosina 0.1 M
- - - - 0.5 - - - .
Ovoalbumina 0.1%
Agua destilada - - - - - 0.5 - - ……………
Ninhidrina 0.1% .
- - - - - - 0.5 -
……………
- - - - - - - 0.5
.
1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
……………
.
……………
.
……………
.
……………
.
Mezclar mediante agitación suave y llevar a baño de agua hirviente por 10

minutos. Retire y enfríe. Observe e interprete los resultados.
EXPERIMENTO N° 2. REACCION XANTOPROTEICA
FUNDAMENTO
Es una prueba positiva para aminoácidos aromáticos (tirosina, fenilalanina y
triptófano). Se basa en la nitración del núcleo de benceno (anillo aromático) dando
derivados amarillos, cuando se calientan con ácido nítrico concentrado; estos derivados
se tornan anaranjados por adición de NaOH (se forman sales).

MATERIAL
Pipetas
Gradillas
Baño maría
2. Reactivos: Solucion de aminoácidos 0.1 M
(glicina, tirosina y triptofano)
Ovoalbumina 0.1% (o Clara de Huevo 5%)
Acido nítrico concentrado
NaOH 1 N
METODO DE TRABAJO
Color
TUBO N° 1 2 3 4 5
observado
Glicina 0.1 M 1.0 - - - -- ……………
Tirosina 0.1 M Triptofano 0.1 - 1.0 - - - ……………
M Ov
- - 1.0 - - ……………
+
- - - 1.0 - ……………
- - - - 1.0 ……………
1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 ……………
oalbumina 0.1% Agua destilada
Acido nítrico
Agite suavemente y lleve a baño maría por 10 minutos. Retire y enfrie. Adicione 1.0 ml
de NaOH. Observe e interprete los resultados.
EXPERIMENTO N° 3. REACCION DE MILLON

FUNDAMENTO
Esta prueba para ser positiva requiere la presencia de un radical hidroxibenceno, y
por lo tanto, es espacífica para tirosina y sus derivados ya sea que estén libres o en

una proteína o en sus productos de hidrólisis. Esta reacción también se emplea en la
cuantificación de tirosina.
El reactivo de Millon es una solución de nitratos mercuriosos y mercúricos,
conteniendo ácido nítrico. Las proteínas del tipo de las albúminas de huevo, que
precipitan por ácidos minerales fuertes, producen un precipitado blanco que se va
volviéndo rojo a medida que se calienta. Otras proteínas como las proteosas y
peptonas solo producen una coloración roja en las mismas condiciones, debido a que
las soluciones contienen sales inorgánicas (Cl-) en gran cantidad, precipitando el
reactivo de Millon, este método no se emplea para determinar proteínas en la orina
MATERIAL
Pipetas
Gradillas
Baño maría
2. Reactivos: Solucion de aminoácidos 0.1 M (tirosina)
Reactivo de Millon
METODO DE TRABAJO
Color
TUBO N° 1 2 3
observado
Tirosina 0.1 M Ovoalbumina 0.1% 1.0 - - …………….
Agua destilada
- 1.0 - …………….
Reactivo de Millon
- - 1.0 …………….
1.0 1.0 1.0 …………….
Mezclar y llevar a baño de agua hirviente por 5 minutos. Retire y enfrie. Observe e
interprete los resultados.
EXPERIMENTO N° 4. REACCIÓN CON ACETATO DE PLOMO

FUNDAMENTO

Cuando un compuesto orgánico que contiene azufre, es tratado con una solución
fuerte de NaOH, este se hidroliza según:
R−S +2 NaOH ⇌ ROH + Na2 S + H 2 O
Este sulfuro inorgánico es altamente ionizable y como resultado de esto se puede

obtener algún test de precipitación para el ion sulfuro. Uno de los más comunes es la
precipitación por el plomo. En efecto, la adición de acetato de plomo causa la
formación de sulfuro de plomo (negro o pardo).
El azufre de la cisteina reacciona fácilmente con el acetato de plomo en cambio el
azufre de la metionina a causa de su gran estabilidad no ennegrese con el plomo. La
mayor parte de las proteínas contienen azufre formando parte de la metionina. Son
excepciones las queratinas, insulina y ciertas seroalbúminas que contienen azufre en
forma de cistina o cisteína. La fibroína d ela seda y algunas protaminas no contienen
azufre. La ergotioneina también contiene zufre y puede dar esta reación.
MATERIAL
Pipetas
Gradillas
Baño maría
(cisteína, cistina y metionina)
NaOH 40%
Acetato de Plomo 0.5 M
METODO DE TRABAJO
Color
TUBO N° 1 2 3 4 5 6 observado
Metionina 0.1 M 2.0 - - - -- - …………
Cisteina 0.1 M - 2.0 - - - - ……..
Cistina 0.1 M - - 2.0 - - - …………
Caseina 0.1% - - - 2.0 - - ……..
Ovoalbumina - - - - 2.0 - …………
0.1% - - - - - 2.0 ……..
Agua destilada 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 …………

NaOH 40% 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 ……..
Acetato de …………
plomo 0.5 M ……..
(Gotas) …………
……..
…………
……..
…………
……..
Mezclar y llevar a baño de agua hirviente por 3 minutos. Retire y enfrie. Observe e
interprete los resultados.
EXPERIMENTO N° 5. REACCIÓN MCCARTHY-SULLIVAN

FUNDAMENTO
Sirven para identificar la presencia de metionina. Para tal efecto se utiliza
nitroprusiato de sodio (Na2NOFe(CN)5) desarrollándose una coloración roja en
presencia de dicho aminoácido.
MATERIAL
Pipetas
Gradillas
Baño maría
2. Reactivos: Solucion de aminoácidos 0.1 M (glicina, metionina)
NaOH 6 N
Nitroprosiato de sodio (20 g/L. Prepárese fresco).
HCl 2 M
METODO DE TRABAJO

Color
TUBO N° 1 2 3 4
observado
....................
Glicina 0.1 M 1.0
..
....................
Metionina 0.1 M 1.0
..
……………
Ovoalbumina 0.1% 1.0
…
……………
Agua destilada 1.0
…
……………
NaOH 6 N 1.0 1.0 1.0 1.0
…
……………
Nitroprusiato de sodio 0.5 0.5 0.5 0.5
…
Lleve los tubos a baño maría a temperatura no mayor de 40°C durante 10 minutos.
Luego enfrie y por las paredes del tubo deslice 1.0 ml de HCl. Anote los resultados.
Luego agite los tubos y observe otra vez.
EXPERIMENTO N° 6. REACCION DE HOPKINS-COLE

FUNDAMENTO
Esta prueba es positiva para aminoácidos que poseen un anillo indol como el
triptofano. El grupo indol del trptofano reacciona con el ácido glioxílico (CHO-
COOH) del reactivo en presencia del ácido sulfúrico dando un color púrpura o
violeta en la interfase de los dos líquidos.
MATERIAL
Pipetas
Gradillas
Baño maría
(glicina, triptofano)
Acido sulfúrico concentrado
Reactivo de Hopkins-Cole

METODO DE TRABAJO
Color
TUBO N° 1 2 3 4
observado
……………
Glicina 0.1 M 1.0
.
……………
Triptofano 0.1 M 1.0
.
……………
Ovoalbumina 0.1% 1.0
.
……………
Agua destilada 1.0
.
……………
Reactivo Hopkins-Cole 0.2 0.2 0.2 0.2
.
Después de añadir el reactivo de Hopkins-Cole agite y agregue a cada tubo,

deslizando por las paredes, 1.0 ml de ácido sulfúrico concentrado, luego lleva al
baño de agua hierniente por 3 minutos. Retire y enfri. Observe los resultados.
CUESTIONARIO
1. La hormona peptidica estimuladora de melanocitos, -melanotropina, tiene la
siguiente secuencia: Ser-Tyr-Ser-met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val
a) Escribir la secuencia utilizando las abreviaturas de una letra.
b) Calcular el peso molecular relativo del peptido.
c) Estimar la carga neta a pH 7.4
2. Dado el peptido siguiente: Ser-glu-Pro-Ile-Met-Ala-Pro-Val-Glu-Tyr-Pro-Lys

a) Estimar la carga neta a pH 7 y a pH 12
b) Cuantos peptidos se producirian si este peptido se corta con: 1) Bromuro de
cianogeno, 2) Tripsina y 3) Quimotripsina?
3. La apamina es una pequeña toxina proteica presente en el veneno de las abejas.

Su secuencia es la siguiente: CNCKAPETALCARRCQQH
a) Se sabe que la apamina no reacciona con yodoacetato. Cuantos enlaces disulfuro

estan presentes?
b) Supongase que la fragmentacion con tripsina produce dos peptidos. Donde esta
(o estan) el enlace o enlaces S-S?

CAPITULO N° 6.
CARACTERIZACION Y
CUANTIFICACION DE PROTEINAS
I
1. Introducción
Las proteínas constituyen más del 50% del peso seco de las células. Son estructuras
formadas por una o más cadenas polipeptídicas. El número de permutaciones y
combinaciones que se pueden obtener a partir de los 20 aminoácidos es enorme y
por esto el número posible de proteínas es realmente muy grande.
Las proteínas, presentes en los organismos vivos, cumplen diferentes funciones.
Actúan como transportadoras de vitaminas, oxígeno y bióxido de carbono. Actúan
también como enzimas, hormonas, anticuerpos, moléculas de almacenaje, unidades
estructurales, fuentes de energía, etc.
Uno de los trabajos más laboriosos e interesantes del Bioquímico es la purificación
de proteínas para su caracterización y cuantificación posterior.
2. Precipitación de proteínas
Las proteínas son coloides liofílico (en particular, hidrofílicos); se hallan
estabilizadas por ambas cargas y por interacciones proteína-solvente. Cuando una de
estas influencias estabilizadoras es removida, la proteína precipita algunas veces;
cuando ambas de estas influencias son eliminadas, la proteína siempre precipita.
2.1 Precipitación en el punto isoeléctrico
Las proteínas, como los aminoácidos, son menos solubles en su punto isoeléctrico.
Algunas proteínas, por ejm. caseína, son precipitadas ajustando el pH de la solución
al punto isoeléctrico de la proteína.
2.2. Precipitación por sales
La adición de una sal neutra causa la precipitación de las proteínas. Las diferentes
proteínas son precipitadas a diferentes concentraciones de sal. Esto ocurre más
fácilmente en el punto isoeléctrico d ela proteína. El efecto de la sal es eliminar el
agua de solvatación, lo cual disminuye la interacción proteína-agua y aumenta la
interacciín proteína-proteína, causando así la precipitación. La sal comúnmente
usada para este tratamiento es el sulfato de amonio, pues es extremadamente
soluble.
2.3. Precipitación por Solventes Orgánicos
La adición de ciertos solventes orgánicos, como etanol y acetona, precipitan las
proteínas, y otra vez la precipitación ocurre más fácilmente en el punto isoeléctrico

de la proteína. Los solventes orgánicos también eliminan agua, así disminuyen la
interacción proteína-agua. Este procedimiento debe ser llevado a cabo a 0°C, de otro
modo puede ocurrir desnaturalización.
2.4. Precipitación por Aniones Complejos

Los ácidos como tricloroacético, sulfosalicílico, pícrico, tánico, tungstico,
fosfomolibdico, etc. precipitan proteínas. La precipitación probablemente se debe a
la neutralización de la carga positiva de la proteína por el anión libre. Este tipo de
precipitación causa muchas veces desnaturalización debido al pH extremo al que se
le lleva a la proteína.
2.5. Precipitación por Metales Pesados
Los cationes de metales pesados como mercurio, plomo, cobre, plata, oro, platino,
etc., precipitan las proteínas en condiciones alcalinas. El catón libre disminuye la
carga negativa de la proteína, causando así la precipitación. Estos iones algunas
veces desnaturalizan las proteínas porque reaccionan con los grupos SH para formar
sulfuros.
2. Desnaturalización de las proteínas

Las proteínas nativas son altamente ordenadas, son moléculas complejas. Cualquier
fuerza que altere la estructura tridimensional de la molécula sin que haya ruptura del
enlace peptídico causa desnaturalización. las proteínas desnaturalizadas tienen
propiedades diferentes a las proteínas nativas y ellas ya no poseen actividad
fisiológica. Además, la desnaturalización desminuye la solubilidad de las proteínas
en agua, porque el arreglo de los grupos hidrofílicos, orientados hacia la superficie,
está destruído. Son comunes agentes desnaturalizantes, el calor, pH extremo,
oxidación y reducción los cuales afectan el enlace disulfuro, agitación, radiación y
úrea. Las proteínas presentan diferentes susceptibilidades para cada agente
desnaturalizante. La desnaturalización puede ser un proceso reversible. Algunas
veces, cuando se remueve el agente, como en el caso de la úrea, a proteína nativa es
restaurada.
OBJETIVOS
- Caracterizar la presencia de prteínas en material biológico
- Demostrar las reacciones de coloración para las proteínas
- Verificar experimentalmente la precipitación de proteínas con y sin
desnaturalización

- Relacionar las observaciones prácticas con la teoría de propiedades generales,
estructura y aislamiento de proteínas
REACTIVOS
- Solución de proteínas al 10%
- Solución de ninhidrina 0,1%
- Hidróxido de sodio 2,5 M
- Solución de sulfato de cobre al 1%
- Acido tricloroacético (TCA) al 10% v/v
- Acetato de plomo al 5% p/v
- Alcohol etílico absoluto
- Clara de huevo “in natura”
- Cloruro de sodio 1 M
- Slución saturada de sulfato de amoio 76,6 g% p/v
EXPERIMENTO N° 1. REACCIONES DE COLORACIÓN

a) REACCIÓN DE NINHIDRINA
Tubo 1: 2 ml de ninhidrina + 5 gotas de proteína al 10%, llevar a baño maría por 5
minutos a 100ºC. Anotar el resultado.
b) REACCIÓN DE BIURET
Tubo 2: 1 ml de proteína al 10% + 5 gotas de NaOH 2,5 M y 3 gotas de sulfato de
cobre al 1%
Tubo 3: 1 ml de agua destilada + 5 gotas de NaOH 2,5 M y 3 gotas de sulfato de
cobre al 1%. Anotar los resultados.
Tubo 1 2 3
Ninhidrina
Biuret
Agua + Biuret
EXPERIMENTO N° 2. REACCIONES DE PRECIPITACIÓN

a) ACCIÓN DEL CALOR
Tubo 4: 2 ml de proteína al 10%; colocar en baño maría a 100ºC por 3 minutos.
Anotar el resultado
b) REACCIÓN CON REACTIVOS PARA ALCALOIDES

Tubo 5: 1 ml de proteína al 10% + 1ml de TCA al 10%, Anotar el resultado
c) REACCIÓN CON SALES DE METALES PESADOS

Tubo 6: 1 ml de proteína al 10% + 1 ml de acetato de plomo al 5%. Anotar el
resultado,

d) REACCIÓN CON SOLVENTES ORGÁNICOS
Tubo 7: 1 ml de proteína al 10% + 3 ml de alcohol etílico. Anotar el resultado
e) EFECTO DE LA ADICIÓN DE SALES
Tubo 8: 3 ml de clara pura + agua destilada hasta la formación de un precipitado
blanquecino. Disolver con ayuda de un varilla, adicionar NaCl 1 M gota a gota hasta
redisolver el precipitado,
Tubo 9: 2 ml de la solución anterior + 4 ml de solución saturada de sulfato de
amonio. Observar. Añadir 4 a 6 ml de agua destilada y observar el efecto,
Tubos 4 5 6 7 8 9
100ºC
TCA al 10%
Acetato de plomo al 5%
Alcohol etílico
NaCl 1 M
Sulfato de amonio
CUESTIONARIO
1. Cual es el fundamento de la reacción de la ninhidrina y que clases de sustancias
reaccionan positivamente?
2. Cuales el fundamento de la reacción de biuret y qué grupos de las proteínas son

responsables de esta reacción?
3. Cual es la importancia de la reacción de biuret?.
4. Cual es la importancia de las reacciones de precipitación de proteínas por los

reactivos de los alcaloides y por sales de metales pesados?. Explique los
mecanismos de las precipitaciones.
5. Explique los mecanismos que llevan a una proteína a disolverse cuando hay un
pequeño aumento de la fuerza iónica de la solución y los mecanismos que llevan a
una proteína a precipitar cuando hay un gran aumento de la fuerza iónica de la
solución.
6. Qué cambios ocurren en una proteína cuando está en contacto con el etanol?

EXPERIMENTO N° 3. DETERMINACIÓN DEL PUNTO ISOELECTRICO Y
SOLUBILIDAD DE LA CASEINA.
FUNDAMENTO
El punto isoelectrico (pI) es la concentración de iones hidrógeno a la que la
proteína es eléctricamente neutra, porque el número total de cargas positivas es igual al
número total de cargas negativas de la proteína. En este punto, algunas proteínas son
muy insolubles y precipitan, pero otras permanecen en solución (ovoalbúmina,
gelatina). En este punto la carga neta de todos los grupos disociables, como carboxilo,
amino, imidazol, guanidino, etc., es igual a cero. La superficie de la proteína siempre
posee una carga eléctrica que depende del pH, de los electrolitos presentes y del
solvente, en particular del agua, y de los puentes hidrógenos; pero existe un conjunto
de condiciones, basado en las relaciones de todos estos factores, para el cual la suma de
las cargas positivas es igual a la suma de las cargas negativas. En este momento el
número de moléculas de proteína que tienen una carga neta positiva o negativa es
mínimo o nulo.
MATERIAL
Pipetas
Gradillas
2. Reactivos: Solución de caseína al 0.5% en acetato de sodio 0.1 N
Acido acético 1 N
Acido acético 0.1 N
Acido acético 0.01 N
NaOH al 10%
METODO DE TRABAJO
Preparar el siguiente sistema de tubos:
TUBO N° 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Ac. acetico 0.01
0.62 1.25
N
Ac. acetico 0.1 N 0.25 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0
Ac. acetico 1.0 N 1.6
Agua destilada 8.38 7.75 8.75 8.5 8.0 7.0 5.0 1.0 7.4
Caseina 0.5% 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

pH
Turbidez
Agitar los tubos antes y después de agregar la caseína. Haga el cálculo del pH
teórico para cada uno de los tubos y si fuera posible determine el pH de cada tubo en
un pHmetro. Con los resultados construya una gráfica. Además, anote la presencia o
falta de turbidez de 0 a ++++, según corresponda para cada tubo. Determinar con la
mayor precisión el tubo que presenta el máximo de precipitación, lo cual se producirá
en el tubo que tiene un pH próximo al punto isoeléctrico y al de solubilidad mínima de
la caseína. Observar a los 10 minutos y 30 minutos, anote los cambios.
Seguidamente calentar los tubos en baño maría y apreciar el resultado. Anote sus
apreciaciones. Agregar NaOH al 10% gota a gota y observe. Anote los resultados.
EXPERIMENTO N° 4 ESTIMACIÓN CUANTITATIVA DE PROTEÍNAS A

PARTIR DE ALGAS MARINAS POR EL MÉTODO DE BIURET DE LAYNE
FUNDAMENTO
Este método colorimétrico distinto está basado en un complejo purpura que se produce
entre las sustancias que contienen dos o más enlaces peptídicos y sales de cobre en una
solución alcalina (Layne 1957). Dado que ninguna otra sustancia distinta a las proteinas
que de la reacción de biuret está normalmente presente en los materiales biológicos, está
es una excelente prueba. Aunque la aparición de color con varias proteinas (especificas)
no siempre es idéntica, las excepciones se encuentran con menos frecuencia que con la
reacción de Folin-fenol. Sin embargo, se requiere de más material para efectuar las
pruebas. La ventaja principal de este método es el sitio de reacción, los enlaces
peptídicos, lo cual permite hacer más eficazmente el análisis de todas las proteínas.
PROCEDIMIENTO:
Para obtener el reactivo de biuret disuelva 1.5 g de sulfato cuprico (CuSO 4 . H2O ) y
6.0 g de tartrato de sodio y potasio (NaKC 4H4O6 . 4H2O) en 500 ml. de agua. Añada,
agitando constantemente, 300 ml de NaOH al 10% (solución libre de carbonato).
Diluya en un litro de agua y almacene en una botella revestida de plástico. Cualquier
signo de precipitado negro o rojizo indica contaminación.
2. Pese de 100 a 200 gr de la muestra y añada 5 ml de NaOH 1N. Deje que repose
de 24 a 72 horas a la temperatura del lugar. Agite ocasionalmente la solución
golpeando la base del tubo de prueba.
3. Tome una alícuota de 1 ml del extracto y añada 4 ml del reactivo de biuret,
mezcle con un agitador Vortex o golpeando rápidamente el fondo del tubo de prueba
y deje que repose durante 30 minutos a la temperatura del lugar.
4. Determine la densidad óptica a 540 nm. Utilice un testigo (tubo control que tiene
1 ml de NaOH 1N y 4 ml de Biuret).

5. Determine el porcentaje de proteínas utilizando la siguiente formula y una curva
estándar como lo indica el procedimiento de lowry, pero con la solución estándar de
100 mg en 50 ml.
( mgdeproteínas)(5 )
mg det ejido
x 100
6. Para obtener la curva estándar disuelva 25 mg de la albúmina de suero de bovino

en NaOH 1N y haga una serie de diluciones de 0.0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1.0 ml de la
solución estándar; añada 4 ml de reactivo de biuret. Obtenga la diferencia utilizando
NaOH 1N.
Tubo [Proteína]
UK UK neta Ab Fc
N mg/ml
Bl
1
2
3
4
5

CAPITULO 7. ESTUDIO DE LOS
PRINCIPALES FACTORES
CINETICOS DE LA FOSFATASA
ACIDA DE QUINUA
1. Introducción
Las enzimas son moléculas proteicas especializadas, que aceleran las reacciones
químicas llevándolas más rápidamente a su posición de equilibrio. Las fosfatasas
ácidas denominadas también Monoéster Ortofosfórico Fosfohidrolasa, actúan en un
rango de pH entre 5.0 y 6.5, hidrolizan sustratos que tienen un enlace fosfoéster,
liberando como productos de la reacción fosfato inorgánico y un alcohol, el cual
varía dependiendo del sustrato utilizado. Estas enzimas no necesitan de metal alguno
para evidenciar su actividad.
2. Factores cinéticos
Son varios los factores que afectan la actividad enzimática, haremos mención de
alguno de ellos:
2.1 Efecto del tiempo

La cantidad de producto formado en una reacción enzimática es proporcional al
tiempo de incubación. La reacción es lineal en el tiempo hasta un período
determinado en que se puede expresar la actividad enzimática en términos de
velocidad, o sea la cantidad de producto formado por unidad de tiempo.
Generalmente la velocidad se expresa en micromoles de producto formado por
minuto.
2.2. Efecto de la concentración de enzima
Cuando el sustrato se encuentra en exceso, a concentraciones saturantes, la
velocidad de la reacción es proporcional a la concentración de la enzima.
2.3. Efecto del pH
La mayor parte de las enzimas tienen un pH característico en el cual su actividad es
máxima, a ese pH se le denomina pH óptimo, y se define como el pH en el cual la
enzima y el sustrato presentan una conformación estructural adecuada para la
actividad catalítica. Por encima y por debajo de este pH la actividad declina,
adoptando una forma característica de campana.

2.4. Efecto de la temperatura
La velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas generalmente se incrementa
con la temperatura dentro del margen de estabilidad y plena actividad de la enzima.
Cuando la temperatura alcanza un cierto valor, variable, según la enzima que se
trate, esta empieza a desnaturalizarse y la velocidad de la reacción empieza a
disminuir. La temperatura a la que se alcanza ese valor máximo se denomina
temperatura óptima.
2.5. Efecto de la concentración de sustrato
Es el más importante, ya que determina la velocidad de la reacción. En la mayoría
de los casos, cuando se representa la velocidad en función de la concentración de
sustrato, manteniéndose constante la concentración de enzima, se obtienen curvar
hiperbólicas en las cuales puede observarse que para valores muy pequeños de
concentrcaión de sustrato [S], la velocidad de reacción es directamente proporcional
a la concentración del propio sustrato.
MATERIAL
Pipetas
Gradillas
Fotocolorímetro o Espectrofotómetro
Baño maría
2. Reactivos: Buffer Acetato de Sodio 0.1 M pH 5
Buffer Acetato de Sodio 0.1 M pH 3
Buffer Acetato de Sodio 0.1 M pH 7
p-Nitrofenilfosfato 1 x 10-2 M y 1 x 10-3 M
Fosfatasa ácida de quinua
NaOH 1 N

EXPERIMENTO N° 1. EFECTO DEL TIEMPO
Prepare un sistema de tubos por duplicado tal como se indica a continuación:
Tubo N° B1 1 B2 2 B3 3 B4 4
Buffer Acetato 0.1 M pH 5 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
p-Nitrofenilfosfato 1 x 10-2 M 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
Agua Destilada 0.8 0.7 0.8 0.7 0.8 0.7 0.8 0.7
Preincubar 2 min a 37 °C
Enzima 0.1 0.1 0.1 0.1
Incubar a 37 °C (min) 1 1 2 2 5 5 10 10
NaOH 1 N 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
Leer en fotocolorímetro a 420 nm (filtro azul). Graficar velocidad frente al tiempo.
Tubo UK UK neta Ab Tiempo (min)

B1
1 1
B2
2 2
B3
3 5
B4
4 10

EXPERIMENTO N° 2. EFECTO DE LA CONCENTRACION DE ENZIMA
Tubo N° Bl 1 2 3 4
Buffer Acetato 0.1 M pH 5 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
P – Nitrofenilfosfato 1 x 102 M 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
Agua Destilada 0.8 0.75 0.7 0.65 0.6
Enzima - 0.05 0.10 0.15 0.20
Incubar 3 min a 37 °C
NaOH 1 N 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
Leer en fotocolorímetro a 420 nm (filtro azul). Graficar velocidad frente a

concentración de enzima.
Tubo UK UK neta Ab [E]

B1
1 0.05
2 0.1
3 0.15
4 0.2

EXPERIMENTO N° 3. EFECTO DEL PH
Tubo N Bl 1 B2 2 B3 3
Buffer Acetato 0.1 M pH 3 1.0 1.0
p – Nitrofenilfosfato 1 x 102 M 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
Agua Destilada 0.8 0.7 0.8 0.7 0.8 0.7
Enzima 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
NaOH 1 N 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0

Leer en fotocolorímetro a 420 nm (filtro azul). Graficar velocidad frente a pH.
Tubo UK UK neta Ab pH
B1
1 3
2 5
3 8

EXPERIMENTO N° 4. EFECTO DE LA TEMPERATURA
Tubo N° Bl 1 B2 2 B3 3
Buffer Acetato 0.1 M pH 5 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
p – Nitrofenilfosfato 1 x 102 M 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
Agua Destilada 0.8 0.7 0.8 0.7 0.8 07
Enzima 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
Incubar 3 min (°C) 20 20 37 37 60 60
NaOH 1 N 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0

temperatura.
Tubo UK UK neta Ab T C
B1
1 20
2 37
3 60

EXPERIMENTO N° 5. EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO
Conc. Inicial de p-NO2ϕ-
1 x 10-2 M 1 x 10-3 M
P
5x10- 2x10-
Conc. Final de p-NO2ɸ-P 1x10-3 B 4 B 4 B 1x10-4 B 5x10-5 B
1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
Buffer Acetato 0.1 M pH
5 p-NO2o-P (ml de 0.2 0.2 0.1 0.1 0.4 0.1 0.2 0.2 0.1 0.1
solución) Agua Destilada
0.7 0.8 0.8 0.9 0.5 0.6 0.7 0.8 0.8 0.9
Enzima
0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
NaOH 1 N
3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0

concentración de sustrato y 1/velocidad frente a 1/concentración de sustrato.
Determinar los valores de Km y Vmax.

* Tome en cuenta que el coeficiente de extinción molar del p-Nitrofenol es 1.8 x
104 M-1 cm-1 *.
Blanc
UK T UK UK neta Ab [S] 1/[S] 1/v
o
B1 1
B2 2
B3 3
B4 4
B5 5

CUESTIONARIO
1. ¿Cuál es la reacción catalizada por la fosfatasa ácida?
2. Cuáles son las fuentes a partir de la cuales se puede obtener la enzima utilizada en
la práctica
3. Qué importancia tienen los valores de Km y Vmax de una enzima?

CAPÍTULO 8. CICLO DE KREBS
1. Introducción
Las transformaciones biológicas de sustratos comprenden procesos de oxido-
reducción y transferencia de electrones a través de una serie de sistemas
enzimáticos. En las oxido-reducciones se produce transferencia de electrones a
partir de un dador hasta un aceptor. Algunas veces el transporte de electrones es
realizado mediante la transferencia de átomos de hidrógeno o bien átomos de
hidrógeno y un electrón. las enzimas que realizan este tipo de reaccione son las
deshidrogenasas pudiendo ser piridin (NAD, NADH) o flavina (FAD) dependientes;
además existen los citocromos que son de naturaleza ferroporfirínica y se
encuentran ordenados de acuerdo a su potencial de oxido reducción constituyendo la
llamada "Cadena de Transporte Mitocondrial".
Algunos compuestos orgánicos coloreados, al aceptar hidrógenos se convierten en
leucoderivados. Tal es el caso del azul de metileno cuyo potencial de oxido-
reducción es +0.01 y el 2,6-diclorofenolindofenol cuyo potencial de oxido-
reducción es +0.22.
2. Estudio del succinato deshidrogenasa

El succinato deshidrogenasa (SHD) es una flavoproteína unida a hierro no hémico.
El metal tiene como finalidad actuar como enlace para conservación de energía y
desacoplar los dos equivalentes reductores del ion hidrogeno aceptado por la flavina
y, finalmente estabilizar la forma semiquinoide de la flavina. Diversas sustancias
pueden actuar inhibiendo los sistemas biológicos de oxido-reducción. Por ejemplo,
el malonato actúa especificamente inhibiendo al succinato deshidrogenasa por un
mecanismo competitivo; por lo tanto, la prueba experimental con azul de metileno
será negativa, es decir no se decolora por no haber movilización de electrones. El
cianuro, actúa impidiendo la reoxidación de los citocromos, pués se combina
específicamente con el Fe++ del citocromo oxidasa; por ello los ciocromos
permanecen reducidos e incapaces de seguir actuando y se bloquea la respiración.
Las enzimas que se utilizan pueden ser de dos tipos:
1) Oxidasas y deshidrogenasas aeróbicas
2) Deshidrogenasas anaeróbicas
Las oxidasas catalizan la eliminación de hidrógeno de un sutrato usando al oxígeno
como aceptor de hidrógeno. Forman agua o peróxido de hidrógeno como un
producto de la reacción. Las deshidrogenasas no entregan los electrones
directamente al oxígeno y requieren la participación de cofactores para transferir el
oxígeno. Los sustratos oxidables ceden sus electrones a cofactores que los
transportan hasta los citocromos de la cadena respiratoria mitocondrial, la cual está
constituída por una serie de enzimas que se protonan eslabonadamente de acuerdo a
sus potenciales de oxido-reducción hasta reducir al oxígeno, para formar agua.

Existen tres centros de formación de ATP en la cadena respiratoria mitocondrial
cuando los electrones provienen del NAD reducido, estos son:
- Paso de los electrones del NAD al FAD FMN
- Paso de los electrones del Cit.b al Cit.c
- Paso de los elctrones del Cit. oxidasa al O2
EXPERIMENTO N° 1. ESTUDIO DE LA ACCIÓN ENZIMÁTICA DEL

SUCCINATO DESHIDROGENASA
OBJETIVO
1. Poner de manifiesto experimentalmente una de las etapas del metabolismo
intermediario y la acción de las enzimas de oxido-reducción, haciendo uso de un
aceptor de electrones como el azul de metileno.
2. Verificar la acción inhibitoria del malonato sobre el succinato deshidrogenasa y del
cianuro a nivel de la cadena respiratoria mitocondrial.
MATERIAL
1. Reactivos: Sucrosa 0.25 M
Succinato de sodio 0.1 M
Malonato de sodio 0.5 M
Buffer fosfato pH 7.4 0.1 M
Azul de metileno 0.05%
Aceite mineral
Pipetas
Morteros

Centrífuga
METODO DE TRABAJO
A) PREPARACION DEL HOMOGENIZADO.- Colocar un mortero sobre hielo
picado, luego pesar 10.0 g. de hígado, corazón o músculo de rata o de conejo; picarlo y
colocarlo sobre el mortero. Añadir 90.0 ml de sucrosa 0.25 M la cual debe estar fría,
homogenizar y luego centrifugar a 8000 rpm durante 10 min. Decantar el sobrenadante
en un beaker y guardarlo en frío hasta su uso.
Tubo N° 1 2 3 4
Succinato de sodio 0.1 0.5 0.5 0.5

Buffer fosfato pH 7.4 2.0 2.0 2.0 2.0
Malonato de sodio 0.5
Cianuro de potasio 0.1 M 0.5
Agua destilada 1.5 1.0 0.5 0.5
Azul de metileno 0.05% 0.5 0.5 0.5 0.5
Extracto enzimático 0.5 0.5 0.5 0.5
Aceite mineral 1.0 1.0 1.0 1.0
El contenido de cada uno de los tubos se mezcla rápidamente antes de agregar el aceite
mineral, el cual tiene la función de crear un medio libre de oxígeno. Llevar a baño
maría a 37°C observar el decoloramiento de cada tubo cada 5 min. Discuta los
resultados.
CUESTIONARIO
1. Escriba la reacción de la oxidación del succinato por acción del succinato
deshidrogenasa, además acople la cadena respiratoria para indicar el destino final
del hidrógeno y de los electrones del succinato.
2. Cuál es el efecto de cada uno de los siguientes inhibidores sobre el transporte
electrónico y la formación de ATP en la cadena respiratoria.
a) Azida
b) Atractilósido
c) Rotenona
d) Monóxido de carbono
e) Antimicina A
3. Escriba tres reacciones químicas de oxido-reducción (diferente a las descritas) de
ocurrencia celular y donde se aprecie pérdida de hidrógenos por parte del sustrato.
4. Cuál es el aceptor final de electrones normal en las mitocondrias y cuál es el utilizado
en el experimento?

CAPÍTULO 9: FOTOSINTESIS
1. INTRODUCCIÓN
Es el proceso químico más importante de la biología. Incluye todos los procesos por los
que: a) la luz solar absorbida se utiliza para impulsar las biosíntesis; b) el CO 2 es
reducido hasta glucosa por las plantas verdes y; c) el agua es oxidada para liberar
oxígeno. Por esta razón, el fenómeno global de la fotosíntesis se representa por la
siguiente ecuación:
G°'= +118000 cal/mol de CO2 reducido
El agua es el donador de electrones que se emplea para reducir el CO 2 y el fenómeno

está acoplado al desprendimiento de oxígeno.
Este proceso se realiza en los cloroplastos, los cuales contiene los pigmentos que
absorben la luz y las enzimas necesarias. Los cloroplastos se asemejan a las
mitocondrias por poseer capas apiladas de membranas internas en las que las
transferencias de electrones se asocian con fosforilación; también tienen su propio
DNA y los sistemas para la síntesis de proteínas. Los cloroplastos elaboran glucosa y la
acumulan como almidón durante las horas de luz; las mitocondrias oxidan el piruvato
desde residuos de glucosa, especialmente durante la noche, para proporcionar energía a
la planta.
2.CENTROS DE REACCION
Para una eficaz absorción de la luz solar, los cloroplastos contienen los carotenos y las
clorofilas que tiene estructuras altamente resonantes. La energía de excitación pasa
desde un pigmento a otro hasta que llega a un centro de reacción, donde los complejos
de clorofila "a" se hallan asociados con otras proteínas necesarias para la utilización de
la energía. La clorofila "a" en el centro de reacción pierde la energía de excitación y es
oxidada por la transferencia de electrones hasta un aceptor.
FOTOFOSFORILACION CICLICA.
En los centros de reacción tipo I los electrones desplazados por fotooxidación son
transferidos de nuevo desde sus receptores hasta la clorofila oxidada. La transferencia
se da a través de varios transportadores a la vez que son utilizados para generar ATP.

En este mecanismo, los electrones desplazados por la luz absorbida son devueltos
continuamente a la clorofila original pero la recombinación ocurre por el aparato de
fosforilación oxidativa.
PRODUCCION DE OXIGENO
Los electrones necesarios para llevar la clorofila oxidada del PS I a su estado inicial,
también puden ser donados por el agua. Para que suceda esto, la luz es absorbida por el
PS II, en el que la clorofila oxidada después de la eliminación de un electrón
reaccionará con los iones hidroxilos del agua y liberará oxígeno. Los electrones
también se transfieren desde el PS II al PS I a través de parte del aparato de
fosforilación oxidativa, y en este caso se gebera por lo menos un ATP por cada par de
electrones transferidos.
REDUCCION DE FERREDOXINA
El uso del agua como donador de electrones permite a los electrones ser liberados del
sistema para otros fines, dejando atrás el oxígeno. El aceptor inmediato de los
electrones liberados por el PS I es un asustanci reductora de ferredoxina, la cual es
reducida por la SRF y es utilizada en las plantas verdes para reducir NADP hasta
NADPH.
REDUCCION DEL DIOXIDO DE CARBONO

La glucosa se elabora a partir de CO 2, utilizando el NADPH y el ATP producidos en
los porcesos fotoquímicos. El CO2 es fijado por la combinación co ribulosa-1,5-
difosfato, esta se escinde para formar dos moléculas de 3-fosfoglicerato, las cuales se
reducen con NADPH. La pentosa transportadora de CO 2 se regenera por una
reordenación de parte de las triosas fosfato obtenidas, y el remanente sirve para formar
glcosa-6-fosfato que será utilizada como combustible. La secuencia comppleta
costituye el Ciclo de Calvin, en el que el ATP se utiliza para regenerar ribulosa
difosfato y para formar 1,3-difosfoglicerato el que se reducirá a triosa fosfato por el
NADPH.
El funcionamineto del Ciclo de Calvin depende de la isomerización y epimerización de
las pentosas fosfato, a través de una reacción de transcetolasa en la que dos unidades de
carbono son transferidas vía tiamina pirofosfato desde un donador cetosa hasta un
donador aldosa.
RUTA DE HATCH-SLACK

Los cloroplastos están construidos de tal forma que la velocidad del Ciclo de Calvin
varía con la concentración de CO2 atmosférico. Una planta que disminuye su pérdida
de agua cerrando los estomas de las hojas, restringue también el suministro de CO 2,
excepto algunas plantas evolucionadas que sobreviven en condiciones secas y
calurosas, y utilizan el ATP para concentrar el CO2. La ruta de Hatch-Slack comprende
la corboxilación de piruvato hasta oxalcetato a expensas de ATP en un anillo externo
de las células mesofílicas, seguido de la reducción hasta malato por NADH. El malato
se difunde en el interior de un anillo de células de la vaina, donde es descarboxilado
oxidativamente por NADP para formar piruvato y una elevada concentración de CO 2
para el ciclo de Calvin.
ALTERACION DE LA ATMOSFERA
La fotosíntesis es responsable de la oxido-reducción, representada por la acumulación
de compuestos de carbonos reducidos en los sedimentos a expensas de carbonatos, y de
la acumulación de oxígeno en la atmósfera a expensas del agua. las alteraciones en el
equilibrio de CO2 y O2 actualmente se autocompensan, siendo el sistema tan masivo
que las alteraciones catastróficas debidas a la interferencia del hombre no son si no
perturbaciones sencillas en la estequiometría del sistema.
3. PARTE EXPERIMENTAL
EXPERIMENTO N° 1. AISLAMIENTO DE CLOROPLASTOS Y

FRAGMENTOS DE CLOROPLASTOS.
FUNDAMENTO
Los cloroplastos enteros y los cloroplastos desintegrados se preparan macerando
hojas u otro material vegetal en agua o solución hipertónica, los desechos celulares
groseros se remueven por filtración y los otros constituyentes protoplasmáticos por
centrifugación diferencial los procedimientos que se describen se basan en que los
cloroplastos intactos se obtienen utilizando solución hiortónica de sacarosa, en
cambio el uso de agua u otra solución hippotónica acompañada de trituración
vigorosa provocan la ruptura de los cloroplastos obteniéndose así los fragmentos de
cloroplastos.
Los métodos descritos son satisfactorios para preparar suspenciones de cloroplastos
a partir de hojas de espinaca, tabaco y algunas otras especies y también a partir de
algunas algas.
INSTRUCCIONES GENERALES
Todas las operaciones se deben realizar a 0°C o a temperaturas cercanas a 0°C
(4°C). Se debe lavar varias veces las hojas recientemte colectadas o almacenadas en
el frío. Se les deja escurrir y se les coloca en una bolsa plástica en un cuarto frío
durante unas horas hasta que las hojas se hinchen. Luego se remueven los peciolos y

las vervaduras y se secan las hojas entre papel filtro. Si se utilizan algas, estas deben
ser lavadas por filtración o centrifugación. Examine las suspenciones de clorolastos
bajo el microscópio (400 a 1000x) antes de usarlas.
MATERIAL
1. Aparatos: Centrífuga
Homogenizador de cuchillas
Tejido de nylon o gasa
Tubos de ensayo
Fiolas
2. Reactivos:
Sacarosa 0.5 M
Solución buffer fosfato de potasio (solución 0.1 M de KH2PO4 en sacarosa
ajustada a pH 6.5)
Medio de sucrosa (solución de EDTA en solución buffer fosfato 10 mM,
ajustada a pH 6.5)
METODO DE TRABAJO
1. CLOROPLASTOS ENTEROS A PARTIR DE HOJAS DE ESPINACA
En la licuadora homogenize 100 g. de hojas de espinaca bien lavadas con 100 ml.
de medio de sucrosa por no más de 3 min., poniendo al máximo de velocidad las
cuchillas del homogenizador. Filtrar el homogenizado verde a través de una doble
capa de tejido de nylon o gasa para remover las paredes celulares y fibras.
centrifugar el filtrato a 200 xg por 5 min, para remover las partículas extrañas y las
células intactas. desechar el precipitado.
El sobrenadante se centrifuga a 600 xg por 12 min para sedimentar los cloroplastos
intactos. Descartar el sobrenadante. El precipitado se resuspende con 20 ml de
sucrosa 0.5 M fría y se centrifuga de nuevo a 600 xg durante 12 min. Descartar el
sobrenadante. El sedimento así obtenido constituye los cloroplastos enteros.
Resuspenda los cloroplastos en 20 ml de sucrosa u otro medio hipertónico (medio
de reacción helado) agitándolo suavemente con una varilla de vidrio y
almacenándolo sobre hielo hasta cuando lo utilice.
2. AISLAMIENTO DE CLOROPLASTOS DESINTEGRADOS A PARTIR DE

HOJAS DE ESPINACA
Homogenizar 100 g. de hojas de espinaca en 100 ml de agua destilada a máxima
velocidad por 3 a 5 min. Filtra el homogenizado a través de una doble capa de

tejido de nylon o gasa. centrifugar el filtrado a 600 xg por 12 min y descarte el
sedimento. Centrifugar el sobrenadante a 15000 xg por 15 min. Descartar el
sobrenadante, suspenda el sedimento en agua, centrifugue y descarte el
sobrenadante. Resuspenda el precipitado el cual contiene los cloroplastos
desintegrados en agua u otra solución.
EXPERIMENTO N° 2. DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE
CLOROFILA.
FUNDAMENTO
La concentración de clorofila de una suspención de cloroplastos, de fragmentos de
cloroplastos o de algas intactas se puede determinar midiendo la densidad óptica en
un extracto de metanol o de acetona.
MATERIAL
1. Aparatos: Centrífuga
Tubos de ensayo
2. Reactivos: Metanol
Acetona al 80%
METODO DE TRABAJO
1. EXTRACTO CON METANOL
Centrifugue 1 ml de la suspención verde oscura por 20 min a 20000 xg por 20 min
y descrate el sobrenadante. Suspenda el sedimento en 5.0 ml de metanol absoluto a
la temperatura del laboratorio, centrifugue y decate el metanol sobrenadante.
Extracte el sedimento dos veces, y diluya hasta un volumen final de 20 ml con
metanol.
- MÉTODO DE WARBURG
Determine la densidad óptica del extracto de metanol a 578 nm en una cubeta de 1
cm.
Cálculo:
578
Densidad óptica a =mgde clorofila por ml
7.4
- MÉTODO DE MACKINNEY
Determine en una cubeta de 1 cm., la densidad óptica del extracto de metanol a 665

nm y a 650 nm, la absorción máxima para la clorofila "a" y para la clorofila "b".
Cálculo:
0.0338 x DO 650−0.0125 x DO 665=mg de clorofila b/ml
0.0165 x DO 665−0.0083 x DO 650=mg de clorofila a/ml
--------------------------------------------------------------------------------
0.0225 x DO 650+ 0.0040 x DO 665=mgde clorofila total
Nota: 1 mg de clorofila/ ml = 1.11 x 10-3 M.
Método de
Método de Warburg
Mackinney
D.O. 578
D.O. 660
D.O. 665
Realice los cálculos necesarios para determinar los mg de clorofila por ml.
2. EXTRACTO CON ACETONA. Agregue 1 ml de la suspención de cloroplastos a

10 ml de acetona al 80% v/v en agua, mezcle fuertemente. Filtre a través de papel
Whatman N° 1 y recoja en un matraz volumétrico de 25 ml. enjuague los tubos con 5
ml de la solución acuoda de acetona usándola luego para lavar el papel filtro. Repita el
lavado una vez más y completa hasta la marca de 25 ml con acetona al 80% v/v. Mida
la extinción de la solución verde a 652 nm contra un blanco de solvente.
Cálculo:
mg de clorofila /ml=DO 652 nm x 5.8
D.O. 652
Bl
Muestra
Calcule los miligramos de clorofila/ml en la(s) muestra(s).
Porque es importante calcular los miligramos de clorofila?

EXPERIMENTO N° 3. REACCION DE HILL
FUNDAMENTO
La síntesis de carbohidratos a partir de CO2 y agua se da en dos etapas, reacción
luminosa y reacción oscura. La reacción luminosa que se demuestra en este
experimento se efectúa solo en presencia de luz visible, que es absorbida por la
clorofila de los cloroplastos. Los electrones de la clorofila son llevados a niveles
más altos de energía y retornan al estado inicial por una serie de reacciones
semejantes a las de la cadena respiratoria mitocondrial. Durante este proceso de
transporte de electrones se produce ATP. Al mismo tiempo se producen euivalentes
reductores en forma de NADPH2 y se libera O2.
La fotólisis del agua o "Reacción de Hill" se define como una reacción de oxido-
reducción dependiente de luz, catalizada por cloroplastos, fragmentos de
cloroplastos, o en algunos casos, células vegetales intactas, en la que el agua es el
donador de hidrógeno, se produce oxígeno, y alguna otra sustancia. El CO 2 (reactivo
oxidante de Hill es el aceptor de hidrógenos. La reacción lleva el nombre de Robert
Hill, quien fue el primero en observar la reducción del oxalato férrico por
cloroplastos iluminados (aislados). La reacción de Hill se puede estudiar: a)
siguiendo la evolución dle oxígeno, b) por el cambio de la concentración del ion
hidrógeno, c) por el cambio del potencial de oxido-reducción; y d) por la redución
de un oxidante.
En este experimento usamos el 2,6-diclorofenolindofenol como un acepor artificial
de hidrógenos. La reducción del colorante no se efectúa en la oscurida. Tampoco se
aprecia reducción cuando se usa cloroplastos hervidos.
La lenta oxidación expontánea del 2,6-diclorofenolindofenol permite usar una
cubeta abierta (de 1 cm. de trayectora de luz y de 5 a 10 ml de capacidad), como un
vaso de reacción o un tubo de ensayo. Sobre la cubeta se enfoca un rayo d eluz que
proviene de un foco de 100 watt. La cubeta de reacción, a su vez está sumergida e
un baño de agua a temperatura constante.
MATERIAL
1. Aparatos: Fotocolorímetro
Tubos de ensayo
Cubetas de vidrio

Focos de 100 watt
2. Reactivos:
Mezcla de reacción (buffer fosfato de potasio 0.02 M pH 6.5, que contiene KCl
0.05%)
2,6-diclorofenolindofenol 0.1 M
Acido Ascórbico
Preparación de cloroplastos: diluya los cloroplastos enteros o fragmentados con
la mezcla de reacción hasta obtener una concentración de clorofila de
aproximadamente 5 mg/ml.
METODO DE TRABAJO
Mezcle 1.0 ml de suspención verdosa de cloroplastos con 4.0 ml de la solución de
2,6-diclorofenolidofenol. Prepare cuatro tubos de la misma forma. Coloque el
primer tubo en la oscuridad durante el experimento. Al segundo tubo añada
suficiente ácido ascórbico para reducir completamete el colorante y lea
inmediatamente la extinción a 520 nm; esta solución reducida nos da una lectura
cero en el instrumento. Lea la extinción del tercer tubo (lectura inicial) frente al al
segundo tubo. Introduzca el cuarto tubo (tubo experimental) en el baño de
temperatura constante y dejar 5 min en la oscuridad para que se establezca el
equilibrio térmico. Para poner en marcha la reacción, se retorna el aparato a la luz
(frente al foco de 100 watt). Siga la reducción del colorante midiendo la extinción
de las muestras retiradas a intervalos convenientes hasta un tiempo de 30 min. Al
final del experimento, lea la extinción del tubo que guardó en la oscuridad.
La diferencia entre la lectura inicial y la lectura cero es proporcional al cambio de la
DO cuando todo el colorante está reducido. Puesto que se conoce la concentración
del colorante, calcule el número de microoles de colorante reducido.
Con los valores de densidad óptica obtenidos durante los 30 min de
experimentación, haga una gráfica colocando los datos de densidad ótica en el eje
vertical y el tiempo en minutos en el eje horizontal.

CUESTIONARIO
1. En la fosforilación cíclica, se calcula que deben pasar dos electrones por el ciclo
para bombardear los protones suficientes para generar un ATP. Suponiendo que el
G para la hidrólisis del ATP en las condiciones que se dan en el cloroplasto sea de
aproximadamente –50 kJ/mol, ¿cuál es el porcentaje de eficiencia de la
fotofosforilación cíclica, utilizando luz de 700 nm?.
2. El flujo de la energía solar que llega a la superficie de la tierra es de

aproximadamente 7 kJ/cm2s. Supóngase que toda esta energía fuera utilizada por
una hoja verde (10 cm2 de superficie), con la eficiencia máxima del 35%. ¿Cuántos
moles de hexosa podría generar teóricamente la hoja en una hora?. Puede utilizar
600 nm como longitud de honda media.
3. Supóngase que un investigador esta realizando estudios en los que añade un donador
electrónico no fisiológico (2,6-diclorofenolindofenol) a una suspensión de
cloroplastos. La iluminación de los cloroplastos produce la oxidación del donador.
¿Cómo podrá determinar si interviene en ello el fotosistema I, el fotosistema II o
ambos?.

4. Los siguientes datos, describen la cinética de la incorporación de CO2 por la enzima
rubisco en presencia de N2 y con O2 puro. Determine si el O2 es un inhibor
competitivo o no competitivo.
Con N2 Con O2
[CO2] (mM)
0.20 16.7 10
0.10 12.5 5.6
0.067 8.3 4.2
0.050 7.1 3.2

CAPÍTULO 10. EXTRACCION E
IDENTIFICACION DE DNA
1. Introducción
La Biología Molecular contemporánea se centra en: 1) como la información está
ordenada en el cromosoma, 2) como se procesa la información, 3) como se
reproducen a sí mismas la información cada vez que la célula se divide, y 4) como
puede modificarse la información para generar nuevas instrucciones. La regulación
y el control de cada una de estas transacciones de información constituyen otro
aspecto de la biología molecular, disciplina que nos permite conocer la vida al
facilitarnos la comprensión de las funciones que desempeñan las macromoléculas.
Hoy se sabe que una sola molécula, el DNA, puede explicar en su totalidad los
fenómenos de codificación, procesamiento, replicación y modificación de la
información. El DNA por lo tanto es el responsable de la transmisión de la
información de una generación a otra para conservar la continuidad genética entre
progenitores y descendientes
Uno de los procedimientos básicos en la biología molecular es la extracción y
purificación de moléculas de ácidos nucleicos (DNA o RNA), como primer paso a
posteriores análisis.
Son varios los métodos utilizados para la extracción de DNA, todos ellos por lo
general tienen el mismo principio, es decir, empiezan con una lisis celular, seguido
por una remoción de proteínas y por último la obtención del DNA de alta pureza por
precipitación etanólica.
Entre las técnicas más comunes de extracción de DNA, se considera:
- Hervir la muestra en agua destilada
- Acción de detergentes
- Acción de NaOH
- Acción de enzimas proteolíticas
- Uso de solventes orgánicos
- Sonicación
- Congelamiento y descongelamiento
Después de la extracción y purificación del DNA, el paso siguiente es la

cuantificación del DNA. Esta cuantificación es importante para posteriores análisis
como PCR, secuenciación hibridación, etc. Tres son los métodos más utilizados para

la cuantificación, los cuales se diferencian en la precisión, así como en la cantidad
de muestra requerida. Dichos métodos son:
- Espectrofotometría
- Fluorometría
- Fluorescencia en Bromuro de Etidio
Otros métodos sólo nos determinan la presencia de bases nitrogenadas

(espectrofotometría), la identificación de desoxirribosas y la identificación de
grupos fosfato.
EXPERIMENTO N° 1. PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE DNA DE
CEBOLLA
MATERIALES
1. Solución de lisis: preparar una solución 0.1% de SDS en EDTA 25 mmol de pH
8.0
1. Alcohol etílico al 95%
2. Reactivo de difenilamina: disolver 1 g de difenilamina en 100 ml de ácido
acético glacial y adicionar 2.75 ml de ácido sulfúrico concentrado.
Beakers
Probetas
Baguetas
Media de nylon
Método de Trabajo
1. Pelar una cebolla de tamaño medio.
2. Rallar la cebolla con un rallador de cocina o utilizar un procesador de
alimentos. Es importante que no haya pedazos grandes de cebolla.
3. Pesar unos 25 g de cebolla rallada y añadir 50 ml de solución de lisis.
4. Dejar en reposo la mezcla a temperatrura ambiente por 10 a 20 minutos.
5. Filtrar la supensión a través de una doble capa de tela de nylon, recogiendo el
filtrado en una probeta. Anotar el volumen.
6. Transferir 4 ml del filtrado y colocar en un tubo de ensayo. Adicionar 2
volúmenes de etanol al 95% procurando no mezclar las dos soluciones. Observar
en la interfase la formación de un precipitado blanquesino. Con la ayuda de una

varilla de vidrio enrrollar el material blanquesino.
7. Transferir el material de la varilla de vidrio a otro tubo y disolverlo en 0.5 ml de
agua. A esta solución adicionarle 1.5 ml de reactivo de difenilamina.
8. En otro tubo de ensayo colocar 0.5 ml de agua y 1.5 ml de difenilamina.
Colocar los dos tubos en baño de agua hirviente por 10 minutos. Comparar los
resultados obtenidos.
9. El filtrado restante (item 4) debe ser transferido a un vaso de precipitados y a
esta solución se le adiciona 2 volumenes de etanol al 95%. El material blanquesino
que se forma en la interfase de las dos soluciones se enrolla en una varilla de vidrio
y se tranfiere a otro tubo de ensayo
10. Disolver el precipitado en 5 ml de agua con ayuda de una varilla de vidrio.
Dividir esta solución en dos tubos para observar los cambios d viscosidad en
diferentes condiciones.
11. Pipetear la solución de uno de los dos tubos con una pipeta gradiada de 0.2 ml y
cronometrar el tiempo de deslizamiento de la solución a partir de la marca 0 ml
hasta la marca 0.15 ml.
12. El otro tubo debe ser calentado en baño maria hirviente por 10 minutos.
Después del periodo de calentamiento, proceder como en el item 10 anotando en
tiempo de deslizamiento.
13. Enfriar esta solución en hielo por 15 minutos y repetir el procedimiento 10.
14. Interpretar los resultados.
CUESTIONARIO
1. Cuál es la función de los componentes de la solución de lisis?
2. A qué se debe la diferencia de viscosidad del DNA observada en los experimentos?
3. Para la extracción de DNA se puede utilizar proteinasas? Si su respuesta es

afirmativa, explique a que componente podría reemplazar o en que paso sería
apropiada utilizarla durante la extracción de DNA.
4. Averigue como se realiza una prueba de paternidad utilizando ADN.

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FUNDAMENTOS TEÓRICOS Y

JOSE ANTONIO VALERIANO ZAPANA

Fundamentos teóricos y prácticos en Bioquímica Ambiental 2

Fundamentos teóricos y prácticos en Bioquímica Ambiental 3

Fundamentos teóricos y prácticos en Bioquímica Ambiental 4

 Que el experimento ilustrara un principio fundamental teórico para relacionar con

Fundamentos teóricos y prácticos en Bioquímica Ambiental 5

Fundamentos teóricos y prácticos en Bioquímica Ambiental 6

Fundamentos teóricos y prácticos en Bioquímica Ambiental 7

1. MEDIDAS GENERALES EN CASO DE ACCIDENTE

Fundamentos teóricos y prácticos en Bioquímica Ambiental 8

2.3 FUEGO EN EL LABORATORIO:

Fundamentos teóricos y prácticos en Bioquímica Ambiental 9

Fundamentos teóricos y prácticos en Bioquímica Ambiental 10

2. Ley de acción de masas y equilibrio químico

Fundamentos teóricos y prácticos en Bioquímica Ambiental 11

Introduciendo una constante de proporcionalidad (k1) que mida la afinidad química

Para la reacción de vuelta, en forma análoga, se tendrá:

donde k2 es la constante de proporcionalidad que mide la afinidad química de la

lo que también puede escribirse así:

Fundamentos teóricos y prácticos en Bioquímica Ambiental 12

El concepto de BRÖNSTED es idéntico al concepto clásico en lo que se refiere a

Fundamentos teóricos y prácticos en Bioquímica Ambiental 13

3.2. Fuerza de ácidos y bases

Ácido clorhídrico HCl H+ + Cl-

Fundamentos teóricos y prácticos en Bioquímica Ambiental 14

Acido fórmico HCOOH H+ + HCOO-

4. Concentración de iones hidrogeno y pH

Fundamentos teóricos y prácticos en Bioquímica Ambiental 15

Ejm. La concentración de hidrogeniones del plasma es 0.0000000398 N. Esta

pH = -log 10 [ 398 x 10 -10 ]

4.2. DISOCIACION DEL AGUA

Fundamentos teóricos y prácticos en Bioquímica Ambiental 16

2H2O H3O+ + OH-

Fundamentos teóricos y prácticos en Bioquímica Ambiental 17

En el agua pura [ H + ] =[ OH - ] puesto que al disociarse el agua produce iguales

Kw=[H + ][OH-] = 10 -7 x 10 -7 = 10 -14

Para evitar dificultades en el uso de números decimales, aplicando los logaritmos

-log 10 -14 = (-log [H + ]) + (-log[OH - ])

donde se observa que el producto de la igualdad se convierte en una suma y así, al

En conclusión, la suma de los logaritmos negativos de las concentraciones de iones

Fundamentos teóricos y prácticos en Bioquímica Ambiental 18

Tabla N° 2. Producto iónico del agua Y pH de neutralidad a diferentes temperaturas.

El pH puede determinarse por mediciones catalíticas, espectrofotométricas, de la

Fundamentos teóricos y prácticos en Bioquímica Ambiental 19

y según la ley de acción de masas:

Si usamos la ecuación de Henderson-Hasselbalch, como para cualquier ácido débil:

Cada indicador tiene su constante de disociación Kin y su (-logKin) pKin. Cuando el

Fundamentos teóricos y prácticos en Bioquímica Ambiental 20

5.1.2. Errores del Método Colorimétrico

Fundamentos teóricos y prácticos en Bioquímica Ambiental 21

Fundamentos teóricos y prácticos en Bioquímica Ambiental 22

Tabla N° 5. Coloración de los indicadores universales I Y II

5.2. METODO POTENCIOMETRICO

Fundamentos teóricos y prácticos en Bioquímica Ambiental 23

5.2.1. Electrodo de Vidrio

Ag.AgCl HCl(0.1 mol/l) Membrana Solución

Electrodo de vidrio Electrodo de referencia de Calomel

Fundamentos teóricos y prácticos en Bioquímica Ambiental 24

La respuesta del electrodo de vidrio debe calibrarse frente a soluciones

Tabla N° 6. Soluciones de pH conocido para la calibración de un medidor de pH

5.2.2. Cuidados del Electrodo de Vidrio

Fundamentos teóricos y prácticos en Bioquímica Ambiental 25

6. pH de ácidos, bases y soluciones salinas