Ecología microbiana del suelo: grupos funcionales y simbiosis microorganismo-planta

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA
ECOLOGÍA MICROBIANA DEL SUELO

COMPENDIO PRÁCTICO
MARIA WDÉS
NORA MEDINA JARITZ
Estilo y sintaxis:
GABRIELA SUSANA HERNÁNDEZ SÁNCHEZ
INDICE
TEMA Pág.
Prólogo ii
Objetivos del curso iii
Normas de Laboratorio iv
Introducción vi
UNIDAD I. El hábitat de los microorganismos del Suelo
Textura 1
Humedad relativa y capacidad de retención de agua 5
pH 9
Materia orgánica 12
Capacidad de intercambio iónico 16
UNIDAD 11. Grupos funcionales microbianos 19
Paisaje microbiano del suelo 21
Fijación asimbiótica de nitrógeno 25
Mineralización del nitrógeno orgánico 30
Solubilización del fósforo insoluble 33
Oxidación de azufre reducido 36
UNIDAD Ill. Interacción microorganismo-planta
Producción de auxinas por Azospirillum asociado a una planta Gramínea 39
Simbiosis Rhizobium y Bradyrhizobium con plantas Leguminosas 42
Simbiosis Frankia-Plantas Actinorrízicas 46
Simbiosis de las plantas con bongos Ectomicorrízicos 49
Simbiosis de las plantas con bongos Micorrízico-Arbusculares 53
AP ÉNDICE 59
PRÓLOGO
El presente Compendio está dirigido a los estudiantes del curso de Ecología Microbiana del
Suelo de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional. Sin
embargo, el deseo de las autoras es que esta obra pueda ser también de utilidad para aquellos
interesados en el estudio de las poblaciones microbianas del suelo y su interacción benéfica con
las plantas.
Esta edición se elaboró con la idea de incorporar prácticas clásicas, que ilustran la relación
microorganismo-suelo y microorganismo-planta, así como otras prácticas con temas
actualizados.
Además de los anteriores, los propósitos con los que este Manual de Laboratorio ha sido
elaborado son:
- Familiarizar al estudiante con técnicas básicas de estudio de microorganismos del suelo que
juegan papeles importantes en la nutrición de las plantas.
- Familiarizar al alumno con técnicas que utilizan microorganismos que representan el uso en
dosis bajas, no contaminantes, de fertilizantes nitrogenados y fosforados en la producción de
las plantas.
- Capacitar al estudiante, a través de la experimentación con las mismas técnicas, para

comprender el fenómeno microbiológico dentro del ecosistema suelo-vegetación.
Algunas de las diferentes técnicas y métodos aquí expuestos han sido adaptados de varios
autores y son aplicables en diferentes condiciones de laboratorio. Todas ellas se han
seleccionado también por su bajo costo.
El Compendio está dividido en cuatro grandes partes:
En la primera se presentan las técnicas para el estudio de algunas características físicas y

químicas del suelo. Esta parte es de fundamental interés para el estudiante que por primera vez
incurre en las ciencias del suelo, pues le permitirá ubicar el fenómeno microbiológico y hacer
una mejor interpretación del mismo.
La segunda parte se refiere a las poblaciones microbianas del suelo en su conjunto y a la

valoración de su actividad biológica en los ciclos del N, P y S .
11
En la tercera parte se presenta el capítulo de las diferentes relaciones simbióticas
microorganismo-planta, incluyendo la asociación con microorganismos productores de
auxmas.
Finalmente, se presenta un apéndice con las fórmulas de los medios de cultivo que se emplean
y las tablas para el conteo de microorganismos del suelo, utilizando diluciones del mismo.
OBJETIVOS GENERALES DEL CURSO
El estudiante, como resultado de este curso:
- Aprenderá a integrar los conocimientos adquiridos en otros cursos, como

fisicoquímica, química, bioquímica, microbiología, fisiología vegetal, ecología
microbiana, genética microbiana, etc., en el estudio del suelo.
- Podrá demostrar la actividad de los principales grupos microbianos responsables de

'
una función definida en el suelo, relacionada con la nutrición y/o salud de las plantas .
- Valorará la acción de los microorganismos del suelo como una alternativa al uso
indiscriminado y contaminante de fertilizantes químicos.
111
NORMAS DE LABORATORIO
En primer término, es necesario recordar que una regla básica para todo laboratorio de
Microbiología es el estado sanitario del mismo. El estudiante debe cooperar para mantener
limpio el laboratorio. Practique la siguiente disciplina microbiológica:
•
El uso de la bata dentro del laboratorio es obligatorio, ésta le protegerá a usted y a su
ropa en caso de accidente o al manejar colorantes, ácidos y álcalis. Por favor
manténgala abotonada.
•
En relación con la organización del trabajo de laboratorio, lea cuidadosamente las
instrucciones de cada práctica antes de cada sesión. Ponga mucha atención en las
indicaciones que ofrezca el instructor, ya que éste pondrá especial énfasis en lo más
relevante de la práctica.
•
El área de trabaj o debe conservarse limpia y libre de ropa, así como de libros que no se
utilicen. Desinfecte su mesa antes y después de llevar a cabo su ensayo. La ropa y
objetos personales deben gu ardarse en las gavetas o áreas especificadas por el
instructor.
•
Lave sus manos antes y después de cada sesión de laboratorio.
•
Queda estrictamente prohibido comer, beber y fumar dentro del laboratorio.
•
Dado que en este laboratorio, durante la primera etapa se trabaja con muestras de suelo,
es necesario un manejo adecuado del mismo. No lo derrame en las mesas de trabajo
ni en el piso del laboratorio, no mezcle diferentes muestras de suelo, j amás retorne el
suelo sobrante al frasco de donde fue tomado; el destino del suelo que ya no será
utilizado se le indicará al inicio de la práctica.
•
En este laboratorio está prohibido "pipetear" con la boca. Para ello utilice una perilla
o una propipeta, el uso de ésta última es lo más adecuado y preciso.
•
Cuando maneje colorantes para tinciones, antes de verterlos en la tarja, deje fluir agua
para evitar que éstos se impregnen en la misma.
lV
•
Una vez concluido el trabaj o con los microscopios, limpie la platina con un paño y el
sistema óptico con papel seda. Si utilizó aceite de inmersión no olvide removerlo con
papel seda. Una vez limpio el microscopio colóquelo en la gaveta correspondiente.
•
Durante la sesión, deberá mantener apagado su teléfono celular y/o radiolocalizador,
para no interrumpir el trabajo de sus compañeros.
Riesgos y precauciones
•
Evite contacto directo con los colorantes vitales. Recuerde que todos los colorantes
vitales pueden ser cancerígenos, por lo que es conveniente usar guantes para su
manejo.
•
Cuando trabaje con el rosa de bengala fenólico, manéj elo dentro de la campana de
extracción de humos. Recuerde que el fenol es una sustancia altamente tóxica,
corrosiva y cancerígena.
• Cuando manej e el KCN, evite estar en contacto directo con la solución. Este reactivo es
extremadamente venenoso.
•
En algunas prácticas se trabaja con reactivos qmm1cos que son corrosivos como el
H2S04 concentrado, NaOH y HCl al 1 0 %, etc., por lo que es necesario que trabaj e con
toda la precaución posible. En caso de accidente lávese abundantemente con agua
corriente, si se trata de H2S04 concentrado, aplicar directamente bicarbonato.
V
INTRODUCCIÓN
La Ecología Microbiana del Suelo es una disciplina que tiene como propósito el estudio de las
interacciones que existen entre las comunidades microbianas y el ecosistema suelo-vegetación del que
ellas forman parte, a saber:
a) Interacciones entre las comunidades microbianas y el suelo.
b) Interacciones entre las comunidades microbianas y la vegetación.
c) Interacciones al interior de las comunidades microbianas.
Un ecosistema es la unidad limitada en el espacio, constituida por el conjunto de seres vivos que ahí se
encuentran y el conjunto de condiciones fisicoquímicas que se presentan alrededor de los seres vivos. A
estas condiciones se les conoce como medio ambiente.
La Ecología Microbiana del Suelo es una disciplina que describe el número, actividad e interacciones de
los microorganismos presentes en el suelo, así como la forma en que son influenciados por el medio
ambiente.
Las comunidades microbianas del suelo llevan a cabo el reciclaje de los compuestos que integran la
materia orgánica, entre ellos los carbonados , nitrogenados y fosforados. Algunos otros
microorganismos pueden ocasionar enfermedades a las plantas; y otros más podrán transformar
compuestos contaminantes presentes en el suelo. Además, en este hábitat podemos encontrar una gran
cantidad de microorganismos desconocidos, debido a que no ha sido posible cultivarlos.
Una de las razones por las que es importante el estudio de los fenómenos microbiológicos del suelo es
la de conocer los mecanismos de productividad del mismo, más aún en núestro país, donde es urgente
un cambio en las prácticas agrícolas y silvícolas, por prácticas que conduzcan de una manera racional y
económica a la sustentabilidad de la producción de alimentos y madera, y a la conservación o
rehabilitación del medio ambiente.
En el marco de las interacciones de los microorganismos y los componentes del ecosistema suelo
vegetación, en este manual se contempla la adquisición de nociones básicas sobre el tema suelo, como
base para los estudios de las actividades biológicas de las poblaciones microbianas y las interacciones
entre éstas y el medio suelo-vegetación, así como la forma en la que participan en los diferentes ciclos
biogeoquímicos.
Vl
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS;
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA .
ECOLOGÍA MICROBIANA DEL SUELO

COMPENDIO PRÁCTICO
INDICE
TEMA Pág.
Prólogo ii
Objetivos del curso iii
Narmas de Laboratorio iv
Introducción vi
UNIDAD I. El hábitat de los microorganismos del Suelo
Textura 1
Humedad relativa y capacidad de retención de agua 5
pH 9
Materia orgánica 12
Capacidad de intercambio iónico 16
UNIDAD 11. Grupos funcionales microbianos 19
Paisaje microbiano del suelo 21
Fijación asimbiótica de nitrógeno 25
Mineralización del nitrógeno orgánico 30
Solubilización del fósforo insoluble 33
Oxidación de azufre reducido 36
UNIDAD llI. Interacción microorganismo-planta
Producción de auxinas por Azospirillum asociado a una planta Gramínea 39
Simbiosis Rhizobium y Bradyrhizobium con plantas Leguminosas 42
Simbiosis Frankia-Plantas Actinorrízicas 46
Simbiosis de las plantas con hongos Ectornicorrízicos 49
Simbiosis de las plantas con hongos Micorrízico-Arbusculares 53
AP É NDICE 59
PRÓLOGO
El presente Compendio está dirigido a los estudiantes del curso de Ecología Microbiana del
Suelo de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del Instituto Politécnico Nacional. Sin
embargo, el deseo de las autoras es que esta obra pueda ser también de utilidad para aquellos
interesados en el estudio de las poblaciones microbianas del suelo y su interacción benéfica con
las plantas.
Esta edición se elaboró con la idea de incorporar prácticas clásicas, que ilustran la relación
microorganismo-suelo y microorganismo-planta, así como otras prácticas con temas
actualizados.
Además de los anteriores, los propósitos con los que este Manual de Laboratorio ha sido
elaborado son:
- Familiarizar al estudiante con técnicas básicas de estudio de microorganismos del suelo que
juegan papeles importantes en la nutrición de las plantas.
- Familiarizar al alumno con técnicas que utilizan microorganismos que representan el uso en
dosis baj as, no contaminantes, de fertilizantes nitrogenados y fosforados en la producción de
las plantas.
- Capacitar al estudiante, a través de la experimentación con las mismas técnicas, para

comprender el fenómeno microbiológico dentro del ecosistema suelo-vegetación.
Algunas de las diferentes técnicas y métodos aquí expuestos han sido adaptados de varios
autores y son aplicables en diferentes condiciones de laboratorio. Todas ellas se han
seleccionado también por su bajo costo.
El Compendio está dividido en cuatro grandes partes:
En la primera se presentan las técnicas para el estudio de algunas características físicas y

químicas del suelo. Esta parte es de fundamental interés para el estudiante que por primera vez
incurre en las ciencias del suelo, pues le permitirá ubicar el fenómeno microbiológico y hacer
una mejor interpretación del mismo.
La segunda parte se refiere a las poblaciones microbianas del suelo en su conjunto y a la

valoración de su actividad biológica en los ciclos del N, P y S .
11
En la tercera parte se presenta el capítulo de las diferentes relaciones simbióticas
microorganismo-planta, incluyendo la asociación con microorganismos productores de
auxmas.
Finalmente, se presenta un apéndice con las fórmulas de los medios de cultivo que se emplean
y las tablas para el conteo de microorganismos del suelo, utilizando diluciones del mismo.
OBJETIVOS GENERALES DEL CURSO
El estudiante, como resultado de este curso:
- Aprenderá a integrar los conocimientos adquiridos en otros cursos, como

fisicoquímica, química, bioquímica, microbiología, fisiología vegetal, ecología
microbiana, genética microbiana, etc., en el estudio del suelo.
- Podrá demostrar la actividad de los principales grupos microbianos responsables de

una función definida en el suelo, relacionada con la nutrición y/o salud de las plantas.
- Valorará la acción de los microorganismos del suelo como una alternativa al uso
indiscriminado y contaminante de fertilizantes químicos.
lll
NORMAS DE LABORATORIO
En primer término, es necesario recordar que una regla básica para todo laboratorio de
Microbiología es el estado sanitario del mismo. El estudiante debe cooperar para mantener
limpio el laboratorio . Practique la siguiente disciplina microbiológica:
•
El uso de la bata dentro del laboratorio es obligatorio, ésta le protegerá a usted y a su
ropa en caso de accidente o al manejar colorantes, ácidos y álcalis. Por favor
manténgala abotonada.
•
En relación con la organización del trabajo de laboratorio, lea cuidadosamente las
instrucciones de cada práctica antes de cada sesión. Ponga mucha atención en las
indicaciones que ofrezca el instructor, ya que éste pondrá especial énfasis en lo más
relevante de la práctica.
•
El área de trabajo debe conservarse limpia y libre de ropa, así como de libros que no se
utilicen. Desinfecte su mesa antes y después de llevar a cabo su ensayo. La ropa y
objetos personales deben guardarse en las gavetas o áreas especificadas por el
instructor.
•
Lave sus manos antes y después de cada sesión de laboratorio .
•
Queda estrictamente prohibido comer, beber y fumar dentro del laboratorio .
•
Dado que en este laboratorio, durante la primera etapa se trabaja con muestras de suelo,
es necesario un manejo adecuado del mismo. No lo derrame en las mesas de trabaj o
ni en el piso del laboratorio, no mezcle diferentes muestras de suelo, j amás retorne el
suelo sobrante al frasco de donde fue tomado; el destino del suelo que ya no será
utilizado se le indicará al inicio de la práctica.
• En este laboratorio está prohibido "pipetear" con la boca. Para ello utilice una perilla
o una propipeta, el uso de ésta última es lo más adecuado y preciso.
• Cuando maneje colorantes para tinciones, antes de verterlos en la tarja, deje fluir agua
para evitar que éstos se impregnen en la misma.
lV
•
Una vez concluido el trabajo con los microscopios, limpie la platina con un paño y el
sistema óptico con papel seda. Si utilizó aceite de inmersión no olvide removerlo con
p apel seda. Una vez limpio el microscopio colóquelo en la gaveta correspondiente.
•
Durante la sesión, deberá mantener apagado su teléfono celular y/o radiolocalizador,
para no interrumpir el trabaj o de sus compañeros.
Riesgos y precauciones
•
Evite contacto directo con los colorantes vitales. Recuerde que todos los colorantes
vitales pueden ser cancerígenos, por lo que es conveniente usar guantes para su
manejo.
•
Cuando trabaje con el rosa de bengala fenólico, manéjelo dentro de la campana de
extracción de humos. Recuerde que el fenol es una sustancia altamente tóxica,
corrosiva y cancerígena.
•
Cuando manej e el KCN, evite estar en contacto directo con la solución. Este reactivo es
extremadamente venenoso.
•
En algunas prácticas se trabaja con reactivos qmm1cos que son corrosivos como el
H2S04 concentrado, NaOH y HCl al 1 0 %, etc., por lo que es necesario que trabaje con
toda la precaución posible. En caso de accidente lávese abundantemente con agua
corriente, si se trata de H2S04 concentrado, aplicar directamente bicarbonato.
V
INTRODUCCIÓN
La Ecología Microbiana del Suelo es una disciplina que tiene como propósito el estudio de las
interacciones que existen entre las comunidades microbianas y el ecosistema suelo-vegetación del que
ellas forman parte, a saber:
a) Interacciones entre las comunidades microbianas y el suelo.
b) Interacciones entre las comunidades microbianas y la vegetación.
c) Interacciones al interior de las comunidades microbianas.
Un ecosistema es la unidad limitada en el espacio, constituida por el conjunto de seres vivos que ahí se
encuentran y el conjunto de condiciones fisicoquímicas que se presentan alrededor de los seres vivos. A
estas condiciones se les conoce como medio ambiente.
La Ecología Microbiana del Suelo es una disciplina que describe el número, actividad e interacciones de
los microorganismos presentes en el suelo, así como la forma en que son influenciados por el medio
ambiente.
Las comunidades microbianas del suelo llevan a cabo el reciclaje de los compuestos que integran la
materia orgánica, entre ellos los carbonados , nitrogenados y fosforados. Algunos otros
microorganismos pueden ocasionar enfermedades a las plantas; y otros más podrán transformar
compuestos contaminantes presentes en el suelo. Además, en este hábitat podemos encontrar una gran
cantidad de microorganismos desconocidos, debido a que no ha sido posible cultivarlos.
Una de las razones por las que es importante el estudio de los fenómenos microbiológicos del suelo es
la de conocer los mecanismos de productividad del mismo, más aún en nuestro país, donde es urgente
un cambio en las prácticas agrícolas y silvícolas, por prácticas que conduzcan de una manera racional y
económica a la sustentabilidad de la producción de alimentos y madera, y a la conservación o
rehabilitación del medio ambiente.
En el marco de las interacciones de los microorganismos y los componentes del ecosistema suelo
vegetación, en este manual se contempla la adquisición de nociones básicas sobre el tema suelo, como
base para los estudios de las actividades biológicas de las poblaciones microbianas y las interacciones
entre éstas y el medio suelo-vegetación, así como la forma en la que participan en los diferentes ciclos
biogeoquímicos.
Vl
UNIDAD I. EL HÁBITAT DE LOS MICROORGANISMOS DEL SUELO
PRÁ CTICA 1.- TEXTURA
INTRODUCCIÓN
El término suelo se refiere al material exterior, poco compacto, de la superficie terrestre; uno
de sus componentes principales es la fracción mineral, ésta proviene del material parental y es
el producto de la desintegración de las rocas provocado por el intemperismo físico, químico y
bioquímico.
La fracción mineral del suelo está constituida por partículas de diferentes tamaños : arena
(200-20 micras), limo (20-2 micras) y arcillas (menos de 2 micras). La cantidad de cada uno
de los componentes de esta fracción varía de un suelo a otro y depende directamente del
material de origen. A la proporción relativa de arena, limo y arcilla, expresada en porcentaje,
se le conoce como textura del suelo.
La textura afecta el número y tamaño de los poros y, por lo tanto, el espacio poroso de cada
suelo. La humedad, aireación y consecuentemente la actividad de los microorganismos en el
suelo, están en función de la textura.
OBJETIVO
El estudiante estimará la proporción en que se encuentran las partículas minerales (arena, limo
y arcilla) en diferentes suelos.
MATERIAL
Hidrómetro de Bouyoucos Peróxido de hidrógeno al 30 %

Probeta ajustada a 1 1 30 ml Vaso de precipitados de 500 ml
Equipo para dispersar (batidora o Pi seta
licuadora con vaso dispersador) Suelo secado en estufa a 1 1 Oº C y
Termómetro graduado de O a 50º C tamizado en malla de 2 mm
Balanza Papel de estraza
Cronómetro Charolas para pesar suelo
Agua destilada Pipetas serológicas de 1 O ml
Sol. acuosa de hexametafosfato de sodio al Probeta de 25 ml
5% Cucharas de plástico
1
PROCEDIMIENTO
Eliminación de la materia orgánica.

Pese 50 g de suelo si la muestra es de textura fina; si es de textura arenosa pese 1 00 g. Para
eliminar la materia orgánica presente, trate la muestra con H202 al 30 % en una proporción de
1 5 ml de reactivo por cada 50 g de suelo. Deje secar 24 horas a 80ºC .
Dispersión.
Coloque la muestra tratada en un vaso de precipitados de 500 ml, agréguele 1 0 ml de la
solución de hexametafosfato de sodio y 250 ml de agua destilada. Dej e en reposo durante 1 5
minutos .
Vierta la muestra preparada en el vaso de la batidora o licuadora y agregue suficiente agua

destilada hasta llegar a 1 O cm por abaj o del borde superior del vaso. Disperse durante 5 a 1 O
minutos. Si el suelo es arenoso, no es necesario dispersar mecánicamente.
Lecturas en el hidrómetro.
Vacíe el dispersado íntegramente en la probeta ajustada a 1 1 30 ml, utilice una piseta para bajar
todo el contenido, afore con el hidrómetro inmerso, hasta 1 1 30 ml con agua destilada, si usó 50
g de suelo, y a 1 250 ml si empleó 1 00 g.
Quite el hidrómetro y tape la probeta con una mano para mezclar la muestra, a fin de
incorporar a la suspensión el sedimento formado. Cuando logre ésto, coloque en posición
vertical la probeta y accione el cronómetro para hacer la primer lectura con el hidrómetro a los
40 segundos, midiendo al mismo tiempo la temperatura para hacer las correcciones, como se
indica más adelante. Dej e la probeta en reposo durante 2 horas y vuelva a introducir el
hidrómetro, sin agitar y teniendo cuidado de que el mismo no toque o quede pegado a las
paredes de la probeta.
Nota: El éxito del método de Bouyoucos para determinar textura depende de la completa
dispersión de las partículas minerales del suelo, ésta se obtiene cuando las aspas de agitación
están en buenas condiciones y el tiempo de dispersión es suficiente.
Cálculos:
Por cada grado arriba de 1 9.4º C agregue a la lectura del hidrómetro 0.36 unidades, y por cada
grado abajo de 1 9.4º C reste a la lectura del hidrómetro 0.36 unidades.
Primera lectura corre!!i<la

XlOO =%de (limo+ arcilla)
Peso de la muestra
1 00 % de (limo+ arcilla) =% de arena

-
Se!!nn<la lectura correl!i<la

XlOO % de (arena+ arcilla) =% de limo
-
Peso de la muestra
2
Nota: Obtenga la clasificación del suelo de acuerdo a su textura en el Triángulo de Texturas
(Fig. 1) anexo.
REPORTE
1 .- Explique la relación que existe entre la textura de los suelos y su contenido de humedad.
2.- Explique la importancia que tiene el conocimiento de la textura de los suelos, así como sus
posibles aplicaciones prácticas.
3.-Discusión y conclusiones.
BIBLIOGRAFÍA.
Brady, C.N. 1 974. The nature and properties of soil. Mac Millan Publishing Co. Inc. 8th
Edition. New York.
Ortíz Villanueva, B. y C.A. Ortíz Selorio. 1 984. Edafología. Editorial de la Universidad
Autónoma de Chapingo, Texcoco, México.
Jackson, M.L. 1 970 . Análisis químico de suelos. 2ª edición. Editorial Omega. Barcelona.
Millar, C. E., Turk, L. M y Foth, H. D. 1 972. Fundamentos de la Ciencia del Suelo. Cía.
Editorial Continental (C.E.C.S .A.). México.
3
ARENA EN�
Fig. 1 .- Triángulo para determinar la clasificación textural de los suelos
(Brady, 1 980).
4
PRÁ CTICA 2. HUMEDAD RELATIVA Y CAPACIDAD DE RETENCIÓN DE
AGUA.
INTRODUCCIÓN
El agua es necesaria para la vida, es el mayor componente celular y gobierna la actividad de

los microorganismos del suelo; cuando la humedad es excesiva, el intercambio gaseoso es
limitado, provocando condiciones de anaerobiosis.
El desarrollo máximo de los microorganismos aerobios del suelo, responsables de algunos de

los procesos más importantes de éste, tiene lugar cuando el contenido de humedad relativa es
mayor de las dos terceras partes de la capacidad de campo, que es como se le denomina a la
capacidad de retención de agua del suelo .
El agua en el suelo se encuentra fuertemente retenida en las partículas arcillosas y en el humus

(agua higroscópica), medianamente detenida en los poros o espacios pequeños que hay entre
las partículas (agua capilar) y se escurre de los macroporos o grandes espacios que hay entre
las partículas (agua de gravedad) (Fig. 2).
Ya que el agua de gravedad escurre, y el agua higroscópica está fuertemente retenida porque
forma parte de los coloides (arcilla y humus), solo una parte del agua en el suelo está
disponible para las plantas. El nivel de humedad óptimo para la actividad biológica en el suelo
es en general de 50 a 70 % de la capacidad de retención.
OBJETIVO
El estudiante evaluará en diferentes tipos de suelo, la cantidad de agua disponible para las
plantas.
A.- HUMEDAD RELATIVA
MATERIAL
Estufa moderna Suelo recién colectado y tamizado por malla de 2 mm

Balanza analítica Papel de estraza
Desecador Cucharas de plástico
Caj a de Petri de vidrio
PROCEDIMIENTO
- Pese 1 O g de suelo en una caja de Petri mantenida a peso constante.
- Coloque la caj a de Petri conteniendo el suelo en la estufa a 80ºC durante 24 horas. Pese y
coloque nuevamente en la estufa hasta obtener peso constante.
5
Cálculos:
- Calcule el contenido de humedad como porcentaje del peso del suelo secado en la estufa.
Humedad (H)= (peso del suelo húmedo) - (peso del suelo seco).
H X 1 00
% de h um edad=
10
B.- CAPACIDAD D E RETENCIÓN DE AGUA O CAPACIDAD D E CAMPO
MATERIAL
Estufa Bases de Caja Petri

Balanza analítica Papel de estraza
Disco de papel filtro Suelo tamizado y secado en la estufa a 80ºC
Embudo Charolas para pesar suelo
PROCEDIMIENTO
- Pese de 5 a 1 O g de suelo seco.
- Coloque un disco de papel filtro en un embudo.
- Humedezca el papel filtro.
- Coloque el suelo sobre el papel filtro húmedo y péselo.
- Adicione agua al suelo hasta que se sature. Deje que escurra el agua.
- Cuando haya escurrido toda el agua, pese el suelo + el papel fil tro.
- Calcule la cantidad de agua retenida por unidad de peso de suelo seco y utilice este valor
para calcular la capacidad de retención de agua del suelo problema.
Cálculos :
Unidad= Papel filtro saturado con agua + suelo
Peso de la unidad
con el suelo
saturado =Peso del papel filtro húmedo + Peso de la muestra del suelo ( 1 O g).
6
Peso del papel filtro Peso del papel filtro
Agua retenida con el suelo saturado con el suelo no
con agua saturado (seco)
Peso de la unidad con

=
Peso del papel filtro húmedo + Peso peso de la muestra del
el suelo saturado suelo (1O g) .
Capacidad de retención de agua = l Agua retenida X 100 ]/1O
REPORTE
1.- ¿Cuál fue la humedad relativa del suelo en estudio?
2.- Reporte la capacidad de retención de agua del suelo.
3 . - ¿Por qué es importante conocer estas variables en el suelo?
4.- ¿De qué componentes del suelo dependen estas propiedades?
5 .- Discusión y conclusiones.
BIBLIOGRAFÍ A
Brady, C.N. 1974. The nature and properties of soil. Mac Millan Publishing Co. Inc. 8th
Edition. N ew York.
Ortíz Villanueva, B. y C.A. Ortíz Selorio. 1984. Edafología. Editorial de la Universidad
Jackson, M.L. 1970. Análisis químico de suelos. Segunda edición. Editorial Omega.
Barcelona.
Millar, C. E., Turk, L. M y Foth, H. D. 1972. Fundamentos de la Ciencia del Suelo. Cía.
Editorial Continental (C.E.C. S .A.). México
7
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,'1_<VQ J.
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Fig. 2.- Los tres tipos de agua del suelo
8
PRÁCTICA 3. pH
INTRODUCCIÓN
Esta propiedad química es quizá la más importante de un suelo como medio destinado al
cultivo de plantas y, por lo tanto, igualmente importante para los microorganismos presentes en
él.
Sin embargo, el pobre crecimiento de los cultivos en suelos ácidos no se debe directamente a la
elevada concentración de H+, a menos que el pH sea inferior a 4.0 . Los efectos negativos de la
acidez del suelo son indirectos y entre ellos están:
1 .- Alta concentración de aluminio intercambiable o en solución.

2.- Retención de fósforo.
3 . - Exceso de manganeso en solución.
4.- Deficiencias de calcio, magnesio y/o molibdeno.
5.- Reducida actividad microbiológica.
6.- Reducida capacidad de intercambio catiónico
La determinación del pH del suelo, efectuada en las condiciones de humedad natural, debe ser
considerada como la más válida en función del ambiente biológico existente en el mismo.
En general, cuanto más diluida sea la suspensión del suelo, mayor será el valor del pH
encontrado.
OBJETIVO
El estudiante determinará y comparará el pH de diversos suelos y explicará las diferencias

encontradas.
MATERIAL
Potenciómetro Suelo recién colectado o bien almacenado

Balanza granataria Piseta con agua destilada
Soluciones reguladoras de pH 4.0 y 7.0 Cucharas de plástico
Vaso de precipitados de 1 50 ml Charolas para pesar suelo
Agitador de vidrio Papel de estraza
PROCEDIMIENTO
En el campo:
Tome 1 5 muestras representativas y mézclelas para formar una sola. Haga inmediatamente la
determinación o en caso contrario pase la muestra a un frasco de vidrio con tapón de baquelita,
9
ciérrelo herméticamente con el propósito de impedir el contacto con trazas de amoniaco u otros
compuestos presentes en el laboratorio que puedan modificar el pH.
En el laboratorio:
Pese 10 g de la muestra por analizar y vacíelos dentro de un vaso de precipitados de 1 50 ml, en
donde se agregan 20 ml de agua destilada; mezcle perfectamente con ayuda de un agitador.
Deje reposar la muestra durante 30 minutos; después de este tiempo agítelo y haga la lectura en
el potenciómetro previamente calibrado después de 1 5 minutos de haberse encendido.
Cuadro l. Clasificación tentativa del pH del suelo y de aguas agrícolas, según el Instituto
Nacional de Investigaciones Agrícolas (INIA):
pH Clasificación
Menor de 4.60 Extremadamente ácido

4.60 a 5. 1 9 Muy fuertemente ácido
5.20 a 5.59 Fuertemente ácido
5.60 a 6. 1 9 Medianamente ácido
6.20 a 6.59 Ligeramente ácido
6.60 a 6.79 Muy ligeramente ácido
6 . 80 a 7.19 Neutro
7.20 a 7. 39 Muy ligeramente alcalino
7.40 a 7.79 Ligeramente alcalino
7 . 80 a 8.39 Medianamente alcalino
8.40 a 8.79 Fuertemente alcalino
8 . 80 a 9.39 Muy fuertemente alcalino
Mayor de 9 .40 Extremadamente alcalino
REPORTE
1 .- Explique cuál es el origen de los iones hidrógeno del suelo.
2.- ¿Cuál es la influencia del pH en la disponibilidad o el intercambio de los nutrientes del

suelo?
10
3 . - Explique la relación que existe entre la capacidad de intercambio iónico y el pH del suelo.
4.- Discusión y conclusiones
BIBLIOGRAFÍA
Aguilar Santelises, A., J. D. Etchevers Barra y J. Z. Castellanos Ramos. 1 987. Análisis

químico para evaluar la fertilidad del suelo. Sociedad Mexicana de la Ciencia del Suelo.
México.
Edition. New York.
Ortíz Villanueva, B. y C.A. Ortíz Solorio. 1 984. Edafología. Editorial de la Universidad
Moreno-Dahme, R. 1 970 . Cuadro de clasificaciones tentativas de suelos. Departamento de
Suelos, INIA/SAR. México.
Jackson, M.L. 1 970 . Análisis químico de suelos. Segunda edición. Editorial Omega.
Barcelona.
Editorial Continental (C.E.C.S.A.). México.
11
PRÁCTICA4. MATERIA ORGÁNICA
INTRODUCCIÓN
El contenido de materia orgamca es objeto de determinaciones rutinarias en todos los

laboratorios de análisis de suelos. Este factor es fundamental por su influencia directa e
indirecta sobre las· propiedades físicas, químicas y biológicas del suelo, tales como: color,
estructura, plasticidad, capacidad de retención de agua, capacidad de intercambio iónico,
disponibilidad de nitrógeno, fósforo y azufre, pH, susceptibilidad a la erosión, etc.
La fracción orgánica del suelo consta de residuos de plantas y animales en diferentes estados
de descomposición e incluye a todos los microorganismos del suelo. No es uniforme en su
constitución y continuamente ocurren cambios en ella.
El carbono orgánico en el suelo está contenido en la materia orgamca y en formas

mineralizadas como grafito y carbón vegetal. Si hacemos uso de una técnica que determine el
contenido de materia orgánica a través de la evaluación de carbono orgánico, es necesario que
la técnica elegida permita discriminar entre las dos fuentes. El método de Walkey y Black está
basado en la oxidación lenta de la materia orgánica (carbono orgánico) con ácido crómico que
se calienta por dilución con H2S04. Con este método se oxida un poco menos que el total de la
materia orgánica, lo que es considerado por algunos autores como una ventaja, ya que se
excluye la fracción de materia orgánica menos activa. Además, debido al calentamiento poco
intenso, permite diferenciar en gran parte la materia que integra el humus del suelo de las
fuentes extrañas de carbón orgánico (grafito y carbón vegetal), lo que constituye una ventaja
evidente. Por esta razón y por su simplicidad, es el método más empleado para estimar la
materia orgánica de los suelos.
OBJETIVO
El estudiante determinará y comparará el contenido de materia orgánica oxidable de diferentes

suelos mediante el método de Walkey y Black.
MATERIAL
Matraz Erlenmeyer de 500 ml Difenilamina

Pipetas serológicas de I O y 20 ml FeS04.7H20 IN
Bureta de 25 ml Suelo secado al aire y tamizado por malla de 0.5 mm
Balanza analítica Frascos goteros de I O ml (plástico)
K1Cr201 IN Charolas para pesar suelo, Papel de estraza
Agua destilada Cucharas de plástico
H3P04 al 85 % Vaso de precipitados de I 00 ml
H2S04 concentrado QP Vaso de precipitados de 500 ml
Probeta de 250 ml Pinzas para bureta
Soporte universal Nota: Para preparar las soluciones consulte el apéndice.
I2
PROCEDIMIENTO
Oxidación de la materia orgánica.

Coloque I g de suelo en un matraz Erlenmeyer de 500 ml. Si observa que el suelo es muy rico
en materia orgánica, ponga de 250 a 500 mg. A continuación añada con una pipeta, I O ml de
K1Cr207 IN sobre el suelo, mezclando con movimientos circulares del matraz. Añada
enseguida, lentamente, 20 ml de H2S04 concentrado, siga mezclando durante un minuto para
asegurar la interacción de los reactivos con el suelo. Evite que el suelo quede adherido a las
paredes del matraz fuera del contacto de los reactivos.
Deje reposar la mezcla se durante 30 minutos. Simultáneamente realice un ensayo de

valoración en blanco (de la misma forma, pero sin suelo).
Valoración por retroceso.

Diluya la mezcla a 200 ml con agua destilada y añada I O ml de H3P04 al 85 % y 30 gotas de
indicador de difenilamina; valore por retroceso con la solución de FeS04 IN colocada en una
bureta.
Nota 1
Al principio, el color es verde oscuro debido a los iones cromo y se desplaza hacia un azul
turbio a medida que avanza la titulación, en el punto final, este color cambia bruscamente a
verde brillante.
Nota 2
Si gasta menos de 2 ml de FeS04, repita el ensayo utilizando menor cantidad de suelo.
REACCIONES
Cálculos:
Realice los cálculos mediante la siguiente ecuación:

p
% de materia orgánica= 1 0 ( I - ) X 0.67
T
donde: P ml de solución de FeS04 IN gastados por el problema.
=
T = ml de solución de FeS04 IN gastados por el blanco.
El factor 0.67 se deduce de la siguiente forma:
13
12 l OO
lNX X _LQ_ X X 1 .72 0.67
4000 0.77 1 .0
IN=Normalidad del K2Cr207

1 2/4000=Peso miliequivalente del carbón.
1 .0 g =Peso de la muestra de suelo.
1 .0/0.77 = Cantidad de carbono total de la materia orgánica que se oxida por este método, que
es igual a 77 %.
1 .72 = Factor de transformación del carbono orgánico a materia orgánica del suelo que
contiene 58 % de carbono orgánico.
Cuando se trabaj a con otra cantidad de suelo, el 1 .0 se substituye por la cantidad específica
utilizada.
Cuadro 2. Tipos de suelo de acuerdo a su contenido de materia orgánica, según el INIA

(Moreno-Dahme, 1970).
%de materia orgánica Interpretación
O.O a 0.25 Extremadamente pobre

0.26 a 0.50 Muy pobre
0.5 1 a 1 .00 Pobre
1 .0 1 a 2.00 Mediano
2.01 a 3 .00 Rico
3.01 a 4.00 Muy rico
4.01 a 5.00 Extremadamente rico
REPORTE
1 .- Explique el fundamento de la determinación de materia orgánica por el método de Walkey

y Black.
2.- ¿Qué influencia tiene la materia orgánica en la capacidad de retención de agua del suelo?
14
3 . - Discusión y conclusiones
BIBLIOGRAFÍA

México.
Edition. N ew York.
Jackson, M.L. 1 970. Análisis químico de suelos. Segunda edición. Editorial Omega.
Barcelona.
Editorial Continental (C.E. C . S .A.). México.
Moreno-Dahme, R. 1 970. Cuadro de clasificaciones tentativas de suelos. Departamento de
Suelos, INIA/SAR. México.
15
PRÁ CTICAS. CAPACIDAD DE INTERCAMBIO IÓNICO
INTRODUCCIÓN
Las fracciones finas mineral y orgamca del suelo (arcilla y humus), por ser partículas
coloidales exponen una gran superficie por unidad de volumen, además presentan carga
negativa en su superficie. Esto les permite el intercambio de cationes que están en solución en
el suelo, por otros cationes que se encuentran neutralizando a las cargas negativas de la arcilla
y el humus. Una parte de los cationes liberados de la arcilla son absorbidos por las raíces de las
plantas y por los microorganismos del suelo para su nutrición. La capacidad de intercambio
iónico es una medida de esta capacidad de los coloides, los cuales actúan como reservorios
para los nutrientes minerales.
La capacidad de intercambio iónico varía de acuerdo a la cantidad y tipo de arcilla, y a la

materia orgánica presente en el suelo.
Esta característica es importante para clasificar a los suelos desde el punto de vista de la
fertilidad. La capacidad de intercambio iónico fluctúa de 1 .0 a más de 50 meq/ 1 00 g de suelo.
OBJETIVO
El estudiante determinará y comparará la capacidad de intercambio iónico de diferentes suelos.
MATERIAL
Balanza granataria Solución de CaC12 1 N pH 7.0

Bureta de 25 ml CH3-CH20H de 96º
Pipetas sexológicas de 1 0 ml Solución de NaCl 1 N pH 7.0
Pipetas sexológicas de 1 ml Solución de EDTA 0. 1 N
Papel filtro Whatman # 2 Solución amortiguadora de pH 1 O
Suelo secado al aire y tamizado en malla de 2 mm Solución de NH20H-HC1
Embudos Buchner. Solución de KCN al 2%
Vasos de precipitados de 250 ml Solución de Negro de Eriocromo T
Soporte universal con pinza para bureta Solución estándar de Ca 0 . 0 1 N
Matraces Erlenmeyer de 250 ml Goteros de plástico de 1 O m1
Cucharas de plástico Papel de estraza
Anillos de fierro para soporte universal Charolas para pesar suelo
Nota: Para la preparación de las soluciones consulte el apéndice
PROCEDIMIENTO
Pese 5 g de suelo y colóquelo en un embudo de Buchner que contenga un papel filtro.
16
Adicione lentamente 1 0 ml de la solucion de CaClz IN, cubriendo toda la superficie de la
muestra de suelo. Recolecte la solución filtrada en un vaso de precipitados de 250 ml, este
filtrado se desecha. Repita esta operación cuatro veces más.
Adicione lentamente 1 O ml de CH3-CH20H de 96º, cubriendo toda la superficie de la muestra

de suelo. Recolecte la solución filtrada en un vaso de precipitados de 250 ml y deséchelo.
Repita esta operación cuatro veces más.
Adicione lentamente 1 O ml de la solución de NaCl, cubriendo toda la superficie de la muestra

de suelo. Recolecte la solución filtrada en un matraz Erlenmeyer de 250 ml. Repita esta
operación cuatro veces más. (Cuidado, este filtrado no se desecha) .
En e l filtrado de NaCl, titule los iones calcio por e l método del versenato.
Método del Versenato
Agregue al filtrado 1 O ml de la solución amortiguadora pH 1 O
Adicione 5 gotas de la solución de KCN.
Agregue 5 gotas de la solución de NH20H-HC1 .
Adicione 5 gotas del indicador Negro de Eriocromo T.
Titule con la solución de verseno hasta que el color de la solución vire de púrpura a color azul.
Cálculos:
Capacidad de intercambio catiónico total (C.l.C.T.)
C.I.C . T. en meq por 1 00 g de suelo =

ml de EDTA X N X 1 00
g de muestra de suelo
Normalización de la solución del dietilendinitrilotetracetato-disódico (EDTA):
1 .- Coloque alícuotas de 1 O ml de la solución estándar de calcio en un matraz Erlenmeyer de

250 ml y agregue 1 00 ml de agua destilada (hacerlo por duplicado o triplicado) .
2.- Agregue a cada matraz 1 0 ml de solución amortiguadora pH 1 0.
3.-Agregue 5 gotas de solución de KCN.
4.- Agregue 5 gotas del indicador negro de eriocromo T.
17
5.-Titule con la solución de EDTA agitando frecuentemente el matraz hasta obtener el color
azul.
Normalidad del EDTA (N) 0.01 N X 1 0 ml

ml de EDTA gastados
REPORTE
1 .- Escriba las características de los coloides del suelo
2.- ¿Cuál es la importancia de la determinación de la capacidad de intercambio iónico de un

suelo?
BIBLIOGRAFÍA

México.
Brady, C .N. 1 974. The nature and properties of soil. Mac Millan Publishing Co. Inc. 8th
Edition. N ew York.
Jackson, M.L. 1 970. Análisis químico de suelos. Segunda edición. Editorial Omega.
Barcelona. Millar, C. E., Turk, L. M y Foth, H. D. 1 972. Fundamentos de la Ciencia del
Suelo. Cía. Editorial Continental (C.E.C.S .A.). México.
18
UNIDAD II. GRUPOS FUNCIONALES MICROBIANOS DEL SUELO
INTRODUCCIÓN
En el suelo existen diferentes grupos de microorganismos que participan en los ciclos

biogeoquímicos en diferentes actividades, a través de las cuales se movilizan los
elementos esenciales para la vida, constituyendo así grupos funcionales. Generalmente,
cada grupo funcional está conformado por diferentes poblaciones que pueden incluir
bacterias y bongos.
Entre los diversos grupos funcionales del suelo destacan los amonificantes, nitrificantes,
desnitrificantes, fijadores de nitrógeno, celulolíticos, amilolíticos, pectinoliticos,
mineralizadores, oxidadores y reductores de azufre, fósforo, potasio, fierro, etc. Todos
estos microorganismos afectan la movilidad de los nutrientes inorgánicos en el suelo,
facilitando o impidiendo el libre tránsito de éstos entre los coloides del mismo.
Posteriormente, los nutrientes pueden ser intercambiados con' las plantas que dependen
directamente de ellos.
Todos los grupos microbianos pueden cuantificarse inoculando con suelo tubos con
medio selectivo líquido y utilizando las tablas de MacGrady. Su actividad biológica se
puede interpretar con el trazado de curvas en función del tiempo y de las diluciones. Los
medios de cultivo llevan básicamente una solución salina (la de Winogradsky) más una
fuente de carbono y una de nitrógeno específicas (Cuadro 3). En el caso de los grupos
funcionales de los diferentes ciclos hay que adicionar la fuente del elemento a estudiar,
ya sea en forma orgánica (para estudiar su mineralización), en forma reducida (para ver
su xidación) o en forma oxidada (para estudiar su reducción) .
Sin olvidar que todos los nutrientes de las plantas son previamente metabolizados por los
microorganismos del suelo, en esta parte del curso estudiaremos la participación de
algunos grupos microbianos importantes en la transformación de nutrientes esenciales
para las plantas y abordaremos procesos tales como el uso de una molécula inerte (el
nitrógeno molecular), la mineralización, la oxidación y la solubilización microbianas.
19
GRUPO FUENTE FUENTE DE INCUBACI Ó N B ÚSQUEDA A
FUNCIONAL DE NITRÓ GENO DE ... TRAVÉS
CARBONO DE...
1 . Fijadores libres Aerobia o Velo en la Ningún
de N2 Glucosa ---
anaerobia superficie del reactivo
medio
2. Amonificadores Glucosa Un aminoácido Aerobia o NH4+ Nessler
anaerobia
3 . Nitrificadores ---
N�+ Aerobia o N02- Griess I y
anaerobia II
4. Desnitrificadores Glucosa KN03 A€robia o N02- Griess I y
anaerobia II
Celulosa Aerobia o Colonias de
5 . Celulolíticos (Papel filtro) NH4NÜ3 anaerobia color en el Ninguno
papel
�. Amilolíticos Almidón NH4NÜ3 Aerobia o Pérdida de Yodo
anaerobia color azul iodurado
FeS
r? . Mineralizadore Lactato de Aminoácido Aerobia o ( anaerobiosis
s de azufre sodio azufrado anaerobia ) S04
(aerobios is)
8 . Oxidadores de NH4NÜ3 Aerobia so4= BaCh+HCl
S (S y H2S)
9. Sulfato Lactato de NH4Cl Anaerobia FeS Feº (un
reductores sodio clavo)
Cuadro 3.- Grupos funcionales de microorganismos del suelo, cuya

clasificación se puede establecer en medios de cultivo mínimos con base en la
selección de las fuentes de carbono y de nitrógeno (adaptado de Pochon y
T ardieux, 1 962) .
20
PRÁ CTICA 6. UN PAISAJE MICROBIANO DEL SUELO
INTRODUCCIÓN
Uno de los retos de los microbiólogos que estudian el suelo es poder observar los
microorganismos in situ, sin alteraciones indeseadas en su hábitat.
La técnica de Rossi-Cholodny, que utiliza portaobjetos enterrados, es una herramienta

ecológica simple y útil para observar la relación espacial que guardan los microorganismos del
suelo entre sí y con el suelo mismo. Según Winogradsky, es la observación de un paisaje
microbiano.
Esta técnica, aunque fue diseñada hace muchos años,- todavía se emplea para estudiar
cualitativamente las poblaciones microbianas del suelo; es especialmente útil para demostrar
las relaciones espaciales entre los microorganismos y puede proveer mucha información en
relación con los cambios poblacionales producidos por algún factor externo como la
temperatura, la humedad, la adición de fuentes de carbono, etc.
Si observa con cuidado, podrá encontrar muchos microorganismos desconocidos, se trata de

organismos no cultivables.
OBJETIVO
El estudiante observará la imagen en conjunto de las relaciones que guardan los

microorganismos entre sí y con las partículas del suelo (Fig. 3).
MATERIAL
Muestras de suelo fresco Microscopio compuesto

Papel aluminio Aceite de inmersión
Portaobjetos Papel seda
Balanza granataria Encendedor o cerillos
Vasos de precipitados de 1 00 ml Agua destilada
Vasos de precipitados de 250 ml o frascos Papel de estraza
de boca ancha Goteros de 50 ml
Probetas de 50 y 1 00 ml Etanol 96º
Baño María (tripie, cristalizador, mechero Solución de ácido acético al 40 %
Bunsen) Colorante rosa de bengala fenólico
Puentes de coloración Sacarosa (comercial)
Cucharas de plástico Nitrato de amonio
Charolas para pesar suelo
21
PROCEDIMIENTO
-Pese dos muestras de 200 g de suelo, a una adiciónele una fuente de carbono más una fuente
de nitrógeno ( 1 % de sacarosa y 0.05% de NH�0 3) , dej e sin tratamiento la otra muestra.
Coloque cada muestra en un vaso de precipitados o en un frasco de boca ancha.
-Adicione agua hasta alcanzar el 60% de la capacidad de retención de agua (capacidad de

campo) del mismo y mezcle bien.
-Inserte verticalmente 2 o 3 portaobj etos limpios en el suelo de cada recipiente. Asegúrese de

que al menos, 2/3 de cada portaobjetos está dentro del suelo.
-Tape los recipientes con papel aluminio e incube a 28ºC.
-Después de una semana, seleccione uno de los portaobj etos del suelo y proceda de la siguiente
manera:
a).- Sáquelo con suavidad del suelo, límpielo cuidadosamente de una de sus caras con papel
húmedo, cuide que la otra cara permanezca sin alterar, ésa es la cara que se va a teñir.
b) .- Para eliminar las partículas grandes del suelo de la cara a teñir, golpee suavemente el
portaobj etos contra un papel de estraza en la mesa de trabajo.
c) .- Adicione CH3 COOH al 40 % al portaobj etos y déjelo actuar 3 minutos. Lave el exceso de
ácido, sin que el chorro de agua caiga directamente sobre el portaobjetos.
d).- En la campana de extracción, tiña la impronta colocando el portaobj etos en un puente de

coloración que esté sobre un baño con agua hirviendo; cúbralo con rosa de bengala fenólico y
manténgalo a emisión de vapores durante 1 0 minutos. No permita que se seque.
e) .- Lave cuidadosamente para eliminar el exceso de colorante. Deje secar y observe al

microscopio a 40X y l OOX. Tenga mucho cuidado con los obj etivos del microscopio, pues
las partículas minerales del suelo que se quedan en el portaobjetos pueden dañar las
lentes.
-Observe el tamaño y forma de las células bacterianas, filamentos y esporas de actinomicetos y

de hongos. Observe la relación entre los mismos y las partículas del suelo. Identifique las
evidencias de grupos microbianos, formación de colonias, protocooperación, etc.
Nota: Para preparar la solución de rosa de bengala fenólico, consulte el apéndice.
REPORTE
22
1 .- Describa las diferencias que observó, en las poblaciones microbianas de los suelos tratados
y sin tratar.
2.- ¿Observó alguna evidencia de que algún grupo de microorganismos interacciona

estrechamente con otro grupo? Describa.
3 .- Mencione cómo diferenció un filamento de un actinomiceto del de un hongo.
4.- ¿Cómo influyeron los resultados de esta práctica en su concepto del desenvolvimiento de
los microorganismos en el suelo? Su respuesta a esta pregunta es muy importante.
5. -Discusión y conclusiones
BIBLIOGRAFÍA
Rossi, G., Riccardo, S., Geseu, G., Stanganelli, M. y Wang, T.K. 1 93 6 . Direct microscopic
and bacteriological examination in soil. Soil. Science 4 1 : 5 3 .
Stotzky, G . 1 997. Soil as a n enviroment for microbial life. In: J.D. Van Elsas, J.T., Trevors
and E.M.H. Wellington (eds.). Modem Soil Microbiology. pp 1 -20. Marcel Dekker, Inc. New
Y ork.
Pramer, D . y E. L. Schmidt. 1 965. Experimental Soil Microbiology. Burgess Publishing
Company, Minnesota.
23
. �
F otos:José l..J.J is C h alqueño
Fig. 3. Microorganismos-arcillas in situ.
24
PRÁ CTICA 7. CICLO DEL NITRÓ GENO : FIJACIÓ N ASIMBIÓ TICA DE
NITRÓ GENO
INTRODU CCIÓN
La primera fase del ciclo del nitrógeno es la fijación. Este término se refiere al fenómeno de
activar el nitrógeno del aire que es inerte (N2) y transformarlo en asimilable (NH3). Los
microorganismos fijadores pueden ser bacterias asimbióticas (aerobias, anaerobias y
fotosintéticas) y simbióticas (bacterias asociadas a leguminosas, bacterias asociadas a
gramíneas y bacterias filamentosas asociadas a ciertos árboles y arbustos llamados plantas
actinorrízicas) ; también tienen esta capacidad algunas cianobacterias simbióticas. Todos estos
microorganismos poseen el equipo enzimático que les permite metabolizar el nitrógeno
atmosférico (N2) .
Cualquiera que sea el microorganismo, el metabolismo final conduce fundamentalmente a la

síntesis de proteínas. Es decir, a través de este fenómeno, el nitrógeno molecular es introducido
al suelo en forma orgánica (Fig. 4).
OBJETIVO
El estudiante diferenciará las características microscópicas y coloniales de algunos

microorganismos del suelo que fijan nitrógeno en el mismo, ya sea en forma aerobia o
anaerobia; así como la incidencia de ellos en el suelo que se estudie.
MATERIAL
Cajas P etri de vidrio con silicagel más medio Cámara de humedad constante
selectivo para fijadores asimbióticos Suelo secado al aire y tamizado por malla
Vidrios de reloj de 2 mm
Varillas de vidrio con punta o palillos Cajas Petri desechables
Equipo de coloración Gram Encendedor o cerillos
Mechero Bunsen Asa microbiológica
Puentes de coloración Microscopio compuesto
CH3-CH20H 96º Aceite de inmersión
Porta y cubreobjetos Papel seda
PROCEDIMIENTO
Técnica de siembra de granos de suelo sobre el medio selectivo para fijadores

asimbióticos (Fig. 4).
- Deposite lo más regularmente posible, 20 granos de suelo por caja, con la ayuda de una
varilla de vidrio con punta o con un palillo, de la siguiente forma:
a) Coloque agua en un vidrio de reloj
b) Humedezca ligeramente la punta de la varilla de vidrio o el palillo
25
c) Con la varilla o palillo humedecido toque ligeramente el grano de suelo, notará que éste
se adhiere
d) Coloque suavemente el grano de suelo sobre el medio de cultivo sílica gel
- Coloque las cajas sembradas en la estufa, en atmósfera húmeda a 28-30º C .
Las colonias de Azotobacter aparecen después de 2 días de cultivo; son lisas, s e extienden y se
oscurecen al final del cultivo (8 días) . Son comunes en suelos neutros y alcalinos (Fig. 5).
Las colonias de Clostridium aparecen después de 3 días de cultivo, se reconocen fácilmente

por la formación de burbujas de aire en el grano de suelo cubierto por la colonia de
Azotobacter. Son comunes en suelos neutros (Fig. 5).
Lecturas:
- Cuente la cantidad de granos de suelo que tienen crecimiento (granos positivos) .
- Examine el tipo de microorganismos fijadores mediante la observación al microscopio de

preparaciones teñidas con la técnica de Gram.
Nota 1 : En una colonia pueden coexistir ambos tipos de microorganismos.

Nota 2 : Para preparar el soporte y el medio de cultivo ver apéndice.
REPORTE
1 .-Porcentaj e de granos de suelo con crecimiento de microorganismos fijadores asimbióticos

de su suelo.
2.-Morfología microscópica y colonial de los mismos.
3 .-¿Puede un suelo depender de la fijación asimbiótica como única fuente de nitrógeno?

Explique ampliamente.
26
4.-Discusión y conclusiones
BIBLIOGRAFÍA
Frioni, L. 1 990. Ecología Microbiana del Suelo. Universidad de la Repúbica. Montevideo,

Uruguay.
Frioni, L. 1 999. Procesos Microbianos. Editorial de la Fundación Universidad Nacional de
Río Cuarto, Argentina.
Pochon, J. & Tardieux, Y. 1 962. Techniques d' Analyse en Microbiologie du Sol. Editorial de
la Tourelle, París.
27
FIJACIÓN DE NITRÓGENO: El nitrógeno es el mayor limitan te de la producción
de las plantas
Su reserva en el planeta no está en el suelo
Son ciertos microorganismos los que lo incorporan
directamente a las plantas o al suelo
FIJACION DE NITROGENO: - El N es el mayor factor limitante de la

producción de Jas plantas
- su reserva en el pt;.neta no está en el suelo
- son cie:rlQs m,io;oo:rganismos los que lo
inco.rpoan cfu'ec�ente a las plantas
o al sue16
.. �
Fig. 4.- El esquema más simple del Ciclo del Nitrógeno.
28
Burbujas de aire
producidas por Clostridium
Colonia de Azotobacter
Grano de suelo negativo
Foto de Jesús Morales
Fig. 5.- Granos de suelo con y sin crecimiento de colonias de Azotobacter

y Clostridium.
29
PRÁ CTICA 8.- CICLO DEL NITRÓ GENO : MINERALIZACI ÓN DEL
NITRÓ GENO ORGÁNICO.
INTRODUCCI ÓN
Uno de los grupos funcionales más importantes en los suelos es el de los

microorganismos que mineralizan el nitrógeno orgánico. Estos pueden ser bacterias
(aerobias y anaerobias), actinomicetos y hongos. Son importantes porque transforman el
nitrógeno orgánico que no es asimilable por las plantas en nitrógeno mineral, asimilable.
Este elemento, el N, es el mayor factor mineral limitante de la producción de las plantas.
La mayor parte del nitrógeno que se encuentra en el suelo está en forma orgánica y
proviene de la fijación de N2, de los tej idos animales y vegetales muertos, de los abonos
verdes, etc. Si tomamos en cuenta solamente los restos microbianos, éstos provienen de
poblaciones vivas, bacterias, hongos, protozoarios, nemátodos, etc. que en su conjunto
pueden constituir más de 20 toneladas por hectárea.
Las formas orgánicas complej as al mineralizarse liberan el nitrógeno en forma de

amonio, por ello este proceso se conoce también con el término de Amonificación y a
los microorganismos que participan se les llama amonificadores.
OBJETIVO
El alumno cuantificará la población del grupo funcional de microorganismos del suelo,

que se encargan de mineralizar el N orgánico para hacerlo asimilable a las plantas.
MATERIAL
Tubos de ensaye de 1 5 0 X 1 7 mm con 1 0 ml Tubos de Kahn

de medio selectivo para amonificantes Balanza granataria
Gradilla para tubos Reactivo de Nessler.
Botellas de dilución con 90 ml de agua Cucharas de plástico
destilada estéril Charolas para pesar suelo
Pipetas sexológicas de 1 O ml estériles Papel de estraza
Pipetas sexológicas de 1 ml estériles Mecheros Bunsen
Suelo recién colectado y tamizado en malla Encendedor o cerillos
de 2mm. Estufa
30
PROCEDIMIENTO
-Pese 1 0 g de suelo y determine su humedad.
-Con una segunda muestra de 1 O g de suelo, haga diluciones desde 1 0- 1 a 1 0-6 en botellas
de dilución que contengan 90 ml de agua destilada estéril.
-Inocule 3 tubos por dilución, conteniendo medio para amonificantes (con un

aminoácido), colocando en cada tubo, 1 ml de cada dilución preparada. Incube a 28º C.
-Después de 4 8 horas, según el tipo de suelo y la actividad buscada, determine la

actividad microbiológica en cada uno de los tubos. Haga determinaciones cada 24 horas
durante 1 O días.
LECTURAS :
- Bajo condiciones de esterilidad, tome con una pipeta estéril, 1 ml de cada tubo
inoculado con suelo. Coloque cada muestra en un tubo de Kahn.
- Adicione 2 gotas de reactivo de Nessler. Un color naranja con turbidez, indica que la
prueba es positiva.
- Determine el número de organismos con actividad amonificante por gramo de suelo,

utilizando las tablas de Me Grady, localizadas en el apéndice.
- Evalúe el proceso microbiano durante 1 O días trazando curvas de actividad

amonificante.
Nota: Para la fórmula del medio de cultivo y las curvas vea el apéndice del Manual.
REPORTE
1 .- Número de microorganismos por gramo de suelo seco.
2.- Anexe una gráfica de la actividad amonificante de cada día elaborada en papel
milimétrico.
31
3 . - Calcule la pendiente de la curva e interprete la misma.
BIBLIOGRAFÍA
Pramer, D. y E. L. Schmidt. 1 965. Experimental Soil Microbiology. Burgess Publishing

Company, Minnesota.
Pochon, J. & Tardieux, Y. 1 962. Techniques d'Analyse en Microbiologie du Sol. Ed. de la
Tourelle, P arís.
Bloem, J., P. De Ruiter,& L. Bowman. 1 997. Soil food webs and nutrient cycling in
agroecosystems. In. J.D. Van Elsas, J.T., Trevors and E.M.H. Wellington (eds.) . Modem Soil
Microbiology. pp 245 - 278. Marcel Dekker, Inc. New York.
32
PRÁ CTICA 9.- CICLO DEL F Ó SFORO : SOLUBILIZACIÓN DEL F Ó SFORO
INSOLUBLE
INTRODUCCIÓN
El fósforo es un elemento esencial para los seres vivos, ya que es un constituyente estructural y
funcional de todos los organismos. Se encuentra formando parte de los ácidos nucleicos, de los
nucleótidos, de las proteínas, de los fosfolípidos, y en los procesos de acumulación y transporte
de energía. En las plantas es también un constituyente de las fitinas (conocidas como inositol
fosfatos) y es una parte importante de los abonos.
El P se encuentra en todas partes de la biosfera. Las concentraciones normales de P total e n los

suelos minerales tienen en promedio 800 mg por kilo, mientras que en las aguas dulces hay un
promedio de 0.02 mg por litro.
En el suelo, el P se presenta bajo formas orgamcas y minerales. Las formas orgamcas

representan del 1 5 al 80% del P total. En cuanto al P mineral, hay formas asimilables y no
3
asimilables. Las formas asimilables, los iones P04- , están en la solución del suelo y adsorbidos
en los coloides por intermedio de los cationes Ca+++, Fe+++ y Al+++ . Los iones fosfato son
cedidos a la solución del suelo a medida que son consumidos por las plantas.
Las formas no asimilables del P son: fosfato tricálcico, hidroxiapatita y carbonato apatita. Las
formas insolubles de P (fosfatos de calcio, aluminio y fierro) pueden ser solubilizadas por
acción microbiana. En los suelos con pH alcalino se encuentra con frecuencia el P baj o forma
insoluble. Muchos de los microorganismos solubilizadores del P son estimulados en su
crecimiento cuando el pH del medio está entre 7.8 a 7.9.
La solubilización microbiana de los minerales fosfatados puede hacerse directamente en el

suelo y puede llevarse a cabo por producción de ácido o por producción de quelantes; en la
rizosfera de las plantas ocurre una gran actividad solubilizadora de P .
OBJETIVO
El alumno demostrará la solubilización de una forma insoluble de P en el suelo por

microorganismos del mismo.
MATERIAL
Suelo recién colectado y tamizado en malla de 2 mm Varillas de vidrio para siembra

Botellas de dilución con 90 mi de agua destilada microbiológica
estéril Balanza granataria
Pipetas serológicas de 1 O mi estériles Cucharas de plástico
Pipetas serológicas de 1 ml estériles Charolas para pesar suelo
Cajas de Petri con Medio Mínimo Modificado Mecheros Bunsen
33
Encendedor o cerillos
Nota: Vea el Apéndice para consultar la fórmula del medio
PROCEDIMIENTO
-Pese 1 O g de suelo y determine su humedad.
3
-Con una segunda muestra de 1 O g de suelo, haga diluciones de 1 0- a 1 0-6 en botellas de
dilución que contengan 90 ml de agua destilada estéril.
-Inocule 3 cajas Petri por dilución, conteniendo Medio Mínimo Modificado, colocando
en cada caj a 1 ml de cada dilución sobre el medio de cultivo.
-Con la varilla de vidrio acodada, extienda uniformemente el inóculo.
-Incube a 28º C durante una semana.
LECTURAS
- Observe las caj as P etri contra la luz buscando halos de disolución del fosfato dicálcico
que contiene el medio de cultivo (Fig. 6).
- Cuente el número de microorganismos solubilizadores de P por gramo de suelo. Para ello,

eleccione la dilución en donde se pueden contar de 30 a 300 UFC.
REPORTE
- El número de microorganismos solubilizadores de P por gramo de su suelo de trabajo.

Compare sus datos con los otros suelos de sus compañeros .
- Cuente tanto e l número d e bacterias como de hongos con actividad solubilizadora (si domina
uno u otro grupo de microorganismos, explique de acuerdo a las características fisicoquímicas
de su suelo de trabajo) .
- Discusión y conclusiones.
34
BIBLIOGRAFÍA
Ehrlich, H. L. 1 996. Geomicrobiology. Marcel Dekker, Inc. New York, Basel, Hong Kong.
D ommergues, Y. y F. Mangenot. 1 970. Ecologie Microbienne du Sol. Masson et Cie. Paris.
Alexander, M. 1 977. Introduction to Soil Microbiology. 2nd Ed. Wiley, New York.
Reyes, l., L. Bernier, R. R. Simard, P. Tanguay & H. Antoun. 1 999. Characteristics of
phosphate solubilization by an isolate of a tropical Penicillium rugulosum and two UV-induced
mutants. FEMS Microbio!. Ecol. 28: 29 1 -295.
Fig. 6 . - Solubilización de Ca(P04)2 por una bacteria del suelo.
35
PRÁ CTICA 10. OXIDACI ÓN DE AZUFRE REDUCIDO.
INTRODUCCIÓN
La mayor parte del S del suelo se encuentra baj o forma orgánica. El azufre mineral se
encuentra en los suelos aireados baj o forma de sulfato; en los suelos mal aireados, bajo
forma de sulfuro. El mismo proviene, aunque en bajas cantidades, de la roca madre y
sobre todo de las prácticas agrícolas como fertilizante y de la industria (S02). Hay
cultivos, como la caña de azúcar, que requieren anualmente 1 00 kg de S por hectárea.
Todas estas formas son metabolizadas rnicrobiológicamente en el suelo.
La oxidación completa del S es un proceso bacteriano llevado a cabo por bacterias

autótrofas, aerobias, que son capaces de oxidar el azufre elemental a sulfatos. La
oxidación parcial se lleva a cabo por diferentes microorganismos heterótrofos y el azufre
lo oxidan a hiposulfitos; la oxidación de los hiposulfitos a politionatos y sulfatos la
conducen tanto microorganismos autótrofos como heterótrofos.
Las transformaciones de S por los microorganismos conducen a la formación geológica

de depósitos de azufre y sulfuros, también a la .corrosión del Fe y a la destrucción del
concreto, así como a la acumulación de ácido en las tuberías de drenaje de las minas y en
los suelos.
OBJETIVO
El alumno evaluará la formación de ácido en el suelo por microorganismos cuando

oxidan S elemental a sulfatos previa adición del mismo al suelo y determinará el número
de microorganismos con actividad de oxidación de S .
MATERIAL
Suelo recién colectado y tamizado en malla Flor de azufre
de 2 mm HCl
S elemental Solución acuosa de BaClz al 5%
Balanza Balanza granataria
Potenciómetro Cucharas de plástico
Tubos de ensaye de 1 50 X 1 7 mm con 1 O Charolas para pesar suelo
ml de medio selectivo para oxidadores de S Papel estrasa
Botellas de dilución con 90 ml de agua Mecheros Bunsen
destilada estéril Encendedor o cerillos
Pipetas de 1 O ml estériles Glucosa
Matraces Erlenmeyer de 250 ml Pipetas de 1 ml estériles
Tubos de Kahn
Nota: Vea el apéndice para consultar la fórmula del medio de cultivo.
PROCEDIMIENTO Y LECTURAS
36
A) Ensayo No. 1
-Pese 1 0 g de suelo y determine su humedad.
-Con una segunda muestra de 1 O g de suelo, haga diluciones desde 1 0- 1 a 1 o-6 en botellas
de dilución que contengan 90 ml de agua destilada estéril.
-Inocule con 1 ml de cada una de las diluciones, 3 tubos por dilución, conteniendo medio
para oxidadores de S elemental, colocando en cada tubo, 1 ml de cada dilución
preparada. Incube a 28º C.
-Después de 2 a 3 semanas de incubación, según el tipo de suelo, determine la actividad

microbiológica en cada uno de los tubos, de la siguiente manera:
- Tome de cada tubo, sin agitar el mismo, de 1 a 2 ml del líquido transparente y

coloquelo en un tubo de Kahn.
- Adicione a la muestra: 2 gotas de HCl + 5 gotas de una solución de BaCh al
5%.
- Observe la precipitación del sulfato. Compare siempre con un testigo.
-Para determinar el número de organismos con actividad oxidante de S por gramo de

suelo, utilice las tablas de Me Grady, localizadas en el apéndice.
B) Ensayo No. 2
-Pese 3 muestras de 1 00 g de suelo cada una, coloque cada muestra en matraces

Erlenmeyer de 250 ml. Trate el suelo de la siguiente manera:
Matraz l . Suelo + 0.5 g de azufre elemental
Matraz 2. Suelo + 0.5 g de azufre elemental + glucosa
Matraz 3 . Suelo sin tratar
- Incube a 2 8°C durante 2 semanas
- Mezcle bien el contenido de cada matraz, tome 1 O g, haga una suspensión 1 :2 con agua
y mida el pH.
37
REPORTE
- El número de microorganismos aerobios que oxidan el S por gramo de su suelo de trabajo.

Compare sus datos con los otros suelos de sus compañeros.
- Los valores de pH del suelo sin adicionar S y con adición del mismo elemento.
- Si la actividad de oxidación del S es mayor en un suelo que en otro, explique.
- Discusión y conclusiones.
BIBLIOGRAFÍA
Ehrlich, H. L. 1 996. Geomicrobiology. Marcel Dekker, Inc., New York.

D ommergues, Y. & F. Mangenot. 1 970. Ecologie Microbienne du Sol. Masson et Cie. Paris.
Alexander, M. 1 977. Introduction to Soil Microbiology. 2nd Ed. Wiley, New York.
38
UNIDAD 111. INTERACCI ÓN MICROORGANISMO-PLANTA
PRÁ CTICA 1 1 . PRODUCCI ÓN D E AUXINAS POR Azospirillum ASOCIADO A

UNA PLANTA GRAMÍNEA.
INTRODUCCIÓN
Azospirillum es un bacilo curvo Gram negativo, es extremadamente móvil en medio

semisólido y líquido. Posee un flagelo polar que utiliza para su locomoción y numerosos
flagelos laterales de longitud corta. Azospirillum es típicamente un organismo aerobio cuando
se le suministra una fuente combinada de nitrógeno y posee la capacidad de utilizar el oxígeno
y el nitrato como último aceptar de electrones. Baj o condiciones de microaerofilia, puede fijar
nitrógeno atmosférico.
Azospirillum se ha aislado generalmente de rizósfera y raíces de pastos forraj eros y cereales de

diversas regiones geográficas, con una mayor frecuencia en regiones tropicales que en
templadas. Azospirillum también ha sido aislado a partir de plantas no gramíneas tales como el
camote (Jpomea batatas) y de leguminosas forraj eras (Lotus corniculatus), así como de
cactáceas de los géneros Opuntia y Stenocereus.
Cuando Azospirillum se encuentra asociado a la planta, su aporte de nitrógeno es bastante

discreto y poco significativo. Sin embargo, la mayor aportación que hace este microorganismo
en dicha asociación es la referida a la producción de ácido indol acético, sustancia reguladora
del crecimiento vegetal, por lo que en muchos países es utilizado en la Agricultura con
resultados positivos. Por ello es una de las bacterias que se producen industrialmente en la
elaboración de inoculantes. Al inducir la ramificación y producción de pelos absorbentes en las
raíces, se incrementa la absorción de nutrientes y de agua.
OBJETIVO
El alumno analizará el efecto del Azospirillum in vitro en la inducción de la ramificación de la

radícula de una plántula de maíz.
MATERIAL
Microscopio compuesto y estereoscópico Medio de cultivo para Azospirillum

Cámara de Petroff-Hauser Solución NaCh03 3 : 1 0 ó
Portaobjetos y cubreobjetos Solución de HgCh 1 : 1 000
Cultivo de Azospirillum brasilense Papel seda
Pipetas de 1 y 1 O ml estériles CH3 CH20H de 96º
Agua destilada estéril Aceite de inmersión
Cajas Petri con agar agua Semillas de maíz
Probeta de 250 ml Pinzas de disección, Bisturí
Matraces Erlenmeyer de 1 2 5 ml con tapón de hule Incubadora a 28ºC
39
Frascos de vidrio de boca ancha Vidrios de reloj
PROCEDIMIENTO
Producción del inóculo:
Prepare el medio de cultivo para Azospirillum. Inocule este medio con la cepa de Azospirillum
brasiliense, cuente el número de células por ml en la cámara de Petroff-Hauser, posteriormente
ajuste el número de células a 1 0 6cel/ml, e inocule las plántulas de maíz.
Germinación de semillas :
- Coloque algunas semillas de maíz a estudiar en un matraz Erlenmeyer de 1 2 5 ml con tapón

de hule.
-Cubra las semillas con una solución acuosa de HgCh 1 : 1 000.
-Agite bien para que la superficie del frasco y el tapón se desinfecten también.
- Deje actuar el HgCh por 2 a 5 minutos según el tamaño de la semilla. Después de este
momento se debe trabajar asépticamente.
-Lave la semilla con agua destilada estéril por lo menos 8 veces. Decante cada enjuague en el
frasco de vidrio de boca ancha.
- Ponga a germinar las semillas desinfectadas en cajas de Petri con agar-agua. Una semilla por
caJ a.
- Las semillas se dejan germinar en incubadora a 28°C.
Inoculación de las plantas:
- Cuando la radícula alcance unos 3 cm, inocule cada una con 0.5 ml del cultivo de 48 horas de
Azospirillum y manténgalas en la incubadora.
- Conserve semillas germinadas testigo (sin inocular).
Lectura d e resultados:
- A los 2 días de incubación, coseche las plántulas.
- Observe en el esteromicroscopio la ramificación de las raicillas y la formación de pelos

radiculares comparando con los testigos. Para ello, corte las radículas en pedazos de 2 a 5 cm y
colóquelas en un vidrio de reloj con agua.
40
- Mida el volumen de las raíces con una probeta.
REPORTE
1 .- ¿La cepa de Azospirillum brasilense que probó produce AIA?
2.- ¿Cómo demostró la producción de AIA?
3 .- Explique ampliamente el efecto que tiene el AIA sobre la planta.
BIBLIOGRAF ÍA
Mascarua-Esparza, M.A., Villa-González, R. and Caballero-Mellado, J. . 1 988. Acetylene

reduction and indolacetic acid production by Azospirillum isolates. Plant and Soil. 1 06 : 9 1 -95.
Okon, Y. and J. Vanderleyden. 1 997. Root-associated Azospirillum species can stimulate
plants. ASM News 63 : 366-3 69.
41
PRÁCTICA 12. SIMBIOSIS Rhizobium Y Bradyrhizobium CON PLANTAS
LEGUMINOSAS.
INTRODUCCIÓN
Los miembros de los géneros Rhizobium y Bradyrhizobium infectan las raíces de las plantas
leguminosas formando nódulos, en donde se lleva a cabo la fijación simbiótica del nitrógeno.
La bacteria en cultivo es un bacilo corto Gram negativo, no forma esporas, es aerobio, mide
0.5 micras de diámetro por 1 .2 a 3 .0 micras de largo. Los representantes de este género son
típicamente móviles en cultivo j oven.
Dentro del nódulo, los rizobios presentan pleomorfismo y se les llama bacteroides. Baj o esta
forma en algunas ocasiones aumentan su tamaño hasta 1 O veces. Rhizobium y Bradyrhizobium
están clasificados junto con Agrobacterium y Phyllobacterium en la familia Rhizobiaceae.
Las plantas leguminosas cuando están noduladas efectivamente, fijan cantidades apreciables de
nitrógeno, traduciéndose en un mantenimiento y a veces aumento de la fertilidad del suelo
(Fig. 7).
OBJETIVOS
-El estudiante experimentará la técnica de aislamiento de Rhizobium y Bradyrhizobium a

partir de nódulos de raíces de plantas leguminosas.
-El estudiante diferenciará las características microscópicas de Rhizobium en forma de

bacteroide, así como las características microscópicas y coloniales de los rizobios.
-El estudiante obtendrá plantas leguminosas noduladas con Rhizobium en cultivos

monoxénicos.
MATERIAL
Tubos con tapón de rosca 1 6X 1 30, estériles Microscopio compuesto

Gradilla para tubos Papel seda
Pipetas serológicas de 5 ml Papel estrasa
Solución de HgCh 1 : 1 000 Tijeras
Varilla de vidrio estéril Mechero Bunsen
Agua destilada estéril. Equipo de coloración Gram
Placas con medio ALM, unas con Rojo Congo y CH3 CH20H de 96º
otras con Azul de Bromotimol Asa microbiológica
Tubos de 1 6X 1 50, con tapón de rosca, con Encendedor o cerillos
solución nutritiva-N-agar blando sembrados con Plantas leguminosas con nódulos
semillas de trébol radicales
42
Tubos de 1 6X 1 50, con tapón de rosca, con Suspensión bacteriana de
solución nutritiva completa-agar blando, Rhizobium leguminosarum bv.
sembrados con semillas de trébol trifolii
Portaobj etos
PROCEDIMIENTO
Aislamiento
- Lave las raíces, abundantemente con agua de la llave. De las mismas, desprenda los nódulos
sin lesionados, dejando una porción de raíz de cada lado del nódulo. Dentro de un tubo de
ensayo sumerj a un sólo nódulo en HgCh 1 : 1 000, durante 1 a 3 minutos, según el tamaño.
-A partir de este momento, trabaj e en condiciones asépticas.
-Dentro del mismo tubo, lave con agua estéril por lo menos 5 veces para eliminar totalmente el
antiséptico. Triture el nódulo desinfectado con una varilla de vidrio estéril dentro del tubo
donde se desinfectó.
-Del triturado del nódulo tome una asada para hacer un frotis que se colorea con la técnica de
Gram para la observación de la forma bacteroide.
-Del mismo triturado tome otra asada que se siembra por estría cruzada sobre el medio de
Agar-Levadura-Manitol (ALM ) con indicador Rojo Congo y otra, sobre el medio que lleva el
indicador Azul de Bromotimol.
-Incube a 2 8ºC por 2 días para los rizobios de crecimiento rápido (Rhizobium) y de 6 a 8 días
para los de crecimiento lento (Bradyrhizobium).
- Observe la morfología colonial en el medio de cultivo que lleva Rojo Congo (los rizobios no
absorben el colorante), así como la modificación del pH original, en el medio con azul de
bromotimol.
- Haga un frotis de las colonias y tíñalo con la técnica de Gram.
Obtención del cultivo monoxénico leguminosa-Rhizobium
- Una vez que las semillas de trébol han germinado y las plántulas han alcanzado un mínimo de
1 cm de altura, inocule cada planta con 0.2 ml de la suspensión bacteriana que se le
proporcione, de la siguiente forma:
Tubos con solución nutritiva completa: inocular un tubo y el otro dejarlo sin
inocular.
Tubos con solución nutritiva sin nitrógeno: inocular un tubo y otro dejarlo sin
inocular.
43
Incube los tubos con iluminación (fotoperiodo de 1 2/ 1 2), a 28º C, por un mes; realice
observaciones dos veces a la semana.
REPORTE
1 .- Observaciones microscópicas de bacteria y bacteroide (Incluya esquemas).
2.- Morfología colonial en ALM-Rojo Congo y en ALM-Azul de Bromotimol (recuerde que

debe incluir cambios en el medio).
3.- Observaciones macroscópicas del cultivo leguminosa-Rhizobium.
44
BIBLIOGRAFÍ A
CIAT-UNDP. 1 987. Simbiosis Leguminosa-Rizobio. Manual de Métodos de Evaluación,

Selección y Manejo. CIAT. Cali.
Somasegaran, P. & Hoben, H.J. 1 985. Methods in Legume Rhizobium Technology. NIFTAL
& MIRCEN, Hawaii.
Spaink, H., A. Kondorosi and P.J.J. Hooykaas, Eds. 1 998. The Rhizobiaceae. Kluwer
Academic Publishers, Holanda.
Fotos José Luis Chalqueño
Fig. 7.- Nódulos y bacteroides de Rhizobium leguminosarum biovar viciae.
45
PRÁCTICA 13. SIMBIOSIS Frankia-PLANTAS ACTINORRÍZICAS.
INTRODUCCIÓN
La primera descripción de nódulos radicales fijadores de nitrógeno atmosférico en plantas no

leguminosas data desde 1 866 y fue hecha en el árbol A lnus glutinosa (Fig. 8)
Los árboles y arbustos que forman nódulos radicales en asociación con Frankia, son conocidos
como plantas actinorrízicas pues este microorganismo fijador de nitrógeno molecular es un
actinomiceto.
Se conocen 25 géneros de plantas actinorrízicas los cuales pertenecen a ocho diferentes

familias botánicas. Algunas de estas familias son: Betulaceae, Casuarinaceae, Myricaceae,
Rhamnaceae y Rosaceae. La mayoría son capaces de fijar altas cantidades de nitrógeno
atmosférico, por ej emplo, Casuarina littoralis puede fijar el equivalente a 290 Kg de
N/ha/año. Aunque estas plantas son taxonómicamente muy diversas, tienen en común el ser
perennes, leñosas y pioneras en suelos marginales. Algunas de estas plantas producen madera
de buena calidad, leña de alto valor calorífico, estabilizan dunas, son buenas cortinas
rompevientos, se usan en reforestación urbana y rural, etc. En México existe un buen número
de ellas, las más conocidas son Casuarina y A lnus (elite o aile), plantas de múltiples usos en
nuestro país .
La bacteria que se encuentra dentro de los nódulos, se logró cultivar en 1 978, aunque hasta la
fecha no se ha logrado el cultivo de las Frankia de todas las especies vegetales que se conocen
como portadoras de nódulos . Frankia es una bacteria Gram positiva, filamentosa y con
estructuras típicas : esporangios multiloculares y vesículas. En estas últimas se encuentra la
enzima nitrogenasa que es la responsable de la fijación del nitrógeno atmosférico.
OBJETIVO
El estudiante analizará el efecto que ejerce la asociac10n de algunos árboles con el

actinomiceto fijador de nitrógeno, Frankia. También identificará a la bacteria en cultivo puro,
así como dentro de las células corticales de los nódulos.
MATERIAL
Microscopio compuesto Mechero Bunsen

Microscopio estereoscópico Encendedor o cerillos
Portaobjetos Frasco gotero con solución de azul de algodón al 1 %
Cubreobj etos Navaj as nuevas de afeitar (doble filo)
Pipetas Pasteur estériles Empaque de unicel
CH3-CH20H de 96º Plantas de aile o de casuarina con y sin nódulos radicales
Papel seda Cultivo puro líquido de Frankia
Tijeras Vidrios de reloj
46
PROCEDIMIENTO
- Tome una gota de un cultivo puro líquido de Frankia y colóquela entre porta y cubreobjetos .
- Observe a l microscopio l a morfología d e las microcolonias con e l objetivo: 1 OX, y la

morfología de las vesículas y esporangios con el objetivo: l OOX.
- Observe y analice los ej emplares de plantas de aile inoculados y sin inocular.
- Tome un lóbulo de un nódulo de aile (A lnus). Colóquelo entre dos pedazos de empaque de
unicel.
- Coloque la unidad (lóbulo y empaque) firmemente entre el índice y el pulgar de la mano

izquierda.
- Haga varios cortes transversales finos con una navaja de afeitar y colóquelos en un vidrio de
reloj con agua.
- Seleccione los cortes más finos, procure que sean del mismo grosor, y colóquelos entre porta
y cubreobj etos, adicione una gota de azul de algodón.
- Observe al microscopio (objetivos l OX y 40X)
REPORTE
1 .-Describa la morfología microscópica de Frankia en cultivo puro. Dibuj e las diferentes

estructuras características de la bacteria.
2.-Dibuj e un corte transversal de un nódulo actinorrízico y describa sus partes. Describa las
vesículas y las células radicales donde se alojan.
3 . - Escriba las observaciones que haya efectuado sobre los arbolitos inoculados y sin inocular.
47
BIBLIOGRAFÍA
D ommergues, Y., E. Duhoux et Diem, H.G. 1 999. Les arbres fixateurs d'azote. CIRAD.
Editions Espaces 34, F AO, IRD, París, Francia.
Schwintzer, C.R. y Tjepkema, J.D. 1 990. The Biology of Frankia and Actinorrhizal Plants.
Academic Press, Inc., New York.
Valdés, M. 2003 . Frankia Ecology. In: K. Kowlowsky y W.E. Newton (Eds.). Actinorrhizal
Simbiosis. Kluwer Academic Publishers, Holanda.
Valdés, M. 2003 . La bacteria filamentosa Frankia. In: Microbios en Línea. J. y E. Martínez
Romero (Eds.). DGTA/UNAM, México.
Foto: Luis Vásquez
Fig. 8 . Filamentos, vesículas y esporangios de la bacteria Frankia.
48
PRÁCTICA 14. ECTOMICORRIZAS
INTRODUCCIÓN
El término micorriza significa literalmente hongo-raíz y se refiere a una estructura radical

resultado de la asociación entre los pelos radicales de una planta y hongos específicos del
suelo. Casi todas las plantas forman micorriza y existen diversos tipos de esta asociación, las
más distribuídas en la naturaleza son la ectomicorriza y la endomicorriza o micorriza
arbuscular (MA). La primera es visible a simple vista, basta con observar la deformación de las
raicillas; mientras que para observar la MA es necesario hidrolizar las raicillas, teñirlas y
examinarlas al microscopio para observar los arbúsculos que todos los hongos de este tipo
forman, así como las vesículas que algunos de ellos presentan.
La ectomicorriza (Fig. 9), está presente en árboles de la familia Pinaceae (pino, abeto, alerce),
Fagaceae (roble, castaño), Betulaceae (aile, aliso o elite, abedul). Salicaceae (chopo),
Juglandaceae (nogal), Myrtaceae (eucalipto), etc. Los hongos que forman este tipo de
micorriza son diversos Ascomicetos y Basidiomicetos, muy abundantes en los bosques de
pinos en la época de lluvias.
OBJETIVO
El estudiante analizará las bases para distinguir las ectomicorrizas formadas en plántulas de
pino por diferentes hongos.
MATERIAL
Plántulas de pino con ectomicorrizas, de vivero Pipetas Pasteur

Plántulas de pino, inoculadas y sin inocular, Trozo de unicel
cultivadas en bolsas de crecimiento o en maceta Aguja de disección
Cultivo de hongos ectomicorrícicos Vidrio de reloj
Estereomicroscopi o Microscopio compuesto
Porta y cubreobjetos CH3CH20H del 96º
Navaja nueva de afeitar de doble filo Papel seda
Frasco gotero con solución de azul de algodón al 1 %
PROCEDIMIENTO
1 .- Lave abundantemente las raíces con agua de la llave. A simple vista, observe el color de las
diferentes micorrizas de una sola raíz, así como la diferente morfología de las mismas
(bifurcada, pinada coraloide, etc.).
-Observe con el estereomicroscopio los diferentes tipos de ectomicorriza.
-Separe una muestra de ectomicorriza y colóquela entre dos pedazos de unicel.
49
-Coloque la unidad (micorriza y empaque) firmemente entre los dedos índice, pulgar y medio
de su mano izquierda.
-Haga 20 cortes transversales finos con una navaja nueva de afeitar. Póngalos en un vidrio de
reloj con agua.
-Coloque los cortes más finos entre porta y cubreobj etos. Procure que sean del mismo grosor,
agregue una gota de azul de algodón.
-Observe al microscopio a 1 OX y 40X.
2.- Observe las raíces de las plantas inoculadas y sin inocular, realice observaciones al
estereomicroscopio. -En caso de que encuentre ectomicorrizas, determine cuál es su morfotipo.
REPORTE
1 - Describa los morfotipos de las diferentes micorrizas presentes en la raíz estudiada.
2.- Morfología microscópica de un hongo ectomicorrícico (Basidiomiceto).
3 .- Géneros de algunos hongos ectomicorrícicos.
4.- Describa las observaciones hechas en los pinos inoculados y sin inocular, cultivados en
bolsas de crecimiento o en maceta.
50
BIBLIOGRAF ÍA
Brundett, M., Bougher, N., D ell, B., Grove, T. and Malajczuk, N. 1 996. Working with
mycorrhizas in foresty and agriculture. ACIAR Monograph 32, Canberra, Australia.
Ingleby, K., Mason, P.A., Last, F.T. y Fleming, L.V. 1 990. Identification of
Ectomycorrhizas. Institute of Terrestrial Ecology. HMSO, London.
Landis, T.D., Tinus, R.W., McDonald, S.E. y Barnett, J.P. 1 990. The Biological
Component: Nursery Pest and Mycorrhizae. In: Forest Service. Tree Nursery Manual, Vol. 5 .
Agriculture Handbook 674. U . S Departament o f Agriculture, Corvallis, Oregon.
Vogt, K., H. Asbjornsen, A. Ercelawn, F. Montagnini and M. Valdés. 1 997. Roots and
mycorrhizas in plantation ecosystems. In: Management of soil, nutrients and water in tropical
plantation forests. ACIAR/CSIRO/CIFOR, Canberra, Australia.
51
C. Typical angiosperm mycorrhiza D. Pine mycorrhizae
� Short __...
roots
E. Typical angiosperm mycorrhiza F. Typical gymnosperm mycorrhiza
Epidermal cells
Hartig net hyphae
Hypodermrs
Fig. 9 . - Ectomicorriza en Angiospermas y Gimnospermas (Brundett et al, 1 996).
52
PRÁCTICA 15. ENDOMICORRIZAS
INTRODUCCIÓN
La MA (Fig. 10),es el tipo de micorriza más ampliamente distribuida y está presente en la

mayoría de las plantas cultivadas tales como: cereales, papas, frijoles, soya, tomate; en la
mayoría de los árboles frutales como cítricos, perales, manzano, parra, almendro; en muchos
árboles de importancia forestal como el arce, caoba, fresno, liquidámbar y en las hortalizas
como cebollas, poro, espinacas. También los pastos, las plantas herbáceas y los cactos forman
MA. Los hongos formadores de este tipo de micorriza pertenecen al orden Glomeromycota,
familias Gigasporaceae, Acaulosporaceae y Glomaceae.
Los hongos micorrízicos benefician a las plantas hospederas en diversas formas, algunas de
ellas son: incremento de la longevidad de los pelos radicales, incremento del área de absorción,
incremento de la absorción de nutrientes tanto mayores como menores (sobre todo fósforo,
potasio, cobre y zinc) y tolerancia a condiciones adversas.
OBJETIVO
El estudiante demostrará la presencia de micorriza arbuscular en raíces de plantas de interés

agronómico, así como la presencia en el suelo de esporas de este tipo de hongos.
MATERIAL
Raicillas de diferentes plantas Soporte universal con anillos de fierro

Muestras de suelo fresco Embudo de vidrio tallo corto de 26 cm de
Vasos de precipitado de 1 000 ml diámetro.
Matraces Erlenmeyer de 1 2 5 ml Palillos de madera
Cajas de Petri Papel filtro
Agujas de disección Tijeras
Porta y cubreobjetos excavados Pipetas serológicas de 5 ml
Viales de vidrio de 5- 1 0 ml Pi setas
Estereomicroscopio Embudos de porcelana de 1 O cm de diámetro
Microscopio compuesto Solución de KOH al 1 0%
Plancha caliente Solución de HCl l N
Juego de tamices de > 250 mm a 0. 1 77 mm Fucsina ácida en lactoglicerol al 0 . 0 1 %
Balanza granataria
PROCEDIMIENTO
Procesamiento de raíces para ver micorrización:
-Lave abundantemente las raíces con agua de la llave para eliminar el suelo adherido.
53
-Corte las raicillas tiernas en pedazos de 1 cm en una caja Petri.
-Coloque las raicillas en los viales y cúbralas con la solución de KOH.
-Caliente el vial en placa a 90 ºC, por 1 O a 1 5 minutos o hasta que las raicillas liberen los
pigmentos y estén blandas.
-Elimine el KOH, lave de 2-3 veces con agua de la llave y acidifique con la solución de HCl,
agite de 5 a 1 0 minutos, para que su pH baje entre 2.5 y 3 .0, para ello, agite el contenido del
vial durante 1 0 minutos. Este paso de acidificación es importante para que haya una buena
coloración.
-Elimine el HCl. NO lave con agua
-Cubra las raicillas con el colorante y caliente en placa a 90ºC por un período de 1 O minutos.
-Monte 20 raicillas en un portaobjetos en forma vertical, paralelas unas a las otras.
-Después de colocar el cubreobjetos, cubra con un papel absorbente y con un pedazo de

madera presione uniformemente para aplastar las raicillas. Cuide que no se formen burbujas de
aire.
-Observe al microscopio a 1 OOX para identificar las estructuras fúngicas: hifas, arbúsculos,
esporas y vesículas.
-Haga la estimación del porcentaj e de colonización revisando 3 campos equidistantes por cada
segmento de raíz (ver esquema en la página siguiente).
-Cuando un pedazo de raíz pasa por el campo óptico del microscopio y tiene alguna estructura
fúngica de micorriza arbuscular, se le da valor igual a 1
CÁLCULOS
Número de puntos colonizados

Porcentaj e de colonización = Número tgtal de puntrn� gb�ervadm;
54
Inicio
Esquema de observación al micro scopio de raíces endomicorrizadas teñidas .
Procesamiento de suelo para extraer esporas de hongos MA:
-Coloque 1 00 g de suelo en un vaso de precipitados de 1 000 ml. Agregue 1 50 ml de solución

de hexametafosfato de sodio al 5% y lleve a 1 000 ml con agua de la llave, mezcle
perfectamente deshaciendo todos los terrones; decante. Tamice primero con malla de 2 mm y
después con malla de 0. 1 77 mm (Fig. 11).
-Con el chorro de agua de una piseta baje las esporas (también habrá material orgánico y
mineral del suelo) del tamiz de abertura pequeña y vacíe sobre un papel filtro circular colocado
en un embudo de porcelana. Para hacer la observación al estereomicroscopio, coloque el papel
filtro en la tapa de una caja de Petri.
-Busque al estereomicroscopio las esporas de los hongos MA.
-Con la ayuda de un palillo de madera o de un pincel fino, tome las esporas y colóquelas sobre
un portaobjetos para observarlas al microscopio ( I OX). Las esporas fracturadas muestran mej or
sus paredes (recuerde que el análisis murámico es la base para la identificación taxonómica de
estos hongos).
REPORTE
! .-Esquematice las estructuras fúngicas de la micorriza arbuscular observadas en el interior y

exterior de las raicillas.
55
2 .-Morfología de las esporas de los hongos MA.
3 .-¿Cómo diferenció las estructuras de los hongos MA de la de otros hongos que pueden
también ser habitantes radicales y que no son rnicorrizicos?
4.- Mencione algunos géneros pertenecientes al orden Glomales.
BIBLIOGRAFÍA
Brundett, M., Bougher, N., Dell, B., Grove, T. and Malajczuk, N. 1 996. Working with
mycorrhizas in foresty and agriculture . ACIAR Monograph 32, Canberra, Australia.
Sieverding, E. 1 99 1 . Vesicular-Arbuscular Management in tropical ecosystems. D.G.T.Z.
Eschbom, Alemania.
Norris, J.R., D. J. Read and A.K. Varma, Eds. 1 992. Methods in Microbiology. Volume 24
Techniques for the study of mycorrhiza. Academic Press. New York.
Gianinazzi, S. and H. Schüepp, Eds. 1 994. Impact of arbuscular mycorrhizas on sustainable
agriculture and natural ecosystems. Birkhauser Verlag, Basilea, Suiza.
56
A. Root C. VAM
systen'I with fungus sporc
cxtcrn:il showing wan
hyphae and structure
sporcs
B. Spores o( D. VAM funzi

VAM fungi within deared
separated .md stained
from soil roots
Fig. 1 0 . - Micorriza arbuscular (Bmndett et al. , 1 996).
57
Suelo lavado
con agua
6�10 veces
Tam•ft o do ln
Fracciones del
suelo
Papel
mtro
Esporas a
0.25 mm papel filtro
'
0.10 mm .
> 250 µm
100 - 250 µm
O.OS mm
50 - 100 µm
.:.gua
Fig. 1 1 . - Procedimiento p ara la extracción de esporas de hongos MA, de muestras

de suelo .
58
APÉNDICE
CÁLCULO DEL N ÚMERO MAS PROBABLE DE BACTERIAS POR EL M ÉTODO DE Me GRADY
La lectura de los resultados consiste en contar para cada dilución el número de tubos positivos que implican
crecimiento. Se debe admitir que la presencia de un microorganismo viable en el inóculo es necesario y suficiente
para que haya tal crecimiento.
La determinación del número más probable de microorganismos se deduce del número de tubos positivos
encontrados para las diluciones consecutivas.
! .-Orden de los resultados.- Hacer un cuadro indicando, para cada dilución, el número de tubos positivos. Se dan
cuatro ejemplos.
1 0- I 1 0-2 1 0- 3 1 0-4 1 0-s 1 0-6 1 0- 7 1 0-8
Ejemplo 1
Para 3 tubos/di! 3 3 3 2 o o o
Ejemplo 11
Para 5 tubos/di! 5 3 2 o o o o o
Ejemplo lII
Para 5 tubos/di! 5 5 5 5 3 2 2 o
Ejemplo IV
Para 5 tubos/di! 2 2 o o o o o
2.-Determinación del número característico (3 cifras). La última dilución (de izquierda a derecha), donde todos
los tubos son positivos, será la primera cifra del número característico; los dos siguientes son aquellos del número
de tubos positivos para cada una de las dos diluciones siguientes.
Para los siguientes ejemplos tenemos:
Ej emplo 1 = 321 para la dilución 1 0-3
Ejemplo 11 = 532 para la dilución 1 0- 1
Ejemplo III = 532 para la dilución 1 0-4
Ej emplo IV = 2 1 2 para la dilución 1 0- 1
3 .-Determinación del número más probable de microorganismos. Existe para cada número de repeticiones, una
tabla que da el número más probable de microorganismos contenidos en el volumen del inóculo de acuerdo a la
dilución correspondiente y al número característico.
Para los mismos ejemplos admitiendo que la inoculación se hizo con 1 mi:
Ejemplo ! 1 5 .0 microorganismos en 1 ml de la dilución 1 0- 3

Ejemplo II 1 4.0 microorganismos en 1 mi de la dilución 1 0- 1
Ejemplo II I 14.0 microorganismos en 1 ml de la dilución 1 0-4
Ejemplo IV 1 .2 microorganismos en 1 mi de la dilución 1 0- 1
59
Se lleva enseguida a l g de suelo, dividiendo por el volumen en ml de inóculo y multiplicando por el inverso del
valor absoluto del exponente de la dilución considerada.
Resultados para los mismos ejemplos:
3
Ejemplo ! = 1 5 .0 X 10 1 5 000/g de suelo
Ejemplo I I = 14.0 X 101 140/g de suelo
4
Ejemplo III = 1 4.0 X 10 1 40 000/g de suelo
Ejemplo IV = l .2 X l 01 1 2/g de suelo
Trazado de las curvas de actividad biológica
! .-Orden de los resultados. Se opera igual que para la determinación del NMP, anotando el número de tubos + y
±; cada + se cuenta por 1 y cada ± por 0.5 para cada dilución. El ejemplo siguiente es para tres tubos por dilución.
2 3 4
1 0- I 1 0- 1 0- 1 0- 1 0-5 1 0 -6 1 0-7 1 0 -8
Después de:
l día
2 +++ +++
3 +++ +++ +++ + +
4 +++ +++ +++ +++ +++ ++
5 +++ +++ +++ +++ +++ +++
6 +++ +++ +++ +++ +++ +++
7 +++ +++ +++ +++ +++ +++
9 +++ +++ +++ +++ +++ +++
12 +++ +++ +++ +++ +++ +++
15 +++ +++ +++ +++ +++ +++
60
2. -Cálculo de la dilución media. Se calcula, para cada día el índice de la dilución media límite, que se expresa así:
78
Número total de los tubos positivos
IDM
Número de tubos inoculados por dilución
Ej emplo precedente:
Tiempo de la lectura (días) Índice de la dilución media
2 - 6.013 =
-2
3 - 1 0. 5/3 = -4.5
4 - 1 7.0/3 =
-5.3
5 - 1 8. 0/3 = -6.0
7 - 1 8.0/3 = -6.0
9 - 1 8.0/3 = -6.0
12 - 1 8 .0/3 =
-6.0
15 - 1 8 .0/3 =
-6.0
61
3 .-Transcripción gráfica. La curva siguiente se hace en papel milimétrico colocando en las abcisas los días y en
las ordenadas, los índices de dilución. Por regla general entre más acentuada es la pendiente inicial de la curva y
más grande es la dilución final, más activo es el grupo funcional de microorganismos.
TABLAS DE Me GRADY
3 tubos /dilución
Número Número Número Número

Característico de Característico de
Microorganismos Microorganismos
000 O.O 222 3.5

001 0.3 223 4.0
010 0.3 230 3.0
01 1 0.6 23 1 3.5
020 0.6 232 4.0
1 00 0.4 300 2.5
101 0.7 301 4.0
1 02 1.1 302 6.5
1 10 0.7 310 4.5
111 1.1 311 7.5
1 20 1.1 312 1 1 .5
121 1 .5 313 1 6.0
1 30 1 .6 320 9.5
200 0.9 321 1 5 .0
201 1 .4 322 20.0
202 2.0 323 30.0
210 1 .5 330 2 5 .0
21 1 2.0 33 1 45.0
212 3.0 332 1 1 0.0
220 2.0 333 1 40.0
221 3.0
Prác t i c a N . 4
Soluciones para la determinación de materia orgánica del suelo
l . K2Cr207 1 N. Se disuelven 49.025 g de K2Cr207 QP en agua destilada, aforar a 1 000 ml.

2. FeS04.7H20 IN. Disolver 278 g de FeS04.7H20 QP en agua destilada, agregar 1 5 ml de H2S04 concentrado
y aforar a 1 000 mi.
3 . Indicador de difenilamina. Disolver 0.5 g de difenilamina en 20 mi de agua y 1 00 mi de H2SÜ4 concentrado.
62
P r á c t i c a No . 5
Soluciones para la determinación de la capacidad de intercambio catiónico total.
l. Solución de CaC)z IN pH 7.- Pesar 1 09.5 g de CaC12. 6H20 o 73 .5 g de CaC!i.2H20, aforar a 1 000 mi con
agua destilada libre de C02 y ajustar el pH a 7 con Ca(OH)2.
2. Solución de NaCI IN pH 7.- Disolver 58.5 g de NaCl en un poco de agua destilada y aforar a 1 000 mi.
3. Solución de EDTA (versenato).- Disolver 20 g de EDTA deshidratado (secado en un desecador) en 900 mi
de agua destilada en la que previamente se disolvieron 0.39 g de MgCl2.6H20 y aforar a 1 000 ml con agua
destilada. Esta solución es 0 . 1 N y debe guardarse en un frasco de polietileno ya que su título cambia en frasco
de vidrio .
4. Solución amortiguadora pH 10.- Disolver 6 7 . 5 g de NH4Cl e n 2 0 0 m l d e agua destilada, adicionar 5 7 0 mi
de NH40H concentrado y diluir con agua destilada a 1 000 ml.
5. Solución de clorhidrato de hidroxilamina.- Disolver 4 g de NH20H-HC1 en 1 00 ml de agua destilada.
6. Solución de cianuro de potasio al 2 %.- Disolver 2 g de KCN en 1 00 mi de agua destilada.
7. Solución indicadora de negro de eriocromo T.- Disolver 0.5 g de eriocromo T y 4.5 g de NH20H-HC1 en
1 00 ml de alcohol metílico. Preparar una solución nueva cada 3 semanas.
8. Solución estándar de calcio.- Disolver 0.5005 g de CaC03 grado reactivo y secado a 1 50ºC en 5 mi de
solución de HCl 6N; esta solución es 0.01 N.
Prác t i c a No . 6
Rosa de Bengala Fenólico
Rosa de Bengala 1 .0 g
CaClz 0.3 g
Agregar estas dos sustancias a 1 00 ml de una solución acuosa de fenol al 5%.
Prác t i c a No . 7
Preparación de silicagel:
A.- Acido clorhídrico d= 1 . 1 9 61 ml

Agua destilada 39 ml
B.- Silicato de sodio d= 1 .32 18 ml
Agua destilada 82 ml
Mezclar volumenes iguales, se vierte el silicato de sodio en el ácido clorhídrico (mezclar B en A) agitar y
repartir 30 ml por cada caja Petri. Dejar solidificar (2-3 h) . Dializar con agua de la llave hasta pH 7.0 ( 1 2-24 h)
colocando las caj as sin tapa en una charola donde el agua de la llave corra.
Impregnación del gel.- Impregnar las placas con 2 ml del medio siguiente:
Solución salina de Winogradsky 1 00.0 ml

Carbonato de calcio 20.0 g
Glucosa 20.0 g
63
Preparación de la solución salina de Winogradsky:
K1HP04 5.0 g
MgS04.7H20 2.5 g
NaCI 2.5 g
MnS04.H20 0.05 g
Fe2(S04)3 0.05 g
NOTA: El CaC03 se agrega como agente neutralizador.
P rá c t i c a No . 8
Medio líquido para amonificación (Pochon & Tardieux, 1 962).
Solución salina de Winogradsky 50 mi

Asparagina u otro aminoácido 0.2 g
Solución de oligoelementos 1 mi
Agua destilada 950 mi
Solución de Oligoelementos
Molibdato de potasio 0.05 g

Borato de sodio 0.05 g
Citrato de Fierro al 1 % 2.0 mi
Nitrato de Cobalto 0.05 g
Sulfato de Cadmio 0.05 g
Sulfato de Cobre 0.05 g
Sulfato de zinc 0 . 05 g
Sulfato de Manganeso 0.05 g
Agua destilada 1 000 mi
Hacer pasar una corriente de C02 en la solución.
Reactivo de Nessler
Solución A: Yoduro mercúrico 50 g

Yoduro de potasio 36.5 g
Triturar en un mortero y añadir poco a poco 1 000 ml de agua destilada
Solución B : Hidróxico de potasio 1 50 g

Agua destilada CSP 1 000 ml
Momentos antes de ser usada, hacer la mezcla de las soluciones en partes iguales.
64
Práctica No.9
Medio para solubilización de P (Medio Modificado Mínimo de Reyes et al. 1 999).
NH4Cl 0.4 Og
KN03 0.78 g
NaCl 0. 1 0 g
MgS04.7H20 O.SO g
CaClz.H20 0. 1 0 g
FeS04.7H20 1 . 5 6 mg
ZnS04.7H20 1 .40 mg
Glucosa 1 0. 0 g
Agar 20.0 g
El P se adiciona al medio en fomrn de Ca(P04)2 a 4 g por litro y el pH se ajusta a 6.5
P r á c t i c a No . 1 0
Medio para la oxidación del S (Pochon & Tardieux, 1 962).
KzHP04 0.25 g
MgCL2 0. 1 0 g
NaCI 0. 1 0 g
NH4NÜ3 2.00 g
CaC03 5 . 00 g
H20 csp 1 . 000 L
El medio se distribuye a razón de 5 mi por tubo utilizando tubos de ensaye de 22 mi. Se tapan los tubos con
algodón y se esterilizan en autoclave por 20 minitos a 1 1 OºC.
Posteriormente se adiciona por tubo alrededor de 50 mg de flor de azufre, sin agitar.
Prác t i c a No . 1 1
Medio de Jain y Patriquin
Acido succínico 2.500 g

Cloruro de sodio 0 . 1 00 g
Sulfato de Magnesio 0 . 200 g
Cloruro de calcio 0 . 020 g
Cloruro férrico 0. 0 1 0 g
Molibdato de sodio 0 . 002 g
Cloruro de amonio 1 .0 g
Las siguientes soluciones se esterilizan por separado y por filtración y se agregan al medio de Jain y Patriquin.
Solución de fosfatos pH 7.0
Fosfato dibásico de potasio 12 %

Fosfato monobásico de potasio 8%
Triptófano l mg/ml
65
Fructosa 5%
pH final de la solución = 6.8
Nota importante :
Al medio base (40 mi por matraz) se le agrega:
2 . 5 ml de cada uno de los fosfatos
2 . 5 mi de fructosa
5.0 ml de triptófano
Reactivo de Salkowski
Cloruro férrico 0.4058 g

Agua destilada 33.0 mi
Acido sulfürico 20.0 ml
Agar-Levadura-Manitol
Manito! 1 0.0 g
Extracto de levadura 0.4 g
K1HP04 0.5 g
MgS04• 7H20 0.2 g
NaCI 0.1 g
Roj o Congo (Sol. acuosa 1 :400) 1 0. 0 ml
Agar bacteriológico 1 8 .0 g
pH final 6.8-7.0
Esterilizar por 20 minutos a 1 1 OºC
NOTA: Cuando al medio se le adiciona Azul de Bromotimol (5 ml/l en sol. alcohólica al 0. 5%), no se le agrega el
Rojo Congo. Se adiciona CaC03 cuando se requiere un agente neutralizador.
Solución de Fucsina ácida en Iactoglicerol
Fucsina ácida 0.01 g

Lactoglicerol 1 00 ml
Lactoglicerol
Acido acético 875 mi

Glicerol 63 mi
Agua 63 ml
66

Ecología microbiana del suelo: grupos funcionales y simbiosis microorganismo-planta

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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

ECOLOGÍA MICROBIANA DEL SUELO

Objetivos del curso iii

UNIDAD I. El hábitat de los microorganismos del Suelo

Humedad relativa y capacidad de retención de agua 5

Capacidad de intercambio iónico 16

UNIDAD 11. Grupos funcionales microbianos 19

Paisaje microbiano del suelo 21

Fijación asimbiótica de nitrógeno 25

Mineralización del nitrógeno orgánico 30

Solubilización del fósforo insoluble 33

Oxidación de azufre reducido 36

UNIDAD Ill. Interacción microorganismo-planta

Producción de auxinas por Azospirillum asociado a una planta Gramínea 39

Simbiosis Rhizobium y Bradyrhizobium con plantas Leguminosas 42

Simbiosis Frankia-Plantas Actinorrízicas 46

Simbiosis de las plantas con bongos Ectomicorrízicos 49

Simbiosis de las plantas con bongos Micorrízico-Arbusculares 53

- Capacitar al estudiante, a través de la experimentación con las mismas técnicas, para

El Compendio está dividido en cuatro grandes partes:

En la primera se presentan las técnicas para el estudio de algunas características físicas y

La segunda parte se refiere a las poblaciones microbianas del suelo en su conjunto y a la

OBJETIVOS GENERALES DEL CURSO

El estudiante, como resultado de este curso:

- Aprenderá a integrar los conocimientos adquiridos en otros cursos, como

- Podrá demostrar la actividad de los principales grupos microbianos responsables de

a) Interacciones entre las comunidades microbianas y el suelo.

b) Interacciones entre las comunidades microbianas y la vegetación.

c) Interacciones al interior de las comunidades microbianas.

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS;

ECOLOGÍA MICROBIANA DEL SUELO

Objetivos del curso iii

UNIDAD I. El hábitat de los microorganismos del Suelo

Humedad relativa y capacidad de retención de agua 5

Capacidad de intercambio iónico 16

UNIDAD 11. Grupos funcionales microbianos 19

Paisaje microbiano del suelo 21

Fijación asimbiótica de nitrógeno 25

Mineralización del nitrógeno orgánico 30

Solubilización del fósforo insoluble 33

Oxidación de azufre reducido 36

UNIDAD llI. Interacción microorganismo-planta

Producción de auxinas por Azospirillum asociado a una planta Gramínea 39

Simbiosis Rhizobium y Bradyrhizobium con plantas Leguminosas 42

Simbiosis Frankia-Plantas Actinorrízicas 46

Simbiosis de las plantas con hongos Ectornicorrízicos 49

Simbiosis de las plantas con hongos Micorrízico-Arbusculares 53

- Capacitar al estudiante, a través de la experimentación con las mismas técnicas, para

El Compendio está dividido en cuatro grandes partes:

En la primera se presentan las técnicas para el estudio de algunas características físicas y

La segunda parte se refiere a las poblaciones microbianas del suelo en su conjunto y a la

OBJETIVOS GENERALES DEL CURSO

El estudiante, como resultado de este curso:

- Aprenderá a integrar los conocimientos adquiridos en otros cursos, como

- Podrá demostrar la actividad de los principales grupos microbianos responsables de

a) Interacciones entre las comunidades microbianas y el suelo.

b) Interacciones entre las comunidades microbianas y la vegetación.

c) Interacciones al interior de las comunidades microbianas.

PRÁ CTICA 1.- TEXTURA

Hidrómetro de Bouyoucos Peróxido de hidrógeno al 30 %

Eliminación de la materia orgánica.

Vierta la muestra preparada en el vaso de la batidora o licuadora y agregue suficiente agua