Tcnicas de muestreo para el control microbiolgico.

Dr. Keiko Shirai

Muestreo Es la sucesin de pasos para asegurar que la muestra posea las caractersticas esenciales del lote. Muestra Una porcin de material tomada y seleccionada de tal forma que sea representativa del lote (IUPAC).

La muestra seleccionada para el anlisis debe ser representativa del lote entero del alimento y lo suficientemente grande para poder llevar acabo todas las determinaciones. La tcnica de anlisis sea ejecutada con estricto apego a la metodologa establecida. Comparacin con normas o estndares de calidad

Para realizar un muestreo en forma prctica se utiliza el "Sentido Comn". La experiencia de los procesos de fabricacin permite que el muestreo puede resolverse al tanteo.

Ejemplo 1: tomando muestras al principio y al final de la jornada; Ejemplo 2: tomando como muestra el ltimo producto de cada serie (como se hace con algunos alimentos precocidos y congelados).

Criterios Generales de Muestreo.

Todo el material que se use debe esterilizarse y envolverse. Al colectar la muestra hay que evitar contaminacin del ambiente (polvo, tierra, agua, saliva). Rotular o etiquetar. Consignar informacin que pueda afectar la prueba o el significado del resultado. Por ejemplo la presencia de algn conservador, olor, color, condiciones de conservacin, temperatura.

Para muestras slidas se recomienda un peso de 100 gramos. Si se encuentra a granel o en recipientes o piezas grandes habr que retirar porciones de diferentes puntos para integrar una muestra representativa. O bien manejar varias muestras independientes de reas que se considere pueden tener mayor riesgo. En productos como carne y pescado deben tomarse muestras de la superficie y profundas (minimizando la contaminacin de la superficie). En alimentos congelados se pueden usar sacabocados para tener muestras sin descongelar.

Transportar muestras de alimentos perecederos bajo refrigeracin (2-8C) o en congelacin si son alimentos congelados. Evitar agua de deshielo que pueda contaminar el alimento. Reducir el tiempo comprendido entre recoleccin y entrega de la muestra. Muestras lquidas deben encontrarse homogneas, emplearse de 100 a 500 ml. Obtencin de muestras superficiales mediante transferencia de pedazos con la ayuda de bistur y pinzas, uso de isopos inertes estriles humedecidos en solucin diluyente estril. Para determinar anaerobios estrictos se debe exponer lo menos posible a la atmsfera y usar lquidos de dilucin con bajo potencial redox como el medio de Stuart (con tioglicolato) o medio enriquecido para clostridios (con cistena).

Tcnicas de manejo de muestras.

Dilucin para conteo de microorganismos viables Si es muestra lquida congelada fundirla y homogeneizarla. No es recomendable que el producto llene totalmente el recipiente para evitar escurrimientos y contaminacin. Para muestras slidas se pesan 10 gramos y se diluyen en 90 ml de solucin diluyente, se lica o se puede usar un mortero estril. Se considera como la primera dilucin. Para las diluciones sucesivas se usan pipetas diferentes inoculando simultneamente a las cajas petri. El volumen que se transfiera nunca ser menor del 10% de la capacidad total de la pipeta, por ejemplo para 0.1 ml no se usa una pipeta de ms de 1 ml.

Diluyentes de uso general

Agua peptonada 0.1% pH 6.8-7 Solucin amortiguadora de fosfatos 0.1M pH 7 Solucin de Ringer Medio enriquecido para clostridios Solucin de sacarosa al 20% o NaCl al 15%, osmfilos y halfilos respectivamente.

Cuenta en placa
Consiste en contar colonias que se desarrollan despus de cierto tiempo en el medio de eleccin presupone que cada colonia proviene de un microorganismo en la muestra.

Vertido Superficie

Reglas para conteo en placa

1. 2. 3. 4. 5. 6.

7.

Seleccionar aquellas placas donde aparezcan de 30 a 300 colonias, pues hay menor error en el conteo. Contar todas las colonias de la placa. Si el nmero se estima mayor de 300 y no hay diluciones subsecuentes: 301-500 colonias se divide en dos partes y el nmero de colonias contadas se multiplica por 2. 501-800 colonias se divide en cuatro partes y el nmero de colonias contadas se multiplica por 4. >800 colonias se cuentan de 10 a 20 cuadros se promedia y se multiplica por el nmero de cuadros que ocupa la caja. El nmero de colonias contadas deber ser multiplicada por el inverso de la dilucin y considerar si la tcnica fue por vertido o por superficie (debido al volumen de la muestra). Redondear la cifra obtenida en el recuento de tal forma que haya dos dgitos al inicio de la cifra por ejemplo: 129 se reporta 130 2,417 se reporta 2400 49 se reporta 49

Recuento en tubo

Son tcnicas empleadas para el anlisis de muestras que supone una concentracin de microorganismos pequea. Es una estimacin de la densidad de bacterias en el alimento. Tiene una base estadstica que sera la probabilidad de obtener tubos con cultivo positivos va a disminuir conforme es menor el volumen de muestra inoculada. Permite la inclusin de agentes selectivos y se utiliza cuando se requiere de un medio enriquecido previo a la identificacin de un grupo microbiano.

Pruebas presuntivas
Frecuentemente se utiliza como una etapa de enriquecimiento que busca aumentar la concentracin de microorganismo de inters. Se considera positivos aquellos que despus de incubados presenten enturbiamiento, cambio de color, formacin de gas. Ejemplo para coliformes fermentacin de carbohidratos como caldo lactosado.

Pruebas confirmativas

De los tubos positivos de la prueba presuntiva se inoculan a la prueba confirmativa. El nmero de tubos positivos y negativos determinar el Nmero Ms Probable mediante el uso de una tabla en la cual se estima la concentracin de microorganismos en el alimento.

Ejemplo para coliformes caldo lactosa bilis verde brillante o agar EMB.

Medio VRB+ colorante fluorescente con desarrollo de Escherichia coli ATCC 11775

Nmero Ms Probable

Tabla Nmero

Ms Probable