CME 022 LQ - Método AOCS Ce 1b - 89 - Composición de Ácidos Grasos de Los Aceites Marinos Por GLC - Rev 03

COMPLEMENTO DE MÉTODOS DE ENSAYO
Documento ID: CME/022/LQ

Elaborado : Diego Uribe Página : 1 de 9
Revisado : Silvia Quevedo Revisión : 03
Aprobado por : Eladio Muñoz Fecha de Aprobación : 14-may-18
AOCS Ce 1B-89 COMPOSICIÓN DE ÁCIDOS GRASOS DE

LOS ACEITES MARINOS POR GLC
1.0 OBJETIVO
1.1 Proporcionar instrucciones de soporte al personal analista en la ejecución del método de ensayo AOCS Ce
1b-89. Composición de ácidos grasos de los aceites marinos por GLC.
2.0 ALCANCE
2.1 El presente instructivo tiene aplicación en el Laboratorio AGRI: Laboratorio de Fisicoquímica, para el
análisis de EPA-DHA según la norma AOCS Ce 1b-89. Composición de ácidos grasos de los aceites marinos
por GLC.
3.0 REFERENCIAS
3.1 AOCS Ce 1b-89.2009. Composición de los ácidos grasos de los aceites marinos por GLC.
4.0 DEFINICIÓN
4.1 Este método permite determinar la composición de ácidos grasos de los aceites marinos y ésteres
del aceite marino mediante una columna capilar, cromatografía de gases.
5.0 ÁMBITO DE APLICACIÓN
5.1 Este método está diseñado para determinar la composición de ácidos grasos de los aceites marinos y los
ésteres de los aceites marinos en valores relativos (% Area) y eicosapentaenoico (EPA) y
ácido docosahexaenoico (DHA) en valores absolutos (mg / g) mediante un columna capilar de sílice
fundida flexible con una fase líquida poliglicol.
5.2 El ácido graso C23:0 se utiliza como patrón interno. El método es aplicable al análisis de aceites marinos
o aceites marinos etil y metil ésteres, cápsulas de EPA y DHA, y naturalmente en menores ocurrencias los
ácidos grasos poliinsaturados (ver notas, 1).
6.0 INSTRUMENTAL
6.1 Cromatógrafo de gases con sistema de inyección capilar (modo dividido, operado en una relación
de división de 1:50; véanse Notas, 2) y detector de ionización de llama (FID, véanse las Notas, 3), capaz de
cumplir los siguientes requisitos mínimos (véanse las Notas, 4):
Puerto de inyección, 250 ° C
Detector, 270 ° C
Perfil de temperatura del horno:
La temperatura inicial, 170 ° C
Tiempo de espera inicial, 0 minutos
Tipo de programa, 1,0 ° C / min
La temperatura final, 225 ° C
Tiempo de retención definitiva, 0 minutos
6.2 La columna capilar GLC debe ser flexible, de sílice fundida, de 25 m de longitud o más e id 0,20 - 0,35 mm
El líquido fase debe estar en condiciones garantizadas, Carbowax-20M o un poliglicol equivalente.
Ejemplos de estos últimos son Supelcowax-10, 30 m × 0,25 mm (o 0,32 mm) con recubrimiento de 0,25
micras (Supelco, Inc., Bellefonte, PA, EE.UU.; catálogo no. 2-4079 o no. 2-4080) y Omegawax 320 de 30
m × 0,32 mm i.d. recubrimiento con 0,25 micras (Supelco, Inc., no de catálogo. 2-4152). O equivalentes,
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personal de esta compañía, por lo que su difusión, copiado o reproducción por cualquier medio sin previa autorización, queda estrictamente
prohibida

debe tenerse en cuenta, la afirmación del fabricante para el límite superior de temperatura de la columna
y verificarse.
6.3 Portador de hidrógeno o el helio, al 99,99% de pureza o mejor, es requerido.
Nota: Un depurador de oxígeno es obligatorio con columnas Carbowax-20M y similares.
6.4 Cualquier amplificador adecuado, registrador, integrador, o un procesador de datos pueden ser utilizados.
6.5 Baño de Agua con temperatura constante, o bloques seco –manteniéndose a 100 °C
6.6 Tubos con tapa 16 × 125 mm, tapas forradas con TeflónTM
6.7 Vial con tapa rosca, 12 mL.
6.8 Pipetas volumétricas-1 y 2 mL.
6.9 Pipetas de tipo Pasteur.
6.10 Matraces aforados-25 y 100 mL.
6.11 Balanza analítica-± 0,0001 g.
6.12 Fuente de nitrógeno seco.
7.0 REACTIVOS
7.1 Hidróxido de sodio-grado reactivo.
7.2 Alcohol metílico grado reactivo (véanse las notas, precaución)
7.3 BF3-12% en metanol, ampollas de 2 mL (Supelco, Inc., no de catálogo. 3-3020, o su equivalente).
7.4 isooctano grado-reactivo (véanse las Notas, Caution).
7.5 Cloruro de sodio-grado reactivo.
7.6 C23: 0 metil éster-véanse las notas de 5.
7.7 C23: 0 éster etílico-véanse las notas de 5.
7.8 Soluciones
a. Hidróxido de sodio alcohólico (NaOH), 0,5 M.- disolver 2,0 g de NaOH en metanol y llevar a 100 mL con
metanol
b. Cloruro de sodio (NaCl).- solución saturada, disolver 36 g de NaCl en 100 mL de agua destilada.
c. Estándar NUCHEK 538.- disolver el contenido de la presentación en Isoctano (llevar a 10 mL)
homogenizar hasta que la disolución esté completa.
8.0 PROCEDIMIENTO
7.1 Aceites
(A) Pesar con precisión (± 2,0 mg) de aproximadamente 25 mg de C23: 0 éster metílico estándar interno
(SI) en un matraz aforado de 25 mL y completar el volumen con isooctano.

(B) Pipetear 1,0 mL de alícuota SI (véanse las Notas, 6) en tubos de ensayo y se evapora el disolvente.
Almacenar los tubos en el congelador si no se utiliza inmediatamente.
(C) Pesar con precisión (± 2,0 mg) de aproximadamente 25 mg de aceite marino (puede ser de la cápsula
de aceite de pescado) en el tubo de ensayo que contiene la SI(Estándar Interno).
(D) Añadir 1,5 mL de NaOH 0,5 M. nitrogenar, tapar, mezclar y llevar a 100 °C durante 4 a 6 min.
(E) Enfriar, agregar 2 mL de reactivo BF3/metanol, nitrogenar, tapar, mezclar, y llevar a 100 ° C durante 25
a 35 min.
(F) Enfriar a 30-40 °C, añadir 1 mL de isooctano, nitrogenar, tapar, y agitar en vortex o sacudir
vigorosamente durante 30 segundos, mientras que todavía está caliente.
(G) Inmediatamente añadir 5 mL de solución saturada de NaCl, nitrogenar, tapar y agitar bien.
(H) Enfriar a temperatura ambiente. Cuando la capa de isooctano este separada de la capa
acuosa, transferir la capa de isooctano a un tubo de vidrio limpio, nitrogenar, y tapar.
(I) Al extracto de la fase metanol / agua, extraer con un adicional de 1 mL de isooctano.
(J) Combinar los extractos de isooctano (véanse las Notas, 7) y concentrar a alrededor de 1 mL con una
corriente de nitrógeno seco (rotular el víal correspondiente con la fecha de preparación de la
solución estándar)
(K) Inyectar (véanse las Notas, 8) 1-2 μL bajo adecuadas condiciones cromatográficas (*). Inyectar
el estándar (NUCHEK 538) y registrar la fecha de preparación en el cromatograma.
7.2 Ésteres metílicos o etílicos
(A) Pesar con precisión (± 0,1 mg) aproximadamente 25 mg de C23: 0 o metil éster etílico (apropiado
para el sustrato que va ser analizado) SI (Estándar Interno) en un matraz aforado de 25 mL y completar el
volumen con isooctano.
(B) Pipetear una alícuota de 1,0 mL (véanse las Notas, 6) del SI (Estándar Interno) en un tubo de
ensayo.
(C) Se evapora el disolvente.
(D) Pesar con precisión (± 0,1 mg) no más de 15 mg de ésteres en el tubo que contiene
la
SI(Estándar Interno), añadir 1 mL de isooctano, nitrogenar, tapar y mezclar bien.
(E) Inyectar 1-2 μL bajo condiciones cromatográficas adecuadas (véase Aparatos, 1).
Ver Figuras 1, 2 y 3 para los cromatógramas de ésteres metílicos y etílicos de los diversos aceites
de origen marino, ver cuadros 1 y 2 para los tiempos de retención de los ésteres metílicos de aceites
marinos
9.0 CÁLCULOS
9.1 De porcentajes en Area-Calcular el porcentaje de área de ácidos grasos mediante la fórmula:
100 × ( )
𝑥
% Á𝑎 á𝑖 𝑔𝑎 = 𝐴𝑡−𝐴𝐼𝑆
Donde :
Ax = Área dedeINTERTEK
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At = Área total del cromatograma
AIS = Área del estándar interno
9.2 Cálculo de los mg de EPA y DHA por gramo de muestra de ensayo
(A) Para los aceites marinos y las cápsulas de aceite de pescado (ésteres metílicos)-el peso de EPA y DHA
(véanse las Notas, 9), expresada en mg de EPA o DHA por ácidos grasos por gramo de aceite:
𝑚𝑔 𝐴𝑋 × 𝐼𝑆 × 𝐶𝐹𝑋 × 1 0 00
𝑃 𝐴, = 𝑔 𝐴𝑆𝐼×𝑆×(1,04)
(B) En el caso de éster etílico de peso de EPA y DHA (véanse las Notas, 9), expresada en mg de
EPA / DHA de ácidos grasos por gramo de muestra:
𝑔 𝐴 × 𝐼𝑆 × × 1000
𝑃𝐴 𝐻𝐴, =
𝑔 𝐴𝑆 × 𝑊𝑆 × (1,08)
Donde:
Ax = área del EPA (20:5 n-3) o DHA (22:6 n-3) Ax
ASI = área estándar interno ASI
CFx = factor de corrección teórico para la EPA o DHA CF x
WIS = masa del patrón interno añadido a la muestra, expresado en miligramos W IS
WS = masa de la prueba de ensayo, en mg W S
9.3 Factores de corrección del detector.- Factores de corrección-teórico en relación con C23: 0 (el
patrón interno, SI) para el C20: 5n-3 (0,99) y C22: 6n-3 (0,97) debe aplicarse a los datos analíticos
para una precisión óptima.
PRECISIÓN
1. Estadísticas de Colaboración de estudio, basado en los resultados de (diferentes laboratorios que
participaron en el estudio, aparecen en la Tabla 3.
NOTAS
Precaución
Metanol (alcohol metílico) es inflamable y tóxico. Evite el contacto con los ojos. Evite respirar los vapores.
El uso de dispositivos eficaces de eliminación de humos. Puede reaccionar vigorosamente con hidróxido de
sodio. El isooctano es altamente inflamable. Una campana de extracción efectiva se debe utilizar en
todo momento cuando se trabaja con isooctano.
NOTAS NUMERADAS
1. Se ha demostrado que el paso de metanálisis-álcali para la determinación de cadena larga de ácidos
grasos marinos produce dimetil y mezcla de ésteres de alcohol de la dioctilo plastificante [en realidad, di
(2-etilhexil)] ftalato. Un paso independiente de metanálisis- trifluoruro de boro produce niveles
bajos, pero el proceso de ambas fases produce una conversión más alta, que cualquier otro catalizador
que se haya usado en forma independiente. Los tiempos de retención para el dimetil, mezcla-
alcohol y los dioctilos ftalatos se desarrollan (las referencias, 1) en relación a los ésteres metílicos de
ácidos grasos comunes, en columnas tubulares abiertas de GLC, recubiertas sus paredes por poli glicol .

2. Generalmente la suficiente cantidad de muestra en el análisis de aceites marinos permite
el funcionamiento en el modo dividido.
3. El final de la columna se puede insertar directamente en el jet del detector, o puede haber
una conexión en la base del jet, con o sin gas makeup. Si el FID requiere de gas makeup , el nitrógeno
es satisfactorio.
4. Estas condiciones de funcionamiento se sugieren para una columna de 30 m.
5. Estándares auténticos de ésteres de ácidos grasos saturados, es necesario para la identificación
del pico, están ampliamente disponibles. C21: 5n-3 deben ser separados de la referencia C23: 0 (SI), y
C24: 0 de referencia debe ser separado de C22: 6n-3 (ver fig. 1).
6. Si la altura del pico de la SI es ≤ la mitad de la EPA o DHA picos, repetir el análisis con 2,0 mL de la SI.
7. Opcional.- Lavar el isooctano con 2 mL de agua y secar sobre sulfato de sodio anhidro.
8. Inyección manual con una micro jeringa es una mejor opción, sin embargo, una
inyección automática puede ser utilizado
9. Tenga en cuenta que este cálculo da resultados para los ácidos grasos y no para los ésteres
de ácidos grasos. El analista puede confirmar los factores de corrección del detector con los estándares
de referencia puro sobre los instrumentos individuales y columnas capilares.
El cálculo % en peso debe ser siempre sobre la base de factores de corrección teórico FID.
En caso de una desviación mayor de los factores experimentales (> 5% de desviación del factor
teórico), el analista debe localizar la causa de la desviación, en lugar de aplicar el factor
experimental.
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Tabla1
Tiempos de retención y el porcentaje de área de ésteres metílicos de ácidos grasos del aceite de lacha vapor
desodorizado. (Muestra de estudio en colaboración 1). Véase la figura 1.
Tabla 2
Tiempos de retención y el porcentaje de área de ésteres metílicos de aceite de hígado de bacalao (muestra de
estudio colaborativo 3). Véase la figura 3.
Tabla 1 Tabla 2

Tabla 3
Análisis estadístico de los resultados de 6 aceites de pescado, según los resultados recibidos de varios
laboratorios.
Todas las muestras fueron una suave gelatina encapsulada. 1. aceite desodorizado menhaden vapor; 2. etil éster
preparación comercial, 3. aceite de hígado de bacalao, 4. aceite de pescado comercial, 5. aceite de
pescado comercial enriquecido en EPA y DHA; aceite de lacha 6.steam-desodorizado (duplicados ciegos de la
muestra 1).

Figura 1. Ésteres metílicos de ácidos grasos de suave gelatina encapsulada, el aceite de lacha vapor desodorizado
(muestra de estudio en colaboración 1) analizar en un sílice fundida flexible columna capilar
(30 m × 0,25 mm), recubiertos con Supelcowax-10, bajo las condiciones mencionadas en el texto....
Figura 2. Ésteres etílicos de ácidos grasos de un producto comercial suaves de gelatina encapsulada, SuperEPA
500 (muestra de estudio de colaboración 2) analizar en un sílice fundida flexible columna capilar (30 m ×
0,25 mm), recubiertos con Supelcowax-10, bajo las condiciones mencionadas en el texto. La ubicación de los
ésteres de metilo saturada está indicado para referencia.

Figura 3. Cromatograma del aceite de hígado de bacalao (muestra de estudio colaborativo 3) ésteres metílicos
analizados de sílice fundida flexible columna capilar (30 m × 0,25 mm), recubiertos con Supelcowax-10, bajo las
condiciones mencionadas en el texto
9.0 CRITERIO DE ADECUACIÓN

9.1 El presente documento será aplicado de manera inmediata.
10.0 ARCHIVO DE REGISTROS
Periodo de Lugar de
Registro Responsable SOPORTE
retención Almacenamiento
FPER/027/LQ - RR – Reporte de Jefe de Laboratorio Laboratorio Físico-
Resultados – EPA & DHA 5 años Físico
AGRI Química
11.0 CONTROL DE CAMBIOS
11.1 Se incluye el uso del estándar NUCHEK 538.
11.2 Se añadió medio de soporte.
12.0 HISTORIAL DE REVISIONES
CME Nº Revisión Fecha Efectiva Elaborado Revisado Aprobado
CME/022/LQ 00 28-set-2010 Vilma Morón Dudley Ramirez Fernando Fossa
CME/022/LQ 01 28-mar-2016 Diego Uribe Silvia Quevedo Eladio Muñoz
CME/022/LQ 02 23-Ene-2017 Diego Uribe Eladio Muñoz Eladio Muñoz
CME/022/LQ 03 14-May-18 Diego Uribe Silvia Quevedo Eladio Muñoz

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9.0 CRITERIO DE ADECUACIÓN

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