1 / 48

TEMA 6.- EL MICROSCOPIO

DIPL. EN ÓPTICA Y OPTOMETRÍA ƒ Introducción.

ƒ Estructura del microscopio.
OPTICA INSTRUMENTAL

ƒ Aumento visual.
ƒ Distancia de enfoque.
ƒ Campo visual.
ƒ Profundidad de enfoque.
ƒ Diafragma de campo y retículos.
ƒ Los oculares.
ƒ Apertura numérica.
ƒ Luminosidad.
ƒ Poder separador.
Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons
 2 / 48

EL MICROSCOPIO
DIPL. EN ÓPTICA Y OPTOMETRÍA 6.1.- Introducción
Microscopio: Instrumento óptico subjetivo para la observación
OPTICA INSTRUMENTAL

de objetos cercanos constituidos por detalles cuyas dimensiones

se sitúan por debajo del mínimo separable por el ojo.

En principio, una lupa de gran aumento visual entraría en esta

definición, sin embargo, en la práctica el valor del aumento de la
lupa está limitado, ya que para valores del aumento superiores a
Γ=20 la lente sería demasiado pequeña.

¿Qué solución aporta el Microscopio?

Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons
 3 / 48

ƒ El microscopio proporciona una imagen final muy aumentada

tras un proceso de doble etapa, mediante el acoplamiento de
DIPL. EN ÓPTICA Y OPTOMETRÍA dos elementos convergentes.

ƒ El objetivo proporciona una imagen intermedia real e invertida.

OPTICA INSTRUMENTAL

ƒ La imagen intermedia sufre un aumento adicional bajo la

acción del ocular.

ƒ El acoplamiento del objetivo y el ocular proporciona un

aumento máximo en torno a 2.000
Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons
 4 / 48
6.2.- Estructura del microscopio
ƒ Objetivo: En la práctica, los objetivos son siempre sistemas
convergentes muy complejos.
DIPL. EN ÓPTICA Y OPTOMETRÍA
ƒ Ocular: En general, el ocular está constituido por:
OPTICA INSTRUMENTAL

Lente de campo
Lente de ojo
ƒ A la distancia, t, entre el foco imagen del objetivo y el foco
objeto del ocular se le denomina intervalo óptico o longitud
óptica del tubo.

Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons

 5 / 48

Práctica de laboratorio
DIPL. EN ÓPTICA Y OPTOMETRÍA
OPTICA INSTRUMENTAL

Construcción del Microscopio

Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons

 6 / 48

6.3.- Aumento visual

DIPL. EN ÓPTICA Y OPTOMETRÍA Al igual que en el caso de la Lupa, se define el aumento normal
del microscopio como el cociente entre el tamaño angular aparente,
w’, de la imagen y el tamaño angular, wA, que tendría el objeto en el
OPTICA INSTRUMENTAL

caso de estar situado a -250mm del observador.

tan w '
Γ=
tan wA

Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons

 7 / 48

DIPL. EN ÓPTICA Y OPTOMETRÍA

OPTICA INSTRUMENTAL

tan w ' y ' 0.25

Γ= = = β ob Γ oc
tan wA y f oc'

El Microscopio proporciona valores altos del aumento visual en un

proceso de doble etapa:

Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons

 8 / 48

DIPL. EN ÓPTICA Y OPTOMETRÍA

OPTICA INSTRUMENTAL

−t 0.25(m) 250 (mm)

Γ = β oc Γ oc = 0.25 = =
f ob' f oc' f m' (m) f m' (mm)

ƒ El Microscopio se comporta como una Lupa de focal f ’m

ƒ El aumento visual del Microscopio es negativo

Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons

 9 / 48

DIPL. EN ÓPTICA Y OPTOMETRÍA

OPTICA INSTRUMENTAL

ƒ Desde un punto de vista comercial el aumento del Microscopio se

suele especificar de la forma
m × n, donde m = β ob y n = Γ oc
• Objetivo m x (entre 10 y 100)
Γ = 2000 (máximo)
• Ocular x n (máximo 20)
ƒ Los objetivos se diseñan (aumento y corrección de aberraciones )
para una determinada longitud óptica y, por tanto, no es conveniente
utilizarlos en microscopios con diferente valor de t.

Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons

 10 / 48

6.4.- Distancia de enfoque

ƒ La distancia de enfoque o distancia de trabajo, de, es la distancia
DIPL. EN ÓPTICA Y OPTOMETRÍA desde el plano objeto hasta el vértice de la primera superficie del
objetivo.
OPTICA INSTRUMENTAL

ƒ Para el caso ideal de un objetivo constituido por una lente delgada

zob f’ob

f ob'
de = = f +
'
ob
β ob

Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons

 11 / 48

6.5.- Campo visual

DIPL. EN ÓPTICA Y OPTOMETRÍA ƒ Porción del objeto que es visible a través del Microscopio.
Cálculo del campo de iluminación media en el espacio óptico imagen:
OPTICA INSTRUMENTAL

ƒ El ocular y la pupila del ojo están en el espacio imagen.

ƒ Hay que calcular la posición del conjugado del objetivo en el espacio imagen.
ƒ La imagen final proporcionada por el microscopio está en el infinito.
ƒ En los microscopios la montura del objetivo actúa siempre como Diafragma
de Apertura (y Pupila de Entrada) y, por tanto, su conjugado en el espacio
imagen es la Pupila de Salida.

Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons

 12 / 48

6.5.- Campo visual

Posición y tamaño de la Pupila de Salida del Microscopio
DIPL. EN ÓPTICA Y OPTOMETRÍA
OPTICA INSTRUMENTAL

f oc'2 f oc'
a 'p = f oc' + z p' a 'p = f oc
' + φ PS = β p φob = φob
' +t
f ob ' +t
f ob
Emergencia pupilar

Para una observación óptima la pupila del ojo ha de

situarse sobre la Pupila de Salida del Microscopio
Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons
 13 / 48

DIPL. EN ÓPTICA Y OPTOMETRÍA

OPTICA INSTRUMENTAL

Cálculo del campo de iluminación media en el espacio óptico imagen

El semicampo imagen de iluminación media es
φoc
el ángulo subtendido por la montura del ocular tan wm' =
2a 'p
desde el centro de la pupila del ojo

φoc
Campo de iluminación media en 2 ρ m' = f oc'
el espacio óptico intermedio a 'p

Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons

 14 / 48

DIPL. EN ÓPTICA Y OPTOMETRÍA

OPTICA INSTRUMENTAL

Campo de iluminación media en φoc

2 ρ m' = f oc'
el espacio óptico intermedio a 'p

Campo de iluminación media en f ob' f oc' φoc 0.25 φoc

2 ρm = =
el espacio objeto (Campo visual) t ap'
Γ a 'p

Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons

 15 / 48

Campo de iluminación media en el espacio objeto (Campo visual)

DIPL. EN ÓPTICA Y OPTOMETRÍA f ob' f oc' φoc 0.25 φoc

2 ρm = =
t ap'
Γ a 'p
OPTICA INSTRUMENTAL

2 ρ m es inversamente proporcional a Γ y a 'p

Se utilizan oculares compuestos para aumentar el campo

Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons

 16 / 48

6.6.- Profundidad de enfoque

En general: la longitud óptica t f ob'
DIPL. EN ÓPTICA Y OPTOMETRÍA
⇓
La posición de la P.S ≅ Plano focal imagen del Microscopio
OPTICA INSTRUMENTAL

⇓
Δ e = f m'2 Am
2
⎛ 0.25 ⎞
Δe = ⎜ ⎟ Am (Expresada en m)
⎝ Γ ⎠
El Microscopio trabaja en condiciones de AUMENTO NORMAL

⎧Microscopio de 100 Aumentos ⎫

Ejemplo ⎨ ⎬ ⇒ Δ e = 0.025mm = 25μ m
⎩Observador de Am = 4 D ⎭

ƒ La profundidad de enfoque de un Microscopio es reducida.

ƒ El mecanismo de enfoque ha de ser muy preciso.
ƒ El Microscopio permite medir distancias axiales con gran precisión.

Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons

 17 / 48

6.7.- Diafragma de campo y retículos

DIPL. EN ÓPTICA Y OPTOMETRÍA
ƒ El Microscopio compuesto presenta frente a la Lupa la ventaja
OPTICA INSTRUMENTAL

adicional de la existencia de una imagen intermedia real.

ƒ Sobre el plano de la imagen intermedia pueden situarse los
siguientes elementos :
• Diafragma de campo:

• Retículo: Elemento transparente, con dibujo de líneas o escala.

Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons

 18 / 48

Práctica de laboratorio
DIPL. EN ÓPTICA Y OPTOMETRÍA
Para una observación óptima la pupila del ojo ha de
situarse sobre la Pupila de Salida del Microscopio
OPTICA INSTRUMENTAL

Determinación de la posición y tamaño de la Pupila de Salida

Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons

 19 / 48

Escala de 20 mm 1 div = 0.2 mm

DIPL. EN ÓPTICA Y OPTOMETRÍA

OPTICA INSTRUMENTAL

Medida del Aumento lateral del

objetivo y del campo visual Medición de objetos

βob = −3.2 y' 2.2mm

y= = 0.7mm
2 ρ m 5.6mm βob 3 .2
Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons
 20 / 48

6.8.- Los oculares

DIPL. EN ÓPTICA Y OPTOMETRÍA El campo visual de un microscopio es inversamente proporcional
al aumento visual del mismo. Como consecuencia de ello el
campo visual de los microscopios de gran aumento es muy
OPTICA INSTRUMENTAL

reducido. Para aminorar este problema, los microscopios, y en

general todos los instrumentos ópticos visuales, incorporan
oculares compuestos por dos lentes.

Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons

 21 / 48

H’oc
Hoc
DIPL. EN ÓPTICA Y OPTOMETRÍA
OPTICA INSTRUMENTAL

f '1 f '2 f '1 f '2 f 'F f 'E

f '= = f 'oc = = f 'E
−t ( f '1 + f '2 ) − e f 'F + f 'E − e

f '1 ( e − f '2 ) f 'F ( e − f 'E )

H1 F = H F Foc = =0
f '1 + f '2 − e f 'F + f 'E − e

f '2 ( f '1 − e ) f 'E ( f 'F − e ) f '2E

H '2 F ' = H 'E F 'oc = = f 'E −
f '1 + f '2 − e f 'F + f 'E − e f 'F

Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons

 22 / 48

DIPL. EN ÓPTICA Y OPTOMETRÍA

OPTICA INSTRUMENTAL

a 'p = H 'E F 'oc + z 'p

f 'E2
a 'p = a 'p −
f 'F

250 φE
2ρm =
Γ a 'p
El campo aumenta al utilizar oculares compuestos
Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons
 23 / 48

ƒ El ocular analizado constituye la forma más simple de un ocular doble. No es

conveniente, sin embargo, situar la lente de campo sobre la imagen intermedia
proporcionada por el objetivo, ya que:
DIPL. EN ÓPTICA Y OPTOMETRÍA • Es preciso evitar que posibles ralladuras o motas de polvo presentes en la
lente de campo aparezcan superpuestas con la imagen final.
OPTICA INSTRUMENTAL

• En muchas ocasiones, es necesario colocar sobre esta imagen intermedia

un retículo para poder efectuar mediciones del objeto.
ƒ En general, el diseño de los oculares es bastante complejo ya que se ha de
tener en cuenta, además, la compensación de aberraciones.
Huygens Ramsdem

f F' = 3 f E' f F' = f E'

Símbolo del Doblete
(3,2,1) ( f '1 , e, f '2 ) (3,2,3)
Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons
 24 / 48

Práctica de laboratorio

DIPL. EN ÓPTICA Y OPTOMETRÍA

OPTICA INSTRUMENTAL

Construcción de un Microscopio con ocular doble.

Estudio de la influencia de la Lente de campo:
• Posición y tamaño de la Pupila de salida:
• La emergencia pupilar disminuye.
• El diámetro de la PS no cambia.
• Campo visual: Aumenta.
• Aumento visual: No varía.

Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons

 25 / 48

DIPL. EN ÓPTICA Y OPTOMETRÍA

OPTICA INSTRUMENTAL

⎧ yr' ⎫
tan w ' = ' ⎪
tan w ' ⎪⎪ fA ⎪
Γ= ⎨ ⎬
tan wA ⎪ y ⎪
tan wA =
⎩⎪ 250 ⎭⎪

Medida del Aumento visual del Microscopio

con ocular simple y con ocular doble.

Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons

 26 / 48

6.9.- Apertura numérica del objetivo

DIPL. EN ÓPTICA Y OPTOMETRÍA Para caracterizar la apertura del haz útil en un microscopio se utiliza la
denominada apertura numérica. Esta magnitud juega un papel decisivo
tanto en la luminosidad como en el poder separador del microscopio.
OPTICA INSTRUMENTAL

AN = n sin σ

Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons

 27 / 48

DIPL. EN ÓPTICA Y OPTOMETRÍA

AN = n sin σ
OPTICA INSTRUMENTAL

φPS = −2 f 'oc sin σ '

n sin σ AN
sin σ ' = =
βob βob

AN AN
φPS = 0.5 m = 500 mm
Γ Γ

Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons

 28 / 48

DIPL. EN ÓPTICA Y OPTOMETRÍA

AN = n sin σ
OPTICA INSTRUMENTAL

AN AN
φPS = 0.5 m = 500 mm
Γ Γ

Ejemplo
AN = 0.50 0.50
φPS = 500 = 0.625 mm
Γ = 40 × 10 = 400 400

βob = 40 × Γ oc = ×10

Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons

 29 / 48

6.10.- Luminosidad
DIPL. EN ÓPTICA Y OPTOMETRÍA Para el caso de objetos extensos, se define la luminosidad como el
cociente entre la iluminación retiniana en visión a través del instrumento
óptico, y la obtenida en visión directa.
OPTICA INSTRUMENTAL

2
E 'r ⎛ φefPS ⎞
Ce = = τ⎜⎜ ⎟
⎟
E 'A ⎝ φA ⎠
En la práctica totalidad de los casos las pupila de salida del microscopio
constituye la pupila de salida efectiva del acoplamiento.
2 2 2
⎛ 500 AN ⎞ ⎛ 500 ⎞ ⎛ AN ⎞
Ce = τ ⎜ ⎟ = τ ⎜ ⎟ ⎜ ⎟
⎝ Γ φ A ⎠ Γ φ β
⎝ oc A ⎠ ⎝ ob ⎠

AN = 0.50
Ejemplo

2
⎛ 500 × 0.50 ⎞
Γ = 40 × 10 = 400 Ce = ( 0.75 ) ⎜ ⎟ ≈ 0.02
⎝ 400 × 4 ⎠
φ A = 4 mm

Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons

 30 / 48

En el caso en que, sobre un fondo oscuro, el objeto observado es

puntual, o sus dimensiones tan reducidas que su imagen impresiona un
único fotorreceptor, la luminosidad vale
2
⎛ a ⎞ ⎛⎜ φ PE ⎟⎞
DIPL. EN ÓPTICA Y OPTOMETRÍA Φ 'r
2 ef
Cp = = τ⎜ ⎟ ⎜
Observación Φ 'A ⎝ x ⎠ ⎝ φ A ⎟⎠
OPTICA INSTRUMENTAL

con instrumento Observación directa

Microscopio Observación directa

2
Φ 'r ⎛ 250 ⎞
2
⎛ φefPE ⎞
Cp = = τ⎜⎜ ⎟⎟ ⎜ ⎟
Φ 'A ⎜φ ⎟
⎝ de ⎠ ⎝ A ⎠

Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons

 31 / 48

2
Φ 'r ⎛ 250 ⎞
2
⎛ φefPE ⎞
Cp = = τ⎜⎜ ⎟⎟ ⎜ ⎟
Φ 'A ⎜φ ⎟
DIPL. EN ÓPTICA Y OPTOMETRÍA ⎝ de ⎠ ⎝ A ⎠
2 2
⎛ 250 ⎞ ⎛ φ PS ⎞
ef
Cp = ⎜ ⎟ τ ⎜⎜ ⎟⎟
OPTICA INSTRUMENTAL

φPS f' f oc
' ' / t ⎠ ⎝ φA ⎠
⎝ f o' b f oc
= βp = oc =
φPE zp ' +t
f ob

f ob
'
d e = ( f ob
' +t )
t
Cp = Γ 2 Ce

Cp
Ganancia en contraste : Gc = = Γ2
Ce
AN = 0.50
Ejemplo

Γ = 40 × 10 = 400 Cp = Γ 2 Ce = 4002 × 0.02 = 3200

φ A = 4 mm

Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons

 32 / 48

6.11 Poder separador

DIPL. EN ÓPTICA Y OPTOMETRÍA El poder separador es la cualidad esencial de un microscopio ya que su
finalidad es proporcionar al ojo imágenes discernibles de los detalles
más finos de los objetos.
OPTICA INSTRUMENTAL

Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons

 33 / 48

Según se establece en el Tema 3, y supuesto que las aberraciones han

sido convenientemente corregidas, el poder separador está limitado por
DIPL. EN ÓPTICA Y OPTOMETRÍA el fenómeno de la difracción y por la estructura discreta de la retina.

ƒ A los efectos de la difracción, y asumiendo que la Pupila de Salida del

OPTICA INSTRUMENTAL

Microscopio es menor que la Pupila de Entrada del ojo, el límite de

resolución vale:
0.61λ 0.33
ηdif = ηdif = μm
AN AN
λ ≈ 0.55 μm

ƒ Con respecto a la influencia de la estructura de la retina, al igual que

en el caso de la Lupa, el límite de resolución vale:

tan (αA ) 1 100

ηret = 250 ≈ mm = μm
Γ 10 Γ Γ

α A = 80''

Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons

 34 / 48

⎧⎪ 0.61 λ 100 ⎫⎪
ƒ Si consideramos conjuntamente ambos factores: η mic = máx ⎨ , ⎬
⎪⎩ AN Γ ⎭⎪
DIPL. EN ÓPTICA Y OPTOMETRÍA
OPTICA INSTRUMENTAL

La intersección de las dos curvas define el aumento útil o superresolvente:

AN
Γutil = 100 Γutil = 300 AN
0.61λ
λ ≈ 0.55 μm
Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons
 35 / 48

Ejemplo

DIPL. EN ÓPTICA Y OPTOMETRÍA AN = 0.5 Γ oc = 10 φoc = 10mm

βob = −15 ⇒ Γ util = 150

OPTICA INSTRUMENTAL

100 100
ηmic = = μm = 0.67μm
Γ 150

2
⎛ 500 AN ⎞
2
⎛ 500 × 0.5 ⎞
Ce = τ ⎜ ⎟ = 0.75 ⎜ ⎟ = 0.13
⎝ Γ φA ⎠ ⎝ 150 × 4 ⎠

250 φoc 250 φoc 250 × 10

2ρm = ≈ = = 0.67 mm
Γ a 'p Γ f 'oc 150 × 25

Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons

 36 / 48

AN = 0.5 Γ oc = 10 φoc = 10mm

DIPL. EN ÓPTICA Y OPTOMETRÍA

βob = −30 ⇒ Γ = 300
OPTICA INSTRUMENTAL

Γ util = 150

ηmic = 0.67μm ηmic = 0.67μm

2
⎛ 500 AN ⎞
2
⎛ 500 × 0.5 ⎞
Ce = τ ⎜ ⎟ = 0.75 ⎜ ⎟ = 0.033 Ce = 0.13
⎝ Γ φA ⎠ ⎝ 300 × 4 ⎠

250 φoc 250 φoc 250 × 10

2ρm = ≈ = = 0.33mm 2ρm = 0.67mm
Γ a 'p Γ f 'oc 300 × 25

Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons

 37 / 48

6.12 Objetivos de microscopio

DIPL. EN ÓPTICA Y OPTOMETRÍA ƒ Los objetivos de microscopio se diseñan para proyectar sobre el plano
focal objeto del ocular una imagen aumentada del objeto. El diseño de
los objetivos busca la corrección óptima de las aberraciones para
OPTICA INSTRUMENTAL

valores de la AN lo más altos que sea posible.

Cuanto mejor es la corrección de aberraciones y más alta la AN, mayor
es la dificultad de diseño y, por tanto, el precio del objetivo.
• Objetivos acromáticos: Son los más baratos (y comunes). Corrigen
la aberración cromática axial para dos λ (rojo y azul) y la aberración
esférica para el verde.

• Objetivos semi-apocromáticos –fluorita (Ph): Corrigen la aberración

cromática axial para dos λ (rojo y azul) y la aberración esférica también
para dos λ.

• Objetivos apocromáticos: Corrigen la aberración cromática axial

para tres λ (rojo, verde y azul) y la aberración esférica para dos λ.

Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons

 38 / 48

DIPL. EN ÓPTICA Y OPTOMETRÍA

OPTICA INSTRUMENTAL

Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons

 39 / 48

DIPL. EN ÓPTICA Y OPTOMETRÍA

OPTICA INSTRUMENTAL

Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons

 40 / 48

DIPL. EN ÓPTICA Y OPTOMETRÍA

OPTICA INSTRUMENTAL

Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons

 41 / 48

DIPL. EN ÓPTICA Y OPTOMETRÍA

OPTICA INSTRUMENTAL

Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons

 42 / 48

Objetivos de inmersión
DIPL. EN ÓPTICA Y OPTOMETRÍA
OPTICA INSTRUMENTAL

AN = n sin σ
http://www.microscopyu.com/tutorials/java/objectives/immersion/index.html

Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons

 43 / 48

Apertura Numérica y distancia de enfoque

DIPL. EN ÓPTICA Y OPTOMETRÍA

OPTICA INSTRUMENTAL

http://www.microscopyu.com/tutorials/java/objectives/nuaperture/index.html
Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons
 44 / 48

DIPL. EN ÓPTICA Y OPTOMETRÍA

OPTICA INSTRUMENTAL

Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons

 45 / 48

DIPL. EN ÓPTICA Y OPTOMETRÍA

OPTICA INSTRUMENTAL

http://www.olympusmicro.com/primer/anatomy/specialobjectives.html

Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons

 46 / 48

Ocular

DIPL. EN ÓPTICA Y OPTOMETRÍA

OPTICA INSTRUMENTAL

Objetivo

Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons

 47 / 48

DIPL. EN ÓPTICA Y OPTOMETRÍA

OPTICA INSTRUMENTAL

Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons

 48 / 48

DIPL. EN ÓPTICA Y OPTOMETRÍA

OPTICA INSTRUMENTAL

Tema 6. El microscopio M. Martínez / A. Pons