UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA

FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA DE BIOLOGÍA
CENTRO DE MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA

INTRODUCCIÓN A LA MICROSCOPÍA
ELECTRÓNICA
-GUÍA TEÓRICO-PRÁCTICA-

(Curso de Pregrado Licenciaturas en Biología y Química)

Elaborada por:
Caribay Urbina.
Pedro Rodríguez.
Héctor Finol.
Tatiana Mérida.
Mitsuo Ogura.

Caracas, Octubre 1997.

 INDICE

Tema 1 Técnicas de Vacío 3

Tema 2. El Microscopio Electrónico de Transmisión. 11

Tema 3. Aberraciones y Resolución en un Microscopio Electrónico

de Transmisión. (M.E.T.) 15

Tema 4. Microscopio Electrónico de Barrido. 18

Tema 6. Técnica del Corte Fino 22

Tema 7. Tinción Negativa 39

Tema 8. Sombreo 41

Tema 9. Réplica 48

Tema 10. Criopreparaciones 53

2
 Tema 1
Técnicas de Vacío
(M. Ogura, C. Urbina)

La Microscopía Electrónica requiere del uso de vacío tanto en los microscopios

electrónicos como en los instrumentos de preparación del material a ser observado. Es
importante por lo tanto conocer algunos conceptos básicos sobre el tema.
Si se tiene un gas encerrado en un volumen, a temperatura constante, las
moléculas gaseosas ejercen una presión como consecuencia de los choques entre ellas y las
paredes de la cámara, que las contiene, la velocidad con que se mueven es proporcional a la
temperatura del ambiente que las encierra. A medida que se van sacando moléculas
gaseosas de la cámara la presión va disminuyendo (a temperatura constante); es decir, que
la presión es función de la densidad de partículas. También a medida que disminuye la
densidad de partículas, aumenta el camino libre medio, que es el camino recorrido por una
partícula entre dos choques sucesivos. Las técnicas de vacío se han desarrollado con el
objeto de disminuir al máximo la densidad de partículas gaseosas en un sistema cerrado (ó
cámara).

Unidades de Presión
La presión dentro de una cámara, de un volúmen determinado, es proporcional al
número de partículas gaseosas (n) que se encuentran dentro de la misma. A temperatura (T)
constante, la presión (p) puede expresarse según la teoría cinética de los gases:

p=nkT p : Presión
n : número de moles
T : Temperatura (Kelvin)
k : constante de Boltzmann

La unidad internacional de la presión es el Pascal ( Pa ) :

N
Pa =
m2

Otras unidades de presión tradicionalmente utilizadas son: atm (atmósfera), torr

(torricelli) y mbar (milibar)

3
 Las relaciones entre estas unidades son las siguientes:

Pa mbar Torr atm

Pa (N / m ) 2
1 1*10-2 7,5*10-3 9,8*10-6
mbar (gr/cm2) 1*102 1 7,5*10-1 9,8*10-4
Torr (mmHg) 133 1,33 1 1,33*10-3
atm 101.30 1.013 760 1

Regiones de Vacío:
Existe una clasificación gruesa de las regiones de vacío que se alcanzan con
diferentes bombas y se miden con diferentes medidores:

Vacío grueso Desde presión ambiental hasta 1 mbar.

Vacío medio Desde (1 - 10-3) mbar
Vacío alto Desde (10 - 10-6) mbar
-3

Vacío Ultra-alto Menor que 10-7 mbar.

Camino Libre Medio.

El camino libre medio de las moléculas gaseosas depende de la naturaleza del gas
y su presión. El producto del camino libre medio y de la presión es constante para cada tipo
de gas.
En la siguiente tabla se dan algunos ejemplos del camino libre medio (cm. mbar)
para diferentes sustancias.

He O2 H2O Etanol H2 N2 CO2 Aire

18.00*10-3 6.50*10 3.95*10 2.10*10 12.00*10 6.10*10 3.95*10-3
-3 - - -3 -3
6.667*10-3
3 3

En el caso de aire a presión atmosférica, las moléculas tienen un camino libre

medio de 70 nm aproximadamente, sin embargo a presión de 1*10-2 mbar ese valor
aumenta a 7 mm, lo cual es comparable con el radio de las tuberías que usualmente
conectan la cámara de vacío con las bombas. En el caso del microscopio electrónico, los
electrones deben recorrer metros sin ningún choque con moléculas desde su origen hasta el
final de la columna (con excepción de la muestra), esto se garantiza con una presión de 10-5
mbar. Este nivel de vacío se alcanza por ejemplo, mediante una bomba difusora apoyada
por una bomba mecánica.

4
 Algunos instrumentos de uso común en Microscopía Electrónica que requieren de
vacío, son los siguientes:

1.- Cubridor iónico

2.- Evaporador de alto vacío
3.- Microscopio electrónico de barrido
4.- Microscopio electrónico de
transmisión

Bombas y Medidores.

Existe una serie de dispositivos que nos permiten obtener presiones menores a la
atmosférica, son las llamadas bombas de vacío. De igual manera disponemos de sistemas
llamados medidores de vacío que nos permiten medir el nivel de vacío que hay en una
cámara.
Bomba mecánica o rotatoria: En la figura 1 se muestra un esquema de ésta. La
misma consta de un estator o cuerpo externo, en cuyo interior se encuentra un par de
paletas que giran por la acción de un rotor. Estas paletas están siempre en contacto con las
paredes de la bomba. El gas que se desea evacuar del sistema de interés entra a la bomba
(zona A en la fig. 1) y a medida que las paletas giran, el gas es comprimido hasta que
alcanza una presión suficiente para abrir la válvula, siendo entonces expulsado del sistema.
Esta bomba tiene un aceite que permite lubricar las partes móviles y mejorar el sellado
entre las paletas y las paredes.
Bomba difusora de aceite: La figura 2 muestra un esquema de este tipo de
bomba. Este sistema se basa en crear un jet de aceite el cual es expulsado por las boquillas
con una alta energía, de tal manera que es capaz de arrastrar las moléculas del gas que se
desea eliminar del sistema. Las moléculas del aceite al chocar con las paredes enfriadas de
la bomba se condensan llegando de nuevo a la parte inferior de la misma para ser sometidas
otras vez al proceso de calentamiento.
En la tabla 1 se presenta la presión última ,es decir, la menor presión que puede
obtenerse en un sistema con una bomba.

Tabla 1

Tipos de bombas Presión última (*)

a: Bomba mecánica (10-3 mbar) (Vacio medio)

b: Bomba difusora (10-6 mbar) (Alto vacío)
Bomba turbo molecular (10-11 mbar) (Vacío ultra-alto)
c: Bomba de atrapamiento
Bomba de criogénica
Bomba de iónica

5
 Válvula

Estator

Rotor

Paletas

Zona "A"
Fig 1
Bomba Mecánica

Jet de Aceite

Serpentin

Boquillas

Calentador

Fig 2
Bomba Difusora de Aceite.

6
 Medidores:
Para la medición del vacío en un sistema se utilizan diferentes dispositivos en los
cuales se hace uso de alguna propiedad que varíe con la presión del gas cuya presión se
desea medir. De esta manera los medidores de vacío se puede clasificar en :

1) Medidores de conductividad térmica: Los cuales como su nombre lo indica se basan

en el cambio de resistencia de un alambre con la temperatura y por tanto con la presión o
cantidad de moléculas gaseosas presentes en una cámara o ambiente cerrado. Pertenecen
a esta familia el medidor tipo Pirani (fig 3) y el de termocupla (fig 4).

R2
5v

VAC
200 6a.c.V G
a.c. VAC

5v
R4 R3

Fig 3
Pirani

FILAMENTO
TERMOCUPLA

Fig 4
Termocupla.

2) Medidores de ionización: Estos se basan en la ionización de las moléculas del gas

cuya presión queremos medir. En este grupo se encuentran el cátodo frío (Penning) fig 5
y el cátodo caliente (Bayard-Alpert) fig 6.

7
 Magneto

Cátodo. Ánodo

Fig 5
Penning.

COLECTOR
FILAMENTO
REJILLA

Fig 6
BAYARD - ALPERT

8
 En la tabla 2 se muestra la región de trabajo de algunos medidores.

Tabla 2

MEDIDORES.

TIPO EJEMPLO PRESIÓN DE TRABAJO

Conductividad térmica Pirani 10-1 - 10-3 mbar

Termocupla 5 - 10-3 mbar
Ionización Cátodo frío ( Penning ) 10-2 - 10-6 mbar

Cátodo caliente
(Bayard - Alpert) 10-5 - 10-10 mbar

Práctica.
Observación de diferentes bombas y medidores de vacío ubicados en:
evaporadores de alto vacío y microscopios electrónicos.

CUESTIONARIO

1. ¿Cuál es el nivel de vacío mínimo para utilizar el microscopio electrónico?.

¿Por qué se requiere esta presión?

2. ¿Cómo consigue este nivel de vacío?

3. ¿Qué tipos de medidores de vacío se utilizan en un microscopio electrónico?

4. ¿Por qué se utiliza la trampa de Nitrógeno Líquido N2 (l) y el dedo frío?.

¿En qué lugar se encuentran en el microscopio?

9
 BIBLIOGRAFIA.

1. High Vacuum Technique.Theory and Properties of Materials. J. Yarwood Fourth

Edition.1.975.

2. Vacuum Technology its Foundations Formulae and Tables. LEYBOLD-HERAEUS

GMBH.1.980.

10
 Tema 2.
EL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE TRANSMISIÓN.
(M. Ogura, C. Urbina)

El Microscopio Electrónico de Transmisión es un instrumento que permite

obtener una imagen aumentada de la muestra utilizando los electrones primarios que la
atraviesan

En la siguiente figura se muestra los elementos básicos que forman un

Microscopio Electrónico de Transmisión. (M.E.T).

FILAMENTO (CÁTODO)
CAÑON DE
CILINDRO DE WEHNELT ELECTRONES
ÁNODO

PRIMER CONDENSADOR

SEGUNDO CONDENSADOR

LENTE OBJETIVO

LENTE INTERMEDIO

LENTE PROYECTOR

PANTALLA FLUORESCENTE

PLACA FOTOGRÁFICA

Estructura de un Microscopio Electrónico de Transmisión

11
I: Columna del M.E.T.:
Para facilitar la comprensión de la estructura de un M.E.T. puede considerarse que
éste está formado por un sistema de iluminación y uno de formación de imagen.

I.1 Sistema de iluminación

El cañón de electrones y los lentes condensadores pueden considerarse como el

sistema de iluminación de un M.E.T.

1- Cañón o fuente de electrones. A diferencia del microscopio óptico, que utiliza

como fuente de iluminación la luz, el microscopio electrónico utiliza un haz de electrones,
cuya emisión se produce por calentamiento de un filamento de tungsteno (efecto
termoiónico). Los electrones son acelerados por una diferencia de potencial aplicada entre
el cátodo y el ánodo y concentrados por el cilindro de Wehnelt.
También es posible obtener emisión de un material aplicando una diferencia de
potencial (voltaje extractor) a una punta muy fina (por ejemplo un cristal de W); de tal
manera que aparezca un campo eléctrico suficientemente alto que permita la tunelización
de los electrones, los cuales son luego acelerados por la aplicación de un voltaje acelerador;
este proceso se conoce como emisión por efecto de campo.
En los microscopios electrónicos se utilizan lentes magnéticos, es decir, se hace
uso del efecto del campo magnético (que aparece al pasar una corriente por un electroimán)
sobre un electrón de carga q y velocidad v. La fuerza F que actúa sobre el electrón puede
expresarse como F = q v x B.
Como se está en condiciones de vacío se toma la densidad de flujo magnético B
igual a H.

2- Lentes condensadores. En general el microscopio electrónico posee dos lentes

condensadores. El primero se utiliza para disminuir el tamaño del haz de electrones
proveniente del cañón con la finalidad de aumentar la resolución y evitar el bombardeo
innecesario que podría dañar la muestra.
El segundo condensador se utiliza para variar el ángulo de irradiación y a la vez
cambiar la luminosidad del campo de observación, evitando también el bombardeo
excesivo de la muestra.

I.2 Cámara de la muestra.

La cámara de la muestra es el sitio donde se coloca el material a observar y tiene

instalada un sistema de carro que permite moverla. Algunos microscopios están equipados
con un goniómetro que permite inclinar y rotar la muestra.

I.3 Sistema de formación de imagen.

12
 1- Lente objetivo: Esta lente, al igual que en el microscopio de luz, es la más
importante del sistema ya que es la encargada de formar la imagen y por tanto determina la
resolución y el contraste de la misma a través del uso de una apertura; conocida como
apertura de contraste.

2- Lente intermedia: Aumenta la imagen formada por el lente objetivo. Este lente
permite observar la información que está en el plano imagen ó la que está en el plano focal
posterior de la lente objetiva, dependiendo del enfoque de la misma

3- Lente proyectora: Los microscopios electrónicos poseen varios lentes

proyectores, que permiten un aumento final de la imagen.

I.4 Sistema de observación y registro de la imagen.

La imagen se observa sobre una placa fluorescente, la cual transforma la energía de los
electrones que chocan contra ella, en luz. En general, las pantallas son de color verde o
amarillo, debido a la mayor sensibilidad del ojo humano hacia estos colores. El registro
permanente de la imagen, se obtiene mediante el uso de placas fotográficas.

Un Microscopio electrónico tiene además los siguientes sistema:

II Sistema de evacuación :
Es necesario obtener un alto vacío en el microscopio electrónico. El vacío deberá
ser siempre superior a 1*10-4 mbar Para la obtención de este alto vacío se utilizan dos
sistemas de bombeo.

a) Bomba rotatoria que permite hacer un prevacío; se obtiene así una presión de 10-3
mbar.

b) Bomba difusora de aceite que permite obtener hasta 1*10-6 mbar.

c) El uso de una bomba criogénica de N2(l) permite obtener mejor nivel de vacío y evita
contaminación de la muestra y la columna. Así mismo, se utiliza el llamado "dedo frío"
alrededor del sitio de la muestra para evitar contaminación de la misma.

III Fuente de poder.

Permite aplicar los diferentes voltajes utilizados.

Práctica.

13
 Familiarizar al estudiante con las diferentes partes del Microscopio
Electrónico de Transmisión y sus diferentes modos de trabajo.

Cuestionario.
1. Haga un esquema de un cañón de electrones del tipo termoiónico y del tipo emisor por
campo.
2. Compare el de W con el de LaB6, en lo que se refiere al brillo.
3. Calcule la longitud de onda del haz de electrones acelerado a los siguientes voltajes:

20 kV; 100 kV; 500 kV; 1 MkV.

3. ¿Qué es un lente para electrones?

Bibliografia.
1. S. Weschnitzer. “Introduction to Electron Microscopy”, Pergamon, 1.970.
2. “Transmission Electron Microscopy”, Vol 36, Reimer; Springer, Berlin 1.984.
3. “Scanning Electron Microscopy and X-Ray Microanalisis”. J. Goldstein, et al. Plenum
Press. 1.992.

14
 Tema 3
Aberraciones y Resolución en un Microscopio Electrónico de Transmisión.
(M.E.T.)
(C.Urbina)

En el capítulo anterior se explicó que las lentes utilizadas en Microscopía

Electrónica son lentes magnéticos.
Al igual que los lentes de la óptica clásica, los de electrones presentan
aberraciones que disminuyen la resolución del microscopio electrónico. En este sentido
podemos considerar que los factores que más influyen en el deterioro de la resolución de
un M.E.T. desde el punto de vista del operador son:

1. Aberración esférica.
2. Aberración cromática.
3. Astigmatismo.
4. Efecto de difracción

1. Aberración esférica: Esta es consecuencia de que el campo magnético no es

homogéneo, es decir, que los electrones que viajan mas alejados del eje óptico
sienten una fuerza mayor que aquellos que pasan mas cerca del eje.
2. Aberración cromática: Se produce debido a que no todos los electrones viajan
con la misma energía, consecuencia de que: i) El voltaje de aceleración puede
tener variaciones y ii) el haz de electrones interacciona inelásticamente con la
muestra y por tanto varía su energía y consecuentemente su velocidad.
3. Astigmatismo: Está presente cuando el lente tiene diferentes distancias focales
dependiendo del plano de viaje de los electrones. La falta de simetría rotacional
del campo hace que aparezca este tipo de defecto. La imagen astigmática lucirá
alargada hacia una dirección.
4. Efecto de difracción: Al utilizar aperturas muy pequeñas en el lente objetivo para
disminuir la aberración esférica debe tenerse en cuenta el efecto de difracción el
cual comienza a hacerse importante (disminuye la resolución) a menores tamaños
de la apertura, de tal manera que la escogencia del diámetro de la misma se hará
tomando en cuenta la aberración esférica y el efecto de difracción para obtener la
máxima resolución.

15
 El tamaño óptimo de la apertura puede estimarse según la relación:

αopt ≈ (λ3/Cs)1/4, donde

Cs= Coeficiente de aberración esférica.

λ = Longitud de onda.

Resultado una resolución óptima (dopt) igual a: dopt ≈ λ 3/4 Cs1/4

Alineación.
Para obtener la mejor resolución en un microscopio electrónico se hace necesario
la alineación de cada uno de sus elementos, entre otras razones para que las
aberraciones afecten en el menor grado posible.
La acción de alinear los microscopios es una tarea diaria y redundará en los
resultados obtenidos. Es necesario alinear el eje óptico del sistema de iluminación, el eje
óptico del lente objetivo y corregir el astigmatismo del lente objetivo.
Para corregir y evaluar el astigmatismo del lente objetivo se hace uso de las
franjas de Fresnel, que se forman en un hueco de una membrana de colodión. El
astigmatismo residual puede evaluarse midiendo el espesor máximo y el mínimo en una
franja de Fresnel, utilizando la relación:

∆fa= (X2 max – X2 min).(3,2 λ)-1

donde :
∆fa : diferencia de distancia focal..
Xmax y Xmin: espesor máximo y mínimo de la franja de Fresnel.
λ: Longitud e anda.

16
Práctica

- Evaluar el astigmatismo residual de un microscopio electrónico de Transmisión a

partir de las fotografías suministradas.
- Elaborar el informe correspondiente a aberraciones y resolución.

Bibliografía

1. S. Weschnitzer “Introduction to Electron Microscopy”, Pergamon, 1.970.

2. “Transmission Electron Microscopy”, Vol 36, Reimer; Springer, Berlin 1.984.
3. Practical Electron, Microscopy in materials Science Monograph One, The
Operation and Calibration of the electron Microcope” J.W. Edington. 1.974.
4. Mac Millan. Philips. Technical library.

17
 Tema 4

Microscopio Electrónico de Barrido.

(M. Ogura, C. Urbina)

Este instrumento permite observar la topografía de una muestra utilizando los

electrones secundarios producidos por la interacción de un haz de electrones de alta energía
con la muestra.
Además de la emisión de electrones secundarios, la interacción haz – muestra
produce otras señales como: retrodispersión de electrones, producción de rayos X,
electrones Auger, cátodo luminicencia, etc, (fig 4.1) . Los microscopios electrónicos
recientes combinan una serie de detectores para analizar las distintas señales que se
generan.

Fig 4.1

Señales generadas por la interacción del haz de electrones con una muestra.

1. Haz incidente.
2. Electrones Auger.
3. Cátodo luminiscencia.
4. Muestra
5. Electrones secundarios.
6. Electrones retrodispersados
7. RX característicos.

Para formar la imagen en un Microscopio Electrónico de Barrido (MEB) se utiliza la

señal de electrones secundarios; que son generados por la interacción inelástica del haz
primario con la muestra. En la fig 4.2 se muestra una imagen de un Microscopio
Electrónico de Barrido (M.E.B.)

18
 1

6 5

Fig 4.2

Esquema de un M.E.B.

Los elementos que lo conforman son:

1. Cañón de electrones.
2. Lente condensador.
3. Lente Final.
4. Bobinas deflectoras.
5. Detector de electrones secundarios.
6. Muestra
7. Tubo de rayos catódicos.

Aumento: El aumento (M) de la imagen en un M.E.B. es la relación entre el área barrida

sobre la muestra (Am) y el área del TRC ( ATRC) y puede expresarse como: M= Atrc/Am.
Esta relación indica que a menor área barrida sobre la muestra el aumento obtenido
es mayor. En un M.E.B. el aumento se varía al modificar la corriente de las bobinas
deflectoras.

Resolución: Al igual que en un microscopio óptico o uno de transmisión, la resolución en

un M.E.B. es la mínima distancia entre dos puntos o estructuras separadas en la muestra,

19
observable en la imagen . En Barrido la resolución depende de factores como: Tamaño del
haz, cantidad de electrones retrodispersados y de la relación señal/ruido.

Profundidad de Campo: La cualidad más importante de un Microscopio Electrónico de

Barrido es su gran profundidad de campo, la cual puede considerarse como una distancia en
la cual puede observarse en foco los componentes de la muestra contenida en dicha
distancia.
La profundidad de campo (D) puede expresarse como: D = 0,2 mm/ α M , donde α
es el ángulo de divergencia y M el aumento. Como puede observarse, existe una relación
inversa entre la profundidad de campo con α y M. El ángulo de divergencia α depende de
la distancia de trabajo (dT) y del radio de la abertura según la relación : α= R/ dT . La dT es
la distancia entre la última lente y la muestra. En la fig 4.3 se muestra la profundidad de
campo en un M.E.B.

Plano de
D
foco óptimo

Región foco efectivo

Fig 4.3
Profundidad de campo en un MEB.

La variación de parámetros como la distancia de trabajo y el aumento conlleva a

observar la muestra en dos condiciones importantes en un M.E.B.:

i) Alta profundidad de campo

ii) Alta resolución.

20
Preparación de muestras para M.E.B
El principal requisito de una muestra para ser observada en un Microscopio
Electrónico de Barrido es que sea conductora, de no ser así ésta se carga y como
consecuencia de esto se presentan efectos como:

1. Distorsión de la imagen debido al sobre-brillo; deflexión del haz de electrones y

astigmatismo.
2. Daño térmico de la muestra.

Práctica:

- Identificar las diferentes partes del M.E.B.

- Trabajar en la condición de alta profundidad de campo y en alta resolución.
- Montar muestras sencillas para M.E.B.

Cuestionario:

1. ¿ Cómo depende de la señal de electrones secundarios de la inclinación de la muestra

respecto al haz de electrones ?
2. ¿ Qué relación hay entre la resolución y el tamaño de apertura de la lente última ?

Bibliografía

J Goldstein; D. Newbrury; P. Echlin; D. Joy; Ch. Fiori; E. Lifshin. “Scanning electron

Microscopy and X-Ray Microanalysis”. Plenun Press. New York & London. 1.984

21
 Tema 6
Técnica del Corte Fino
(M. Ogura; P. Rodríguez; H. Finol; T. Mérida))

La técnica de preparación de muestras para su observación al Microscopio

Electrónico de Transmisión (MET) conocida como Técnica del Corte Fino, puede ser
dividida en cuatro pasos principales: fijación, deshidratación, infiltración e inclusión. Este
proceso se inicia con la muestra hidratada y finaliza cuando la misma, libre de agua y
preservada, es inmersa en una matriz de resina plástica. Esta penetra al interior de la célula
sustituyendo al agua y le confiere suficiente firmeza para hacer posible la obtención de
secciones (cortes) finas (50-120 nm). Los cortes obtenidos serán posteriormente
contrastados y observados al MET. El protocolo a seguir es detallado en las figuras 1 y 2.
El propósito de esta práctica es que el estudiante se familiarice con la técnica del
corte fino mediante el procesamiento de algunos tejidos. Asimismo, se pretende que el
estudiante observe las estructuras biológicas más comunes tal como se presentan luego de
procesadas. Finalmente, se aspira dotar al estudiante con criterios que le permitan evaluar la
calidad de una preparación.
En esta práctica se tratarán únicamente los métodos más comúnmente usados en el
laboratorio, los cuales se agrupan en dos secciones:
a) Fijación, deshidratación, infiltración e inclusión.
b) Ultramicrotomía y contraste de los cortes finos.
Fijación.
La finalidad del proceso de fijación es la de preservar la ultraestructura biológica.
El fijador ideal debe ser capaz de detener el proceso de degradación autolítico durante el
tiempo de la fijación. Además debe proteger a la muestra de posibles alteraciones durante
los procesos de inclusión, corte y observación al microscopio electrónico. En realidad, los
fijadores introducen artefactos durante el proceso de preparación de la muestra por lo que,
frecuentemente, la selección de un protocolo particular de fijación depende de la capacidad
para preservar un tipo estructural determinado.
Históricamente, el tetróxido de osmio fue el primer fijador usado en microscopía
electrónica (Claude y Fullan, 1946; Palade 1952), posteriormente fue utilizado el

22
permanganato de potasio (Luft, 1956). En 1963 Sabatini et al. desarrollaron el protocolo
estándar de la doble fijación (glutaraldehído-tetróxido de osmio), el cual es utilizado
actualmente en muchos laboratorios. En dicho protocolo, la fijación primaria con
glutaraldehído es seguida de una fijación secundaria (postfijación) con tetróxido de osmio.
A partir de entonces, se han desarrollado muchas modificaciones del procedimiento básico
de dos pasos; p.ej. se han combinado glutaraldehído y paraformaldehído (aprox. 4%)
permitiendo una penetración mas rápida en los tejidos (Karnovsky, 1965) o se ha reducido
el tetróxido de osmio con ferrocianuro con el fin de aumentar la preservación de las
membranas y del glicógeno (Karnovsky, 1971).
Para realizar una fijación satisfactoria se requieren las siguientes condiciones:
• Ajustar el pH y la osmolaridad de la solución fijadora de acuerdo a las necesidades del
material. Se ha establecido una osmolaridad de aprox. 320 miliosmoles para la mayoría
de los fluídos extracelulares de mamíferos.
• Trabajar a 4º C y con rapidez para lograr una rápida difusión de fijador dentro del
material y evitar así los cambios post-mortem.
En esta práctica se efectuará una doble fijación, primero con glutaraldehido y
luego con tetróxido osmio (OsO4).
El glutaraldehído es un dialdehído de 5 átomos de carbono con una estructura
relativamente sencilla y con un peso molecular de 100,12 (ver figura 3). Su máximo
atributo como fijador reside en su capacidad de establecer puentes de entrecruzamiento
(Cross-link) con proteínas. El glutaraldehido enlaza a los grupos amino de las proteínas,
específicamente el grupo aldehído reacciona con el grupo amino de la lisina ubicada en
proteínas adyacentes originando los puentes de entrecruzamiento (Bozzola y Russell,
1992). Uno de los avances más importantes en referencia al proceso de fijación fue el
introducido por Palay et al. (1962), el cual consiste en utilizar el sistema vascular del
animal vivo para introducir el fijador a los tejidos. La introducción del fijador por vía
vascular o perfusión permite una rápida exposición del tejido al fijador facilitando de esta
manera la preservación de la ultraestructura del tejido a observar.
El tetróxido de osmio tiene un peso molecular de 254,2 y reacciona
primariamente con moléculas lípidicas (ver figura 4). Se ha propuesto que las
insaturaciones de los ácidos grasos son oxidados por el tetróxido de osmio, el cual, a su

23
vez, es reducido a osmio metálico formando un precipitado -opaco- que añade densidad y
contraste al tejido a observar (Bozzola y Russell, 1992). De este modo, actúa como fijador
y contrastante del tejido aunque su efecto no es tan elevado en comparación a los
contrastantes utilizados en la “coloración” de los cortes finos. Comercialmente se consigue
en presentaciones que van de 0,1 a 6,0 gr. Tiene un costo muy elevado, por lo tanto es
necesario usar una mínima cantidad para la realización del trabajo. Por esto, generalmente
se prepara una solución de tetróxido de osmio al 2-4 % que se almacena a 4º C y protegida
de la luz; de allí se toman alícuotas para preparar la solución fijadora.

Deshidratación.
La deshidratación es el proceso de sustitución del agua en la célula por un líquido
que actúa como solvente entre el medio celular acuoso y la resina de inclusión
(hidrofóbica). Los agentes de deshidratación más usados son el etanol y la acetona. Se
pretende lograr el reemplazo del medio acuoso utilizando una serie de concentración
ascendente del agente deshidratante. La serie comienza con una concentración de 30 o 50%
seguida por 70, 90, 95 y 100% etanol o acetona. El etanol es utilizado mas frecuentemente
que la acetona como agente deshidratante debido a que la acetona anhidra tiene una mayor
tendencia a absober agua de la atmósfera y es un poderoso extractor de lípidos
intracelulares. La figura 1 muestra el proceso de deshidratación que será utilizado en esta
práctica.

Infiltración
Generalmente se hace necesario el reemplazo del agente deshidratante por un
compuesto intermediario miscible con la resina que se utilizará para la inclusión. Por
ejemplo, si se utilizó etanol para deshidratar y se desea incluir en Epón, debe emplearse un
compuesto intermediario (óxido de propileno) ya que el etanol es poco miscible en dicha
resina (ver adelante). Es importante resaltar que el óxido de propileno es un líquido
altamente volátil y potencialmente carcinogénico.
La infiltración de la resina al interior de la muestra se realiza aumentando
gradualmente su concentración en una mezcla resina:compuesto intermediario (p.ej.

24
Epón:óxido de propileno). En el CME, la infiltración se realiza en un sólo paso Epón:óxido
de propileno (1:1, 30 min) para material animal (ver figura 2).
Inclusión
El proceso de inclusión propiamente dicho, consiste en la sustitución de la mezcla
resina:compuesto intermediario por resina pura que polimerizará bajo ciertas condiciones,
proporcionando a la muestra el soporte físico necesario para la obtención de cortes finos
(60-90 nm). Los bloques resultantes del proceso de inclusión son mostrados en la figura 5.
Es posible realizar una clasificación de los diferentes medios de inclusión usados en
microscopía electrónica en base a su solubilidad con el agente deshidratante (etanol o
acetona) o con el agua (ver figura 6). Es necesario acotar que la revisión que sigue tiene un
carácter histórico ya que en la actualidad, y desde hace varios años, las resinas epóxicas son
las de uso más extendido.
El metacrilato fue introducido como agente de inclusión en microscopía
electrónica por Newman, Borysko y Swerdlow (1949). Para su preparación se emplean dos
metacrilatos monoméricos solubles en alcohol como son el metil-metacrilato (dureza) y el
butil-metacrilato (plasticidad), además del peróxido de benzoílo que actúa como
catalizador. Para la reacción de polimerización se requiere de calor o de luz ultravioleta.
Presenta amplias desventajas, entre ellas la gran toxicidad de los componentes de la mezcla,
la heterogeneidad de la polimerización, la cual puede incluso afectar a la muestra
originando artefactos y su poca estabilidad a la irradiación de electrones. Por otro lado, las
mezclas plásticas (metacrilato/selectron) han sido desarrolladas debido a que las
características de la mezcla superan ampliamente las de los componentes individuales. Es
posible, además, extraer un componente de la mezcla una vez obtenido el corte fino para
aumentar la penetración del contrastante.
Los medios de inclusión epóxicos son los de uso más amplio en los laboratorios de
microscopía electrónica del mundo. El Epón (o Epón 812) es una resina introducida por
Luft en 1961 como medio de montaje; se trata de un monómero (poliaril-éter de glicerol)
que posee, como grupo funcional, dos grupos epoxi terminales consistentes en un átomo de
oxígeno unido a dos átomos de carbono en configuración triangular; el átomo de oxígeno es
capaz de unirse a otra cadena similar mediante la reacción con una poliamina y/o un
anhídrido ácido, originando de este modo los puentes de entrecruzamiento (ver figura 7).

25
Las resinas epóxicas poseen, como ventaja principal, una alta estabilidad a la irradiación de
electrones y, en general, están formadas por los mismos componentes: una mezcla de
resina (monòmero), endurecedor (mezcla de anhídridos ácidos) y acelerador (poli-amina).
La dureza de la mezcla final es controlada por las proporciones relativas de los anhídridos.
Entre las resinas epóxicas de uso más frecuente tenemos: Araldita, LR White/Lowicryl y
Spurr’s. La Araldita (Ciba Ltd, Basle) fue usada por primera vez en 1956 por Glauert et al.
Polimeriza de manera bastante uniforme y es estable a la irradiación de electrones aunque
en menor grado que el Epón. Mezclada con este último (Araldita 502/Epón 812) produce
bloques duros y facilmente seccionables así como imágenes altamente contrastadas. Es
miscible en etanol lo cual evita el uso del óxido de propileno el cual es altamente tóxico.
LR White es una resina acrílica de baja viscosidad, no tóxica, que ha sido muy utilizada en
estudios enzimáticos, inmunohistoquímicos y citoquímicos. Los cortes obtenidos son
hidrofílicos lo que facilita la penetración de los reactivos de inmunocitoquímica. Lowicryl
es una resina acrílica de baja viscosidad con gran tendencia a entrecruzarse, la cual ha sido
ampliamente usada en inmunocitoquímica. Presenta la desventaja de ser altamente tóxica
con respecto a LR White. A bajas temperaturas la denaturalización de proteínas es baja por
lo que se mantiene la capacidad antigénica. La resina acepta un cierto grado de humedad
por lo que debe evitarse el uso del óxido de propileno. Por otro lado, Spurr’s es una resina
de baja viscosidad la cual presenta una excelente penetración en tejidos biológicos.
Entre el grupo de las resinas de tipo poliéster, se encuentra el Vestopal. Se trata de
una resina miscible en acetona, de grano muy fino y relativamente fácil de contrastar. Se
caracteriza por una rápida penetración y polimerización. Las secciones obtenidas son
estables a los electrones.
Finalmente, entre las resinas solubles en agua tenemos al Glicol-metacrilato (2-
hidroxipropil-metacrilato), un medio de inclusión hidrosoluble y monómero de un ácido
metacrílico introducido por Rosenberg, Bartl y Lerko en 1960. Esta resina fue desarrollada
con el objeto de realizar hidrólisis enzimática sobre los tejidos previamente fijados en
aldehídos para estudios citoquímicos. Es miscible, además de agua, en alcohol etílico y
éter. Es capaz de retener hasta el 15% del agua contenida en la muestra fresca.

26
 En esta práctica se realizará la inclusión de material animal en la resina epóxica
Epón 812. El protocolo a seguir se detalla en las figuras 1 y 2 y las proporciones de la
mezcla de resina se detallan a continuación:
Material animal
Epón 812 2
NMA (anhídrido metil nádico) 1
DDSA (anhídrido dodecil succínico) 1
DMP-30 (poli-amina) 0,25 ml/10 ml resina

Material vegetal
Epón 812 1
Araldita 6005 1
DDSA (anhídrido dodecil succínico) 3
DMP-30 (poli-amina) 3gotas/5ml resina
ADVERTENCIA: Las sustancias que se utilizan durante este proceso son tóxicas, por
lo que deberán ser manipuladas con sumo cuidado.

Caso de tejidos vegetales: material vegetal blando, suave o suculento:

1.- Lograr cortes entre 0,5 y 1,0 mm de espesor, sumergièndolos en la solución fijadora.
2.- Fijación del material con solución de glutaraldehìdo al 2-5 % en buffer pH 7,4 a 4°C
durante 30'.
3.- Lavado del material en buffer, durante 10' a 4 ºC.
4.- Fijación en solución de OsO4 al 2 %, 1h a temp. amb.
5.- Enjuagar en buffer.
6.- Deshidratar en una serie ascendente de acetona.
7.- Mezclar partes iguales de acetona 100% y resina (LX-112, Araldita 6005 y DDSA en
proporción 1:1:3) sin acelerador. Colocar todo en vacío suave durante 1 h.
8.- A igual cantidad de la mezcla anterior (acetona-resina) agregar la resina preparada de
igual manera, pero añadiendo ahora el acelerador, 3 gotas de DMP-30 por cada 5 ml de
la mezcla de resinas (LX-112, Araldita y DDSA), dejándola en vacío suave durante 30'.

27
 9.- Transferir el material, previa limpieza en papel parafilm, a viales limpios con resina
preparada igual que antes (8) y dejándolo infiltrar durante 1 h.con vacío suave.
10.- Incluir y polimerizar en estufa, a 70°C 48 h.

Manejo y disposición de fijadores y resinas

Glutaraldehído:
-Evite hasta donde sea posible el contacto con la piel.
-Evite la aspiración del vapor, no pipetee directamente con la boca.

Tetróxido de osmio:
-Muy volátil y sumamente tóxico.
-El vapor fija suave y sutilmente tejidos especialmente el de los ojos, nariz y boca.
-Los desechos de osmio deberán ser vertidos en 50-60 ml de alcohol etílico con el objeto de
hacerlo inofensivo antes de lavarlo con abundante agua.
-Todos los envases donde se guarda el tetróxido de osmio deberán ser almacenados a 0°C
aproximadamente.
Estos procesos deberán ser realizados bajo campana extractora.

Resinas:
-Las resinas epóxicas son carcinogénicas.
-Evite el contacto con la piel.
-En caso de contaminación de la piel o del laboratorio, éstos deberán ser lavados
inmediatamente con jabón y agua.

Cuestionario (A):
1:- Porqué es necesario trabajar en frío?
2:- A qué compuestos afectan principalmente el glutaraldehido y el tetróxido de osmio?
3:- Cuál es el propósito de realizar una doble fijación?
4:- Cuáles son los agentes deshidratantes más comunes?
5:- Cuáles son las ventajas y las desventajas de usar etanol como deshidratante?

28
 6:- Cuál es el propósito de la infiltración? ¿Con qué objeto se usa óxido de propileno?
¿Cuáles son las ventajas de usarlo? ¿Cuáles son las desventajas?
7:-¿Qué ventajas presenta el uso del Epón como resina de inclusión?

Ultramicrotomía y contraste de los cortes finos.

La Ultramicrotomía es el procedimiento de obtención de secciones ultrafinas a
partir de una muestra previamente incluída en resina con el fin de observarlas al MET. Para
obtener los cortes finos a ser observados al MET, es necesario efectuar las siguientes
operaciones usando el ultramicrótomo:
1. - Tallar (trimming) el bloque en forma de pirámide truncada (ver figura 8).
2. - Obtener cortes gruesos (0,1-0,5 µm aprox.) para confirmar la calidad de la inclusión
y seleccionar la región donde se obtendrán los cortes finos.
3. - Obtener los cortes finos.
4. - Recoger los cortes en rejillas preparadas con membrana de soporte.
La fase previa a la observación de las secciones al MET, consiste en conferir
contraste a los cortes obtenidos. Para esto se utilizan soluciones de sales de metales pesados
(usualmente Citrato de Plomo y Acetato de Uranilo), las cuales contienen iones de alto
número atómico, es decir con un importante número de electrones y protones capaces de
desviar el haz de electrones incidente sobre la muestra y con cierta afinidad por
componentes específicos de la misma.
La figura 9 ilustra el mecanismo de avance de la muestra en el ultramicrótomo.
Este equipo permite obtener cortes finos con un grosor entre 50-120 nm y consta de:
• Sistema de soporte de la cuchilla.
• Mecanismo para el avance del bloque de muestra (mecánico o térmico).
• Sistema de observación de los cortes (binocular).

Para sostener y desplazar la cuchilla (diamante o vidrio) se utiliza un soporte que

permite regular los siguientes movimientos: giratorio, bidireccional de avance (adelante-
atrás), paralelo a la superficie del bloque y rotatorio. La óptima graduación de estos ajustes
permitirá obtener buenos cortes de grosor deseado, sin deformaciones ni daños mecánicos.

29
 La figura 8 muestra el tallado o trimming del bloque de resina. Este proceso se
realiza con el objetivo de minimizar las deformaciones de los cortes obtenidos debido a una
repartición desigual de las fuerzas generadas al momento del contacto del bloque con el filo
de la cuchilla usada para cortar. En general, se realiza una superficie de corte en forma de
pirámide truncada con lados inclinados entre 45 y 60º. Esta forma, de lados inclinados, es
mas estable que, p.ej., una de lados paralelos (cuadrado). Luego del tallado de la pirámide,
se realizan varias secciones de 0,5 µm aprox. llamadas gruesas; esto se efectúa con el
objetivo de confirmar la calidad de la inclusión y para seleccionar la región de la muestra
donde se obtendrán los cortes finos. Para esto, las secciones gruesas son colectadas sobre
gotas de agua en láminas portaobjetos, coloreadas con Azul de Toluidina y observadas al
microscopio óptico.

Cortes finos
El objetivo es lograr cortes finos de grosor homogéneo a cada paso de la muestra
por la cuchilla, para lo que se requiere de una pirámide correctamente tallada, de una
orientación apropiada del bloque con respecto a la cuchilla y de un ambiente sin
perturbaciones en el cual no se produzcan vibraciones que alterarían la calidad de los cortes
obtenidos. Las figuras 10a y 10b muestran el movimiento rotatorio de la muestra frente a la
cuchilla de diamante visto desde diferentes ángulos. La figura 10c muestra el proceso de
recolección de los cortes finos sobre rejillas de Cu con membrana soporte. Por último, y
como paso previo a la observación de los cortes al MET, se procede al contraste de los
cortes según los requerimientos de la investigación (p.ej. según Watson, 1958 y según
Reynolds, 1963). El grosor de los cortes se determina según el color de interferencia , en el
cual un color equivale a un cierto espesor del corte y se parte del principio de que los cortes
mas delgados reflejarán la mayor cantidad de luz incidente y serán, en consecuencia, de
colores claros, mientras que los cortes mas gruesos absorberán una mayor proporción de luz
incidente resultando en cortes de colores oscuros.

Color de interferencia Intervalo de espesor (nm)

gris 60
plateado 60-90

30
 dorado 90-150
violeta 150-190
azul 190-240
verde 240-280
amarillo 280-320

Contraste de los cortes.

El acetato de uranilo (PM 422) fue introducido por Watson (1958) y se usa en
forma de solución acuosa o alcohólica al 50% de 0,5 a 2 %. La rejilla se coloca por unos
20-30 min sobre la superficie de la solución alcohólica (filtrada) de acetato de
uranilo:alcohol 100% (1:1) en oscuridad, luego se lava con alcohol al 50% y se deja desecar
completamente antes de proceder al tratamiento con el siguiente compuesto. El uso del
citrato de plomo (PM 1054) como colorante es una modificación realizada por Reynolds
(1963) sobre la técnica de Watson que usaba hidróxido de plomo. El modo de acción exacto
de estos contrastantes no se conoce con exactitud, se cree que los iones uranilo reaccionan
fuertemente con los grupos amino y fosfato contenidos en los ácidos nucleicos y en
proteínas, las cuales se tiñen de modo importante. Asimismo, los iones plomo se enlazan a
componentes cargados negativamente tales como los grupos hidroxilo y a las áreas donde
se enlazó el osmio previamente. Los grupos fosfato pueden estar igualmente implicados en
este fenómeno (Bozzola y Russell, 1992). Estos dos compuestos son llamados teñidores
generales o no específicos debido a su capacidad de reaccionar con diferentes componentes
celulares.

La solución de citrato de plomo se prepara como sigue:

Nitrato de plomo (Pb(NO3)2: 1,33 gr.
Citrato de sodio Na3(C6H5O7): 1,76 gr.
Agua destilada: 30 ml.
Hidróxido de Sodio (NaOH) 1 N: 8 ml.
Mezclar los primeros tres componentes, agitando constantemente durante 30 min.,
hasta obtener un precipitado blanco. Luego, añadir el NaOH y diluir con agua destilada,
mezclando hasta que el precipitado desaparezca completamente. El agua destilada debe ser

31
previamente hervida y enfriada para remover el CO2, allí disuelto. La solución, así
preparada, permanece activa por mucho tiempo si el frasco se mantiene herméticamente
cerrado.
El contraste con citrato de plomo se efectúa colocando una gota de la solución
preparada anteriormente sobre un papel parafilm en una placa de Petri con cera dental en el
fondo. Es importante destacar que a dicha placa se le extrajo la humedad colocando perlitas
de NaOH durante los 20 min previos a la introducción de las rejillas. Luego de 20-30 min
de contacto con el contrastante, los cortes son enjuagados vigorosamente en tres baños de
agua destilada.
Cuestionario (B):
1. Cómo se produce el color de interferencia?
2. Discuta acerca de los requerimientos respecto al grosor de los cortes. Relacione con la
pérdida de resolución como consecuencia de la aberración esférica.
3. Cuáles son las limitaciones que deben tomarse en cuenta en el proceso del corte fino?
4. Cuáles son los propósitos de hacer los cortes seriados ?
5. A cuáles compuestos afectaría principalmente el acetato de uranilo y el citrato de
plomo?
6. Cuál es el propósito de realizar una doble coloración?
7. Cuáles son los criterios que le permiten afirmar que se ha logrado una buena coloración
del tejido ?
8. Cuáles son las precauciones que se deben tomar para realizar una coloración adecuada?
9. Defina cualitativamente el contraste de las diferentes estructuras que se observan al
microscopio electrónico.

32
 *

Fijación
Muestra fresca Glutaraldehido 2-5% Tetróxido de Osmio 1%
(2.0 mm x 0.5 mm) (30 min., 4ºC) (1h, t amb.)

Deshidratación
Etanol 30% Etanol 50%
(10 min.) Etanol 70%
(10 min.) (10 min.)

Etanol 90%
(10 min.) Etanol 95% Etanol 100%
(10 min.) (3 x 15 min.)
(*) Entre las dos soluciones fijadoras y antes de la deshidratación, es necesario enjuagar
con el tampón utilizado (1 x 10 min, 4ºC).

Figura 1. Técnica del corte fino.

Infiltración
Agente de transición

Óxido de propileno Óxido de propileno:Epón Epón

(2 x 15 min.) (1:1, 30 min.) (4 x 30 min.)

Muestra en Epón

Polimerización en estufa
60 - 70º C, 48 hs

Moldes de inclusión

Figura 2. Técnica del corte ultrafino (continuaciòn).

33
 O O
C-CH2-CH2-CH2-C Glutaraldehído

H H
H H
O O
Proteína 1 N-R’-C Proteína 2
C-R-N
HO H H OH

O O
C-R-N CH-CH2-CH2-CH2-HC N-R’-C + 2 H2O
HO OH
Proteínas estabilizadas con Glutaraldehído

Figura 3. Reacción estabilizadora del Glutaraldehído (Bozzola and Russell, 1992)

O O
O O
Os
Os + R-HC CH-R
O O O
O
Tetróxido de Osmio Ácido graso insaturado R-HC CH-R
O O
R-HC CH-R
Os
+ R-HC CH-R O Os O
O O Ácido graso insaturado
R-HC CH-R O O
R-HC CH-R
Lípidos estabilizados

Figura 4. Reacción estabilizadora del OsO4 (Vigglesworth, 1957)

Nota: existe otro mecanismo propuesto en el cual el Osmio forma un doble monoéster entre cadenas diferentes de ácidos grasos en el
caso de que las insaturaciones se encuentren opuestas en cadenas adyacentes.

34
 Muestra

Bloque de resina

Vista aérea Vista frontal Vista lateral

Figura 5. Aspecto de un bloque de inclusión.

Figura 6. Medios de Inclusión usados en M.E.T.

Solubles en Solubles en Agua

Etanol o Acetona

Plásticos Mezclas Plásticas Resinas Epóxicas Resinas Poliéster

Glicol-metacrilato
Metacrilatos Metacrilato + Epón Vestopal Durcupán
Selectrón
Epón812 hidrosol.

Plexigum Araldita Rigolac

Lowicryl Selectrón
LRWhite

Spurr Viapale

35
 H
R-C-CH2 + R2NH ó Anhídrido ácido

Grupo epoxi terminal O Amina secundaria

OH H OH
R-CH-CH2 + R-C-CH2 R-CH-CH2 + ROH
R2N O R’N Grupo epoxi terminal

Grupo epoxi terminal R-CH-CH2

OH

Figura 7. Reacción de polimerización de resinas epóxicas

Muestra
Soporte del ultramicrotomo

Espejo de agua

Bote de agua
Bloque de resina tallado
con muestra incluida Movimiento del soporte del
Cuchilla de diamante ultramicrotomo

Vista lateral

Figura 8. Desplazamiento de la muestra frente a la cuchilla de diamante.

36
 Soporte del ultramicrotomo
Movimiento del soporte del Bloque de resina tallado
ultramicrotomo con muestra incluida
Cuchilla de diamante

Cortes ultrafinos
sobre agua
(120-150 nm)

Vista Frontal

Figura 9. Desplazamiento de la muestra frente a la cuchilla de diamante.

Pinza

Cortes ultrafinos
sobre el espejo de agua
(120-150 nm)

Bote de agua

Contraste de los cortes:

Citrato de Plomo (Reynolds, 1963). Observación
Acetato de Uranilo (Watson, 1958). al T.E.M.

Cortes ultrafinos sobre rejillas de Cu

Figura 10. Recolección de los cortes ultrafinos sobre rejillas de Cu.

37
Bibliografía

Bozzola, J.J. and Russell, L.D. (1992) Electron Microscopy. Jones and Bartlett Publishers.
Sudbury, Massachusetts. Chap. 5 Specimen staining and and contrast methods for
transmission electron microscopy. pp 110-133.
Claude, A. and Fullam, E.F. (1946) J. Exp. Med. 83:499.
Glauert, A.M., Rogers, G.E. and Glauert, R.H. (1956) Nature 178:803.
Karnovsky, M.J. (1965) J. Cell Biol. 27:137.
Karnovsky, M.J. (1971) Proc. 14th Annu. Meet. Am. Soc. Cell Biol. p146.
Luft, J.H. (1956) J. Biophys. Biochem. Cytol. 2:799.
Luft, J.H. (1961) J. Biophys. Biochem. Cytol. 9:409.
Newman, S.B., Borysko, E., and Swerdlow, M.J. (1949) Science 110:66.
Palade, G.E. (1952) Anat. Record. 114:427.
Palay, S.L., Mc Gee-Russell, S.M. Gordon, S., and Grillo, M.A. (1962) J. Biophys.
Biochem. Cytol. 12:385.
Reynolds, E. S. (1963) J. Cell Biol. 17:208-12.
Rosenberg, M., Bartl, P. and Lerko, J. (1960) J. Ultrastr. Res. 4:298.
Sabatini, D.D., Bensch, R.G., and Barrnett, R.J. (1963) J. Cell Biol. 17:19.
Vigglesworth, V.B. (1957) Proc. Roy. Soc. 147:185.
Watson, M. L. (1958) J. Biophys. Biochem. Cytol. 4:475 y 727.

38
 Tema 7
Tinción Negativa
(M. Ogura; P. Rodríguez)

Tal y como se observó en la practica anterior (Corte fino y Contraste de los

cortes), durante la tinción positiva los iones del metal pesado reccionan con
macromoléculas de la muestra incrementando su contraste. En el caso de la Tinción
Negativa (Hall, 1955; Huxley, 1957; Hall y Litt, 1958; Brenner y Horne, 1959), la
macromolécula no es teñida sino que es rodeada por el contrastante electrón-denso (ver
figura 1). Como resultado de lo anterior, la muestra aparece en contraste negativo, es
decir electrón-transparente en contraste con un fondo electrón-denso. Los contrastantes
negativos no son usados sobre muestras seccionadas sino sobre muestras completas e
intactas, p.ej. virus, bacterias, organelos celulares, etc las cuales han sido colectadas
sobre rejillas cubiertas con membrana de soporte. Frecuentemente las muestras a ser
preparadas según esta técnica no son fijadas previamente, obteniéndose sin embargo un
nivel de resolución aceptable y, en ocasiones, mejor que por la técnica del corte
ultrafino. esto se explica por la ausencia de material plástico alrededor de la muestra a
observar. La técnica de tinción negativa es muy simple, rápida y sólo se necesita un
mínimo de experiencia y equipo para su realización. Entre las sales de metales pesados
más usados como contrastantes negativos se encuentran: Molibdato de Amonio (1-3%
acuoso), Fosfotungstato de Sodio (producto de la neutralización del Ácido
Fosfotúngstico -PTA- con NaOH 1N) 1-2% acuoso, Acetato de Uranilo (0.5-2%
acuoso), Formato de Uranilo (0.5-2% pH 4.5-5.2 ajustado con Hidróxido de Amonio).
Ejercicio
Cultivo de E. coli teñido con Fosfotungstato de Sodio
Procedimiento
1. Preparar membrana de soporte (rejillas)
2. Preparar una suspensión acuosa del material.
3. Preparar una solución de reactivo para la tinción (1% PTA a pH 7,0 con NaOH 1N).
4. Montaje de muestra en la rejilla:

39
5. Mezclar dos soluciones (2 y 3) y colocar un gota de esta mezcla sobre la rejilla. Otra
alternativa consiste en colocar la suspensión del material (secar) e inmediatamente
añadir la solución de tinción.
6. Eliminar el agua exceso con el paper del filtro y desecar en el aire.

Tarea
Compare cualitativamente la fotografía de material obtenidas con este método y otros
sin tratamiento.
Qué grado de resolución podría obtener?
Qué factores cree usted que pueden modificar sus resultados?
Discuta las ventajas y desventajas de la tinción negativa con respecto a la tecnica de
sombreo.

Bibliografía

Brenner, S. and Horne, R.S. (1959) Biochim. Biophys. Acta 34:103.

Hall, C.E. (1955) J. Biophys. Biochem. Cytol. 1.
Hall, C.E. and Litt, M. (1958) Ibid 4.
Huxley, H.E. (1957) J. Biophys. Biochem. Cytol. 3:631.

40
 Tema 8
Sombreo
(M. Ogura; P. Rodríguez; C. Urbina)

La técnica de Sombreo, al igual que la técnica de Tinción Negativa

considerada en la práctica anterior, permite aumentar el contraste de una preparación.
El sombreo consiste consiste en la deposición, mediante evaporación al vacío, de una
capa metálica delgada (5-20 nm) sobre una muestra. El material debe ser depositado
de manera tal que entre la dirección del sombreo y el plano de la muestra exista un
cierto ángulo (45º es un valor muy usado para membranas biológicas). Esta técnica es
usada ampliamente para evidenciar las superficies de fractura de muestras procesadas
por criofractura (freeze-fracture) aunque su uso se extiende en otras direcciones, p.ej.
para aumentar detalles estructurales de pequeñas macromoléculas como DNA,
ribosomas, pared celular y otras fracciones celulares. La técnica requiere de
evaporadores de vacío por lo que los artefactos generados estarán relacionados con el
proceso de evaporación.
Las figuras 1a-e muestran el proceso de sombreo de una membrana
biológica. En las áreas de la muestra que no estan expuestas al bombardeo de los
átomos, no ocurre la deposición de la capa metálica delgada. Estas áreas son
transparentes a los electrones, en consecuencia aparecen más brillantes que las áreas
expuestas al bombardeo de electrones. Estas últimas fueron cubiertas con una capa
metálica delgada y aparecen, por tanto, electrón-densas. En dependencia del grado de
inclinación que presente cada región de la superficie de la muestra con respecto al
punto de emisión del metal en evaporación, será posible obtener área de sombra de
mayor longitud (ángulos pequeños) o de menor longitud (ángulos cercanos a 90º). El
espesor de la película depositada depende, entre otros parámetros, del ángulo
existente entre una superficie determinada de la muestra y la dirección de
evaporación; esta deposición “diferencial” del metal evaporado sobre las
irregularidades de la muestra genera los diferentes grados de contraste, dando la
impresión de una superficie iluminada oblícuamente.
Existen varios métodos para la evaporación del material al vacío.
Nombraremos a continuación tres métodos diferentes:

41
a) Calentamiento de Electrodos. Es el método más antiguo y el de uso más extendido
debido principalmente a que el aparato requerido para este procedimiento es el más
económico de todos los métodos de vaporización de metales. El método involucra el
calentamiento de un electrodo (p.ej. carbon o algún metal de alto punto de fusión)
mediante la aplicación de una corriente eléctrica de modo que el material a ser
evaporado es fundido y volatilizado en una cámara de alto vacío. Debido a su alto
punto de fusión (3650 ºC), el carbon puede ser usado como fuente de calor para
vaporizar un metal de inferior punto de vaporización (p.ej. Pt 1774 ºC, Au/Pd 1465
ºC, W 3382 ºC, Cr 1900 ºC, etc). En este caso el carbon se evapora conjuntamente
con el metal utilizado como contrastante; la presencia de carbon permite lograr una
película metálica de espesor más homogéneo sobre la muestra.
b) Evaporación mediante haz de electrones. Consiste en el calentamiento (en alto
vacío) de un filamento (p.ej. tungsteno) el cual envuelve al metal a evaporar sin entrar
en contacto con este último. Entre el filamento de tungsteno (cátodo) y el metal a
evaporar (ánodo) se establece una diferencia de potencial de manera que los
electrones generados en el cátodo son atraídos hacia el ánodo donde colisionan con
éste generando la evaporación del metal. El equipo necesario para este procedimiento
es más costoso que los de calentamiento de electrodos, pero las películas generadas
poseen un tamaño de cristal tal que permite la realización de estudios en los cuales se
requiere de alta resolución.
c) Sputtering (ataque catódico). En este método, un gas noble (p.ej. argón) es
ionizado mediante la aplicación de alto voltaje; los iones positivos producidos son
enfocados con lentes electromagnéticos sobre el metal a evaporar. La colisión de los
iones de argón sobre el metal arranca moléculas metálicas que inciden sobre la
muestra generando una película delgada. Este método presenta como principal
ventaja la total ausencia de calor, el cual puede dañar la muestra.

El procedimiento más sencillo consiste en calentar un trozo de metal en una "cesta"

de tungsteno hasta una temperatura superior a la temperatura de vaporización del
metal utilizado. Este calentamiento se realiza en la campana en alto vacío y debe
seleccionarse un metal que posea una temperatura de vaporización inferior a la del

42
tungsteno a fin de evitar la evaporación del metal que constituye la "cesta". El ángulo
utilizado para realizar el sombreo varía según la estructura a examinar, p.ej. para
objetos grandes (bacterias, cultivos celulares, etc) o material inorgánico -los cuales
poseen un tamaño de varios µm- se usa un ángulo de 45º, mientras que para objetos
pequeños (ADN aislado y, en general, muestras con tamaño del orden de nms) el
ángulo varía entre 10 y 15º. Es posible calcular la cantidad necesaria de metal a
evaporar para depositar una película de un espesor requerido. Esto se hace con el fin
de asegurar la obtención de un nivel de contraste adecuado el el microscopio y se
calcula de la manera siguiente:

M = 4π r2 t d/ Sen α
donde:
M: peso del material (gr).
r: distancia desde la fuente de evaporación a la muestra (cms).
t: grosor de depósito (Å).
d: densidad del material (gr/cm3).
α: ángulo de sombreo.

La altura h, de una partícula que proyecta una sombra de longitud l, se puede

calcular usando la fórmula :
h = l tang α
lo cual permite a su vez calcular el volumen, cuando la partícula presenta una
geometría regular.

Ejercicio
a.- Colocar Oxido de Magnesio o látex de poliestireno en la rejilla con membrana de
soporte reforzada con carbón. Observar los efectos de sombreo comparando los
materiales con sombreo y sin él.

43
b.- Preparar material biológico (Bacterias con o sin flagelos) en la rejilla con
membrana de soporte reforzada con carbón. Sombrearlos con cromo y observar los
efectos de sombreo.

Práctica:
Limpieza de la cesta de Tungsteno:
1.- Colocar la cesta en la campara. Hacer alto vacío y calentar la cesta hasta
incandescencia (color blanco). Esperar 1h que se enfríe hasta temperatura ambiente e
introducir aire a la campana.
2.- Colocar 2 - 4 mg de cromo en la cesta de Tungsteno. Colocar el material a
sombrear a una distancia horizontal no menor de 10 cm y seleccionar una distancia
vertical de modo que el ángulo resultante sea de 45° o de 15° dependiendo del
tamaño y naturaleza de la muestra a sombrear.
3.- Hacer alto vacío en la campana (10-5 Torr) y efectuar la completa evaporación del
metal colocado en la cesta (observe a través del vidrio ahumado). Esperar 1h para
introducir aire en la campana.

Preguntas:
1.- Calcule el grosor de la capa depositada sobre la rejilla, si se utiliza para sombrear
un trozo de cromo de 3.5 mg de peso y si h=3 cm, l=10 cm y d=6,9 gr/cm3.
2.- Porqué se requiere de un alto vacío para la evaporación?
3.- Porqué es necesario esperar 1h antes de introducir aire en la campana de vacío
luego de la limpieza de la “cesta” de Tungsteno y de la evaporación del metal de
sombreo?
4.- Mida la altura del material fotografiado. ¿Qué estructura tridimensional puede
identificar?
5.- Cuál es el grado de resolución que puede lograrse con este método?

44
 1.a) Obtención de la muestra:

Membrana
Fosfolípidos
biológica

Proteínas de la membrana

1.b) Preparación de la cesta de evaporación e introducción en la cámara de vacío:

Cesta de evaporación
Metal a evaporar
(2 − 4 mg Cr)

α=45º

Membrana biológica
Nota: es importante destacar que, en el caso de membranas biológicas, el ángulo existente entre
la superficie de la muestra y la dirección de incidencia del metal debe ser de 45º. Dicho ángulo
varía dependiendo del tipo de muestra.

Figura 1. Sombreo.

1.c) Evaporación del metal (P en la cámara < 10-5 Torr):

I I

Metal evaporado en alto vacío

α=45º

Película delgada de metal depositado

(1-5 nm)

45
1.d) recolección y observación de la muestra al M.E.T.

Muestra biológica con película metálica depositada

Recolección de la muestra sobre rejillas de cobre

Observación al M.E.T.

1.e) Obtención de contraste en el M.E.T.

Haz de electrones primarios

Lente objetivo
Muestra

Apertura Haz deflectado

(zona oscura en la pantalla)

Haz parcialmente transmitido

a través de la apertura
(zona de grises en la pantalla)
Haz transmitido a través de la apertura
(zona brillante en la pantalla)

46
 Bibliografía
Bradley, D.E. (1967) Replica and Shadowing Techniques in Techniques for Electron
Microscopy. D. Kay edt. Blackwell Scientific Publications.
Misra, D.N., Das Gupta, N.N. and Sadhukhan, P. On the Distortion in Dimensions
produced by Shadowing, Electron Microscopy, 5 th Internacional Congress,
Philadelphia 1962. A.P. Vol. II, pp 14-15.
Preuss, L.E. (1965) Shadowcasting and contrast in: Cuantitative Electron
Microscopy. Bahr and Zeitler Edt., pp181-195.

47
 Tema 9

Réplica
(M. Ogura; P. Rodríguez; C. Urbina)

Las réplicas de material biológico han sido desarrolladas para los casos en
los cuales se requiere de información topográfica y con un alto nivel de resolución
acerca de una muestra determinada. El límite de resolución de esta técnica se ubica en
2-3 nm. Existen dos métodos de obtención de réplicas; en el caso de la obtención de
la réplica directamente de la muestra, se denomina réplica de un paso; por el
contrario, si se usa un componente intermediario entre la muestra y la réplica, se
denomina réplica de dos pasos. A continuación detallaremos cada uno de ellos:

Réplica de un paso:
Este tipo de réplica ofrece un buen nivel de resolución y debe ser
considerado antes de cualquier otro método, si la muestra lo permite (ver figura 1).
Antes de su realización es necesario que la muestra esté limpia y seca, para ello se
emplean diferentes métodos dependiendo del tipo de muestra. Se puede resumir el
procedimiento de la siguiente manera:
a) Fijar y secar la muestra de acuerdo al nivel de preservación de los detalles a
estudiar. En algunos casos, esto puede significar dejarlos secar al aire durante un
período de tiempo (algunos insectos, pared celular, semillas y, en general, muestras
duras); Otras muestras (tejidos, células aisladas y, en general, muestras blandas)
requieren de fijación, deshidratación y secado (secado por punto crítico o por freeze-
dry) como pasos previos a la réplica. La técnica funciona mejor con muestras que
poseen poco relieve y que pueden ser disueltos usando solventes apropiados.
b) Colocar la muestra en el evaporador y realizar alto vacío (P<10-5 Torr).
c) Evaporar Pt a 45º (sombreo) y C a 90º.
d) Recuperar el conjunto muestra mas réplica.
e) Separar la réplica de la muestra. Para esto puede sumergirse la muestra
cuidadosamente en agua destilada y esperar que la réplica flote, puede utilizarse
Scotch para adherir la réplica para luego disolver el Scotch en cloroformo y recuperar

48
la réplica o, finalmente, puede utilizarse una solución de ácido hidrofluórico al 10%
para facilitar la separación.
f) Disolver el material orgánico adherido a la réplica. Puede usarse Cloro comercial
diluído al 50% con agua destilada durante varias horas o, incluso, toda la noche o una
solución al 50% de ácido crómico. Estos dos solventes remueven cualquier resto de
material biológico adherido a la réplica, sin embargo si persiste la presencia de estos,
puede usarse algún ataque enzimático.
g) Lavar en agua destilada tres veces por 5min cada vez.
h) Recoger la réplica en rejillas de 400 mesh hexagonales (preferiblemente).
i) Observar al M.E.T.

Réplica de dos pasos

En muestras muy voluminosas o que no pueden ser destruídas es posible
realizar una réplica de la superficie utilizando el método de réplicas de dos pasos o
réplicas negativas (ver figura 2). El uso de un material intermediario que entra en
contacto con la muestra y el cual será replicado posteriormente limita la resolución
del método. Se trata de un proceso muy similar al anterior pero con algunas
diferencias:
a) La muestra fijada y seca entra en contacto con el material intermediario (p.ej.
Colodión al 1% y luego al 4% aplicado en varias capas).
b) El colodión seco es retirado de la superficie de la muestra (p.ej. con una pinza o
con Scotch).
c) La película de Colodión es recolectada en rejillas sin película.
d) Una vez secas, las rejillas son colocadas en el evaporador.
c) Evaporar Pt a 45º (sombreo) y C a 90º.
d) Recuperar el conjunto muestra mas réplica.
e) Separar la réplica del Colodión. Para esto puede sumergirse las rejillas con
Colodión en Cloroformo.
f) Recolectar las réplicas en rejillas hexagonales de 400 mesh.
g) Observar al M.E.T.

49
 Procedimiento
a) Frotis de eritrocito
1.- Hacer un frotis con sangre recién extraída, sobre un portaobjeto bien limpio.
2.- Colocar el portaobjeto con el frotis en el evaporador, sombrear con cromo a 15° y
luego cubrir con carbón a 90º.
3.- Cuadricular la superficie de la lámina sombreada y cubierta con carbón con cortes
de de 3 mm.
4.- Introducir el portaobjeto en agua destilada con lo cual réplica (cromo/carbón) se
desprende de la lámina y flota sobre el agua. Agregar NaOH (0,1 N) para facilitar este
proceso y para digerir todo resto orgánico adherido a la réplica.
5.- Recolectar en rejillas de Cu (400 mesh).
6.- Secar bien y observar al M.E.T.

50
 51
Muestra Muestra
Sombreo
Plàstico
Muestra
Muestra
Plàstico
Sombreo
Rèplica
Muestra
Plàstico
Rèplica
Rèplica Final Rèplica Final
Figura 1. Procedimiento para la obtenciòn de Rèplicas en un paso. Figura 2. Procedimiento para la obtenciòn de Rèplicas en dos pasos.
 Bibliografía
Murr, L. E. Electron Optical Aplication in Metal Science Mc-Graw Hill pp165-184.
Goodhew, P. J. Practical Methods in Electrón Microscopy. Ed. A. M. Glauert.
North-Holland Pub. Vol. 1, Chap. 5, pp137-157.
Von Heimendahl, M. (1980) Electron Microscopy of Materials. Academic Press
pp74-88.

52
 Tema 10
Criopreparaciones
(P. Rodríguez)

Las técnicas que involucran la congelación de la muestra y su posterior

procesamiento para ser visualizada al microscopio electrónico, son conocidas con el
nombre de Criopreparaciones. La fijación por congelación (fijación física) fue desarrollada
con el fin de evitar los artefactos originados por el uso de los fijadores tradicionalmente
utilizados en microscopía electrónica, glutaraldehído y tetróxido de osmio (fijación
química). Se ha desarrollado una amplia tecnología para el logro de una velocidad de
congelación (tasa de congelación) adecuada para muestras biológicas, de esta manera se
impide la formación de cristales de agua de gran tamaño los cuales son generadores de
numerosos artefactos. Cada método ha sido diseñado de acuerdo con la naturaleza de la
muestra (células o partículas en suspensión, monocapas, pellet de centrifugación, tejidos,
etc). Luego de la congelación existe la posibilidad de observar directamente la muestra, aún
congelada, mediante el uso de un microscopio electrónico con cámara de muestra enfriada
o se puede observar la muestra después de una deshidratación por sublimación del hielo
(freeze-dry); también es posible la observación de una réplica realizada sobre una cara de
fractura de la muestra original (criofractura o freeze-fracture). En este último caso, es
posible exponer detalles de la ultraestructura de la muestra los cuales no son replicados sin
una previa sublimación del agua solidificada al momento de la congelación (freeze-
etching). La revisión aquí presentada no pretende ser exhaustiva y enfatizará
principalmente en aquellas técnicas de uso corriente en el CME.

Para la mejor comprensión de esta área de la microscopía electrónica, el presente

tema será desarrollado de la siguiente manera:
• Congelación. Principios físicos. Métodos de congelación.
• Métodos de preparación de la muestra congelada para su observación al microscopio
electrónico.

53
 CONGELACIÓN
Principios físicos. Métodos de
congelación
El concepto fundamental en la microscopía de bajas temperaturas lo constituye la
congelación: la conversión del agua líquida en sólida. Esta transición de fase aparentemente
simple es, de hecho, una compleja serie de eventos que puede ser modificada por factores
tales como tasa de congelación, presencia de solutos y presión. En sistemas biológicos, los
cambios fisicoquímicos que ocurren durante el congelamiento permanecen poco estudiados
y muchos de los métodos prácticos utilizados en la actualidad están basados en el uso
empírico más que en una verdadera comprensión de los cambios que toman lugar en el
tejido congelado. Las preguntas fundamentales a responder en el marco de la
crioinvestigación biológica son: cuál es la tasa de congelación óptima y en que intervalo de
temperatura? Pueden ser usados los aditivos químicos para mejorar la calidad de la muestra
congelada sin producción de artefactos? Cuál es la máxima temperatura a alcanzar de modo
seguro por la muestra congelada? Para contestar estas interrogantes es necesario entender
algunas ideas acerca del principio de la congelación-descongelación.
Cuando el agua pura es enfriada por debajo de su temperatura de equilibrio ,Tf,
(temperatura a la cual las dos fases están en equilibrio, p.ej. para agua y hielo Tf = 0°C,
273°K) la congelación no ocurre inmediatamente sino que el agua permanece en un
equilibrio metaestable llamado estado superenfriado. El superenfriamiento no puede
continuar indefinidamente y, eventualmente, ocurre cristalización espontánea con
liberación del calor latente de fusion el cual calienta el agua haciéndola retornar a su punto
de fusión. El grado de superenfriamiento depende de la pureza del agua pero en ningún
caso dicho estado se produce por debajo de 0.8Tf (expresada en °K). Esto ocurre debido a
que los pequeños cristales formados inicialmente se repelen entre ellos para valores de
temperatura cercanos a la temperatura de equilibrio debido a una relación
superficie/volumen energéticamente desfavorable. A medida que el enfriamiento continua,
los cristales se estabilizan y aumentan de tamaño sirviendo así como núcleos de

54
cristalización para el volumen total de líquido. Este tipo de proceso es conocido como
nucleación homogénea y la temperatura a la cual comienza el crecimiento cristalino se
define como temperatura de nucleación homogénea (Th). Por otro lado, la tasa de
crecimiento de cristales de hielo es dependiente de la temperatura con un máximo alrededor
de 260°K (-13°C) y cae a medida que la temperatura disminuye hasta los 140°K (-133°C)
donde ya no existe crecimiento cristalino. Yannas (1968) establece la temperatura de
vitrificación del agua en 127±4°K (-146±4°C) y lo define como la temperatura sobre la cual
el agua vitrificada puede transformarse en cristales de hielo.
De esta manera se establece un intervalo de formación de cristales de hielo entre la
temperatura de nucleación homogénea y la temperatura de vitrificación; en el caso del
agua pura, dicho intervalo va aproximadamente de los 230 a 130°K (-43 a –143°C). Esto
significa que los cristales de hielo se formarán y crecerán en cualquier temperatura que esté
comprendida en dicho intervalo. La cristalización será evitada solamente si este intervalo es
atravesado lo suficientemente rápido, es decir si el calor latente de fusión es extraído del
sistema más rápidamente de lo que es producido. La principal ventaja de lograr un máximo
superenfriamiento previo a la congelación es evidente cuando comparamos los valores de
calor latente de fusión del agua a 0°C (334J/g) y del agua superenfriada en el punto de
nucleación homogénea (-40°C; 166J/g). Aunque ha sido propuesto que la nucleación del
hielo no puede ser evitada simplemente por utilizar un rápido congelamiento (quenching)
en agua pura, la adición de solutos y la consecuente reducción en la proporción total de
agua disponible para el congelamiento disminuye el punto de congelación (punto de
nucleación) y eleva el punto de recristalización reduciendo en consecuencia, el intervalo de
temperatura crítico a través del cual puede ocurrir una congelación rápida. En este sentido,
Dubochet (1981, 1984) logra la vitrificación del agua en la muestra para especímenes
pequeños. En el caso de las muestras biológicas típicas, las cuales contienen más de 80%
agua, el punto de congelación es disminuido sólo 2°K con respecto al del agua pura aunque
la temperatura de recristalización es elevada en 50°K. Este intervalo de temperatura crítico
(270~180°K) aunque disminuido, es aún lo suficientemente amplio como para ser
atravesado por el estado superenfriado. En el caso de la nucleación homogénea, los cristales
de hielo constituyen, en si mismos, núcleos de cristalización pero la estabilidad de dicho
sistema aumenta considerablemente si el núcleo en formación crece asociado a la superficie

55
de alguna partícula insoluble con un diámetro ≥ a 20nm. En tal sistema, el grado de
superenfriamiento es mucho menor y el proceso de congelación es conocido como
nucleación heterogénea.
El proceso de cristalización del hielo implica la separación de fases: cuando el
cristal crece, la solución circundante se concentra. Este hecho inevitable es independiente
del tamaño del cristal de hielo en formación. La separación de fases tiene serias
repercusiones en la interpretación ultraestructural, por lo que la solución ideal a este
problema sería la vitrificación del agua en la muestra. Vitrificación significa la
solidificación del agua en la muestra de manera amorfa, esto es sin producción de cristales
del hielo. El problema consiste en que los investigadores no han reportado aún los valores
de tasa de congelación adecuados para lograr la vitrificación del agua pura y, menos aún, el
valor de la tasa de congelación necesaria para vitrificar el agua dentro de muestras
biológicas. Existe una relación entre la tasa de congelación y el tamaño del cristal
producido, por ejemplo, ha sido reportado un tamaño de 4-5µm para una tasa de
congelación de 100°K/seg mientras que cuando esta tasa es aumentada a 500°K/seg, los
cristales producidos tienen un tamaño variable entre 1-2µm para suspensiones acuosas. En
biología se usa frecuentemente el término vitrificación para describir el congelamiento que
produce cristales mas pequeños que el límite de resolución de la técnica de medición
empleada. Se considera frecuentemente que el estado vítreo implica una modificación del
agua sólida con producción de cristales de un tamaño menor a 10nm. Actualmente los
cristales de hielo de este tamaño son descritos como hielo microcristalino y su producción
no debe ser confundido con el logro del estado vítreo; sin embargo, para efectos prácticos,
consideraremos la presencia de este estado microcristalino como prueba de una tasa de
congelación adecuada.
Los métodos de congelación han sido desarrollados en función a muestras
específicas, esto significa que cada método de congelación ha sido particularmente
diseñado de acuerdo a la naturaleza de la muestra: partículas o células en suspensión (spray
freezing), monocapas celulares (jet freezing), tejidos o agregados celulares (inmersión en el
criógeno o plunge freezing), estudio de la union neuromuscular (slamming), etc.
En caso de la congelación por inmersión en nitrógeno sub-enfriado, se recomienda
el tratamiento previo de la muestra con un crioprotector; se trata de moléculas orgánicas

56
que, por una parte, se enlazan a las moléculas de agua disminuyendo la cantidad disponible
para la formación de cristales y, por otra parte, forman sólidos amorfos (es decir no
cristalinos) los cuales presentan un menor aumento de volumen al solidificar. Es importante
destacar que debido a su alto peso molecular, generalmente no se recomienda el uso de
crioprotectores si se desea realizar un etching (sublimación) de la muestra. Es importante
destacar que las altas tasas de congelación se logran en muestras extremadamente pequeñas
(<100µm en una dimensión) o en una superficie de un máximo de 20µm de profundidad,
para materiales de un tamaño superior a los descritos, se hace necesario el uso de
crioprotectores y se debe evitar el uso de criógenos que lleven a la formación de film
boiling (película gaseosa alrededor de la muestra sumergida en el criógeno) tal como el
nitrógeno líquido.
• El método denominado spray freezing consiste en rociar gotas muy finas de la muestra
(suspensión, emulsión, etc.) en el líquido criógeno (p.ej. propano). Es muy empleado
en el estudio de soluciones baja viscosidad.
• El jet freezing es un método desarrollado para muestras que puedan ser colocadas entre
dos capas finas metálicas en forma de sandwich (p.ej. monocapas celulares <0,05mm)
las cuales serán rociadas por uno o ambos lados con el criógeno (p.ej. propano).
• La congelación por alta presión consiste en colocar agua a una presión lo
suficientemente alta (aprox. 2.100bar ó 2,1x108Pa) para disminuir su punto de fusión
desde 0 a –22°C (251°K). En esta condición, la tasa crítica de congelación para
vitrificación de material biológico pasa de 104 a 102 °K/seg y entre sus principales
ventajas tenemos que es posible producir cristales muy pequeños (5-10nm) utilizando
una solución de glicerol (crioprotector) al 5%, la temperatura de recristalización
disminuye en 30°K y la velocidad de formación de cristales disminuye en un factor de
103. La principal limitación del método es que presiones tan altas destruirían la muestra
por lo que ésta es expuesta sólo durante varios mseg a tales presiones y es necesaria
una sincronía precisa con el sistema de disminución de temperatura lo cual aumenta la
complejidad y costo del equipo.
• El método de congelación contra superficie enfriada por el criógeno (slamming)
consiste en impactar a la muestra contra una superficie pulida de un metal de alta
conductividad térmica la cual es enfriada a baja temperatura (usualmente hasta 77°K)

57
 mediante flujo del criógeno en la cara opuesta al impacto. Este método produce
excelente congelación en una amplia superficie y a relativa profundidad (10-20µm).
• La técnica de inmersión en el líquido criógeno (plunge freezing) es el método de
congelación más versátil, simple y de menor costo de todos los métodos descritos. Es
adecuada para muestras de mayor tamaño y debe tenerse en consideración la
optimización de los parámetros de inmersión tales como velocidad de entrada de la
muestra al líquido criógeno, tipo de soporte utilizado, orientación de la muestra con
respecto a la superficie del criógeno, etc.

Métodos de preparación de la muestra

congelada para su observación al microscopio
electrónico.
Entre los métodos de preparación de la muestra congelada para su observación al
microscopio electrónico tenemos aquellos en los cuales se utilizó un crioprotector:
criofractura sin sublimación o freeze-fracture y aquellos en los cuales no se utilizó dicho
compuesto: criofractura con sublimación o freeze-etching. El uso del crioprotector es
opcional para otros métodos, p.ej. crioultramicrotomía y freeze-dry.
• La criofractura o freeze-fracture consiste en fracturar la muestra congelada en el interior
de una cámara a baja presión (P<105Torr) y replicar la superficie de fractura mediante
la evaporación al vacío de una película delgada de Pt/C a 45° y de C a 90°. Luego de
esto, la muestra con la réplica aún adherida es sacada apresión y temperatura ambiente
para realizar la digestión de la muestra, la réplica obtenida es colocada en una rejilla
soporte y observada al microscopio electrónico.
• El método de criofractura con sublimación o freeze-etching tiene el mismo principio del
método anterior sólo que luego de la fractura se promueve la sublimación del agua
solidificada en la muestra. Esto sólo ocurrirá si se asegura que la presión de la fase
gaseosa (Pcámara) es menor que la presión de saturación del agua en la muestra (Psat), de
lo contrario se favorecerá la condensación de gases sobre la muestra. Debido a que la

58
 Psat es dependiente de la temperatura de la muestra, este parámetro es fácilmente
controlable asímismo la presión de la fase gaseosa es dependiente de la tecnología de
vacío empleada en el equipo utilizado. La tasa de sublimación del hielo de la muestra
(Js) se calcula con la siguiente expresión:
Js=ηPs (M/2πϕT)0.5 donde 0<η<1
Js: Tasa absoluta de sublimación del hielo (g/cm2seg).
η: Coeficiente de evaporación.
Ps: Presión de vapor de saturación del hielo.
M: Peso molecular del vapor de agua (18.016g/mol).
ϕ: Constante de los gases (constante de Boltzmann x número de Loschmidt).
T: Temperatura absoluta.
De la ecuación anterior se desprenden dos presunciones: (i) que existe un equilibrio
dinámico entre la superficie del hielo y el vapor y (ii) que el número de moléculas de agua
que escapan depende de la temperatura del hielo, mientras que el número de moléculas que
condensan en la superficie del hielo y que no escapan depende de la presión y temperatura
del vapor. Basado en un valor ideal de η=1 y usando la expresión analítica para la presión
de saturación del vapor de agua descrita por Washburn (1924), Umrath (1983) calculó la
presión de saturación de vapor y la correspondiente tasa de sublimación (g/cm2seg) para el
intervalo de temperatura de –1 a –160°C (272.1 a 113.1°K), la disminución de espesor de la
capa de hielo en función del tiempo de sublimación (nm/seg) y el tiempo necesario para
sublimar una capa de hielo de espesor de 1mm (ver tabla 1).
• Los métodos restantes (crioultramicrotomía y freeze-dry) han sido, hasta ahora, de uso
menos frecuente en el CME. El primero de ellos (crioultramicrotomía) consiste en la
obtención de secciones finas congeladas de un espesor variable entre los 50-500nm. Es
un método de relativa importancia en inmunocitoquímica debido a que el material
preserva su inmunoreactividad. El método de freeze-dry permite la congelación de la
muestra y la sublimación del hielo con la consecuente deshidratación de la misma.
Luego de esto, la muestra puede ser procesada tanto para su observación al microscopio
electrónico de transmisión como de barrido.

59
 ºC
Tamb 25

Pto. Fusión 0 Calor latente de fusión (0ºC):

334J/g
Agua super-enfriada(*)

T nucleación -43 Calor latente de fusión (-43ºC):

167J/g
Intervalo de crecimiento cristalino
T recristalización -143

T almacenamiento -180
N2(l)
(*) Si la tasa de congelación
≥ 5x104 ºC/seg.

Métodos de Congelación
Líquidos Criógenos

Sin Crio-protección Con Crio-protección

(Congelación Ultra-rápida)

Impacto contra Contacto directo Inmersión en el criógeno:

bloque metálico con el criógeno:
(slaming) •Spray freezing •N2(l) sub-enfriado
• Jet propano •Freón, Propano enfriados
•Inmersión

60
 2. Spray-freezing

4. Inmersión
en el criógeno

3. Jet de
Propano

1. Slaming

•N2(l) sub-enfriado •Freón o Propano enfriados

61
 Material Biológico Congelado
(componentes sub-celulares, células aisladas o en cultivo, tejido animal o vegetal, etc.)

No Crio-protegido Crio-protegido

Crio-fractura/sublimación Crio-sustitución Freeze-dry Crio-fractura o

(Etching) Crio-ultramicrotomía

Inmunomarcaje Inclusión-corte Cubrimiento Réplica o

de las réplicas iónico Secciones congeladas

MET(*)
MET(*) MET(*) MET(*)/MEB(**)

MET(*): Microscopio Electrónico de Transmisión

MEB(**): Microscopio Electrónico de Barrido

Procesamiento de la
muestra congelada
(parte II): Crio-fractura.

62
 Inmuno-marcaje de réplicas de Criofractura

Fracture-label

Label-fracture Label-fracture-etch Freeze-fracture flip

SDS-FRL

Autoradiografía y Crio-fractura

Método Método Monocapas

directo indirecto
63
 Bibliografía

Robards, A.W. and Sleytr, U.B. (1985) Low temperature methods in biological electron
microscopy. Elsevier. Amsterdam, New York, Oxford.

64