UNIVERSIDAD NACIONAL DE MOQUEGUA

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AMBIENTAL

Título:
“Nº 1 PRACTICA VIRTUAL - ANALISIS DE SECUENCIAS DEL GEN 16S”

Curso:
BIOTECNOLOGÍA

Estudiante:
QUISPE CUTIPA, HOLGUER

Docente:
DR. HEBERT H. SOTO GONZALES

ILO

SEPTIEMBRE DEL 2021

 Nº 1 PRACTICA VIRTUAL - ANALISIS DE SECUENCIAS DEL GEN 16S

Introducción

Indudablemente el estudio de secuenciación del ADN ha tenido mucha importancia en la

biotecnología, y las tecnologías que se aplican en estos estudios no ha parado de

desarrollarse. Sumando el aumento meteórico de la información sobre secuencias de

ADN no tiene más remedio que ir hacia arriba (Mardis, 2008).

Ahora bien, la era digital propuso hace décadas una herramienta que ha repercutido

favorablemente la ciencia biotecnológica, DATABANKS. Ofrece a los usuarios

ocasionales y a los expertos una puerta de entrada directa y actualizada a la creciente red

de bancos de datos, lo que permite un acceso cómodo a una amplia gama de datos y

servicios (Kreil & Etzold, 1999).

Mas específico, BLAST es, sin duda, el software más importante que se ha escrito para

las ciencias biológicas (White et al., 2011). La rápida expansión de los datos de secuencias

de nucleótidos disponibles en bases de datos públicas está revolucionando la

investigación biomédica (Pandey & Lewitter, 1999). Es el núcleo de la mayoría de los

flujos de trabajo bioinformáticos, siendo un componente crítico de las búsquedas de

homología del genoma y de la anotación (White et al., 2011).

Estas herramientas no son eficaces por si solas y por ello existen otros softwares que

facilitan su uso como es el caso de Bioedit.

Bioedit es un software libre que permite la lectura de las secuencias de ADN por medio

de cromatogramas y con ella su posterior identificación, tal como trabajaron (Premzl,

2018), (Zhang et al., 2019), (Kanata et al., 2019).

Estas tecnologías proporcionarán una aplicaciones que van desde la inmunoprecipitación

de la cromatina, el mapeo de mutaciones y el descubrimiento de polimorfismos hasta el

descubrimiento de ARN no codificante (Mardis, 2008).

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 Nº 1 PRACTICA VIRTUAL - ANALISIS DE SECUENCIAS DEL GEN 16S

Objetivos:

- Revisar los fundamentos de las técnicas de secuenciación de ácidos nucleicos.

- Efectuar el análisis y la selección de electroferogramas automatizados de

secuenciación mediante la aplicación de software libre BIOEDIT en específico el

estudio del gen ribosomal 16S.

Materiales y métodos:

Materiales

- Laptop: Permite ejecutar los softwares y herramientas necesarias.

- BLAST: Encuentra regiones de similitud entre secuencias biológicas. El

programa compara las secuencias de nucleótidos o proteínas con las bases de datos

de secuencias y calcula la significación estadística (BLAST: Basic Local Alignment

Search Tool (nih.gov)).

- Bioedit 7.2.5: Editor y análisis de alineación de secuencias biológicas.

- Excel: Hoja de cálculo digital. (Software de hojas de cálculo Microsoft Excel |

Microsoft 365).

Métodos

Análisis de cromatogramas a través de Bioedit

Las muestras de formato AB1 proporcionados por el docente (Ilustración 1) se analizaron

en el programa Bioedit 7.2.5 (Ilustración 2). De esta forma, se puede analizar la calidad

de las secuencias de nucleótidos y posteriormente realizar la exportación en formato Fasta

(Ilustración 3 e Ilustración 4).

Las exportaciones se abren en el bloc de notas el cual te permite editar las secuencias que

posean excesos de errores (Ilustración 5 e Ilustración 6). Si no es el caso se puede copiar

directamente todo el texto para su análisis en el BLAST.

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 Nº 1 PRACTICA VIRTUAL - ANALISIS DE SECUENCIAS DEL GEN 16S

Análisis de secuencia de nucleótidos

El texto copiado pasa a pegarse en el cuadro de texto de BLAST del NCBI (Ilustración

7), luego se seleccionan los parámetros de búsqueda, en este caso “cualquier secuencia

similar”, finalmente presionamos BLAST y esperamos los resultados (Ilustración 8).

Resultados
Los resultados obtenidos de cada muestra fueron recopilados en la siguiente tabla.
Tabla 1
Resultados de análisis de nucleótidos

Calidad de la secuencia Tamaño Porcentaje

Muestra Código de la Organismo de
Mala Regular Buena secuencia identidad
1 A07_1H_01 X 978 NOT FOUND -
2 A08_9H_02 X 729 Herbaspirillum seropedicae 88.73
3 A09_1_01 X 280 Pseudomonas putida 83.21
4 A10_9_02 X 674 uncultured bacterium 86.14
5 A11_17_01 X 1163 NOT FOUND -
Stenotrophomonas sp.
6 B07_2H_03 X 629 75.78
UYSB32
7 B08_10H_04 X 575 Leclercia adecarboxylata 87.55
8 B09_2_03 X 626 Klebsiella grimontii 82.35
9 B10_10_04 X 669 Enterobacter soli 71.76
uncultured Pseudomonas
10 B11_18_03 X 617 72.62
sp.
11 C07_3H_05 X 748 Leclercia adecarboxylata 91.9
12 C08_11H_06 X 749 Enterobacter mori 91.07
13 C09_3_05 X 743 Phytobacter diazotrophicus 86.58
uncultured Pseudomonas
14 C10_11_06 X 767 69.01
sp.
15 C11_19_05 X 666 Klebsiella aerogenes 65.62
16 D07_4H_07 X 679 uncultured bacterium 90.18
17 D08_12H_08 X 697 Staphylococcus sp. US-13 84.27
18 D09_4_07 X 741 Phytobacter diazotrophicus 88.43
19 D10_12_08 X 668 Pseudomonas putida 81.82
20 E07_5H_09 X 769 NOT FOUND -
Paraburkholderia
21 E08_13H_10 X 657 79.97
silvatlantica
Enterobacter hormaechei
22 E09_5_09 X 981 85.02
subsp. xiangfangensis
23 E10_13_10 X 774 uncultured bacterium 67.47
24 F07_6H_11 X 619 Enterobacter ludwigii 95.89
25 F09_6_11 X 610 Klebsiella sp. 83.76
26 F10_14_12 X 1204 NOT FOUND -
27 G07_7H_13 X 566 Enterobacter sp. ICBR 189 93.17
28 G09_7_13 X 615 uncultured Enterobacter sp. 73.78
29 G10_15_14 X 657 Enterobacter cloacae 96.28
30 H07_8H_15 X 1100 NOT FOUND -

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 Nº 1 PRACTICA VIRTUAL - ANALISIS DE SECUENCIAS DEL GEN 16S

Calidad de la secuencia Tamaño de

Porcentaje
Muestra Código la Organismo
Mala Regular Buena de identidad
secuencia
31 H09_8_15 X 1262 NOT FOUND -
32 H10_16_16 X 656 Enterobacter sp. IICDBZ9 84.42
33 419NZ_A01_01 X 810 Klebsiella michiganensis 74.54
34 526NZ_B01_03 X 807 Klebsiella variicola 85.85
35 419AZ_C01_05 X 733 Klebsiella sp. MPUS7 97.3
36 88NZ_D01_07 X 755 Klebsiella pneumoniae 94.44
37 88AZ_E01_09 X 644 Klebsiella pneumoniae 95.32
38 526Y1_F01_11 X 338 Klebsiella pneumoniae 95.91
39 419Y1_G01_13 X 293 Enterobacter sp. WF14-6 98.61
40 375H_H01_15 X 568 Klebsiella oxytoca 73.75
41 419YZ_A02_02 X 315 Enterobacter sp. CB7 95.81
endosymbiont of
42 88H_B02_04 X 523 72.46
Sphenophorus levis
43 375NZ_C02_06 X 233 uncultured bacterium 82.02
44 526YZ_D02_08 X 318 Klebsiella sp. BR3357 92.25
45 483NZ_E02_10 X 562 Enterobacter cloacae 91.06
46 483H_F02_12 X 504 Enterobacter hormaechei 89.33
47 456NZ_G02_14 X 559 bacterium EAB-F8.08 95.89
48 01_A03_01 X 663 Kosakonia radicincitans 81.6
49 02_B03_03 X 720 uncultured soil bacterium 71.52
50 03_C03_05 X 539 Klebsiella pneumoniae 75.71
51 04_D03_07 X 570 Kosakonia oryzae 81.93
52 05_E03_09 X 518 Enterobacter sp. 93.26
53 06_F03_11 X 1347 NOT FOUND -
54 07_G03_13 X 1185 NOT FOUND -
55 08_H03_15 X 991 uncultured bacterium 72.17
56 09_A04_02 X 1163 NOT FOUND -
57 10_B04_04 X 677 Achromobacter sp. 77.29
58 11_C04_06 X 597 Enterobacter cloacae 72.58
Enterobacteriaceae
59 12_D04_08 X 442 85.71
bacterium HGH0104
60 13_E04_10 X 377 NOT FOUND -
61 14_F04_12 X 350 Pantoea deleyi 78.05
62 15_G04_14 X 656 Klebsiella sp. 90.53
63 16_H04_16 X 626 Kosakonia sacchari 77.49
64 1Y2_F04_12 X 423 Kosakonia radicincitans 79.2
65 2Y2_G04_14 X 570 Herbaspirillum sp. 86.75
66 3Y2_H04_16 X 478 Klebsiella sp. MB42 79.04
67 17_A04_02 X 500 NOT FOUND -
68 18_B04_04 X 377 Enterobacter sp. 84.93
69 19_C04_06 X 654 Pseudomonas aeruginosa 74.74
70 20_D04_08 X 369 Klebsiella sp. SI-Ar(M)-B1 78.14
71 21_E04_10 X 866 uncultured bacterium 74.24
Nota: De 71 muestras en 11 no se encontraron resultados a la hora del BLAST, 43 muestras fueron de mala
calidad (60.56%), 20 de calidad regular (28.16%) y 8 de buena calidad (11.28%). El organismo más
identificado fue uncultured bacterium (6) seguido de enterobacter cloacae (3). El mayor porcentaje de
identidad lo alcanzó el organismo Enterobacter sp. WF14-6 con 98.61%.

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 Nº 1 PRACTICA VIRTUAL - ANALISIS DE SECUENCIAS DEL GEN 16S

Conclusiones
Se revisó los fundamentos de las técnicas de secuenciación de ácidos nucleicos y se
encuentra que la actual tecnología (tercera generación) permite secuenciar con una
facilidad y rapidez que antes nunca se tuvo permitiendo que la biotecnología se desarrolle
a pasos gigantes.
Se efectuaron el análisis y la selección de electroferogramas automatizados de
secuenciación mediante la aplicación de so ftware libre BIOEDIT que mostró lo variedad
de calidad en los resultados de las muestras, posterior al análisis de electroferogramas se
hizo un análisis en BLAST que permitió identificar a los organismos en la mayoría de las
muestras pero que sin embargo 11 de ellas tenían muy mala calidad y por lo tanto no se
encontró identificación alguna.

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 Nº 1 PRACTICA VIRTUAL - ANALISIS DE SECUENCIAS DEL GEN 16S

Referencias
Hall, T.A. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and
analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp. Ser. 41:95-98.
Kanata, E., Llorens, F., Dafou, D., Dimitriadis, A., Thüne, K., Xanthopoulos, K., Bekas,
N., Espinosa, J. C., Schmitz, M., Marín-Moreno, A., Capece, V., Shormoni, O.,
Andréoletti, O., Bonn, S., Torres, J. M., Ferrer, I., Zerr, I., & Sklaviadis, T. (2019).
RNA editing alterations define manifestation of prion diseases. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America, 116(39), 19727–
19735. https://doi.org/10.1073/pnas.1803521116
Kreil, D. P., & Etzold, T. (1999). DATABANKS - A catalogue database of molecular
biology databases. Trends in Biochemical Sciences, 24(4), 155–157.
https://doi.org/10.1016/S0968-0004(99)01363-8
Mardis, E. R. (2008). The impact of next-generation sequencing technology on genetics.
Trends in Genetics, 24(3), 133–141. https://doi.org/10.1016/j.tig.2007.12.007
Pandey, A., & Lewitter, F. (1999). Nucleotide sequence databases: A gold mine for
biologists. Trends in Biochemical Sciences, 24(7), 276–280.
https://doi.org/10.1016/S0968-0004(99)01400-0
Premzl, M. (2018). Comparative genomic analysis of eutherian adiponectin genes.
Heliyon, 4(6), e00647. https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2018.e00647
White, J., Matalka, M., Fricke, W. F., & Angiuoli, S. (2011). Cunningham: a BLAST
Runtime Estimator. Nature Precedings, December, 1–6.
https://doi.org/10.1038/npre.2011.5593.2
Zhang, X., Haro von Mogel, K. J., Lor, V. S., Hirsch, C. N., de Vries, B., Kaeppler, H.
F., Tracy, W. F., & Kaeppler, S. M. (2019). Maize sugary enhancer1 (se1) is a
gene affecting endosperm starch metabolism. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America, 116(41), 20776–20785.
https://doi.org/10.1073/pnas.1902747116

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Nº 1 PRACTICA VIRTUAL - ANALISIS DE SECUENCIAS DEL GEN 16S

Anexos
Ilustración 1
Archivos AB1 proporcionados por el docente.

Fuente: Elaboración propia

Ilustración 2
Software Bioedit 7.2.5 realizando la lectura del archivo AB1.

Nota: El recuadro rojo muestra la zona de lectura de la secuencia de nucleótidos, la cual se

analiza visualmente para determinar su calidad.
Fuente: Elaboración propia

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Ilustración 3
Exportación de resultados en formato fasta.

Fuente: Elaboración propia

Ilustración 4
Guardado de resultados en formato fasta en una carpeta designada

Nota: Se recomienda crear una carpeta nueva para guardar estos archivos y también que los
archivos generados se codifiquen con su mismo código inicial para organizar de la mejor forma
los archivos.
Fuente: Elaboración propia

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Ilustración 5
Ejecución de archivos fasta en Bloc de notas

Fuente: Elaboración propia

Ilustración 6
Edición de secuencia para mejores resultados

Nota: Se recomienda borrar parte del texto donde se observe errores comunes de secuenciación,
se identifica fácilmente pues la letra N aparece de forma excesiva, normalmente suele darse al final
de la secuencia. Finalmente se copia el texto editado.
Fuente: Elaboración propia

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Nº 1 PRACTICA VIRTUAL - ANALISIS DE SECUENCIAS DEL GEN 16S

Ilustración 7
Blasteado de la secuencia de nucleótidos en la web de BLAST del NCBI.

Nota: El texto seleccionado del bloc de notas se pegaría en la zona del recuadro rojo y
posteriormente se puede optimizar los niveles de búsqueda (cuadro verde), finalmente presionar
en BLAST para ver los resultados.
Fuente: Elaboración propia

Ilustración 8
Resultados del BLAST.

Nota: El tamaño de la muestra se observa en el recuadro azul, el organismo identificado en el

recuadro rojo y porcentaje de identidad (similitud) en el recuadro verde.
Fuente: Elaboración propia

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