MDR Direct Flow Chip Kit: Detección de Patógenos Multirresistentes Mediante PCR Múltiple e Hibridación Reversa

MDR Direct Flow Chip
Kit
Detección de patógenos
multirresistentes mediante PCR múltiple
e hibridación reversa
para plataformas hybriSpot manual y automática
Compatible con la versión 2.02.00.R09.01 y posteriores de hybriSoft HSHS.

Para compatibilidad con otras versiones por favor consulte con el fabricante / distribuidor.
Ref. MAD-003946M-HS12 24 determinaciones

Ref. MAD-003946M-HS 24 determinaciones
Para uso exclusivo en diagnóstico in vitro

Directiva 98/79/CE e ISO 18113-2
Vitro S.A Rev.: 2022-03-31
Calle Luís Fuentes Bejarano 60 Ed. Nudo Norte Local 3 41020 Sevilla (Spain)
Tel: +34 954 933 200. vitro@vitro.bio ; www.vitro.bio
1/36
TABLA DE CONTENIDO
1 USO PREVISTO .............................................................................................................................. 3

2 PRINCIPIO DEL MÉTODO ............................................................................................................... 5
3 COMPONENTES ............................................................................................................................ 5
4 MATERIAL ADICIONAL REQUERIDO NO SUMINISTRADO Y MATERIAL OPCIONAL ............................ 7
4.1 Reactivos y materiales ........................................................................................................................ 7
4.2 Equipamiento ...................................................................................................................................... 7
4.3 Material adicional opcional ................................................................................................................ 8
5 CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD ................................................................... 8
6 ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES.................................................................................................. 8
7 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA................................................................................................... 10
7.1 Exudados rectales ............................................................................................................................. 10
7.2 Exudados/aspirados nasofaríngeos .................................................................................................. 11
7.3 Exudados rectales y exudados nasales como una muestra única .................................................... 11
7.4 Hemocultivos .................................................................................................................................... 12
7.5 Colonias bacterianas ......................................................................................................................... 12
7.6 Protocolos de procesamiento de muestras con medio de dilución y trasporte (TDM) ................... 13
8 PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS .................................................................................................... 15
8.1 Reacción de amplificación múltiple del ADN .................................................................................... 15
8.2 Hibridación reversa por flow-through .............................................................................................. 15
9 PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS PARA EL EQUIPO HS12 PCR AUTO ................................................. 17
10 PROCEDIMIENTO DE CONTROL DE CALIDAD ................................................................................ 18
11 INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS .............................................................................................. 19
12 CARACTERÍSTICAS DEL FUNCIONAMIENTO .................................................................................. 23
12.1 Funcionamiento analítico en hybriSpot 12 (HS12) ........................................................................... 23
12.2 Funcionamiento analítico en hybriSpot 24 (HS24) ........................................................................... 29
12.3 Funcionamiento analítico en hybriSpot 12 PCR AUTO (HS12a) ........................................................ 30
12.4 Clínico................................................................................................................................................ 32
13 LIMITACIONES ............................................................................................................................ 33
14 PROBLEMAS Y SOLUCIONES ........................................................................................................ 34
15 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................................... 35
16 SÍMBOLOS DE LA ETIQUETA Y CAJA ............................................................................................. 36
17 GLOSARIO .................................................................................................................................. 36
18 HISTÓRICO DE CAMBIOS ............................................................................................................. 36
Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

2/36
1 USO PREVISTO
“Multidrug Resistance” (MDR) Direct Flow Chip es un kit de diagnóstico in vitro que permite una detección
cualitativa de forma rápida de bacterias multirresistentes. Está basado en PCR múltiple e incluye la
detección de 5 especies bacterianas (S. aureus, K. pneumoniae, P. aeruginosa, E. coli y A. baumannii) y un
total de 55 marcadores de resistencia que incluyen los principales mecanismos de tipo “enzimáticos”
descritos para nueve clases de antibióticos diferentes: -lactámicos, glucopéptidos, oxazolidionas,
macrólidos, aminoglucósidos, sulfonamidas, fluoroquinolonas, polimixinas, cloranfenicol, así como
mutaciones puntuales más frecuentemente detectadas en cepas de E. coli y P. aeruginosa resistentes a
fluoroquinolonas. Entre estos el kit detecta quince genes que confieren resistencia a carbapenemos (kpc
alelo: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 y 23, sme alelo: 1, 2, 3, 4 y 5,
nmc/imi alelo: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9, ges alelo: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,
20, 21, 22, 23, 24, 25 y 26, vim alelo: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,
23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45 y 46, gim alelo: 1 y 2,
spm, ndm alelo: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 y 16, sim, imp3, 15, 19_like alelo: 1, 2, 3, 5, 6, 8,
9, 10, 11, 15, 19, 20, 21, 24, 25, 28, 29, 30, 40, 41, 42 y 47, oxa23_like alelo: 23, 27, 49, 73, 133, 146, 165,
166, 167, 168, 169, 170, 171 y 225, oxa24_like alelo: 24, 25, 26, 40, 72, 139 y 160, oxa48_like alelo: 48, 162,
163 y 181, oxa51_like alelo: 51, 60, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 82, 83, 84, 88, 89, 90, 91,
92, 93, 94, 95, 98, 99, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 115, 116, 117, 128, 130, 131, 132, 138, 144,
148, 149, 150, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 195, 196, 197, 194, 200, 201, 202, 203, 206, 208
y 223, oxa58_like alelo: 58, 96, 97 y 164).
El test se realiza de forma directa en exudados rectales, exudados/aspirados nasofaríngeos y/o

hemocultivos, en pacientes que estén infectados o que presenten riesgo de ser colonizados, como medida
para ayudar en el control y prevención de este tipo de infecciones. El método se basa en la amplificación de
dianas de ADN, mediante una reacción de PCR multiplex, y la posterior hibridación reversa sobre una
membrana que contiene sondas específicas.
Determinante genético Resistencia antibiótica asociada

aac (6´)-Ib
armA
rmtB Aminoglucósidos
rmtC
rmtF
blaCMY
β-lactámicos
blaDHA
blaCTX
blaSHV-SK
Cefalosporinas
blaSHV-S
blaSHV
ges Cefalosporinas/Carbapenems
gim
imp_like Carbapenems
kpc
Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

3/36
ndm
nmc/imi
oxa23_like
oxa24 _like
oxa48_like
oxa51_like
oxa58_like
sim β-lactámicos
sme
spm Carbapenems
vim
catB3 Cloranfenicol
mcr1
Colistina
mcr2
gyrE-S83L
gyrE-S83L-D87G
gyrE-S83L-D87G, parES80I
gyrE-S83L-D87N
gyrE-S83W-D87G Quinolonas
gyrP-T83I
gyrP-T83I-D87G
gyrP-T83I-D87N
parE-S80I
cfr Macrólidos/lincosamida/streptogramina
ermA
ermB
ermC Macrólidos
mefA/E
msrA
mecA
β-lactámicos
mecC
oqxA
Fenicol/quinolonas
oqxB
qnrA
qnrB Quinolonas
qnrS
sul1
sul2 Sulfonamidas
sul3
vanA
vanB Vancomicina
Diana Organismo
Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

4/36
nuc Staphylococcus aureus
ecfX Pseudomonas aeruginosa
ompA Acinetobacter baumannii
gyrA Escherichia coli
khe Klebsiella pneumoniae
Tabla 1: Genes diana usados para la amplificación de marcadores de resistencias a antibióticos y bacterias en MDR Direct Flow
Chip kit.
Estado Microbiológico: Producto no estéril.
2 PRINCIPIO DEL MÉTODO

El kit MDR Direct Flow Chip se basa en una metodología que consiste en la amplificación simultánea de S.
aureus, K. pneumoniae, P. aeruginosa, E. coli y A. baumannii y 56 marcadores de resistencia mediante PCR
múltiple, directamente a partir de extractos celulares, colonias bacterianas y/o hemocultivo, seguida de
hibridación en membrana con sondas de ADN específicas mediante la tecnología DNA-Flow para
plataformas hybriSpot, tanto automática como manual. Los amplicones biotinilados generados tras la PCR
se hibridan en membranas que contienen un array de sondas específicas para cada diana, así como sondas
de control de amplificación e hibridación. La tecnología DNA-Flow permite una unión muy rápida entre el
producto de PCR y su sonda específica en un ambiente tridimensional poroso en contraste con la hibridación
en superficie convencional. Una vez producida la unión entre los amplicones específicos y sus sondas
correspondientes, la señal se visualiza mediante una reacción inmunoenzimática colorimétrica con
Estreptavidina-Fosfatasa y un cromógeno (NBT-BCIP) que genera precipitados insolubles en la membrana
en aquellas posiciones en las que ha habido hibridación. Los resultados son analizados automáticamente
con el software hybriSoft™.
3 COMPONENTES
El kit MDR Direct Flow Chip se comercializa bajo dos formatos principales atendiendo al tipo de plataforma
de hibridación que se vaya a emplear para el análisis de las muestras clínicas. Ambos formatos proporcionan
todos los reactivos necesarios para la amplificación por PCR múltiple y posterior hibridación de 24 muestras
clínicas. Cada formato de kit cuenta con los siguientes componentes y referencias:
KIT/COMPONENTES FORMATO REFERENCIAS

MDR Direct Flow Chip kit (Manual) 24 tests MAD-003946M-HS12
1. MDR Flow Chip kit (PCR Reagents) 24 tests MAD-003946M-P
MDR PCR Mix 1 3 strips × 8 tubes (green) MAD-003946M-MIX1
MDR PCR Mix 2 3 strips × 8 tubes (yellow) MAD-003946M-MIX2
2. MDR Chips 24 tests MAD-003946M-CH-HS
3. Flow Chip Hybridization Reagents Type I (Manual) 24 tests MAD-003925M-HS12
Hybridization Solution (Reagent A) 40 ml MAD-003930MA-HS12-24
Blocking Solution (Reagent B) 10 ml MAD-003930MB-HS12-24
Streptavidin-Alkaline Phosphatase (Reagent C) 10 ml MAD-003930MC-HS12-24
Washing Buffer I (Reagent D) 35 ml MAD-003930MD-HS12-24
Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

5/36
Reagent E 10 ml MAD-003930ME-HS12-24
Washing Buffer II (Reagent F) 18 ml MAD-003930MF-HS12-24
Tabla 2: Reactivos suministrados en el formato MDR Direct Flow Chip kit (Manual).
KIT/COMPONENTES FORMATO REFERENCIAS

MDR Direct Flow Chip kit (Auto) 24 test MAD-003946M-HS12
1. MDR Direct Flow Chip kit (PCR Reagents) 24 test MAD-003946M-P
MDR PCR Mix 1 3 strips × 8 tubes (green) MAD-003946M-MIX1
MDR PCR Mix 2 3 strips × 8 tubes (yellow) MAD-003946M-MIX2
2. MDR Chips 24 test MAD-003946M-CH-HS
3. Flow Chip Hybridization Reagents Type I (Auto) 24 test MAD-003925M-HS
Hybridization Solution (Reagent A) 60 ml MAD-003930MA-HS24-24
Blocking Solution (Reagent B) 10 ml MAD-003930MB-HS24-24
Streptavidin-Alkaline Phosphatase (Reagent 10 ml MAD-003930MC-HS24-24
C)
Washing Buffer I (Reagent D) 35 ml MAD-003930MD-HS24-24
Reagent E 10 ml MAD-003930ME-HS24
Tabla 3: Reactivos suministrados en el formato MDR Direct Flow Chip kit (Auto: hybriSpot 24 e hybriSpot 12 PCR AUTO).
- Ambas presentaciones incluyen agua bidestilada libre de DNasa/RNasa para manipulación de

muestras clínicas: RNASE/DNASE-FREE DISTILLED WATER; Ref: MAD-DDW; Vol 60 mL.
• MDR Direct Flow Chip kit (PCR Reagents): se comercializa en un formato de tiras de 8 tubos de 0,2 ml
que contienen los reactivos liofilizados correspondientes a dos mixes de PCR – Mix 1 y Mix 2.
- Los tubos correspondientes a la Mix 1 (verdes) se disponen en un formato de esfera liofilizada de
color rosado cuyos componentes son: tampón de PCR, polimerasa,
Uracil DNA glicosilasa, dNTPs (U/T), agua libre de DNAsas, DNA de un control exógeno de
amplificación y primers biotinilados. Los primers que se incluyen son los específicos para la
amplificación de: gen de resistencia a meticilina (mecA, mecC), genes de resistencia a
vancomicina (vanA, vanB), genes de resistencia a Carbapenemasas de clase A (kpc, sme,  nmc/imi,
ges), genes de resistencia a Carbapenemasas de clase B (vim, gim, spm, ndm, sim, imp_like), genes
de resistencia a Carbapenemasas de clase D (oxa23_like, oxa24_like, oxa48_like, oxa51_like,
oxa58_like), gen de ß-Lactamasas SHV (blaSHV), genes de ß-Lactamasas SHV de espectro extendido
(blaSHV-S, blaSHV-SK), gen de ß-Lactamasas CTX-M de espectro
extendido (blaCTX), Staphylococcus aureus (SA), Klebsiella pneumoniae (kpneum), Pseudomonas a
eruginosa (Paer), Acinetobacter baumannii (Abau). Además, incluye los primers para amplificar un
fragmento de DNA genómico humano (BG) como control endógeno, y primers para amplificar
el DNA sintético (CI-1) añadido como control exógeno de amplificación.
- Los tubos correspondientes a la Mix 2 (amarillos) se disponen en un formato de esfera liofilizada de

color azul cuyos componentes son: tampón de PCR, polimerasa, Uracil DNA glicosilasa, dNTPs (U/T),
agua libre de DNAsas, DNA de un control exógeno de amplificación
y primers biotinilados. Los primers que se incluyen son los específicos para la amplificación
de: Genes resistencia a colistina (mcr1, mcr2), genes de resistencia a sulfonamidas (sul1, sul2,
sul3), genes de β-Lactamasa AMPC (blaDHA, blaCMY), genes de resistencia a macrólidos
(msrA, mef, ermA, ermB, ermC), genes de resistencia a
Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

6/36
aminoglucósidos (aac, armA, rmtB, rmtC, rmtF), gen girasa A de Escherichia coli (gyrA) para
detección de mutaciones asociadas a resistencia a fluoroquinolonas (gyrE-S83L, gyrE-S83L-D87G,
gyrE-S83L-D87N, gyrE-S83W-D87G), gen de la topoisomerasa IV de Escherichia coli (parC) para
detección de la mutación asociada a resistencia a quinolonas parE-S80I, gen de la girasa A
de Pseudomonas aeruginosa (gyrA-Paer) para detección de mutaciones asociadas a resistencia a
fluoroquinolonas (gyrP-T83I, gyrP-T83I-D87N, gyrP-T83I-D87G), genes de resistencia a quinolonas o
fluoroquinolonas (qnrA, qnrB, qnrS), genes de resistencia a olaquindox (oqxA, oqxB), gen de
resistencia a linezolid (cfr), gen de resistencia a cloranfenicol. Además, se incluye los primers para
amplificar un fragmento de DNA genómico humano (RNasaP) como control
endógeno y primers para amplificar el DNA sintético (CI-2) añadido como control exógeno de
amplificación.
• MDR Chips: El kit incluye un total de 24 Chips o membranas (ref: MAD-003946M-CH-HS) que contienen
un array de sondas DNA específicas para cada de las dianas incluidos en el análisis, así como otras
correspondientes a los controles de amplificación incorporados en este kit. La disposición de todas ellas
sobre el Chip se puede consultar en el apartado 10 de este manual (INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS).
• Flow Chip Hybridization Reagents: contiene todos los reactivos necesarios para el proceso de hibridación
reversa por Flow-Through.
4 MATERIAL ADICIONAL REQUERIDO NO SUMINISTRADO Y MATERIAL OPCIONAL
4.1 Reactivos y materiales

A. Reactivos comunes para plataformas tanto manual como automática:
• Guantes desechables.
• Puntas de pipeta con filtro libres de DNasa/RNasa.
• Para manipulación de muestras clínicas: Agua bidestilada libre de DNasa/RNasa
B. Reactivos específico (Auto, ref: MAD-003946M-HS24):

• Washing Reagent (ref: MAD-003930WSH).
4.2 Equipamiento
A. Equipamiento común para para plataformas tanto manual como automática:
• Microcentrífuga.
• Micropipetas automáticas: P1000, P200, P20 y P2.
• Software hybriSoft.
B. Equipamiento específico:
• Con MDR Direct Flow Chip kit (Manual) (ref: MAD-003936M-HS12)
o Termociclador.
o Bloque térmico para calentar tubos de PCR (puede ser sustituido por un
termociclador).
o Placa de frio (4 °C).
o Equipo manual para hibridación hybriSpot 12 (VIT-HS12).
Vitro S.A Rev.: 2022-03-31
7/36
o Baño termostatizado/estufa.
• Con MDR Direct Flow Chip kit (Auto: hybriSpot 24 e hybriSpot 12 PCR AUTO) (ref: MAD-
003936M-HS24)
o Equipo automático para hibridación hybriSpot 24 (VIT-HS24) o hybriSpot 12
PCR AUTO (VIT-HS12a).
o Termociclador (no necesario para hybriSpot 12 PCR AUTO).
o Bloque térmico para calentar tubos de PCR (no necesario para hybriSpot 12
PCR AUTO).
o Placa de frio (4 °C).
4.3 Material adicional opcional

• Para la manipulación de muestras clínicas es posible el uso del producto Transport and Dilution
Medium (TDM) (Ref: MAD-003930TDM). El protocolo de trabajo, en función del tipo de
muestra de partida, se indica en el apartado 7. Preparación de la muestra.
5 CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD

El kit MDR Direct Flow Chip consta de tres componentes que se suministran en envases separados:
• MDR Direct Flow Chip kit (PCR Reagents): Envío a 2-8 °C. Una vez recibido se deben conservar
almacenados a 2-8 °C, siendo estables hasta la fecha de caducidad especificada. Los reactivos de
PCR deben ser conservados en zonas libres de contaminación por ADN o productos de PCR. Una vez
abierto el envase que contiene la tira de tubos, conservar los tubos sobrantes hasta un máximo
de una semana a 2-8 °C en el embalaje original.
• MDR Chips: Enviados y almacenados entre 2-8°C*. No congelar. Los Chips de hibridación son
estables hasta la fecha de caducidad especificada.
• Reactivos de hibridación: Enviados y almacenados entre 2-8°C*. No congelar. Los reactivos de

hibridación son estables hasta la fecha de caducidad especificada. Consideraciones previas sobre
los reactivos de hibridación:
• El reactivo A de hibridación debe ser pre-calentado en un baño termostatizado o estufa (sólo
antes de usar en equipo manual) a 46°C previo a su uso.
• El resto de los reactivos de hibridación deben ser usados a temperatura ambiente (15-25°C).
*Nota: Dentro de cada paquete se incluye una banda indicadora del tiempo y la temperatura para controlar las
condiciones durante el envío. Se recomienda contactar con el fabricante previo al uso de los reactivos incluidos en
el paquete si la cadena de frío se ha interrumpido.
6 ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES
• Lea las instrucciones de uso antes de utilizar este producto.

• Las precauciones de seguridad y eliminación de residuos vienen descritas en la Ficha de Datos de
Seguridad de este producto. Este producto está destinado únicamente para uso profesional en un
laboratorio, y no como fármaco, para uso doméstico ni otros fines. La versión actual de la Ficha de Datos
de Seguridad de este producto puede ser descargada en la página web www.vitro.bio o solicitada en
Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

8/36
regulatory@vitro.bio.
• MDR Direct Flow Chip kit utiliza como material de partida bien ácidos nucleicos previamente extraídos
y purificados o bien muestras clínicas que requieren de una manipulación previa para su análisis. Se
proporcionan protocolos de manipulación de los distintos tipos de muestras clínicas cuyo procesamiento
ha sido validado con este kit (ver apartado 7.1).
• Consideraciones generales para evitar la contaminación con producto de PCR:
La mayor fuente de contaminación suele ser el propio producto de PCR amplificado, por lo cual es
recomendable llevar a cabo la manipulación de los productos amplificados en una zona diferente a donde
se realiza la reacción de PCR. Es recomendable trabajar en áreas diferenciadas de pre- y post-PCR en
donde se realice la manipulación del ADN problema y preparación de tubos de PCR (pre-PCR) y la
manipulación e hibridación de los productos amplificados (post-PCR). Estas áreas deben estar separadas
físicamente y debe emplearse distinto material de laboratorio (batas, pipetas, puntas…, etc.) para evitar
la contaminación de las muestras con el ADN amplificado, lo que podría conducir a falsos diagnósticos
positivos. El flujo de trabajo debe ir siempre en una única dirección, desde la zona de pre-PCR hasta la
zona de post-PCR y nunca en dirección opuesta. Se debe evitar el flujo de material y personal desde la
zona post-PCR a la zona pre-PCR. Además, a fin de evitar la contaminación con productos de PCR previos,
se incluye en el kit la enzima Uracil DNA glycosylase, que degrada productos de PCR que contengan dUTP.
Se recomienda incluir controles negativos de amplificación que contengan todos los reactivos manejados
en el kit, desde la extracción hasta la amplificación, con excepción de la muestra de ADN, con objeto de
detectar y controlar cualquier posible contaminación de los reactivos con muestras problema o con
productos amplificados. La hibridación en membrana de este control debe ser negativa, marcándose solo
el control de hibridación y el control exógeno de amplificación. De este modo se comprueba que no
existe contaminación de ADN de pacientes y/o de ADN amplificado en la zona de pre-PCR.
• Precaución: el empleo de óxido de etileno para la preparación de muestras clínicas y/o la mezcla de PCR
podría interferir en el correcto desarrollo de la reacción de PCR. Se recomienda evitar el uso de este
compuesto para tales fines.
• Eliminación de residuos: La manipulación de residuos generada por el uso de los productos
comercializados por Vitro S.A, S.L., debe realizarse de acuerdo con la legislación vigente en el país en el
que estos productos sean usados. Como referencia, la siguiente tabla indica la clasificación de los
residuos generados por este kit de acuerdo con la legislación europea, específicamente de acuerdo con
la decisión de la comisión europea del 18 de diciembre de 2014 enmienda de la decisión 2000/532/CE
sobre la lista de residuos conforme a la directiva 2008/98/CE del parlamento europeo y del consejo:
RESIDUOS POTENCIALES GENERADOS CÓDIGO

TIPO DE RESIDUO DE ACUERDO A ELW
TRAS EL USO DE ESTE PRODUCTO ELW*
1. Basura/Residuos generados a “Residuos acuosos líquidos que contienen sustancias
partir de los reactivos de hibridación peligrosas” después de añadir un 10% del volumen total de
2. Desecho de Residuos líquidos un agente desinfectante. Si la desinfección no es llevada a
161001
(“Residuos” en los equipos HS12 y cabo, estos residuos deben considerarse como “residuos
HS24) cuyo almacenamiento y eliminación es sometida a
requisitos especiales a fin de prevenir infección”
Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

9/36
3. Chips empleados
4. Material perecedero (tubos,
“Residuos cuyo almacenamiento y eliminación es
puntas, papel de aluminio, etc.)
180103 sometida a requisitos especiales a fin de prevenir
5. Cualquier elemento que haya
infección”
estado en contacto con ADN
6. Contenedor para reactivos usados

clasificados como peligrosos (de
“Envases que contienen residuos o contaminados por
acuerdo a la Ficha de Datos de 150110
sustancias peligrosas”
Seguridad)
Tabla 4: Clasificación de residuos generados por este kit de acuerdo con la legislación europea. *ELW: Acrónimo del inglés
European Legislation of Waste.
Nota: Esta clasificación se incluye como pauta general de actuación, estando bajo la responsabilidad final del
usuario el cumplimiento de todas las regulaciones locales, regionales y nacionales sobre la eliminación de este tipo
de materiales.
7 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
7.1 Exudados rectales

El kit MDR Direct Flow Chip se ha validado para su uso en PCR directa partiendo de suspensiones celulares
de exudados rectales sin necesidad de extraer el ADN. El protocolo recomendado para el procesamiento de
las torundas es el siguiente:
1. Colocar la torunda en 0.5 ml de agua bidestilada libre de DNasa/RNasa.
2. Agitar la torunda dentro del tubo para que las células se dispersen en el líquido.
3. Diluir la suspensión obtenida 1:50 en agua bidestilada libre de DNasa/RNasa (con esta dilución
se consigue reducir la concentración de posibles inhibidores presentes en este tipo de
muestras): 10 µl de muestra + 490 µl de agua bidestilada libre de DNasa/RNasa, agitar en
vortex.
4. Añadir 30 µl de esta dilución, previamente homogeneizada, a los dos tubos de PCR con la
Master Mix liofilizada (Mix 1 y Mix 2).
En el caso de que se trabaje con torundas con medio de transporte se recomienda agitar la torunda
manualmente o con vórtex en el propio medio de transporte durante unos segundos y proceder de la misma
manera que para torundas secas a partir del punto 7.1.3.
NOTA: Si tras diluir 1:50 quedaran inhibidores en la muestra, se recomienda diluir 1:2 a partir de la dilución 1:50 o
purificar el ADN a partir de la suspensión inicial (0.5 ml).
El kit también se puede usar a partir de ADN purificado de exudados rectales. Se ha validado con los
siguientes sistemas de extracción:
• NucliSENS® easyMag® (bioMérieux S.A.)
• MagNa Pure (Roche)
• Chelex® (Bio-Rad)
Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

10/36
NOTA: El sistema no ha sido validado con otros sistemas de extracción de ADN, por tanto, si se emplea otro sistema de
purificación diferente éste debe verificarse previamente.
7.2 Exudados/aspirados nasofaríngeos

El kit MDR Direct Flow Chip se ha validado para su uso en PCR directa partiendo de suspensiones celulares
de exudados/aspirados nasofaríngeos sin necesidad de extraer el ADN. El protocolo recomendado para el
procesamiento de las torundas es el siguiente:
1. Colocar la torunda en 0.5 ml de agua bidestilada libre de DNasa/RNasa.
3. Diluir la suspensión obtenida 1:5 en agua bidestilada libre de DNasa/RNasa (con esta dilución
se consigue reducir la concentración de posibles inhibidores presentes en este tipo de
muestras): 100 µl de muestra + 400 µl de agua bidestilada libre de DNasa/RNasa, agitar en
vórtex.
4. Añadir 30 µl de esta dilución, previamente homogeneizada en vórtex, a los dos tubos de PCR
con la Master Mix liofilizada (Mix 1 y Mix 2).
En el caso de que se trabaje con torundas con medio de transporte se recomienda agitar la torunda
manualmente o con vortex en el propio medio de transporte durante unos segundos y proceder de la misma
7.3 Exudados rectales y exudados nasales como una muestra única

El kit MDR Direct Flow Chip se ha validado para su uso en PCR directa partiendo de doble toma de muestra
procedente de exudado rectal y exudado nasal del mismo paciente, sin necesidad de extraer el ADN. El
protocolo seguido para el procesamiento de las dos torundas en paralelo y posterior análisis como una
muestra única fue el siguiente:
1. Colocar cada una de las torundas por separado en 0.5 ml de agua bidestilada libre de
DNasa/RNasa.
2. Agitar cada torunda dentro del tubo para que las células se dispersen en el líquido.
3. Añadir 25 µl de cada una de las suspensiones obtenidas para cada hisopo en un único tubo
eppendorf con 450µl de agua bidestilada libre de DNasa/RNasa, de manera que cada una
quedará diluida 1:20. Agitar en vortex.
4. Añadir 30 µl de esta dilución, previamente homogeneizada, a los tubos de PCR con la Master
Mix liofilizada (Mix 1 y Mix 2).
En el caso de que se trabaje con torundas con medio de transporte se recomienda agitar las torundas
manualmente o con vortex en el propio medio de transporte durante unos segundos, y proceder de la misma
NOTA: Si tras diluir 1:20 quedaran inhibidores en la muestra, se recomienda hacer una dilución 1:50 del exudado rectal
y 1:20 del exudado nasal. Para ello, añadir 10 µl de la suspensión obtenida del exudado rectal y 25 µl de la suspensión
obtenida del exudado nasal en un único tubo eppendorf con 465µl de agua bidestilada libre de DNasa/RNasa.
Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

11/36
7.4 Hemocultivos
El kit MDR Direct Flow Chip se ha validado para su uso en PCR directa partiendo de hemocultivos sin
necesidad de extraer el ADN. El protocolo recomendado para el procesamiento de los hemocultivos es el
siguiente:
1. Agitar bien el frasco de hemocultivo hasta obtener una mezcla homogénea, tomar un volumen
de 100 µl y pasar a un tubo eppendorf.
2. Diluir el hemocultivo 1:100 en agua bidestilada libre de DNasa/RNasa en un volumen final de
1 ml:
- 1:100: 10 µl de hemocultivo + 990 µl de agua bidestilada libre de DNasa/RNasa, agitar en
vortex.
Si se trata de muestras pediátricas la dilución que hay que aplicar al hemocultivo es de 1:1000.
4. Agitar bien el frasco de hemocultivo hasta obtener una mezcla homogénea, tomar un
volumen de 100 µl y pasar a un tubo eppendorf.
5. Diluir el hemocultivo 1:100 en agua bidestilada libre de DNasa/RNasa en un volumen final de
1 ml:
- 1:100: 10 µl de hemocultivo + 990 µl de agua bidestilada libre de DNasa/RNasa, agitar en
vortex.
6. Diluir 1:10 el hemocultivo anteriormente diluido 1:100 en agua bidestilada libre de
DNasa/RNasa en un volumen final de 1 ml:
- 1:10: 100 µl de hemocultivo 1:100 + 900 µl de agua bidestilada libre de DNasa/RNasa,
agitar en vortex.
7.5 Colonias bacterianas

El kit MDR Direct Flow Chip ha sido validado para su uso partiendo directamente de colonias bacterianas. El
protocolo recomendado para ello es el siguiente:
1. Tomar una pequeña cantidad de la colonia con asa estéril.
2. Resuspender cada muestra en 500 µl de agua bidestilada libre de DNasa/RNasa.
3. Agitar vigorosamente en vórtex hasta obtener una suspensión celular homogénea.
Los exudados rectales, exudados/aspirados nasofaríngeos y hemocultivos se deben tratar como posibles
agentes infecciosos. Las directrices para la manipulación de este tipo de muestras se pueden consultar en
las publicaciones del Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades de EEUU (CDC). Todos los
materiales peligrosos o biológicamente contaminados se deben desechar de forma segura y aceptable
según las directrices de su institución.
Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

12/36
7.6 Protocolos de procesamiento de muestras con medio de dilución y trasporte (TDM)
Opcionalmente, es posible usar el medio Transport & Dilution Medium TDM (Ref: MAD-003930TDM) para
el procesamiento de los diferentes tipos de muestras clínicas descritas en los apartados anteriores. A
continuación, se muestra una tabla donde describen los pasos a seguir para el procesamiento de muestras
con este reactivo, en función del tipo de muestra de partida (tabla 5).
Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

13/36
MUESTRA DE FORMATO PROTOCOLO PROCESAMIENTO DE MUESTRA CON REACTIVO TRANSPORT AND
PARTIDA DILUTION MEDIUM (TDM) (Ref: MAD-003930TDM)
1. Colocar la torunda en uno de los viales con 900 µl de medio de dilución y
transporte pre-alicuoteado (TDM).
Torunda/hisopo sin
3. Tomar un volumen de 35 µl de esta muestra y añadirlo a un nuevo vial de medio
medio de transporte
TDM.
4. Agitar la dilución resultante en vórtex y utilizar 30 µl de esta muestra como
Exudados rectales
molde para realizar la amplificación.
1. Agitar la torunda manualmente o con vórtex en el propio medio de transporte
durante unos segundos.
Torunda/hisopo con
2. Añadir 18 µl de muestra a uno de los viales con 900 µl de medio TDM.
medio de transporte
3. Usar 30 µl de esta dilución, previamente homogeneizada, para la PCR.
1. Colocar la torunda en uno de los viales con 900 µl de medio TDM.

Exudados Torunda/hisopo sin 3. Tomar un volumen de 500 µl de esta muestra y añadirlo a un nuevo vial de
nasofaríngeos medio de transporte medio TDM.
4. Agitar la dilución resultante en vortex y utilizar 30 µl de esta muestra como
1. Colocar la torunda rectal en uno de los viales con 900 µl de medio TDM y la
torunda nasofaríngea en otro vial de TDM.
Exudados rectales y 2. Agitar cada torunda dentro de los tubos para que las células se dispersen en el
exudados líquido.
Torundas/hisopos sin
nasofaríngeos 3. Tomar un volumen de 100 µl de cada una de las suspensiones celulares
medio de transporte
como muestra obtenidas y añadirlas a un nuevo vial de medio TDM.
única 4. Agitar la dilución resultante en vórtex y utilizar 30 µl de esta muestra como
1. Agitar bien el frasco de hemocultivo hasta obtener una mezcla homogénea.

2. Tomar un volumen de 10 µl del hemocultivo y añadirlo a uno de los viales con
Medio aerobio y medio 900 µl de medio TDM.
Hemocultivos 3. Agitar la dilución resultante en vórtex y utilizar 30 µl de esta muestra como
anaerobio
1. Tomar una pequeña cantidad de la colonia con asa estéril.

2. Resuspender la muestra en 900 µl de medio TDM.
Colonias 4. Agitar la dilución resultante en vórtex y utilizar 30 µl de esta muestra como
- molde para realizar la amplificación.
bacterianas
Tabla 5. Protocolos para el procesamiento de muestras usando el reactivo de dilución y trasporte TDM.
Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

14/36
8 PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS
8.1 Reacción de amplificación múltiple del ADN

La reacción de PCR se lleva a cabo en un volumen final de 30 µl en dos tiras de tubos de PCR de 0.2 mL que
contienen la mezcla de reacción de PCR liofilizada. Las esferas liofilizadas de color rosado y color azul
corresponden a la mix 1 y a la mix 2, respectivamente y se suministran en tiras separadas. Por cada muestra
se deben usar dos tubos de PCR, uno de cada tira.
El procedimiento es el siguiente:
• Tomar un tubo, que contiene cada una de las mezclas de PCR liofilizada, por cada muestra a analizar.
• Añadir hasta 30 µl de muestra en cada tubo siguiendo el protocolo recomendado en apartado 7.
• Homogenizar la mezcla mediante pipeteo y centrifugar durante unos segundos.
• Si el número de muestras a analizar es inferior o superior a ocho, se pueden separar de la tira los
tubos que sean necesarios sin tener que emplear tiras completas. El resto de la tira de tubos
liofilizados que no se vaya a usar en el momento debe ser almacenada durante un máximo de 1
semana a 4 °C en el embalaje original.
• Colocar los tubos en el termociclador y programar las siguientes condiciones de amplificación:
PROGRAMA DE AMPLIFICACIÓN EN TERMOCICLADOR
• Tanto si se trabaja con tubos individuales de PCR o con tiras de tubos, una vez se haya añadido el
ADN purificado o la suspensión celular, colocar los tubos o tiras en el termociclador y programar las
condiciones de amplificación que figuran a continuación:
1 ciclo 25°C 10 min

1 ciclo 95°C 3 min
95°C 15 s
40 ciclos 55°C 45 s
72°C 1 min
8°C ∞
Tabla 6: Programa de PCR.
Si no se va a proceder con la hibridación directamente, se pueden almacenar los tubos o tiras de tubos con
el producto amplificado en la zona de post-PCR a una temperatura de 8-10 °C durante 1-2 días. Para
almacenarlos durante un periodo mayor de tiempo se recomienda hacerlo a -20 °C.
8.2 Hibridación reversa por flow-through

Todos los reactivos se suministran en formato “listo para uso”.
Los Chips son de un solo uso. Se deben manejar con guantes y alejados de cualquier fuente de
contaminación.
Atendiendo al tipo de kit con el que se esté trabajando se procederá de la siguiente manera:
Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

15/36
A. Para MDR Direct Flow Chip kit (Manual, ref: MAD-003946M-HS12):
Todo el proceso de hibridación se realiza de forma semiautomática en hybriSpot (HS12) siguiendo las
instrucciones proporcionadas por el wizard del equipo. La gestión de las muestras, la captura de las
imágenes y el análisis e informe de los resultados se realizan a través del software hybriSoft.
Nota: Configurar el instrumento siguiendo las instrucciones del manual de usuario (proporcionadas con el instrumento).
Antes de comenzar el proceso de hibridación realizar los siguientes pasos:

1. Precalentar el Reactivo A (Reagent A) a 46 °C durante al menos 20 min en un baño termostatizado.
2. Mezclar los productos de PCR obtenidos con la mix 1 y mix 2 y alicuotear 50 µl de la mezcla en un
nuevo tubo siendo éste el material utilizado en los siguientes pasos.
3. Desnaturalizar los productos de PCR calentando a 95 °C durante 10 min (en termociclador o bloque
térmico) y enfriar rápidamente, manteniendo las muestras a 4 °C durante al menos 2 min.
4. Situar cada MDR Chip en la posición indicada en la plataforma (HS12).
PROTOCOLO DE HIBRIDACIÓN:
a) Añadir 300 µl de reactivo A (Solución de Hibridación) precalentada a 46 °C e incubar durante al
menos 2 min a 46 °C.
b) Eliminar el reactivo A activando la bomba de vacío.
c) Añadir 50 µl correspondientes a la mezcla de los productos de PCR de la Mix 1 y Mix2 (previamente
desnaturalizadas y mantenidas en hielo) a 230 µl de reactivo A (Solución de Hibridación) (46 °C)
y dispensar la mezcla sobre el MDR Chip-HS correspondiente.
d) Incubar a 46 °C durante 8 min.
e) Activar la bomba para eliminar los productos de PCR (asegurarse que la bomba está activa al
menos 30 s).
f) Lavar 3x 300 µl con reactivo A (46 °C).
g) Fijar la temperatura en 29 °C.
h) Bloquear las membranas durante al menos 5 min con 300 µl de reactivo B (Solución de Bloqueo).
i) Cuando la temperatura llegue a 29 °C activar la bomba para eliminar el reactivo B.
j) Añadir 300 µl de reactivo C (Complejo estreptavidina-fosfatasa alcalina) e incubar durante 5 min
a 29 °C.
k) Activar la bomba para eliminar el reactivo.
l) Fijar la temperatura en 36 °C.
m) Lavar las membranas 4x 300 µl con reactivo D (Washing buffer I).
n) Revelar las membranas añadiendo 300 µl de reactivo E (Solución de revelado) e incubar 10 min a
36 °C.
o) Activar la bomba para eliminar el reactivo E.
p) Lavar las membranas con 2x 300 µl con reactivo F (Solución de lavado II).
q) Activar la bomba para eliminar el reactivo.
r) Captura de imágenes, análisis e informe de resultados siguiendo instrucciones del manual de
usuario HS12.
Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

16/36
B. Para MDR Direct Flow Chip kit (Auto, ref: MAD-003946M-HS) en equipo HS24:
Todo el proceso de hibridación se realiza en plataforma hybriSpot automática. La gestión de las muestras,
la captura de las imágenes y el análisis e informe de los resultados se realizan a través del software
hybriSoft.
Nota: Configurar el instrumento siguiendo las instrucciones del manual de usuario (proporcionadas con el instrumento).
Antes de comenzar el proceso de hibridación realizar los siguientes pasos:

1. Configurar el instrumento siguiendo las instrucciones del manual de usuario (proporcionadas con
el equipo).
2. Desnaturalizar los productos de PCR calentando a 95 °C durante 10 min en un termociclador o
bloque térmico y enfriar rápidamente en hielo durante al menos 2 min.
3. Seguir las instrucciones dadas en el manual de usuario del equipo para llevar a cabo la introducción
de los datos de las muestras.
4. Seguir las instrucciones del manual para colocar los tubos de PCR de la Mix 1 y 2, los MDR Chips y
los reactivos en sus correspondientes posiciones del hybriSpot 24.
5. Una vez que han sido colocados correctamente en el equipo todos los reactivos de hibridación,
muestras y Chips dar al botón de Iniciar, en la ventana de hS Control, para comenzar el protocolo.
9 PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS PARA EL EQUIPO HS12 PCR AUTO

Los procesos de amplificación por PCR e hibridación se realizan de forma automática en la plataforma HS12
PCR AUTO.
El procesamiento de la muestra, la captura de imágenes y el análisis de los resultados se lleva a cabo
mediante el software hybriSoft.
Antes de comenzar el proceso, se recomienda leer con atención el manual de usuario (incluido en el equipo
HS12a). Seguir sus instrucciones del manual para colocar las tiras de tubos de PCR, CHIPs y reactivos de
hibridación en el instrumento.
Protocolo:
1. Tomar dos tubos que contienen cada una de las mezclas de PCR liofilizada por muestra a analizar.
2. Añadir hasta 30 µl de muestra en cada tubo siguiendo el protocolo recomendado en apartado 8.1.
3. Homogenizar la mezcla mediante pipeteo y centrifugar durante unos segundos.
4. Si el número de muestras a analizar es inferior o superior a 8, se pueden separar de la tira los tubos
que sean necesarios sin tener que emplear tiras completas. El resto de la tira de tubos liofilizados
que no se vaya a usar en el momento debe ser almacenada durante un máximo de 1 semana a 4 °C
en el embalaje original.
5. Seguir las instrucciones que se indican en el equipo HS12a para colocar las tiras de tubos de PCR,
chips y reactivos de hibridación en el instrumento e iniciar el proceso.
Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

17/36
10 PROCEDIMIENTO DE CONTROL DE CALIDAD
El kit MDR Direct Flow Chip contiene varios controles internos para controlar la calidad de los resultados.
SPOTS CONTROL POSICIÓN INTERPRETACIÓN
B Control hibridación 1A-1B-2M-7G-
5 posiciones son correctas
12A
CI-1 Control de amplificación exógeno Mix 1 1C-7H 0, 1 o 2 posiciones son correctas
CI-2 Control de amplificación exógeno Mix 2 1D-7I 0, 1 o 2 posiciones son correctas
BG Control de amplificación endógeno Mix 1 1E-7J 0, 1 o 2 posiciones son correctas
RNaseP Control de amplificación endógeno Mix 2 1F-7K 0, 1 o 2 posiciones son correctas
Tabla 7: Sondas control incluidas en MDR Chip.
• Control de hibridación: Tras el revelado de las membranas debe aparecer una señal intensa en las
cinco posiciones de control de hibridación (B) que sirve como control de calidad. Esta señal indica
que los reactivos de hibridación y revelado han funcionado correctamente. Si no aparece señal
indicará que ha habido un fallo durante el proceso de hibridación o que algún reactivo no se ha
usado correctamente. Además, esta señal permite que el software pueda orientar correctamente
el panel de sondas para su posterior análisis.
• Control de amplificación exógeno (CI): sonda para la detección de ADN sintético incluido en la
mezcla de PCR. Este ADN se co-amplificará junto con el material genético de la muestra. Dos señales
positivas en el Control de amplificación exógeno (CI) indicarán que la reacción de PCR ha funcionado
correctamente. Un resultado negativo en este control no invalida el resultado de la técnica si el
control endógeno ha amplificado correctamente y/o la muestra ha sido positiva para alguna de las
dianas incluidas en el panel.
• Control de amplificación endógeno (BG): sonda para la detección de ADN del gen de la beta-globina
humana que es co-amplificado durante la PCR. Todas las muestras donde el ADN problema se haya
amplificado correctamente tendrán una señal positiva en el Control de amplificación endógeno
(BG). Esta señal es indicativa de la calidad/cantidad del ADN empleado en la amplificación. Una
señal positiva indica que la amplificación ha funcionado correctamente y que la calidad y cantidad
del ADN empleado para ello han sido óptimas. La ausencia de señal para este control nos indica
fallos durante la amplificación, baja calidad/ cantidad del ADN utilizado en la amplificación o
ausencia de DNA humano en la amplificación. Este último caso es posible que ocurra con algunas
muestras, teniendo en cuenta la dilución a que se somete las muestras clínicas para la preparación
de la PCR. Esta señal no aparecerá en el caso de que se use como muestra de partida colonias
bacterianas. No obstante, un resultado negativo en este control no invalida el resultado de la técnica
si el control exógeno ha amplificado correctamente y/o la muestra ha sido positiva para alguno de
las dianas incluidas en el panel.
Las muestras que sean positivas para alguno de los marcadores de resistencias incluidos en el kit deben
dar señal para algunas de las sondas específicas. Además, deben aparecer las cinco señales de control de
hibridación (B), dos señales de Control de amplificación exógeno (CI) y dos señales de Control de
amplificación endógeno (BG) (siempre que la muestra contenga ADN humano). En el caso de que no
aparezcan señales para los controles de amplificación, pero sí para los marcadores de resistencias se incluye
Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

18/36
en el informe un mensaje de ausencia de ADN humano/presencia de inhibidores de la PCR. En este caso el
usuario debería verificar la calidad de las muestras antes de validar los resultados.
Cuando las muestras sean negativas para todos los marcadores de resistencias incluidos en el kit
presentarán las cinco señales positivas para el control de hibridación (B) dos señales para el Control de
amplificación exógeno (CI). Las señales de Control de amplificación endógeno (BG) aparecerán además si la
muestra analizada contiene ADN humano.
El usuario es responsable de determinar los procedimientos de control de calidad apropiados para su
laboratorio y cumplir con la reglamentación aplicable.
11 INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
La interpretación de resultados se realiza de forma automática mediante el software de análisis hybriSoft.
En el siguiente esquema se muestra la disposición de las sondas en el Chip de MDR:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
A B msrA catB3 ndm mcr1 rmtB qnrB nmc/imi B
B B mef gyrE-S83L mecA sim Abau sul1 rmtC qnrS ges oxa51_like
C CI-1 ermA gyrE-D87G vanA imp_like mcr2 sul2 rmtF oqxA vim oxa58_like
D CI-2 ermB gyrE-S83W vanB blaSHV-S mecC sul3 Ecoli oqxB gim SA
gyrE-S83W-
E BG ermC blaSHV blaSHV-SK gyrP-D87G blaDHA cfr spm kpneum
D87N
F RnaseP aac gyrP-T83I blaCTX oxa23_like parE-S80I blaCMY catB3 ndm Paer
G mcr1 armA gyrP-D87N kpc oxa24 _like B msrA gyrE-S83L mecA sim
H sul1 rmtB qnrA sme oxa48_like CI-1 mef gyrE-D87G vanA imp_like Abau
I sul2 rmtC qnrB nmc/imi oxa51_like CI-2 ermA gyrE-S83W vanB blaSHV-S mcr2
gyrE-S83W-
J sul3 rmtF qnrS ges oxa58_like BG ermB blaSHV blaSHV-SK mecC
D87N
K blaDHA Ecoli oqxA vim SA RnaseP ermC gyrP-T83I blaCTX oxa23_like gyrP-D87G
L blaCMY oqxB gim kpneum aac gyrP-D87N kpc oxa24 _like parE-S80I
M B cfr spm Paer armA qnrA sme oxa48_like
Figura 1: Esquema de la disposición de sondas sobre el array. Se incluyen las sondas específicas para los patógenos y genes de
resistencia de estudio y aquellas sondas empleadas como controles de amplificación e hibridación. Las coordenadas de cada una de
ellas también quedan indicadas.
Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

19/36
“B”: control de hibridación
“CI”: Control de amplificación exógeno
“BG”: Control de amplificación endógeno (fragmento ß-Globina humana)
“X”: Sondas específicas para cada marcador de resistencia
Todas las sondas están duplicadas para garantizar la fiabilidad en el análisis automático de los resultados.
El control de hibridación (B) está repetido en 5 posiciones y permite que el software pueda orientar
correctamente el panel de sondas para su posterior análisis.
En la siguiente tabla se muestran tipo de sondas empleadas y posiciones en las que éstas han sido
espoteadas sobre el Chip de MDR. Igualmente se indican los posibles resultados obtenidos y la
interpretación de los resultados:
Sonda/posiciones (columna-fila)
Resultados esperados (Organismos/Resistencia) Sonda ID
Sonda B CI-1 CI-2 BG RnaseP
1A-1B-2K-
Staphylococcus aureus SA 2F-7J --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
6F-10A
1A-1B-2K-
GEN DE RESISTENCIA A METICILINA mecA mecA 3I-8C --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
6F-10A
1A-1B-2K-
GEN DE RESISTENCIA A VANCOMICICA vanA vanA 3J-8B --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
6F-10A
1A-1B-2K-
GEN DE RESISTENCIA A VANCOMICINA vanB vanB 3K-8A --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
6F-10A
1A-1B-2K-
CARBAPENEMASA CLASE A KPC kpc 4A-9E --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
6F-10A
1A-1B-2K-
CARBAPENEMASA CLASE A SME sme 4B-9G --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
6F-10A
1A-1B-2K-
CARBAPENEMASA CLASE A NMC/IMI nmc/imi 4C-9H --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
6F-10A
1A-1B-2K-
ß-LACTAMASA SHV blaSHV 4E-9J --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
6F-10A
ß-LACTAMASA DE ESPECTRO EXTENDIDO SHV blaSHV-SK 5F-9I 1A-1B-2K-
--/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
(mutante doble) blaSHV-S 5E-9A 6F-10A
ß-LACTAMASA DE ESPECTRO EXTENDIDO SHV 1A-1B-2K-
blaSHV-S 5E-9A --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
(mutante sencillo) 6F-10A
1A-1B-2K-
ß-LACTAMASA DE ESPECTRO EXTENDIDO CTX-M blaCTX 4F-9K --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
6F-10A
1A-1B-2K-
CARBAPENEMASA CLASE A GES ges 4G-9B --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
6F-10A
1A-1B-2K-
CARBAPENEMASA CLASE B VIM vim 4H-9C --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
6F-10A
1A-1B-2K-
CARBAPENEMASA CLASE B GIM gim 4I-9D --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
6F-10A
1A-1B-2K-
CARBAPENEMASA CLASE B SPM spm 5A-9F --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
6F-10A
1A-1B-2K-
CARBAPENEMASA CLASE B NDM ndm 5B-10G --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
6F-10A
1A-1B-2K-
CARBAPENEMASA CLASE B SIM sim 5C-10H --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
6F-10A
1A-1B-2K-
CARBAPENEMASA CLASE B IMP3, 15, 19_like imp _like 5D-10I --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
6F-10A
1A-1B-2K-
CARBAPENEMASA CLASE D OXA48_like oxa48_like 5I-10D --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
6F-10A
Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

20/36
1A-1B-2K-
CLASS D CARBAPENEMASE OXA23_like oxa23_like 5G-10B --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
6F-10A
1A-1B-2K-
CLASS D CARBAPENEMASE OXA24_like oxa24_like 5H-10C --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
6F-10A
1A-1B-2K-
CARBAPENEMASA CLASE D OXA51_like oxa51_like 5J-10E --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
6F-10A
1A-1B-2K-
CARBAPENEMASA CLASE D OXA58_like oxa58_like 5K-10F --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
6F-10A
1A-1B-2K-
Gen de resistencia a colistina (mcr-1) mcr1 1G-8A --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
6F-10A
1A-1B-2K-
sul1 1H-8B --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
Gen de resistencia a sulfonamidas (sul-1) 6F-10A
1A-1B-2K-
sul2 1I-8C --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
1A-1B-2K-
sul3 1J-8D --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
1A-1B-2K-
blaDHA 1K-8E --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
β-lactamasa AmpC 6F-10A
1A-1B-2K-
blaCMY 1L-8F --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
β-lactamasa AmpC 6F-10A
1A-1B-2K-
msrA 2A-8G --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
Gen de resistencia a macrólidos (msrA) 6F-10A
1A-1B-2K-
mef 2B-8H --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
Gen de resistencia a macrólidos (mefA/E) 6F-10A
1A-1B-2K-
ermA 2C-8I --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
Gen de resistencia a macrólidos (ermA) 6F-10A
1A-1B-2K-
ermB 2D-8J --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
Gen de resistencia a macrólidos (ermB) 6F-10A
1A-1B-2K-
ermC 2E-8K --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
Gen de resistencia a macrólidos (ermC) 6F-10A
1A-1B-2K-
aac 2F-8L --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
Gen de resistencia a aminoglucósidos (aac (6´)-Ib) 6F-10A
1A-1B-2K-
armA 2G-8M --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
Gen de resistencia a aminoglucósidos (armA) 6F-10A
1A-1B-2K-
rmtB 2H-9A --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
Gen de resistencia a aminoglucósidos (rmtB) 6F-10A
1A-1B-2K-
rmtC 2I-9B --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
Gen de resistencia a aminoglucósidos (rmtC) 6F-10A
1A-1B-2K-
rmtF 2J-9C --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
Gen de resistencia a aminoglucósidos (rmtF) 6F-10A
1A-1B-2K-
Ecoli 2K-9D --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
E. coli 6F-10A
Resistencia de bajo nivel a fluoroquinolonas (mut. gyrE-S83L 3B-9G 1A-1B-2K-
--/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
gyrE-S83L) Ecoli 2K-9D 6F-10A
gyrE-S83L 3B-9G
1A-1B-2K-
Resistencia a fluoroquinolonas (mut. gyrE-S83L-D87G) gyrE-D87G 3C-9H --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
6F-10A
Ecoli 2K-9D
gyrE-S83L 3B-9G
Resistencia a fluoroquinolonas (mut. gyrE-S83L-D87G- gyrE-D87G 3C-9H 1A-1B-2K-
--/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
parE-S80I) parE-S80I 6F-12L 6F-10A
Ecoli 2K-9D
gyrE-S83L 3B-9G
gyrE-S83W- 3E-9J 1A-1B-2K-
Resistencia a fluoroquinolonas (mut. gyrE-S83L-D87N) --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
D87N 6F-10A
Ecoli 2K-9D
gyrE-S83W 3C-9H
1A-1B-2K-
Resistencia a fluoroquinolonas (mut. gyrE-S83W-D87G) gyrE-D87G 3D-9I --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
6F-10A
Ecoli 2K-9D
Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

21/36
gyrP-T83I 3F-9K 1A-1B-2K-
Resistencia a fluoroquinolonas (mut. gyrP-T83I) --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
Paer 5M-12F 6F-10A
gyrP-T83I 3F-9K
1A-1B-2K-
Resistencia a fluoroquinolonas (mut. gyrP-T83I-D87N) gyrP-D87N 3G-9L --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
6F-10A
Paer 5M-12F
gyrP-T83I 3F-9K
1A-1B-2K-
Resistencia a fluoroquinolonas (mut. gyrP-T83I-D87G) gyrP-D87G 6E-12K --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
6F-10A
Paer 5M-12F
Gen de resistencia a quinolonas o fluoroquinolonas 1A-1B-2K-
qnrA --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
(qnrA) 3H-9M 6F-10A
qnrB --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
(qnrB) 3I-10A 6F-10A
qnrS --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
(qnrS) 3J-10B 6F-10A
1A-1B-2K-
oqxA --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
Gen de resistencia a olaquindox (oqxA) 3K-10C 6F-10A
1A-1B-2K-
oqxB --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
Gen de resistencia a olaquindox (oqxB) 3L-10D 6F-10A
1A-1B-2K-
cfr --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
Gen de resistencia a linezolid (cfr) 3M-10E 6F-10A
1A-1B-2K-
catB3 --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
Gen de resistencia a cloranfenicol (catB3) 4A-10F 6F-10A
1A-1B-2K-
kpneum --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
Klebsiella pneumoniae 5L-12E 6F-10A
1A-1B-2K-
Paer --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
Pseudomonas aeruginosa 5M-12F 6F-10A
1A-1B-2K-
Abau --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
Acinetobacter baumannii 6B-12H 6F-10A
1A-1B-2K-
mcr2 --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
Gen de resistencia a colistina (mcr-2) 6C-12I 6F-10A
1A-1B-2K-
mecC --/1C-7H --/1D-7I -- / 1E-7J -- / 1F-7K
Gen de resistencia a Meticilina (mecC) 6D-12J 6F-10A
1A-1B-2K-
MDR NEGATIVO -- -- 1C-7H 1D-7I 1E-7J 1F-7K
6F-10A
RESULTADOS NO VÁLIDOS (presencia de inhibidores de 1A-1B-2K-
-- -- -- -- -- --
PCR) (Ausencia de control de DNA humano) 6F-10A
1A-1B-2K-
MDR NEGATIVO (Ausencia de control de DNA humano) -- -- 1C-7H 1D-7I -- --
6F-10A
Imagen no disponible/Imagen defectuosa/Error de
-- -- -- -- -- -- --
hibridación
Tabla 8: Posición de las sondas en el Chip de MDR e interpretación de los resultados.
Otros resultados posibles:
1. En exudados rectales y nasofaríngeos frecuentemente aparecen positivos para la sonda mecA

debido a la presencia de Staphylococcus Coagulasa Negativos resistentes a meticilina en la flora. En
el caso de exudados/aspirados nasofaríngeos, en los que se busca identificar portadores de SARM,
cuando una muestra es positiva para S. aureus también puede aparecer positiva para mecA, no
pudiendo atribuírsele necesariamente este gen de resistencia a la cepa de S. aureus.
2. La β-lactamasa de espectro limitado SHV-1 se encuentra en cepas de K. pneumoniae con una alta
frecuencia (entre el 80-90%) y está codificado cromosómicamente. Sin embargo, hay dos
posibilidades para que este gen confiera un fenotipo de espectro extendido: uno es mediante la
sobreexpresión del gen (ocurre cuando su localización es plasmídica, que es la forma encontrada en
otras Enterobacterias como E. coli) y otra es por la aparición de mutaciones concretas en su
Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

22/36
secuencia. El kit ha sido diseñado y validado para detectar todas las variantes de SHV, la cepa salvaje
SHV-1 y todas las formas mutadas del enzima son detectadas por la sonda genérica blaSHV, sin hacer
distinción entre ellas. Considerando que K. pneumoniae podría encontrarse como parte normal de
la flora, la detección de SHV no indicaría necesariamente una evidencia fenotípica de producción de
β-lactamasa de espectro extendido. En el caso de obtener un positivo para la versión de SHV
mutada, tanto mutación sencilla como doble, esto indica la producción de una β-lactamasa de
espectro extendido.
12 CARACTERÍSTICAS DEL FUNCIONAMIENTO
12.1 Funcionamiento analítico en hybriSpot 12 (HS12)

12.1.1 Repetitividad
La repetitividad del método se analizó usando ADN sintético para cada una de las dianas específicas del
panel. Se emplearon dos concentraciones distintas de ADN sintético y de cada una de ellas se obtuvieron
como mínimo cinco réplicas. El ensayo se realizó por un mismo operador, en una sola localización y usando
un mismo lote de reactivos.
Diana Nº copias/reacción Positivos/Ensayados % positivos

2000 5/5 100%
aac (6´)-Ib
1000 7/7 100%
20 5/5 100%
Acinetobacter baumannii
10 7/7 100%
2000 5/5 100%
armA
1000 7/7 100%
100 5/5 100%
blaCMY
20 7/7 100%
500 5/5 100%
blaCTX
100 6/7 85%
250 5/5 100%
blaDHA
100 7/7 100%
100 5/5 100%
blaSHV
50 7/7 100%
blaSHV-S 1000 7/7 100%
500 7/7 100%
blaSHV-SK
250 6/7 85.7%
20 5/5 100%
catB3
10 7/7 100%
100 5/5 100%
cfr
20 7/7 100%
1000 5/5 100%
ermA
500 7/7 100%
ermB 100 5/5 100%
2000 5/5 100%
ermC
1000 7/7 100%
Escherichia coli 250 5/5 100%
Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

23/36
100 7/7 100%
50 5/5 100%
ges
10 7/7 100%
100 5/5 100%
gim
50 7/7 100%
1000 5/5 100%
gyrE-S83L
100 7/7 100%
1000 5/5 100%
gyrE-S83W
100 7/7 100%
1000 5/5 100%
gyrE-S83W-D87N
100 7/7 100%
1000 5/5 100%
gyrE-D87G
100 7/7 100%
1000 5/5 100%
gyrP-T83I
100 7/7 100%
1000 5/5 100%
gyrP-D87G
100 7/7 100%
gyrP-D87N 1000 5/5 100%
500 5/5 100%
imp
250 7/7 100%
20 5/5 100%
Klebsiella pneumoniae
10 7/7 100%
kpc 500 7/7 100%
100 5/5 100%
mcr1
50 7/7 100%
20 5/5 100%
mcr2
10 7/7 100%
50 5/5 100%
mecA
10 7/7 100%
50 5/5 100%
mecC
10 7/7 100%
2000 5/5 100%
mef
1000 7/7 100%
2000 5/5 100%
msrA
1000 2/7 28%
ndm 500 7/7 100%
50 5/5 100%
nmc/imi
10 7/7 100%
50 5/5 100%
oqxA
10 7/7 100%
100 5/5 100%
oqxB
10 7/7 100%
100 5/5 100%
oxa23
50 7/7 100%
50 5/5 100%
oxa24
10 7/7 100%
Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

24/36
100 5/5 100%
oxa48
50 7/7 100%
250 7/7 100%
oxa51
50 5/7 71%
100 7/7 100%
oxa58
50 4/5 80%
1000 5/5 100%
parE-S80I
100 7/7 100%
20 5/5 100%
Pseudomonas aeruginosa
10 7/7 100%
500 5/5 100%
qnrA
100 7/7 100%
20 5/5 100%
qnrB
10 7/7 100%
20 5/5 100%
qnrS
10 7/7 100%
1000 5/5 100%
rmtB
500 7/7 100%
rmtC 100 5/5 100%
20 7/7 100%
rmtF
10 5/5 100%
50 5/5 100%
sim
10 6/7 86%
50 5/5 100%
sme
10 7/7 100%
50 5/5 100%
spm
10 7/7 100%
100 5/5 100%
Staphylococcus aureus
10 7/7 100%
20000 5/5 100%
sul1
1000 7/7 100%
sul2 100 5/5 100%
1000 5/5 100%
sul3
500 7/7 100%
50 5/5 100%
vanA
10 7/7 100%
500 5/5 100%
vanB 250 7/7 100%
100 2/5 40%
50 5/5 100%
vim
10 7/7 100%
Tabla 9: Ensayo de repetitividad para cada uno de los genes incluidos en el panel.
Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

25/36
12.1.2 Especificidad analítica
Para el ensayo se partió de 106 copias/reacción de ADN sintético diseñado para cada marcador. No se
observaron reacciones cruzadas entre los genes incluidos en el test, a excepción de la mutación parE-S80I y
parE-R91Q cuya especificidad es superior al 92%.
Diana Especificidad
Staphylococcus aureus 100%
Klebsiella pneumoniae 100%
Pseudomonas aeruginosa 100%
Escherichia coli 100%
Acinetobacter baumannii 100%
aac (6´)-Ib 100%
armA 100%
rmtB 100%
rmtC 100%
rmtF 100%
blaCMY 100%
blaDHA 100%
blaCTX 100%
blaSHV-SK 100%
blaSHV-S 100%
blaSHV 100%
ges 100%
gim 100%
imp_like 100%
kpc 100%
ndm 100%
nmc/imi 100%
oxa23_like 100%
oxa24 _like 100%
oxa48_like 100%
oxa51_like 100%
oxa58_like 100%
sim 100%
sme 100%
spm 100%
vim 100%
catB3 100%
mcr1 100%
mcr2 100%
gyrE-S83L 100%
gyrE-S83W 100%
gyrE-D87G 100%
gyrE-S83W-D87N 100%
gyrP-T83I 100%
gyrP-T83I-D87G 100%
gyrP-T83I-D87N 100%
parE-S80I 92.31%
cfr 100%
ermA 100%
ermB 100%
ermC 100%
Vitro S.A Rev.: 2022-03-31
26/36
mef 100%
msrA 100%
mecA 100%
mecC 100%
oqxA 100%
oqxB 100%
qnrA 100%
qnrB 100%
qnrS 100%
sul1 100%
sul2 100%
sul3 100%
vanA 100%
vanB 100%
vim 100%
Tabla 10: Especificidad de MDR Direct Flow Chip.
12.1.3 Sensibilidad analítica

Se calculó el límite de detección del kit para cada uno de los genes analizados. La determinación del número
mínimo de copias detectadas se realizó mediante diluciones seriadas del ADN sintético de cada uno de los
genes incluidos en el panel con 5 ng de ADN genómico humano. Cada muestra se repitió entre 6 y 14 veces.
Todas las PCRs fueron hibridadas usando la plataforma hybriSpot 12. Los resultados se analizaron con
hybriSoft y el valor establecido para considerar las señales positivas fue de 4 (intensidad de gris).
Nº copias/ Positivos/ IC IC
Diana Sonda Sensibilidad Especificidad
reacción testados 95% 95%
aac (6´)-Ib aac 1000 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
Acinetobacter 20 10/10 100% 65.54-100% 100% 99.08-100%
Abau 73.24-100% 100% 99.07-100%
baumannii 10 14/14 100%
armA armA 1000 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
blaCMY 100 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
blaCMY
blaCMY 20 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
blaCTX 500 10/10 100% 65.54-100% 100% 99.08-100%
blaCTX blaCTX 250 14/14 100% 73.24-100% 100% 99.07-100%
blaCTX 100 8/10 80% 44.22-96.46% 100% 99.08-100%
blaDHA blaDHA 100 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
blaSHV 100 10/10 100% 65.54-100% 100% 99.08-100%
blaSHV
blaSHV 50 14/14 100% 73.24-100% 100% 99.07-100%
blaSHV-S 1000 14/14 100% 73.24-100% 100% 99.07-100%
blaSHV-S
blaSHV-S 250 3/7 42.8% 20.14-79.86% 100% 99.08-100%
blaSHV-SK 500 12/12 100% 65.54-100% 100% 99.07-100%
blaSHV-SK
blaSHV-SK 250 6/7 85.7% 50.88-97.06% 100% 99.08-100%
catB3 20 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
catB3
catB3 10 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
cfr 100 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
cfr
cfr 20 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
ermA 1000 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
ermA
ermA 500 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
ermB 100 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
ermB
ermB 20 0/6 0% 0-48.31% 100% 99-100%
ermC ermC 1000 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
Escherichia coli Ecoli 250 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

27/36
100 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
ges 50 10/10 100% 65.54-100% 100% 99.08-100%
ges
ges 10 14/14 100% 73.24-100% 100% 99.07-100%
gim 100 10/10 100% 65.54-100% 100% 99.08-100%
gim
gim 50 14/14 100% 73.24-100% 100% 99.07-100%
gyrE-S83L 1000 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
gyrE-S83L
gyrE-S83L 100 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
gyrE-S83W 1000 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
gyrE-S83W
gyrE-S83W 100 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
gyrE-D87G 1000 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
gyrE-D87G
gyrE-D87G 100 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
gyrE-S83W- 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
1000
D87N
gyrE-S83W-D87N
gyrE-S83W- 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
100
D87N
gyrP-T83I 1000 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
gyrP-T83I
gyrP-T83I 100 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
gyrP-T83I- 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
1000
D87G
gyrP-D87G
gyrP-T83I- 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
100
D87G
gyrP-T83I- 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
1000
D87N
gyrP-D87N
gyrP-T83I- 0/6 0% 0-48.31% 100% 99-100%
100
D87N
imp_like 500 10/10 100% 65.54-100% 100% 99.08-100%
imp
imp_like 250 14/14 100% 73.24-100% 100% 99.07-100%
Klebsiella Kpneum 20 10/10 100% 65.54-100% 100% 99.08-100%
pneumoniae Kpneum 10 14/14 100% 73.24-100% 100% 99.07-100%
kpc 500 10/10 100% 65.54-100% 100% 99.08-100%
kpc
kpc 100 14/14 100% 73.24-100% 100% 99.07-100%
100 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
mcr1 mcr1
50 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
10 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
mcr2 mcr2
20 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
mecA 50 10/10 100% 65.54-100% 98.43% 96.81-99.27%
mecA
mecA 10 14/14 100% 73.24-100% 98.43% 96.81-99.27%
50 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
mecC mecC
10 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
mef 2000 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
mef
mef 1000 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
msrA 2000 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
msrA
msrA 1000 2/6 33% 6-75.9% 100% 99-100%
ndm 1000 10/10 100% 65.54-100% 100% 99.08-100%
ndm
ndm 500 14/14 100% 73.24-100% 100% 99.07-100%
nmc/imi 50 10/10 100% 65.54-100% 100% 99.08-100%
nmc/imi
nmc/imi 10 14/14 100% 73.24-100% 100% 99.07-100%
50 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
oqxA oqxA
10 4/6 66% 24.1-94% 100% 99-100%
100 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
oqxB oqxB
10 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
oxa23_like 100 10/10 100% 65.54-100% 100% 99.08-100%
oxa23
oxa23_like 50 14/14 100% 73.24-100% 100% 99.07-100%
oxa24_like 50 10/10 100% 65.54-100% 100% 99.08-100%
oxa24
oxa24_like 10 14/14 100% 73.24-100% 100% 99.07-100%
oxa48_like 100 10/10 100% 65.54-100% 100% 99.08-100%
oxa48
oxa48_like 50 14/14 100% 73.24-100% 100% 99.07-100%
oxa51 oxa51_like 500 10/10 100% 65.54-100% 100% 99.08-100%
Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

28/36
oxa51_like 250 14/14 100% 73.24-100% 100% 99.07-100%
oxa51_like 100 6/10 60% 27.37-86.31% 100% 99.08-100%
oxa58_like 100 8/8 100% 59.77-100% 100% 99.08-100%
oxa58
oxa58_like 50 5/10 50% 20.14-79.86% 100% 99.08-100%
parE-S80I 1000 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
parE-S80I
parE-S80I 100 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
Pseudomonas Paer 20 10/10 100% 65.54-100% 100% 99.08-100%
aeruginosa Paer 10 14/14 100% 73.24-100% 100% 99-100%
qnrA 500 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
qnrA
qnrA 100 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
qnrB 20 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
qnrB
qnrB 10 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
qnrS 20 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
qnrS
qnrS 10 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
rmtB 1000 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
rmtB
rmtB 500 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
rmtC rmtC 100 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
rmtF 20 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
rmtF
rmtF 10 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
sim 50 10/10 100% 65.54-100% 100% 99.08-100%
sim
sim 10 10/12 83.3% 50.88-97.06% 100% 99.07-100%
sme 50 10/10 100% 65.54-100% 100% 99.08-100%
sme
sme 10 14/14 100% 73.24-100% 100% 99.07-100%
spm 50 10/10 100% 65.54-100% 100% 99.08-100%
spm
spm 10 14/14 100% 73.24-100% 100% 99.07-100%
Staphylococcus SA 100 10/10 100% 65.54-100% 100% 99.08-100%
aureus SA 10 14/14 100% 73.24-100% 100% 99.07-100%
sul1 sul1 1000 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
sul2 sul2 100 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
sul3 1000 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
sul3
sul3 500 6/6 100% 51.56-100% 100% 99-100%
vanA 50 10/10 100% 65.54-100% 100% 99.08-100%
vanA
vanA 10 14/14 100% 73.24-100% 100% 99.07-100%
vanB 500 10/10 100% 65.54-100% 100% 99.08-100%
vanB vanB 250 14/14 100% 73.24-100% 100% 99.07-100%
vanB 100 4/10 40% 13.7-72.63% 100% 99.08-100%
vim 50 10/10 100% 65.54-100% 100% 99.08-100%
vim
vim 10 14/14 100% 73.24-100% 100% 99.07-100%
Tabla 11: Sensibilidad analítica (LoD): número de copias de cada diana que da resultados positivos en el 100% de las réplicas,
analizados con software hybriSoft y punto de corte de positividad en un valor de 4.
*El gen ges confiere resistencia a ampicilina y presenta un cierto grado de homología con el gen de resistencia a ampicilina blaTEM.
Este último es utilizado como marcador de selección en la construcción del plásmido para la obtención de la proteína recombinante
Taq DNA polimerasa, en E. coli. La especificidad para ges del 97.3% podría deberse a la presencia de cantidades traza de E. coli con
dicho marcador en la enzima.
** El gen mecA confiere resistencia a meticilina y se encuentra frecuentemente asociado a Staphylococcus epidermidis, bacterias
propias de la flora de la piel. La especificidad del 98.4% para mecA podría deberse a contaminación de las muestras durante su
manipulación.
12.2 Funcionamiento analítico en hybriSpot 24 (HS24)

Se validó el funcionamiento y robustez del kit MDR Direct Flow Chip en el equipo automático HS24
analizando un número de copias límite de fragmentos sintéticos de cuatro genotipos incluidos en el panel.
Esta validación demuestra la reproducibilidad de los resultados entre las posiciones 1 y 24 del equipo HS24
y la reproducibilidad de los resultados con diferentes programas para distinto número de muestras.
Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

29/36
12.2.1 Reproducibilidad de resultados en programas para distinto número de muestras
Se realizan réplicas de una muestra positiva que contenía un número de copias límite de ADN de kpc (500
copias). Estas réplicas se situaron en diferentes posiciones de la cámara de reacción del equipo HS24 y se
evaluaron cuatro protocolos diferentes:
▪ Protocolo para 2 muestras (2 réplicas)
Los resultados fueron analizados de forma automática con hybriSoft y se compararon con los obtenidos en
HS12 (Control). No se detectaron diferencias entre las distintas posiciones de la cámara de reacción ni entre
los protocolos utilizados.
12.2.2 Reproducibilidad de resultados en diferentes posiciones de hibridación en HS24

Se realizaron ocho réplicas de una dilución límite de tres genes de resistencia del panel, a las que se añadió
5ng de ADN genómico humano. Las réplicas se mezclaron en un pool y se utilizaron de la siguiente forma:
- 4 réplicas se analizaron en el HS24 distribuidas en las primeras y últimas posiciones de ambas cámaras
del equipo, con el objetivo de cubrir las mejores y peores condiciones del protocolo.
En cada serie se analizaron 3 genotipos siguiendo la siguiente distribución:

- Genotipo 1: posiciones 1, 10, 13, 22
Paralelamente, dos réplicas de cada genotipo se utilizaron como control en el HS12.

Los resultados fueron analizados de forma automática con hybriSoft y comparados con los resultados
obtenidos en el equipo HS12 (Control). En todos los casos las muestras fueron detectadas como positivas.
Las diferencias de intensidad observadas entre posiciones son aceptables.
Diana Nº copias/reacción Positivos/testados Diferencias entre posiciones

blaCTX-M16 500 4/4 No
ndm 500 4/4 No
oxa51 250 4/4 No
Tabla 12: Reproducibilidad de MDR Direct Flow Chip en HS24. Los resultados fueron analizados automáticamente con hybriSoft
estableciendo como punto de corte de positividad un valor de 4.
12.3 Funcionamiento analítico en hybriSpot 12 PCR AUTO (HS12a)

Se validó el funcionamiento y robustez de MDR Direct Flow Chip en el equipo automático HS12a. Para ello
se realizaron 3 réplicas de cada marcador de resistencia y patógenos del panel a diluciones límite y se
amplificaron e hibridaron en diferentes posiciones del equipo. Todo el proceso se realizó de forma
automática en el HS12a y los resultados se analizaron con hybriSoft.
Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

30/36
Nº copias/ Positivos/
Diana Sonda
reacción testados
aac (6´)-Ib aac 1000 3/3
Acinetobacter baumannii Abau 10 3/3
armA armA 1000 3/3
blaCMY blaCMY 20 3/3
blaCTX blaCTX 250 3/3
blaDHA blaDHA 100 3/3
blaSHV blaSHV 50 3/3
blaSHV-S blaSHV-S 1000 3/3
blaSHV-SK blaSHV-SK 500 3/3
catB3 catB3 10 3/3
cfr cfr 20 3/3
ermA ermA 500 3/3
ermB ermB 100 3/3
ermC ermC 1000 3/3
Escherichia coli Ecoli 100 3/3
ges ges 10 3/3
gim gim 50 3/3
gyrE-S83L gyrE-S83L 100 3/3
gyrE-S83W gyrE-S83W 100 3/3
gyrE-D87G gyrE-D87G 100 3/3
gyrE-S83W- 3/3
gyrE-S83W-D87N 100
D87N
gyrP-T83I gyrP-T83I 100 3/3
gyrP-T83I- 3/3
gyrP-D87G 100
D87G
gyrP-T83I- 3/3
gyrP-D87N 1000
D87N
imp imp_like 250 3/3
Klebsiella pneumoniae Kpneum 10 3/3
kpc kpc 100 3/3
mcr1 mcr1 50 3/3
mcr2 mcr2 10 3/3
mecA mecA 10 3/3
mecC mecC 10 3/3
mef mef 1000 3/3
msrA msrA 2000 3/3
ndm ndm 500 3/3
nmc/imi nmc/imi 10 3/3
oqxA oqxA 50 3/3
oqxB oqxB 10 3/3
oxa23 oxa23_like 50 3/3
Vitro S.A Rev.: 2022-03-31
31/36
parE-S80I parE-S80I 100 3/3
Pseudomonas 3/3
Paer 10
aeruginosa
qnrA qnrA 100 3/3
qnrB qnrB 10 3/3
qnrS qnrS 10 3/3
rmtB rmtB 500 3/3
rmtC rmtC 100 3/3
rmtF rmtF 10 3/3
sim sim 50 3/3
sme sme 10 3/3
spm spm 10 3/3
Staphylococcus aureus SA 10 3/3
sul1 sul1 1000 3/3
sul2 sul2 100 3/3
sul3 sul3 500 3/3
vanA vanA 10 3/3
vanB vanB 250 3/3
vim vim 10 3/3
Tabla 13: Reproducibilidad de MDR Direct Flow Chip en HS12a. Los resultados fueron analizados automáticamente con hybriSoft
estableciendo como punto de corte de positividad un valor de 4.
12.4 Clínico
12.4.1 Identificación de mecanismos de resistencia con MDR Direct Flow CHIP
Para la validación clínica del kit MDR Direct Flow Chip se llevó a cabo un estudio retrospectivo con un total
de 70 aislados clínicos (ADN purificado) y 24 muestras clínicas (PCR directa), procedentes del Hospital
General Universitario de Elche, que incluían microorganismos multirresistentes a diferentes clases de
antibióticos. Además, se incluyó un total de 44 colonias bacterianas portadoras de múltiples genes de
resistencias procedentes del Hospital Universitario Virgen del Rocío (Sevilla). En la siguiente tabla se muestra
los genes de resistencias detectados en las muestras y la correlación con los perfiles de susceptibilidad
antibiótica (AST) obtenidos para cada uno.
Marcadores de
resistencia detectados Aislados/genes de genes Resistencia fenotípica
en el chip MDR
8 mecA 1 S. epidermidis, 7 S. aureus
2 mecC 2 S. aureus
6 CMY 3 K. pneumoniae, 3 E. coli
5 DHA 2 K. pneumoniae, 2 E. coli, 1 Enterobacter
14 CTX 6 K. pneumoniae, 5 E. coli, 1 P. aeruginosa, Penicilinas/Cefalosporinas
1 Enterobacter, 1 Proteus
3 SHV-SK 1 K. pneumoniae, 1 E. coli, 1 Providencia
1 SHV-S 1 K. pneumoniae
6 SHV 5 K. pneumoniae, 1 Enterobacter
2 GES 2 P. aeruginosa
3 IMP 2 P. aeruginosa, 1 A. guillouae
Carbapenems
6 VIM 3 P. aeruginosa, 3 K. pneumoniae
Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

32/36
8 oxa48 5 K. pneumoniae, 1 Enterobacter, 2 E. coli
5 NDM 1 K. oxytoca, 3 K. pneumoniae, 1
Enterobacter
5 KPC 5 K. oxytoca
2 mef 1 S. maltophilia, 1 Providencia
3 ermA 3 S. aureus
2 ermB 2 Enterococcus Macrólidos
2 ermC 1 S. aureus, 1 A. guillouae
6 msrA 6 S. aureus
23 aac (6’)-Ib 5 P. aeruginosa, 9 K. pneumoniae, 5 E. coli,
3 Enterobacter, 1 K. oxytoca
Aminoglucósidos
1 armA 1 K. pneumoniae
1 rmtC 1 Enterobacter
32 sul1 16 E. coli, 11 P. aeruginosa, 2 Enterobacter,
3 K. pneumoniae
20 sul2 1 P. aeruginosa, 8 E. coli, 1 Proteus, 9 K. Sulfonamidas
pneumoniae, 1 Enterobacter
6 sul3 6 E. coli
8 qnrS 4 K. pneumoniae, 3 E. coli, 1 P. aeruginosa
20 qnrB 7 K. pneumoniae, 7 E. coli, 3 P. aeruginosa,
1 S. aureus, 1 S. epidermidis, 1 K. oxytoca
2 gyrA-S83L 2 E. coli
Quinolonas
15 gyrA-S83LD87N 15 E. coli
13 gyrA-T83I 13 P. aeruginosa
5 gyrA-D87N 5 P. aeruginosa
5 oqxA/B 5 K. pneumoniae
3 mcr-1 3 E. coli
Colistina
1 mcr-2 1 E. coli
1 vanA 1 E. faecium
Vancomicina
1 vanB 1 E. faecium
3 CatB3 2 K. pneumoniae, 1 E. coli Cloranfenicol
Tabla 14: Genes de resistencia a antibióticos identificados con el kit MDR Direct Flow Chip.
Los marcadores de resistencia detectados pueden explicar el perfil de resistencia fenotípica en el 90% de
los casos. Además, se han obtenido resultados preliminares que muestran un funcionamiento correcto del
test en PCR directa partiendo de muestras clínicas sin necesidad de extraer el ADN, como hemocultivos y
exudados rectales y/o nasales.
13 LIMITACIONES
Utilización de muestras no adecuadas: el método ha sido validado con muestras directas de exudados
rectales, muestras directas de exudados/aspirados nasofaríngeos, muestras directas de hemocultivo y
material genético purificado procedente de exudados rectales (ver apartado 7). El análisis de cualquier otro
tipo de muestra no indicado puede generar resultados erróneos o no concluyentes por inhibición de la
reacción de PCR por agentes químicos inhibitorios.
Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

33/36
14 PROBLEMAS Y SOLUCIONES
Problema Causas Soluciones
Fallo en el protocolo de hibridación Comprobar que se han añadido todos los
reactivos de hibridación en el orden correcto
(plataforma manual). Comprobar el
funcionamiento del hybriSpot (plataforma
automática).
Repetir la prueba.
No se observa ninguna
Los reactivos de hibridación han
señal/
caducado o no han sido almacenados Comprobar la fecha de caducidad y las
no hay señal de
de forma adecuada condiciones de almacenamiento de los
hibridación
reactivos y de los Chips. Repetir el test.
Posible degradación del ADN de los Limpiar con agua destilada abundante las
Chips durante el proceso de cámaras de reacción. Repetir el test.
descontaminación de superficies y
material.
Presencia de resistencias Problemas de contaminación en las Descontaminar (lejía 1%) las áreas de trabajo
en control negativo zonas pre-PCR o post-PCR. y repetir el test.
Problemas en la amplificación por Comprobar que el programa del
PCR. termociclador es el adecuado, que la mezcla
madre de PCR se ha preparado de forma
adecuada y que los reactivos de PCR se
conservan correctamente. Repetir el test.
No hay señal de control
exógeno de amplificación Presencia de inhibidores de PCR en la Si la muestra de partida corresponde a una
muestra problema. dilución 1:10 de una suspensión de exudado
rectal purificar el ADN con alguno de los
sistemas de extracción validados (ver
preparación de la muestra en apartado 7).
Cantidad insuficiente de ADN humano Repetir la PCR aumentando la cantidad de

en la muestra problema. muestra de partida o disminuyendo la
dilución inicial de la muestra. En todo caso,
cuando se trate de muestras de exudados
rectales, no usar diluciones inferiores a la
No hay señal de control Presencia de inhibidores de PCR en la dilución 1:4.
endógeno de muestra problema.
Si se parte de ADN purificado comprobar que
amplificación
el sistema de extracción del material genético
empleado funciona correctamente
incluyendo un control de extracción.
Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

34/36
Reactivos de PCR y/o hibridación Comprobar la caducidad de los reactivos, la
caducados o almacenados de forma conservación de mezcla de PCR y reactivos.
incorrecta.
Comprobar las temperaturas y tiempos de
Error en el protocolo de hibridación. hibridación y verificar el funcionamiento del
equipo hybriSpot.
El producto de PCR no se desnaturalizó Verificar que la desnaturalización se ha

Señales débiles en la correctamente antes de la hibridación. realizado correctamente. Repetir el test.
hibridación
Volumen erróneo de muestra usado Repetir el ensayo usando el volumen correcto
para resuspender el liofilizado de muestra
Inhibición parcial de la PCR.

Diluir la muestra durante su procesamiento o
extraer el ADN. Verificar el correcto
funcionamiento del sistema de extracción de
ácidos nucleicos empleado.
15 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
• Ariffin N, Hasan H, Ramli N, Ibrahim NR, Taib F, et al. (2012) Comparison of antimicrobial resistance
in neonatal and adult intensive care units in a tertiary teaching hospital. Am J Infect Control; 40:
572–575
• Burke JP (2003). Infection Control — A Problem for Patient Safety. N Engl J Med; 348: 651-656
• Boucher HW, Talbot GH, Bradley JS, Edwards JE, Gilbert D, et al. (2009) Bad bugs, no drugs: no
ESKAPE! An update from the Infectious Diseases Society of America. Clin Infect Dis; 48: 1–12
• Spangler R, Goddard NL, Thaler DS (2009). Optimizing Taq Polymerase Concentration for
Improved Signal-to-Noise in the Broad Range Detection of Low Abundance Bacteria PLoS ONE; 4:
e7010
• Benjamin AE, Sebastian GB Amyes (2014). OXA B-Lactamases. Clinical Microbiology Reviews; 27:
241-263
• Martínez-Martínez L, and González-López J.J. (2014). Carbapenemases in Enterobacteriaceae:
Types and molecular epidemiology. Enferm Infecc Microbiol Clin; 32 (supl 4): 4-9
• Chaves, J, Ladona, MG, Segura, C et al. (2001). SHV-1 β-lactamase is mainly a chromosomally
encoded species-specific enzyme in Klebsiella pneumoniae. Antimicrobial Agents and
Chemotherapy; 45, 2856–61.
• Bradford, PA (2001). Extended-spectrum beta-lactamases in the 21st century: characterization,
epidemiology, and detection of this important resistance threat. Clinical Microbiology Reviews; 14,
933–51.
• Shu Xia1, Xin Fan2, Zengguang Huang1, Liang Xia3, Meng Xiao2, Rongchang Chen1, Yingchun Xu2*,
Chao Zhuo1 (2014). Dominance of CTX-M-Type Extended-Spectrum b-Lactamase (ESBL)-Producing
Escherichia coli Isolated from Patients with Community-Onset and Hospital-Onset Infection in
China. PLOS ONE; 9: e100707
Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

35/36
16 SÍMBOLOS DE LA ETIQUETA Y CAJA
Producto sanitario para diagnóstico in
Fecha de caducidad
vitro
Número de catálogo Límite de temperatura
Código de lote Fabricante

Contenido suficiente para <n>
Consúltese las instrucciones de uso
ensayos
Ficha de datos de seguridad
17 GLOSARIO
ADN: ácido desoxirribonucleico
PCR: reacción en cadena de la polimerasa
HS12: hybriSpot 12 (plataforma manual)
HS24: hybriSpot 24 (plataforma automática)
NBT-BCIP: Cloruro de nitroblue tetrazolium- 5-Bromo-4-cloro-3-indolil fosfato
MgCl2 : cloruro de magnesio
dNTPs: desoxirribonucleótidos trifosfato
DNasas: desoxirribonucleasas
RNasas: ribonucleasas
dUTP: desoxiuridina trifosfato
CDC: Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades de EEUU
18 HISTÓRICO DE CAMBIOS
Fecha Descripción
2021/08/03 Creación de documento.
2022/01/07 Se modifica la temperatura ambiente en el epígrafe 5.
2022/02/17 Se incluye la referencia MAD-DDW en el epígrafe 3 “Componentes”.
- Se modifica el epígrafe 1 “Uso previsto” (se hace referencia a la detección cualitativa y a que el Kit
está basado en PCR múltiple).
2022/03/31
- Se incluye la especificidad para blaDHA en la Tabla 11.
- Se modifican la especificidad e IC 95% para ges en la Tabla 11.
Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

36/36

MDR Direct Flow Chip Kit: Detección de Patógenos Multirresistentes Mediante PCR Múltiple e Hibridación Reversa

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

MDR Direct Flow Chip Kit: Detección de Patógenos Multirresistentes Mediante PCR Múltiple e Hibridación Reversa

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

MDR Direct Flow Chip

para plataformas hybriSpot manual y automática

Compatible con la versión 2.02.00.R09.01 y posteriores de hybriSoft HSHS.

Ref. MAD-003946M-HS12 24 determinaciones

Para uso exclusivo en diagnóstico in vitro

1 USO PREVISTO .............................................................................................................................. 3

Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

El test se realiza de forma directa en exudados rectales, exudados/aspirados nasofaríngeos y/o

Determinante genético Resistencia antibiótica asociada

Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

Estado Microbiológico: Producto no estéril.

2 PRINCIPIO DEL MÉTODO

KIT/COMPONENTES FORMATO REFERENCIAS

Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

KIT/COMPONENTES FORMATO REFERENCIAS

- Ambas presentaciones incluyen agua bidestilada libre de DNasa/RNasa para manipulación de

- Los tubos correspondientes a la Mix 2 (amarillos) se disponen en un formato de esfera liofilizada de

Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

4 MATERIAL ADICIONAL REQUERIDO NO SUMINISTRADO Y MATERIAL OPCIONAL

4.1 Reactivos y materiales

B. Reactivos específico (Auto, ref: MAD-003946M-HS24):

4.3 Material adicional opcional

5 CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD

• Reactivos de hibridación: Enviados y almacenados entre 2-8°C*. No congelar. Los reactivos de

• Lea las instrucciones de uso antes de utilizar este producto.

Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

RESIDUOS POTENCIALES GENERADOS CÓDIGO

Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

6. Contenedor para reactivos usados

7.1 Exudados rectales

Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

7.2 Exudados/aspirados nasofaríngeos

7.3 Exudados rectales y exudados nasales como una muestra única

Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

7.5 Colonias bacterianas

Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

1. Colocar la torunda en uno de los viales con 900 µl de medio TDM.

1. Agitar bien el frasco de hemocultivo hasta obtener una mezcla homogénea.

1. Tomar una pequeña cantidad de la colonia con asa estéril.

Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

8.1 Reacción de amplificación múltiple del ADN

PROGRAMA DE AMPLIFICACIÓN EN TERMOCICLADOR

1 ciclo 25°C 10 min

8.2 Hibridación reversa por flow-through

Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

Antes de comenzar el proceso de hibridación realizar los siguientes pasos:

Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

Antes de comenzar el proceso de hibridación realizar los siguientes pasos:

9 PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS PARA EL EQUIPO HS12 PCR AUTO

Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

A B msrA catB3 ndm mcr1 rmtB qnrB nmc/imi B

M B cfr spm Paer armA qnrA sme oxa48_like

Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

Otros resultados posibles:

1. En exudados rectales y nasofaríngeos frecuentemente aparecen positivos para la sonda mecA

Vitro S.A Rev.: 2022-03-31

12 CARACTERÍSTICAS DEL FUNCIONAMIENTO

12.1 Funcionamiento analítico en hybriSpot 12 (HS12)