Artículo original
Un método rápido para verificar la configuración de la
deposición de células individuales para clasificadores de células
Olivia Roos Rodrigues, 1 Simón Monard 2 *
1 Centro MRC de Medicina Regenerativa,
Universidad de Edimburgo, Edimburgo
EH16 4UU, Reino Unido
2 El Laboratorio de Citometría, Instituto
Walter y Eliza Hall, Parkville 3052,
Victoria, Australia
Recibido el 9 de noviembre de 2015; Revisado el 20 de
marzo de 2016; Aceptado el 7 de abril de 2016
Puede encontrar información adicional de
apoyo en la versión en línea de este artículo.
* Correspondencia a: Simon Monard, The
Walter and Eliza Hall Institute, 1G Royal
Parade, Parkville, Victoria 3052, Australia.
Correo electrónico: monard@wehi.edu.au
Publicado en línea el 3 de mayo de 2016 en
Wiley Online Library (wileyonlinelibrary.com)
DOI: 10.1002 / cyto.a.22865
VC 2016 Sociedad Internacional para
el Avance de la Citometría
Citometría Parte A 89A: 594600, 2016
Resumen
El estudio de células individuales revela una biología que no se puede explorar utilizando técnicas de
masa. Los clasificadores de células brindan la oportunidad de separar células individuales para cultivo
celular o para aplicaciones moleculares posteriores, como qPCR, para estudiar la expresión génica
específica y la secuenciación de ARNm de células individuales. Algunos de estos estudios moleculares
pueden ser costosos, por lo que el investigador a menudo querrá estar seguro de que el clasificador de
células puede depositar de manera confiable una sola gota en cada pocillo de una placa de 96 o 384
pocillos. Tales placas pueden contener volúmenes muy pequeños de fluido ya que reducir el volumen
de fluido usado puede reducir el costo del ensayo. Pasar por alto algunos de los pozos podría dejar el
conjunto de datos incompleto y requerir una costosa repetición. Verificar esto mediante microscopía,
en el mejor de los casos, lleva mucho tiempo y en el peor, es imposible. Aquí, Se describe un método
colorimétrico económico para verificar si un pocillo, ya sea en una placa de 96 o 384 pocillos, recibió
una única gota clasificada de un clasificador de células en el fluido en el fondo del pocillo. La gota
consiste en partículas suspendidas en una solución enzimática, peroxidasa de rábano picante, que se
deposita en los pocillos de la placa de microtitulación que contienen un sustrato, 3,3 0, 5,5 0- tetrametilbencidina.
Este método no requiere equipo especial o experiencia y es lo suficientemente rápido como para
2016 Sociedad Internacional de
realizarse directamente antes del experimento de clasificación de una solaVC celda.
Avance de la citometría
Términos clave
clasificación unicelular; citometría de flujo; peroxidasa de rábano picante; método colorimétrico de
detección; microesferas de poliestireno
S INGLE - la clasificación de células en placas o tubos se ha convertido en un recurso esencial en la
investigación biológica. Después de la clasificación, las células se pueden cultivar, cada pocillo dando
lugar a un cultivo clonal o se pueden estudiar en aplicaciones posteriores a nivel molecular utilizando,
por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La transcriptómica unicelular de alto
rendimiento ofrece un enfoque molecular imparcial para comprender el alcance, la base y la función de
la variación de la expresión génica entre células aparentemente idénticas (1). La expresión génica
unicelular, la secuenciación del ARNm unicelular (2) y la secuenciación del ADN unicelular se encuentran
entre las muchas técnicas genómicas unicelulares que los investigadores utilizan actualmente para
estudiar e identificar las diferencias entre células individuales en una población homogénea (3 , 4).
Se han desarrollado varias técnicas de clasificación de células, como la clasificación de placas de
índice, posicional y reflectante, en respuesta a las crecientes demandas en el análisis de células
individuales (5). Estas técnicas clasifican las células en placas de varios pocillos y realizan un
seguimiento del origen de la célula y la ubicación del pocillo clasificado. Las mejoras en el muestreo de
la diversidad de la población (6) han aumentado aún más el poder y el potencial de la clasificación
unicelular. Toda clasificación de una sola celda se beneficiaría enormemente de un método eficiente y
reproducible para validar la precisión de la deposición de una sola celda.
Determinar la eficacia de la clasificación unicelular es un desafío técnico. Si las
células se clasifican en pozos de fondo plano y se deja suficiente tiempo para que la célula
se asiente en el fondo, puede ser posible usar microscopía para determinar si cada

bien contiene de hecho una celda. Este procedimiento requiere mucho
tiempo, ya que las células no teñidas pueden ser difíciles de visualizar.
Con el fin de demostrar que el instrumento está clasificando una sola
partícula por pocillo, las microesferas fluorescentes se pueden
clasificar en pocillos de una placa de fondo plano y la placa se puede
ver con un microscopio de fluorescencia invertida. La fluorescencia de
cada microesfera se puede ver incluso con un aumento menor, pero se
debe permitir que las microesferas se asienten en el fondo de los
pocillos. Si las células se clasifican en otros tipos de placas con pocillos
de fondo cónico o redondo, la microscopía no es una opción, ya que
no todas las partículas estarán en el mismo plano óptico. Además,
algunos tipos de placas, como las placas de amplificación blancas de
384 pocillos (Nunc TM, Rochester, NY) no son transparentes, por lo que
será necesaria alguna otra forma de verificación. Demostrar que el
clasificador de células está depositando una sola gota clasificada en el
fondo de una placa de microvaloración también es un desafío. Es
posible clasificar las gotas en las tapas de las placas de
microvaloración y asumir que una sola gota caerá en esa posición,
pero generalmente las gotas clasificadas no se mueven directamente
verticalmente y esto requerirá cierta consideración. Recientemente, se
describió un método para abordar este problema. Los investigadores
utilizaron discos de papel tornasol colocados en el fondo de placas de
96 y 384 pocillos para ver la posición exacta de las gotas clasificadas
(7). Sin embargo, el enfoque requirió múltiples gotas clasificadas y una
inspección cuidadosa de los discos con una lupa.
A continuación, describimos un método rápido que puede
demostrar que se ha depositado una sola gota clasificada en el fluido
del pozo. El sistema puede distinguir fácilmente si un bien recibió más
de una gota y la lectura es un cambio de color claramente visible en el
pozo. Aunque depositar una sola gota en un pozo no significa
automáticamente que una sola célula o partícula esté contenida
dentro de esa gota, se pueden usar otras pruebas para determinar si
cada gota clasificada contiene la partícula de interés. El retraso de
caída se puede verificar mediante varios métodos: Se puede clasificar
un número conocido de células o microesferas en varios charcos en un
portaobjetos de microscopio. El retraso de caída se cambia para cada
charco en una gota completa. El número de partículas en cada charco
se cuenta usando microscopía de contraste de fase. Se realizan ajustes
hasta que casi todas las partículas se encuentran en el mismo charco y
se usa ese retardo de caída. El retraso de caída también se puede
validar mediante el método RMAX descrito por Riddell et al. (8), donde
se determina el número de células objetivo en la corriente de residuos.
Fluidigm (South San Francisco, CA) ha desarrollado varios enfoques
para la genómica unicelular basados en tecnología de micro y nanofluidos.
El Biomark de Fluidigm TM El instrumento permite la multiplexación de
muestras y sondas de oligonucleótidos y la clasificación de células
individuales a menudo precede al paso de amplificación. El uso de Fluidigm
Biomark y las tecnologías de secuenciación unicelular puede ser costoso,
por lo que el investigador puede querer una prueba de que se están
clasificando gotas individuales en cada pocillo y determinar las tasas de
ocupación probables de los pozos en un tipo particular de placa.
En 1971, Van Weemen et al. propuso el uso de peroxidasa de
rábano picante (HRP) como alternativa a la radiactividad en un
inmunoensayo (9). Varios años después 3,3 0, 5,5 0- tetrametilbencidina clasificar.
(TMB) se sintetizó y presentó como un método más seguro
Citometría Parte A 89A: 594600, 2016
Artículo original
sustrato para detectar la actividad peroxidasa en sangre (10). TMB se
convirtió en el sustrato de elección para los ensayos de
inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA).
El método que se describe a continuación utiliza el sustrato de la
enzima HRP y TMB para detectar gotas individuales clasificadas en pocillos
de placas de microtitulación. Ninguno de estos reactivos es caro o peligroso
y no se necesita ningún equipo especial, aunque es útil un lector de placas
del tipo utilizado en la detección ELISA. En nuestro ensayo, a diferencia de
ELISA, el fondo es muy bajo, ya que los pocillos que no han sido clasificados
no contienen HRP, por lo que los falsos positivos no son un problema, lo
que da al ensayo una sensibilidad exquisita.
HRP utiliza peróxido de hidrógeno (H 2 O 2) para oxidar
compuestos orgánicos e inorgánicos (10). HRP cataliza elec-
reacciones de transferencia de tron, puede reducir H 2 O 2 también 2 y H 2 O
utilizando TMB como molécula donante. TMB en su sub-
La forma estratificada es incolora, cuando se oxida se vuelve azul.
El progreso de la reacción se puede controlar mediante la
aparición de la coloración azul o se puede medir la absorbancia a
650 nm en un espectrofotómetro o lector de placas. La intensidad
del color y el tiempo de desarrollo variarán según las condiciones
del ensayo. Para los ensayos de punto final, la reacción puede ser
detenido con un ácido, por ejemplo, H 2 S0 4 para formar un producto amarillo. Esto
también se puede cuantificar en un lector de placas, pero midiendo
absorbancia a 450 nm. En nuestros experimentos, descubrimos que no era
necesario terminar la reacción mediante la adición de una solución de
parada, ya que el desarrollo de la mancha azul en pequeños volúmenes de
TMB fue muy rápido, generalmente evidente en el momento en que se
retira la placa del clasificador de células. No es necesario un lector de
placas, pero permite una medida cuantitativa del desarrollo del color.
El método se basa en el hecho de que las partículas de los
clasificadores de gotas convencionales están contenidas en una corriente
central. Cuando se forman gotitas, una partícula a clasificar estará dentro
del núcleo del fluido dentro de una gotita más grande de fluido envolvente.
Este núcleo está formado por el líquido en el que se suspendieron las
células. Si las partículas que se van a clasificar se suspenden en un tampón
que contiene HRP, la gota clasificada contendrá algo de esta enzima. Antes
de la clasificación, se preparan placas de microtitulación que contienen
TMB. Una sola gota clasificada en un pocillo de dicha placa contendrá
suficiente HRP para volver el pocillo azul. Si se utiliza un lector de placas
para detectar y cuantificar el cambio de color, el método se puede utilizar
para determinar el número de gotas clasificadas en cada pocillo. Para estos
fines, las partículas en sí pueden ser cualquier cosa que active el clasificador
de células. En este estudio, Se utilizaron tanto microesferas de poliestireno
carboxilato desacopladas como una línea celular linfoblastoide. Mostramos
que el volumen del núcleo de la gota cambia con la presión de la muestra y
que, como era de esperar, el núcleo de la gota se reduce con un tamaño de
boquilla más pequeño. La formación y deflexión de gotas no se ve afectada
por los diferentes tipos de partículas analizadas en este estudio. Los
tamaños de boquilla utilizados para estos experimentos fueron 70 l my 100 l metro.
Aquí, describimos un método colorimétrico fácil, rápido y reproducible que
permite la verificación de la deposición de una sola gota en los pocillos de la
placa de microtitulación. Este procedimiento se puede realizar
inmediatamente antes de la clasificación. No se recomienda agregar TMB a
los medios de cultivo y agregar HRP a la suspensión de una célula para
595
Artículo original
METRO ATERIALES Y METRO ÉTODOS
Microesferas y HRP
Las microesferas utilizadas en este experimento fueron 4.5 l my
10 l m Polybead V R microesferas de carboxilato (Polysciences
Inc, PA). Las microesferas no se acoplaron a ninguna proteína.
Generalmente 2 l L de 4,5 l m microesferas y 5 l L de 10 l Se
añadieron microesferas m a 0,5 ml de solución salina tamponada
con fosfato (PBS). Se utilizó HRP (Alpha Diagnostic International,
TX y ThermoFisher Scientific, MA) a una concentración final de 50 l g
/ mL o 250 l g / mL.
Medida de absorbancia
Se utilizaron dos lectores de placas: BMG Omega TM Lector de
placas en serie (Offenburg, Alemania) y un dispositivo molecular V-max TM
Lector de microplacas cinético (CA). En ambos instrumentos se leyó la
absorbancia a 650 nm.
Imágenes de placas
Se tomaron imágenes de las placas de varias formas. Algunos
simplemente fueron fotografiados con la cámara digital en una
Blackberry Curve. TM teléfono inteligente, (Waterloo, Ontario, Canadá)
otros fueron fotografiados usando un transluminador y una cámara
digital Nikon SLR con lente macro montada en un fuelle. Esto produjo
la mejor calidad de imagen con iluminación uniforme.
Cultivo de células
La línea de células B humanas linfoblastoides U266 se hizo crecer y se
mantuvo en medio RPMI con suero de ternero fetal al 10% (FCS) (Invitrogen,
CA). Las células se utilizaron directamente del cultivo a una concentración
de aproximadamente 1 millón de células / ml.
Configuración del clasificador de células
FACS Jazz. BD FACSJazz TM clasificador de células (BD Biosciences, San José,
CA), equipado con láser azul de argón (488 nm) y diodo rojo (633 nm) con un l
La boquilla m se configuró para la clasificación de una sola celda con el
modo de gota de una sola celda 1.0. El retraso de caída se calculó
manualmente usando Accudrop TM perlas (BD Biosciences, San Jose, CA). La
presión de la funda usada fue de 20 psi y la compensación de la muestra se
estableció en 0,3 psi y se mantuvo constante durante la duración del
experimento. La frecuencia de activación de caída fue de 30 kHz y la
amplitud de activación de caída fue de 15 V. El instrumento se activó en
dispersión directa y la puerta de clasificación se estableció en dispersión
frontal y dispersión lateral de microesferas. El fluido de la vaina no contenía
conservantes, DNasa, RNasa, ni proteasa, solución salina tamponada con
fosfato (Fisher Bioreagents, Fair Lawn, NJ).
Moflo MLS. Se configuró un láser Moflo MLS (Beckman Coulter, FL) de
tres láser equipado con un láser de argón azul (488 nm), un láser de
diodo rojo (640 nm) y un láser de estado sólido amarillo-verde (561
nm) para una sola celda. clasificación usando el modo de clasificación
de celda única y desviación de gota única. Solo se utilizó el láser de 488
nm. El retraso de la gota se calculó de la forma habitual clasificando las
microesferas en portaobjetos de microscopio y observando al
microscopio. Al ordenar con un 100 l m boquilla, la presión de la vaina
se fijó en 20 psi y la frecuencia de accionamiento de la caída en 31 kHz.
Al ordenar con un 70 l m la presión de la vaina de la boquilla fue de 60
psi y la frecuencia de 98 kHz. El instrumento se ajustó de manera que
cuando la presión de la vaina y la muestra leyeran la misma presión
596
ninguna muestra fluyó al punto de interrogación. Cuando la presión
de la muestra aumenta a 0,1 psi por encima de la presión de la vaina,
la muestra comienza a fluir. La medición de la presión de la muestra y
la vaina solo tuvo una precisión de un decimal. El fluido de la envoltura
fue solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (Invitrogen,
CA).
Configuración de clasificación de celdas
Los clasificadores de células se ajustaron cuidadosamente para que las gotas
clasificadas estuvieran lo más cerca posible del centro de cada pocillo. Este ajuste se
realizó teniendo la trayectoria de las gotas clasificadas lo más vertical posible y cubriendo
la placa con papel de aluminio adhesivo. La lámina se alisa firmemente permitiendo ver el
perfil del pozo. La clasificación de 50 gotas en la cubierta de aluminio produce un charco
pequeño pero visible. No se utilizaron cubiertas de película de plástico o poliestireno, ya
que pueden llevar una carga electrostática que puede hacer que el charco se mueva.
Puede ser necesario calzar la placa o realizar modificaciones en el soporte de la placa para
garantizar que las gotas caigan en el centro de todos los pocillos de la placa, ya que el
movimiento de la placa puede no ser exactamente paralelo a las posiciones de los pocillos
de cada fila. Esto es particularmente importante para clasificar en placas de 384 pocillos.
Otro enfoque utilizado en el clasificador de células Moflo fue hacer una plantilla de papel
de la posición del fondo de los pozos. La plantilla tenía una cruz en el centro de cada pozo.
La plantilla se aseguró al soporte de la placa. El instrumento se ajustó de modo que las
gotitas clasificadas se clasificaran exactamente en los centros de las cruces. Luego, la
placa se colocó encima de la plantilla de manera que el centro de cada pocillo estuviera
exactamente sobre las cruces en la plantilla de la placa y se aseguró con Bluetac. El
instrumento se ajustó de modo que las gotitas clasificadas se clasificaran exactamente en
los centros de las cruces. Luego, la placa se colocó encima de la plantilla de manera que el
centro de cada pocillo estuviera exactamente sobre las cruces en la plantilla de la placa y
se aseguró con Bluetac. El instrumento se ajustó de modo que las gotitas clasificadas se
clasificaran exactamente en los centros de las cruces. Luego, la placa se colocó encima de la plantilla de manera qu
Clasificación de placas de 96 pocillos con múltiples gotas
Placas de 96 pocillos Falcon TM ( Corning, Tewksbury, MA) se prepararon con
100 l Solución de sustrato de alta sensibilidad LTMB (Biolegend, San Diego, CA) en
cada pocillo. Las microesferas se suspendieron en 50 o 250 l g / ml de HRP en PBS.
Inmediatamente antes de la adquisición, las microesferas se resuspendieron y se
clasificaron basándose en la dispersión frontal frente a la dispersión lateral.
Al clasificar, se clasificaron 4 microesferas por pocillo en la
Fila A, 3 microesferas por pocillo en la Fila B, 2 microesferas por
pocillo en la Fila C, 1 microesfera por pocillo en la Fila D, sin
microesferas por pocillo en la Fila E y 1 microesfera por pocillo
para el resto de la placa Filas F – H.
Inmediatamente después de clasificar la placa se retiró y se dejó
en la oscuridad durante 30 min. Las placas se fotografiaron y se
leyeron en un lector de placas BMG Omega Series midiendo la
absorbancia a 650 nm.
Clasificación en placa de una sola gota de 384 pocillos
Placas de amplificación blancas de 384 pocillos (Nunc TM Rochester,
NY) se prepararon agregando 10 l L de TMB a cada pocillo. 4.5
l m microesferas se suspendieron en PBS que contenía 50 l g / ml de
HRP.
El clasificador de células BD FACSJazz se ajustó cuidadosamente de modo
que todas las gotas clasificadas estuvieran lo más cerca posible del centro de cada
pocillo. Las microesferas individuales se clasificaron en placas utilizando varios
patrones diferentes.
Deposición unicelular
 Artículo original

Figura 1. Placas de 96 pocillos después de la clasificación en el FACS Jazz TM clasificador de células seguido de una incubación de 30 minutos en la oscuridad. La
coloración azul es producida por TMB por catálisis por peroxidasa de rábano picante (HRP). La absorbancia a 650 nm se leyó en un lector de placas BMG Serie
Omega. La fila A recibió 4 gotas, la fila B 3 gotas, la fila C 2 gotas, la fila D una gota, la fila E sin gotas y las filas FH recibieron 1 gota por pocillo. A: Plato
preparado con 100 l L de TMB en cada pocillo y concentración de HRP de 50 l g / mL. B: Plato preparado con 100 l L TMB en cada pocillo y concentración de HRP
de 250 l g / mL. C: Valores de absorbancia relativa de TMB de la placa A. Los valores de absorbancia relativa se calcularon dividiendo los valores medios de
absorbancia de múltiples pocillos de gotitas por el valor medio obtenido para gotitas individuales. Los valores se representan como media 6 Error estándar.

Después de clasificar las placas se incubaron en la oscuridad
durante 15 min, tras lo cual se fotografiaron.
Clasificación de placa de 96 pocillos de una sola gota
Se preparó una muestra que contenía 0.5 mL de células
U266 en medio de cultivo, 2 l L de 4,5 l m microesferas, 5 l L 10 l m
microesferas, y 25 l L de 5 mg / mL de stock de HRP. Esto dio una
concentración final de HRP de 250 l g / mL. 5 l Se añadió L de TMB a
Esto se repitió para presiones de muestra de 0,6 psi y 0,8 psi en
columnas posteriores.
Cinco minutos después de completar la clasificación, las
placas se fotografiaron y se leyeron en el lector de placas
Molecular Devices V-max TM Lector de placas cinético.
Clasificación de placa de PCR de 96 pocillos de una sola gota
Placas de PCR Twin Tec de 96 pocillos (Hamburgo,
Eppendorf V
R

cada pocillo de microtitulación de vinilo de 96 pocillos. V platos R

Alemania) se prepararon agregando 5 l L TMB a las filas A y

(Thermo Scientific, Nueva York).
B, 2 l L TMB a las filas C y D, 1 l L TMB a las filas E hasta
El Moflo se ajustó, como se describió anteriormente, de modo que la
H. Las placas se mantuvieron en hielo y se cubrieron con celofán
muestra comenzara a fluir a 0,1 psi por encima de la presión de la vaina.
adherente para evitar la evaporación. Se tuvo especial cuidado para
Luego, la presión de la muestra se fijó a 0,2 psi por encima de la presión de
ajustar la trayectoria de las gotas clasificadas ya que el objetivo es muy
la vaina y se dejó estabilizar el caudal de la muestra. La ganancia de
pequeño.
dispersión frontal y lateral se ajustó para que los tres tamaños de partículas
Se preparó una muestra que contenía 2 l L de 4,5 l m microesferas
pudieran observarse simultáneamente y se hizo una puerta de clasificación
suspendidas en 0,5 ml de PBS que contienen 250 l g / ml de HRP. Las gotas
para cada uno de los tipos de partículas.
individuales se clasificaron en todas menos las dos últimas filas.
Una gota que contiene un 4.5 l m microesferas se clasificó en la
Inmediatamente después de la clasificación, se aplicaron cubiertas de
Columna 1, una gota que contiene una 10 l m microesfera se clasificó
celofán a las placas y las placas se fotografiaron en 5 minutos.
en la Columna 5, y una gota que contenía una celda se clasificó en la
Columna 9. La presión de la muestra se aumentó a 0,4 psi por encima
R ESULTADOS
de la presión de la vaina, se dejó estabilizar el caudal y luego se l m
microesferas se clasificó en la Columna 2, una gota que contiene una Clasificación de placas de 96 pocillos con múltiples gotas
10 l Se clasificó la microesfera m en la Columna 6, y una gota que La transición colorimétrica de líquido transparente a azul se
contenía una celda se clasificó en la Columna 10. puede detectar con tan solo una gota clasificada que contiene 50
l g / mL en 100 l L de TMB (Fig. 1A). Sin embargo, el cambio es

Citometría Parte A 89A: 594600, 2016 597

Artículo original
Figura 2. Placas de 384 pocillos después de la clasificación de una sola gota
en el FACS Jazz TM clasificador de células. El plato se preparó con 10 l L TMB en
cada pocillo y concentración de HRP de 50 l g / mL. Se depositaron gotitas
individuales en columnas alternas y la placa se incubó durante 15 min.
más rápido y obvio si 250 l Se utilizan g / mL de HRP (Fig. 1B). Este
cambio colorimétrico se puede cuantificar fácilmente utilizando un
lector de placas como los que se utilizan para ELISA. La medición de la
absorbancia a 650 nm da un resultado cuantitativo altamente
reproducible (Fig. 1C). La clasificación en placas de 96 pocillos se
repitió veinte veces y los resultados entre ensayos fueron
cualitativamente comparables.
Clasificación de placas de 384 pocillos
El desarrollo del color es más rápido cuando se clasifican gotas
individuales en pocillos dentro de placas de 384 pocillos que contienen 10 l L
de TMB (Fig. 2). El color se desarrolla en unos pocos minutos y los primeros
pocillos ya muestran una coloración azul en el momento en que se retira la
placa del clasificador de células. La clasificación en placas de 384 pocillos
también se repitió más de diez veces y los resultados entre ensayos fueron
cualitativamente comparables.
Clasificación de placa de 96 pocillos de una sola gota con
aumento de la presión de la muestra
La figura 3 muestra que la clasificación 4.5 l m microesferas, 10 l m
microesferas y células produjeron resultados muy similares. La formación y
desviación de las gotas parece no verse obstaculizada por la presencia de
células. Ambos tamaños de microesferas y las células U266 se clasificaron
secuencialmente en cada diferencial de muestra, por lo que las diferencias
observadas no se debieron a la dificultad de duplicar presiones de muestra
idénticas. Las imágenes de la placa (Figs. 3A y 3B) y los gráficos que
cuantifican la absorbancia de TMB de los respectivos pocillos clasificados
(Figs. 3C y 3D) muestran como se esperaba, que el aumento del diferencial
de muestra aumenta progresivamente el volumen del núcleo de la muestra
y por tanto los valores de absorbancia. Los valores medios de absorbancia
de TMB representados en las Figuras 3C y 3D se calcularon después de
restar los valores de absorbancia de fondo respectivos medidos en la última
fila de pocillos que no recibieron gotas clasificadas. Los valores de
absorbancia leídos con el 70 l m tipo de boquilla se reducen en comparación
con los 100
l m boquilla por aproximadamente la mitad utilizando un diferencial de
muestra similar. Para este experimento solo 5 l Se añadió L de TMB al
fondo de las placas de tipo ELISA de vinilo. El color parece tenue ya
que el líquido se esparce muy finamente en el fondo del pozo. Varios
598
las gotitas no alcanzaron los pocillos objetivo, estos pozos están rodeados con un círculo
negro y no se utilizaron para los valores medios calculados. Los 100 l La placa de la boquilla
m mostró cuatro pozos objetivo perdidos mientras que el 70 l La placa de la boquilla m
reveló uno de los pocillos objetivo perdidos. Se muestra un diagrama de puntos de
dispersión frontal y lateral con puertas de clasificación que muestran todas las partículas
en el mismo diagrama (Fig. 3E).
Clasificación de placa de PCR de 96 pocillos de una sola gota
La clasificación en placas de amplificación por PCR produjo
una coloración azul casi de inmediato. El color parece más intenso
cuando 5 l L de TMB se usa moderadamente intenso con 2
l LTMB y menos intenso con 1 l LTMB. Sin embargo, la señal se
puede ver claramente cuando se usa solo 1 l L de TMB (Fig. 4).
D ISCUSIÓN
Se describe una técnica colorimétrica fácil y reproducible que se
puede utilizar para la validación de la clasificación de una sola gota
utilizando una solución de HRP y placas de microtitulación que
contienen TMB. Este método fue desarrollado simplemente para
asegurar al investigador y al operador que el clasificador de células
está ajustado correctamente y que la gota desviada alcanzará su
objetivo. No puede demostrar que la gota contiene una partícula de
interés solo que la gota llegó a su destino. Inicialmente, se demuestra
que una sola gota clasificada de una muestra de microesferas
suspendidas en solución de HRP puede detectarse en un pocillo de
placa de microtitulación que contiene 100 l L de TMB. Luego se muestra
que el sistema puede cuantificar fácilmente si una, dos o más gotas
clasificadas bien recibidas.
El método funciona bien para placas de PCR de 384 pocillos que
contienen 10 l L de TMB. El desarrollo del color es rápido y el color azul
distintivo ya se está desarrollando cuando se retira la placa del
clasificador.
El sistema funciona igualmente bien si las partículas clasificadas son
células o microesferas. Las células linfoblastoides U266 son células bastante
grandes que varían de 10 a 20 l m de diámetro de tamaño. La clasificación de
estas células no interrumpió la formación de gotas ni la desviación hacia los
pocillos. Ambos tamaños de microesferas y las células U266 se clasificaron
sin cambiar el diferencial de la muestra y los tres tipos de partículas
demostraron resultados similares con aumentos progresivos en el volumen
del núcleo de la gota a medida que aumentaba el diferencial de la muestra.
El mayor volumen de las células en comparación con las microesferas
parece tener un efecto mínimo sobre los valores de absorbancia.
Finalmente, se demuestra que el sistema se puede utilizar con
volúmenes muy pequeños de TMB presentando un target muy
reducido. Gotitas depositadas en 1 l L de TMB provocan un cambio de
color visible que muestra la robustez de la química. El desafío de
clasificar en volúmenes de <2 l L evita que el contenido del pozo se
seque y ajusta el clasificador para entregar la gota en un objetivo tan
pequeño. Debilidad de la señal observada en los pocillos de la placa de
PCR de 96 pocillos al clasificar una sola gota en 1 l L de TMB
probablemente se debe a que el TMB se secó parcialmente antes de
fotografiar la placa y, en parte, la profundidad del fluido en el pozo es
muy pequeña. Podría valer la pena considerar clasificar en una placa
seca y agregar el fluido después de la clasificación si eso fuera
compatible con la aplicación posterior. Se muestra que el desarrollo
del color azul es más pronunciado
Deposición unicelular
 Artículo original

Figura 3. Placas de 96 pocillos después de la clasificación de partículas individuales en 5 l L TMB en siete pocillos replicados (filas A – G), la fila H no tiene partículas
clasificadas. Cada tamaño de partícula se clasificó a diferenciales de muestra crecientes de 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 psi por encima de la presión de la funda. 4.5 l m microesferas
(columnas 1 a 4 respectivamente), 10 l m microesferas (columnas 5–8) y células individuales, línea celular linfoblastoide B humana U266 (columnas 9–12). Ambos 70 l m A) y
100 l m B) Los tamaños de boquilla se utilizaron en un clasificador de células MoFlo MLS. Las placas se incubaron durante 5 min en la oscuridad. Los pozos objetivo no
detectados están marcados con un círculo negro. Los valores de absorbancia de TMB se cuantificaron tanto para 70 l m C) y 100 l m D) tamaños de boquilla. Los valores de
absorbancia se midieron en un dispositivo Molecular Devices V-max TM Lector de placas cinéticas que mide la absorbancia a 650 nm y se representan como media 6 Error
estándar. ( MI) Representación gráfica de puntos de dispersión directa (FS) frente a dispersión lateral (SS) de las puertas de clasificación para 4.5 l m, 10 l m microesferas y
células U266.

con un 100 l m, ya que entrega un mayor volumen de solución de HRP.
Generalmente, cuando se clasifica en una sola celda, las tasas de eventos son
bajas, por lo que se pueden usar boquillas de mayor tamaño. La ventaja de las
boquillas más pequeñas es que permiten frecuencias de impulsión de caída más
altas y, por lo tanto, tasas de eventos de muestreo más altas. Puede haber
ocasiones en las que se necesite una alta tasa de eventos, como cuando se
clasifican células muy raras y, en este caso, podría ser prudente aumentar la
concentración de HRP.
Aunque todos los experimentos realizados utilizan placas de 96 o
384 pocillos, el sistema se puede adaptar fácilmente a otros formatos,
como tubos de PCR individuales, tiras de tubos, placas de terasaki o
placas de 1536 pocillos.
Como ya se mencionó, las partículas se usan simplemente para activar
el instrumento, una señal de prueba electrónica está disponible en el
instrumento Moflo MLS pero no se usó ya que creemos que el uso de
partículas imitaría mejor el comportamiento de las partículas clasificadas.

Citometría Parte A 89A: 594600, 2016 599

Artículo original
Figura 4. Placa de PCR de 96 pocillos después de la clasificación de una sola gota de 4,5
l m microesferas en las filas A – F. Las filas G y H no tenían gotas. El plato se
preparó con 5 l L TMB en las filas A y B, 2 l L TMB en las filas C y D, 1 l L TMB en
las filas E a H. La concentración de HRP fue 250 l g / mL. Las placas se
incubaron durante 5 min. Los pozos objetivo no detectados están marcados
con un círculo negro.
gotitas en un experimento de clasificación de células reales. El
comportamiento de las partículas, especialmente las células en un chorro
de líquido, puede ser impredecible debido a la distribución no aleatoria de
las células y la formación de dobletes o agregados celulares durante la
preparación de la muestra (11,12). El método descrito en este artículo
podría usarse para investigar los efectos de células o agregados muy
grandes en la formación de gotas.
En un intento de demostrar que la gota clasificada contiene
la partícula de interés, se acopló HRP directamente a la superficie
de las microesferas carboxiladas. Se esperaba que una sola
microesfera acoplada a HRP pudiera generar un cambio de color
visible en TMB. Desafortunadamente, no se pudo generar un
cambio de color azul visible con una microesfera. Se exploraron
varios tamaños de microesferas de carboxilato y varios protocolos
de acoplamiento. Se necesitan aproximadamente 0,2 ng de HRP
para lograr un cambio de color visible rápido, pero es posible que
no sea posible unir esta cantidad de HRP a una sola perla
(consulte la Información complementaria). Sin embargo, si esto se
lograra, un pozo positivo demostraría que la gota alcanzó el pozo
y que, de hecho, la gota contenía la partícula de interés. Por otro
lado, un pozo no puede mostrar cambio de color por dos razones,
o la gota nunca llegó al pozo o la gota no contenía la partícula,
por lo que un resultado negativo podría ser ambiguo. Sin
embargo, con este sistema que usa HRP soluble, un pozo
negativo mostraría definitivamente que la gota no alcanzó su
objetivo.
Se realizaron algunos experimentos utilizando indicadores
quimioluminiscentes de la actividad de HRP que parecen tener una sensibilidad
comparable o ligeramente mejor, pero como un lector de placas específico es un
requisito para tal ensayo, no se siguió el método.
600
Las figuras 3 y 4 muestran que se pasaron por alto varios
pozos. Esto, en lugar de ser una falla del sistema, es lo que se
diseñó para demostrar y sugiere que valdría la pena realizar
algunos ajustes adicionales. Clasificación de una celda en el FACS
Jazz TM fue especialmente eficaz con las gotas que rara vez fallaban
en su objetivo.
El método descrito aquí es tanto sensible como cuantitativo.
Haciendo una curva estándar de concentración de HRP en una
placa de 96 pocillos (ver Información de apoyo), se puede calcular
la cantidad absoluta de HRP en cada gota. Como conocemos la
concentración de HRP, se puede dilucidar el volumen central de la
gota.
Cabe señalar que encontramos diferencias pronunciadas en la
reactividad de HRP de diferentes proveedores, lo que significaría que
se deben probar varias concentraciones para obtener resultados
óptimos. Usar el método para validar la precisión de la colocación de
las gotas no requiere un lector de placas o incluso una cámara. La
coloración azul se desarrolla rápidamente por lo general en unos
pocos minutos, lo cual es obvio para el ojo humano.
Aquí, demostramos un método de validación fácil y confiable para ayudar
con la configuración de costosos experimentos de clasificación de una sola celda.
El método es lo suficientemente sensible como para que una sola gota clasificada
pueda producir un rápido cambio de color visible. Este método es cuantitativo si
se utiliza un lector de placas pero, por lo demás, no requiere equipo especial.
Puede adaptarse a cualquier tipo de receptáculo de clasificación y cualquier tipo
de clasificador de células.
L ITERATURA C ITED
1. Shalek AK, Satija R, Shuga J, Trombetta JJ, Gennert D, Lu D, Chen P, Gertner RS, Gaublomme JT,
Yosef N, et al. RNA-seq de una sola célula revela el control paracrino dinámico de la variación
celular. Nature 2014; 510: 363–369.
2. Tang F, Barbacioru C, Wang Y, Nordman E, Lee C, Xu N, Wang X, Bodeau J, Tuch BB, Siddiqui A,
et al. Análisis del transcriptoma completo de mRNA-Seq de una sola célula. Nat Methods 2009;
6: 377–382.
3. Macaulay IC, Voet T. Genómica unicelular: avances y perspectivas de futuro. PLoS
Genet 2014; 10: e1004126.
4. Chattopadhyay PK, Gierahn TM, Roederer M, Love JC. Tecnologías unicelulares para
monitorizar el sistema inmunológico. Nat Immunol 2014; 15: 128-135.
5. Osborne GW. Avances recientes en la clasificación de células por citometría de flujo. Methods Cell Biol
2011; 102: 533–556.
6.
Osborne GW, Andersen SB, Battye FL. Desarrollo de un nuevo método de clasificación de células que
muestrea la diversidad de poblaciones en citometría de flujo. Citometría A 2015; 87A: 1047–
1051. Nov;
7. Baumgartner T, Byrne P, Kweens M, O'Donnel C, Hendrikx J. Confirmación visual directa de la alineación
de la deposición del material de clasificación en la parte inferior de los pocillos de la placa de PCR de 96 y
384 pocillos. Cyto 2014; B254: 329.
8. Riddell A, Gardner R, Pérez-González A, Lopes T, Martinez L. Rmax. Un enfoque sistemático para evaluar
el rendimiento de clasificación de instrumentos utilizando la captura de flujo central. Métodos 2015; 1:
64–73.
9. Van Weemen BK, Schuurs AHWM. Inmunoensayo con conjugados antígeno-enzima.
FEBS Lett 1971; 15: 232-236.
10. Holanda VR, Saunders BC. Un sustituto más seguro de la bencidina en la detección de sangre.
Tetraedro 1974; 30: 3299-3302.
11. Lindmo T, Fundingsrud K. Medición de la distribución de intervalos de tiempo entre pases
celulares en citometría de flujo como método para la evaluación de los procedimientos de
preparación de muestras. Citometría A 1981; 2: 151-154.
12. Riddell A, Gardner R, Bispo C, Andrade C. Tiempo entre partículas: uso de un microcontrolador
pequeño y económico para medir la distribución de la tasa de eventos en un Beckman Coulter
Moflo. Cyto 2014; B90: 228.
Deposición unicelular