PRACTICA N° 04

TECNICA DEL MICROCULTIVO, MONTAJE Y SELLADO

I. Fundamento:
La técnica del microcultivo consiste en sembrar el material fúngico en los
márgenes de un bloque pequeño de agar dispuesto en el centro de una
lámina portaobjetos estéril. Se incuba dentro de una placa Petri sobre una
varilla en “V” y en cámara húmeda para impedir la desecación. Se examina
periódicamente con el objetivo de 10X y 40X hasta observar las estructuras
fructificativas maduras características de cada hongo. Finalmente se hace el
montaje con Lactofenol o azúl de Lactofenol y el sellado con esmalte de uñas
transparente.

II. Objetivos:
- Adiestrar al estudiante en la técnica del microcultivo, útil para la
identificación de los hongos, mediante el estudio microscópico in “situ”.

- Observar los procesos de desarrollo del hongo en estudio mediante

observaciones periódicas hasta obtener una formación característica de
sus estructuras reproductivas.

III. Materiales:
- Placas Petri con papel absorbente, varilla en “v” y una lámina portaobjetos
y cubreobjetos, estériles.
- Agua destilada estéril.
- Pipeta de 5 ml estéril.
- Pinza.
- Asa de Kolle dispuesta en aro, aguja y en ángulo recto.
- Mechero
- Algodón, alcohol.
- Cultivo de hongos
- Placa Petri con Agar papa dextrosa en capa delgada ( 3 mm de grosor
Aproximadamente).
- Aguja hipodérmica
- Esmalte de uñas de marca (Incoloro)

IV. Procedimiento
4.1 Microcultivo
a) Hacer cuadrículas de 0,5 cm de lado en el reverso de la placa Petri
conteniendo el medio, empleando una regla y plumón de tinta
indeleble. Realizar todo el trabajo en condiciones de asepsia, y con
el mechero encendido,
b) Cortar el medio de cultivo utilizando el asa de Kolle dispuesta en
aguja.
c) Colocar el bloque de agar (PDA) sobre la lámina portaobjetos.
 d) Colocar un pequeño inóculo del hongo en estudio (Aspergillus flavus)
en los cuatro lados del blogue de agar, evitando romper el medio.
e) Cubrir el cultivo con una laminilla cubreobjetos empleando una pinza
previamente flameada al mechero.
f) Adicionar el agua destilada solo hasta humedecer totalmente el papel,
evitando mojar el microcultivo.
g) Incubar a temperatura ambiente (22 – 25 °C) hasta observar las
estructuras reproductivas maduras características de cada hongo
(aprox. 7 días).
h) Evaluar periódicamente al microscopio con objetivos de 10x y 40x,
hasta observar el desarrollo completo del hongo.

4.2 Montaje
a) Sacar el cubreobjeto y colocarlo sobre una lámina limpia con la cara
inferior dispuesta hacia arriba.
b) Retirar el bloque de medio de cultivo con una aguja hipodérmica y
colocarlo en un recipiente conteniendo solución sulfocrómica.
c) Adicionar el líquido de montaje en el centro de la lámina portaobjetos
y cubrir con las laminillas cubreobjetos respectivas. Dejar en reposo
por 20 minutos.
d) Secar con mucho cuidado los bordes de la láminilla con un trozo de
papel absorbente.

4.3 Sellado
a) Sellar el microcultivo pasando una pincelada del esmalte de uñas
incoloro sobre los bordes de la laminilla cubreobjetos.
b) Una vez seco, pasar una segunda pincelada para un sellado perfecto.

V. Resultados
Esquematizar todas las etapas de desarrollo del hongo en estudio, desde una
espora hasta la formación de las estructuras reproductivas maduras
características.
VII. Discusión de resultados
VIII. Conclusiones
IX. Bibliografía
Cuestionario
1. ¿Cómo se realiza el crecimiento de los hongos a partir de una espora?
2. ¿Cuáles son los cuidados a tener en cuenta cuando se realiza un
microcultivo?
3. ¿Cuál es la importancia de un microcultivo?
4. ¿Cuál es el procedimiento más adecuado para identificar
microscópicamente un hongo filamentoso?
5. ¿Cuál es el líquido de montaje más utilizado para la observación
microscópica de las observaciones micológicas? ¿Por qué?