Tecnología Bioambiental 66 (1998) 25—40
Oc 1998 Elsevier Science Ltd. Todos los derechos
ELSEVIE R
P 1 1: S 0 9 6 0 - 8 5 2 4 (9 8) 0 0 0 3 7 - 6
PRODUCCIÓN BIOTECNOLÓGICA DE XILITOL. PARTE 3:
FUNCIONAMIENTO EN MEDIOS DE CULTIVO FABRICADOS
CON HIDROLIZADOS DE LIGNOCELULOSA
Juan Carlos Parajó *, Herminia Domínguez y José Manuel Domínguez
Departamento de Ingeniería Química, Universidad de Vigo (Campus Ourense) Edificio Politécnico, As Lagoas 32004, Ourense,
España
(Recibido el 24 de agosto de 1997; versión revisada recibida el 6 de febrero de 1998; aceptado el 10 de febrero de 1998)
Abstracto
Se revisa la hidrólisis ácida de materiales
lignocelulósicos para obtener soluciones de xilosa y la
utilización de hidrolizados para hacer medios de cultivo
para la producción de xilitol. Se discuten las estrategias
para mejorar la bioconversión de hidrolizados, incluida
la adaptación de microorganismos y el procesamiento
físico-químico de hidrolizados. También se consideran
los efectos causados por otros factores influyentes
(como el tipo y la concentración de inhibidores, el grado
de concentración de hidrolizado, la concentración
celular, el pH, el oxígeno disponible y la suplementación
con medios).fi 1998 Elsevier Science Ltd. Todos los
derechos reservados.
Palabras clave: Xilitol, fermentación, hidrólisis, xilosa,
hemicelulosas, pentosas.
HIDROLIZADOS DE LIGNOCELULOSA EN CRUDO
MATERIALES PARA OBTENER SOLUCIONES DE
XILOSA
Los materiales lignocelulósicos son renovables,
generalizados y baratos. El componente principal de la
fracción hemicelulósica de las maderas duras y los
residuos agrícolas es el xilano, un polímero elaborado
a partir de unidades de xilosa que puede hidrolizarse a
este azúcar mediante ácidos minerales. En
condiciones seleccionadas, el residuo sólido de la
hidrólisis ácida contiene las fracciones de celulosa y
lignina, que pueden separarse en una etapa de
reacción adicional y utilizarse para diferentes
aplicaciones de productos. La fase líquida de la
reacción de hidrólisis (que contiene xilosa,
subproductos y compuestos derivados de otras
fracciones de las materias primas como extractos o
lignina) se puede utilizar para hacer que los medios de
fermentación sean adecuados para la producción de
xilitol.
* A quién debe dirigirse la correspondencia.
25
reservados
Impreso en Gran
Bretaña 0960-
8524 / 98 $ 19.00
En cuanto a los medios de fermentación sintéticos,
la concentración de xilosa es uno de los principales
factores que afectan la producción de xilitol, el
aumento de las concentraciones de sustrato resulta en
mejores productividades y rendimientos. Sin
embargo, cuando los medios de cultivo se preparan a
partir de hidrolizados lignocelulósicos, hay efectos
adicionales relacionados con la concentración de
sustrato que deben considerarse. Si la concentración
de xilosa aumenta por evaporación, se produce un
aumento simultáneo de la concentración de otros
compuestos no volátiles, algunos de los cuales inhiben
el metabolismo microbiano y reducen el crecimiento
celular y el rendimiento del producto (Watson et al.,
1984; Frazer y McCaskey, pág. 1989; Palmqvist et al.,
1996; Olsson y Hahn-Hägerdal, 1996).
Leonard y Hajny (1945) consideraron como
inhibidores los siguientes: (i) minerales o metales
contenidos en los materiales lignocelulósicos o
resultantes de la corrosión del equipo de hidrólisis; (ii)
productos derivados de la hidrólisis de hemicellu- sas,
como ácido acético (liberado de los grupos acetilo de
la materia prima) o furfural e hidroximetil-furfural
(generado por degradación de azúcares); (iii)
productos derivados de la degradación de la lignina
(compuestos fenólicos, ácidos aromáticos y
aldehídos); y (iv) compuestos derivados de extractos.
Los ácidos vainílico, siríngico, caproico, caprílico,
pelargónico y palmítico se han citado entre los ácidos
orgánicos con capacidad inhibidora presentes en los
medios de fermentación obtenidos a partir de
lignocelulosa.
La concentración máxima permisible para cada
inhibidor no puede establecerse con carácter general,
ya que depende fuertemente de factores como el
microorganismo utilizado y su grado de adaptación, el
proceso de fermentación empleado y la presencia
simultánea de varios otros inhibidores.
Las siguientes secciones resumen los aspectos
químicos y biotecnológicos involucrados en la
producción de xilitol a partir de lignocelulosa.
26 JC Parajó et al.
FUNDAMENTOS DE LA HIDROLISIS ÁCIDA DE
MATERIALES LIGNOCELULÓSICOS
La separación simultánea en forma polimérica de los
tres principales grupos poliméricos de biomasa
(lignina, celulosa y hemicelulosas) no es factible con
los procedimientos de separación convencionales
(tales como cristalización, precipitación o extracción).
Al menos uno de los polímeros anteriores debe
degradarse mediante tratamientos basados en las
diferencias en sus propiedades químicas. La celulosa
y las hemicelulosas son menos susceptibles a la
oxidación que la lignina, pero por el contrario, ambas
pueden ser hidrolizadas por ácidos (al contrario de la
fracción fenólica, que permanece como un residuo
sólido en medio ácido). Las hemicelulosas son más
susceptibles que la celulosa a la acción hidrolítica de
los catalizadores debido a su estructura abierta y
ramificada. Para obtener azúcares aptos como fuentes
de carbono para la fermentación, los polisacáridos de
la materia prima deben hidrolizarse a los azúcares
correspondientes. Para este propósito, H2SO4 y HCl
son los catalizadores más comúnmente empleados
(Tabla 1).
Cuando la xilosa es el producto deseado, una
materia prima adecuada puede someterse a una
hidrólisis ácida selectiva suave (prehidrólisis) para
obtener tanto una solución rica en este azúcar como
un residuo sólido que contiene celulosa y lignina. La
tabla 1 enumera la composición de hidrolizados
hemicelulósicos obtenidos a partir de diferentes
materias primas que se han utilizado con fines de
fermentación. Si se usa ácido sulfúrico como
catalizador, los licores de hidrólisis se pueden
neutralizar con óxido de calcio o carbonato de calcio
para dar un precipitado de sulfato de calcio y los
licores clarificados se pueden usar para preparar
medios de fermentación.
BIOCONVERSIÓN DE HIDROLIZADOS PARA
PRODUCCIÓN DE XILITOL
Se han informado varios estudios sobre la
bioconversión de hidrolizados de lignocelulosa,
incluidos los procedimientos de desintoxicación para
aumentar su susceptibilidad a la fermentación. du
Preez (1994) revisó la bioconversión de hidrolizados
y, más recientemente, Olsson y Hahn-Hägerdal (1996)
informaron un artículo completo centrado en la
producción de etanol. En los siguientes apartados se
resumen los datos sobre los aspectos más relevantes
de la bioconversión de hidrolizados para la
producción de xilitol.
EFECTO DE OTROS AZÚCARES DIFERENTES
DE XILOSA CONTENIDA EN HIDROLIZADOS
Una bioconversión eficaz de la xilosa contenida en los
hidrolizados lignocelulósicos se complica por la
presencia de otros azúcares (hexosas y / o pentosas)
producidos por hidrólisis de polisacáridos contenidos
en la materia prima. Hexosas (como glucosa o
manosa) puede inhibir el metabolismo de la xilosa
mediante la represión e inactivación del sistema de
transporte de xilosa o enzimas catabólicas. Felipe ef
al. (1993) observaron el consumo simultáneo de
glucosa y xilosa por Candida guilliermondii en
hidrolizados hemicelulósicos de bagazo de caña de
azúcar, hecho también reportado por Chen y Gong
(1985) durante la fermentación con Candida sp. del
mismo tipo de hidrolizados. Perego et al. (1990) en
experimentos con Pachysolen tannophilus y C.
shehatae utilizando medios hechos de hidrolizados
hemicelulósicos de madera dura. Roberto y col.
(1995a) y Pessoa et al. (1996) también observaron la
utilización simultánea de glucosa y xilosa en medios
basados en hidrolizados. Wilson y col. (1989)
encontraron que la xilosa y la xilobiosa (una
dissacharíde formada por unidades de xilosa) eran
consumidas simultáneamente por Pichia stipitis
después de que se agotaba la glucosa; y que la
fermentación de celobiosa se produjo una vez que se
redujeron las concentraciones de xilosa y xilobiosa.
La arabinosa fue poco utilizada por D. hansenii
durante la fermentación de hidrolizados de madera de
eucalipto (Parajó et al., 1996d).
EFECTO DE LOS INHIBIDORES
Los inhibidores contenidos en los hidrolizados de
lignocelulosa pueden limitar el consumo de la fuente
de carbono, reducir la cinética de crecimiento o
incluso dificultar el proceso de fermentación. En
ocasiones, la inhibición es el resultado de efectos
sinérgicos. La utilización directa de hidrolizados
neutralizados (sin procesamiento adicional)
generalmente reduce la eficiencia de la fermentación,
afectando tanto el crecimiento como la formación del
producto (Frazer y McCaskey, 1989).
En experimentos con hidrolizados de madera de
eucalipto, la presencia de compuestos tóxicos provoca
pérdidas de floculación y viabilidad, lo que resulta en
fases de retardo prolongadas (Ferrari et al., 1992;
Roberto ct al., 1991a).
El ácido acético (que puede aparecer en
hidrolizados a niveles de concentración de hasta
varios gramos por litro) es el inhibidor más estudiado
(ver Tabla 2). Su acción inhibidora depende de la
concentración de la forma no disociada, que es
función tanto de la concentración como del pH. A pH
ácido, el ácido acético puede difundirse en el
citoplasma celular, donde se disocia y reduce el pH
intracelular, lo que resulta en una producción de
energía desacoplada y un transporte deficiente de
varios nutrientes con mayores requerimientos de ATP.
La sensibilidad de las levaduras al ácido acético
depende del microorganismo considerado, siendo los
datos de la literatura difícil de comparar debido a las
diferentes condiciones en las que se han realizado los
estudios (van Zyl et al., 1991). Watson et af. (1984)
informaron que concentraciones de ácido acético
superiores a 1-45 g / l inhibían completamente el
crecimiento de P. tannophilus, siendo el efecto
inhibidor más marcado a pH más bajos. Se ha
informado que una concentración similar de ácido
acético (1 2 g / l) es responsable de inhibir la
 Cuadro 1. Materias primas, tecnologías de hidrólisis y composición de hidrolizados hemicelulósicos utilizados para la fabricación de medios
de fermentación

Materia prima Tratamiento Concentración (g / l) Referencia

hidrolítico
Azúcar Inhibido
r
Xil Gluc Arabino Manos Galactosa Acético FurfuralHMF " p Vanil
osa osa sa a ácido H ina
B'
Bagazo de caña H SO „130 ° C 40 55 5 —10 4 3 6— - - Watson y col. (1984)
de azúcar 5
1
HzS 120 ° C 3 27 3 - 66 03
O„ 3
0
Bagazo de caña H2S 100 ° C 10 30 1 47 0 —— - ——— Chen y Gong (1985)
de azúcar O„ 5-
3
madera de roble HzSOq, 150 ° C 50 - 12 1 13 ---Tran y Chambers (1986)
Madera blanda Tratamiento de 7 3-3 1 16 2 - - ——— Yu y col. (1987)
sulfito 8
7
Madera blanda Tratamiento de 11 6 4 16 5 - - ——— Tilo y Hahn-Hägerdal (1989)
sulfito
5
Paja de trigo HF 10 27 5 3 1 - - ---Tilo y Hahn-Hägerdal (1989)
Madera blanda Tratamiento de 9 7 2 21 6 3 0-2 ——— Björling y Lindman (1989)
sulfito
Pino madera HCl, 167 ° C 5 52 1 9 12 0-4 - ---Previo et al. (1989)
6
7 2
Álamo temblón HC1, 165 ° C 15 6-3 0 1 0-8 0-6 - ——— Prior et al. (1989)
madera 3 -
9 2
Madera de HCO, 240 ° C
álamo temblón
2 sólidos 59c 12 09 01 —0-50-1 Wilson y col. (1989)
3
59c sólidos 23 1-7 0-3 —1-10-2
7
madera de roble H, SO „190 ° C 43 90 2 3 - 10 9 03 0 9—— Perego et al. (1990)
5 Bi
9 4 ot
Bagazo de caña H SOA, 190 ° C 1 - ó 0-2 ——— Roberto et al. (1991b) ec
de azúcar 4
0' no
Eucalipto madera HzSOq, 190 ° C 30 1'5 2 1 3-7 10 - ——— Ferrari et al. (1992) ló
gi
8
Caña de azúcar H SOA, 190 ° C 90 18 8 11 0 - - 16 7 - ——— Gong y col. (1993)
bagazo 6
Bagazo de caña H2SO ‹ 17 70 13 18 0 06 —— Felipe y col. (1993)
de azúcar -0
Bagazo de caña H SOA, 140 ° C 54 10-7 7 - - 47 - ——— Roberto et al. (1995a)
de azúcar 5
7
Paja de arroz H, SO „140 ° C 61 18 9 11 - - 15 - ——— Roberto et a /. (1995a)
Paja de arroz H SOA, 140 ° C 79 22 6 13 4 - 18 0-1 0 5 —— Roberto et al. (1995b)
-3
Eucalipto madera H SO „130 ° C 17 28 1 - - 2-3 05 ——— Parajó y col. (1995)

9
Eucalipto madera H, SO „100 ° C 17 1 68 2 13 2 99 <0-5 - ——— Parajó et al. (1996a)
-1
Eucalipto madera H SO „130 ° C 18 3-6 0 - 52 <0 5 ——— Parajó et al. (1996c)
-
6
Bagazo de caña H SOA, 140 ° C 18 51 37 2-0 0 08—— Pessoa y col. (1996)
de azúcar -5
Caña de azúcar H, SO „100 ° C 66 23-9 7 - - 13 9 - ——— Domínguez et al. (1996)
bagazo 9
9
Eucalipto madera HzSOq, 150 ° C 52 19 24 3 0 25 0 - - Felipe et al. (1996a)
-9 5 42
Paja de arroz H SO „145 ° C 79 22-6 13 4 - - 1 82 0-13 0 ——Roberto et al. (1996a)
3 51
Arroz Paja H SO „145 ° C 16 44 2 - - 1-4 04 0-1 —— Robertoet al. (1996b)
4
3
Sauce SO vapor, 205 ° C 5- 20 - 0 05 26 01 0-2 —— Palmqvist y col. (1997)
2
6
Madera dura HCI, 165 ° C 15 63 0 1 08 48 - - —— Parekh ei u /. (1987)
3 -
9 2
Pino madera HC1, 167 ° C 5 5-2 1 9 12 27 - - ——Parekh et al. (1987)
6
7 2
Madera de Entonces, 203 ° C 6- 45 1 10 0 13 28 - - —— Parekh ei al. (1987)
coníferas 4
7
° HMF = hidroximetilfurfural. 'pHB =
ácido p-hidroxibenzoico.CLa medidaD
como azúcares reductores.
28 JC Parajó et al.
Cuadro 2. Efecto de la concentración de ácido acético sobre el crecimiento celular
Concentración de ácido acético, (g / l) Concentración de biomasa %
(g / 1) crecim
iento
Maiorell Wats Phowchin Delge
a on da nes
et al. et al. et al. et
al.
(1983) (198 (1995) ' (1996
“ 4) ' )
0 1-75 0-78 4 58 100
0-25 17
0-5 1-4
1 3-65
1-45 0 69
2 2-98
3 2-56
4 1-94
5 1-53 6
3
6 1-48
7-5 0-22
8-5 0-25
10 64
14 2 0-15
15 —64
'° Saccharomyces cerevisiae / concentración inicial de glucosa, 20 g / l / - / - / v / V (volumen medio / sistema de volumen) = 2-4 /
5/5% saturación de oxígeno.
'Pachysolen tannophilus / concentración inicial de xilosa, 10 g / 1/30 ° C / 130 rpm / v / V = 2/5.
'Saccharomyces cerevisiae / concentración inicial de glucosa, 50 g / l / 30 ° C.
'Pichia Estipitis / concentración inicial de xilosa, 20 g / l / 30 ° C / 150 rpm / v / V = 50/100.

crecimiento de C. utilis. Wilson et al. (1989) para
causar una reducción en la utilización de pentosa por
P. stipitis. Utilizando medios hechos de hidrolizados
de madera de eucalipto con10-1-10 5 g de ácido acético
/ l, no se detectó producción de xilitol ni consumo de
ácido acético a pH 5-0, pero se produjo a pH inicial de 5-
5 y 6-5. En estos últimos casos, el ácido acético se
consumió parcialmente (Ferrari et al., 1992). Roberto e /
al. (1996b) observaron una fase de retraso durante el
cultivo de C. guilliermondii en hidrolizados
hemicelulósicos de paja de arroz (pH = 4-5) que
contenían menos de 2 g de ácido acético / l. Beck
(1986b) midió la absorción de oxígeno en presencia de
ácido acético y observó que C. shehatae toleraba mejor
el ácido acético a pH 5-5 que a 4-5 y encontró que el
ácido acético no se consumía en concentraciones de 4-5.
7 g / lo más. El efecto tóxico del ácido acético depende
de la presencia de otros compuestos: Pampulha y
Loureiro (1989) encontraron una relación exponencial
entre la concentración de ácido acético no disociado y la
velocidad de fermentación y observaron que el ácido
acético era más tóxico en presencia de etanol; mientras
que Arneborg et al. (1995) en presencia de trehalosa. La
aireación afecta significativamente la asimilación del
ácido acético por las levaduras: van Zyl et al. (1991)
informaron un efecto beneficioso de la aireación sobre la
utilización de ácido acético y xilosa por P. stipitis, con
una eficiencia de fermentación reducida en condiciones
de oxígeno limitado y un crecimiento mínimo y
utilización de ácido acético en anaerobiosis. Ferrari et al.
(1992) para la fermentación de hidrolizados de madera
de eucalipto. Arneborg y col. (1995), trabajando bajo
anaerobiosis en un medio limitado en glucosa,
El ácido redujo la energía disponible para la
formación de biomasa, y el crecimiento en presencia
de ácido acético demostró la adaptación de la
levadura al ácido acético cuando se utilizó una tasa de
crecimiento específica baja. C. tropicalis consumió
más rápidamente el ácido acético contenido en el
hidrolizado de bagazo de caña de azúcar en
condiciones de mayor aireación (Pessoa et al., 1996).
Schneider (1996) observó una estrecha relación entre
la velocidad de eliminación de ácido acético y las
condiciones de aireación, con una mayor utilización
de azúcar y producción de biomasa después de la
eliminación de ácido acético. Felipe y col. (1996a), en
experimentos con C. guilliermondii, encontraron una
reducción del 50% en la concentración de ácido
acético de los hidrolizados de madera de EttCalyptus,
que se consumían simultáneamente con los azúcares
después de un período de retraso prolongado (88 h)
sin producción de xilitol. Utilizando la misma
levadura, Felipe et al. (1997) reportaron un consumo
del 40% del ácido acético contenido en hidrolizados
hemicelulósicos de bagazo de caña de azúcar. Roberto
y col. (1996b) también indicaron el consumo de ácido
acético en medios hechos de hidrolizados de
hemicelulosa de paja de arroz.
El furfural y el hidroximetilfurfural retrasan la
fermentación durante su asimilación o degradación,
provocando un período de muerte celular. El efecto
tóxico del furfural sobre P. stipitis está relacionado
con la inhibición de la respiración y la fosforilación
oxidativa y su forma reducida (alcohol furfurílico)
también afectó el crecimiento celular (Weigert et al.,
1988). Los datos enumerados en la Tabla 3 muestran
el efecto del furfural en los estudios informados. En el
primer caso, la tasa máxima de crecimiento específico
se redujo en un 63% a una concentración de furfural
de 0-35 g / ly se inhibió completamente a 1-75 g / l.
Roberto y col. (1991b) observaron un efecto
activador de furfural sobre el crecimiento celular en
 Producción biotecnológica de xilitol.- Parte 3 29

Cuadro 3. Efecto del furfural sobre la

concentración celular
HoFurfural (g / l) Relativo tasa de
crecimiento (%)
P. pag. estipitis ' P. stipitis ” C. shehatae ' S. cerevisia Z.
tannophilus » mobilis
” '
0 100 100100100 1 1
0 0
0 0
0 35 8
5-
9
0-5 - 114 4 7 51 53 82
5
I 96-4 5 62 19 81
3
1 75 5-13
2 2-4 9 10 44
7
3 - 0
4 0
Condiciones de cultivo:
'v / V = 2/5 / S' = 10 g / l / l 68 h (Watson et al., 1984); '30 °
C / v / V = 2/5 / S '= 10 g / 1/36 h (Roberto et al., 1991b);
"30 ° C / pH„ = 5-6 / 150 rpm / v / V = 1/2 / So 20 1/9/36 h (Delgenes et al., 1996).

concentraciones de hasta 0-5 g / l, pero una casi estimaron que el potencial inhibidor de los grupos
completa inhibición del crecimiento en medios que funcionales adheridos al anillo de benceno aumentó de
contienen 2 g / lo más. De la misma manera, Beck COOH, a p-OH, CHO y CH = CH, sin efecto de m -OI-1
(1986b) encontró que 0,3-1,1 g de furfural /l en y efecto estimulante de OCH, (un hallazgo también
hidrolizados de madera dura causó una reducción del 97- informado por Tran y Chambers, 1985, 1986). Tran y
100% en el consumo de sustrato por P. tannophylus, Chambers (1985) observaron que la
siendo solo notable el efecto del pH sobre la toxicidad
del furfural. a concentraciones de furfural superiores a
0,3 g / l. Delgenes et al. (1996) encontró que
P. stipitis fue más severamente afectado por furfural
que otras levaduras: en presencia de 0,5, 1 y 2 g de
furfural /l, el crecimiento celular se redujo en un 25%,
47% y 99%, respectivamente. Tran y Chambers
(1986) informaron poco efecto sobre la fermentación
causada por 1,3 g de furfural / l. Wilson y col. (1989) no
consideraron el efecto inhibidor de 0,28 g de furfural / l
en la fermentación de hidrolizados hemicelulósicos de
madera de álamo con P. stipitis. Pessoa y col. (1996), en
la fermentación de hidrolizados de bagazo de caña de
azúcar con
C. tropicalis, no observó efecto inhibitorio sobre el
crecimiento celular por 2 g de furfural /l y 0,08 g de
hidroximetilfurfural / I. Felipe y col. (1993) informaron
del consumo de hidroximetilfurfural durante la
fermentación.
Los compuestos derivados de extractos de la materia
prima, encontrados en bajas concentraciones (por debajo
de 0,1 g / l), tenían un gran potencial inhibidor. Entre los
inhibidores, los productos de degradación de la lignina
son más tóxicos que el furfural y el hidroximetilfurfural
(Clark y Mackie, 1984). Ando y col. (1986) identificaron
los siguientes monómeros aromáticos en álamo
explotado con vapor: ácido p-hidroxibenzoico, ácido m-
hidroxibenzoico, ácido vanílico, ácido siríngico, p-
hidroxibenzaldehído, vainillina, ácido cinámico y trazas
de jeringa- aldehído, cinamaldehído, p
-hidroxicinamaldehído, alcohol de coniferilo y alcohol
3,5-dimetoxi-4-hidroxicinamílico. Los mismos autores
Los ácidos aromáticos eran menos tóxicos que los
aldehídos correspondientes y que los ácidos grasos C6 a
C9 eran más inhibidores que los C16. Clark y Mackie
(1984) encontraron una gama de compuestos fenólicos
de bajo peso molecular (presentes aproximadamente a 2
g / l) en hidrolizados, siendo los compuestos a base de
lignina los más inhibidores. Wilson y col. (1989)
informaron de una utilización del 77% de xilosa en
hidrolizado rotoevaporado a pesar de la presencia de
0,21 g de vainillina/l. Clark y Mackie (1984)
encontraron una inhibición completa de S. cerevisiae en
hidrolizados de Pinus radiata por 5 g de vainillina/l y
una inhibición de 50 Wo por 37 g / l. Maiorella y col.
(1983) encontraron que el acetaldehído inhibía el
transporte de nutrientes (de manera similar al ácido
acético) y provocaba cambios en la morfología celular.
En medios obtenidos a partir de madera por
tratamientos con SO2 o sulfito (ambas tecnologías
provocan hidrólisis y deslignificación simultánea de
hemicelulosa), aparecieron en los licores sulfitos y
lignosulfonatos con efecto inhibidor. El efecto de los
sulfitos depende del pH, pero sus efectos son menos
pronunciados que los del ácido acético.
Clark y Mackie (1984) estudiaron el efecto
sinérgico de compuestos tóxicos y reportaron
interacciones no significativas entre furfural, 5-
hidroximetilfurfural, ácido levulínico y ácido
fórmico, siendo el efecto general similar a la suma de
los compuestos individuales. Tran y Chambers
(1985, 1986) estudiaron los inhibidores presentes en
los hidrolizados de roble rojo y observaron efectos
acumulativos.
Watson ct al. (1984) estudiaron los efectos de los
iones Fe, Cu, Cr, Ni (en concentraciones similares a las
que se encuentran en los hidrolizados) sobre el
crecimiento celular en medios sintéticos: iones Cu y Cr
en concentraciones de 0-0,004 y 0-0,10 g / l no afectó
significativamente a umax, pero se observó una
reducción del 60% para los medios que contenían 0,10 g
de Ni+2 / l. Solo unos pocos estudios se ocupan del
efecto de los cationes metálicos sobre la actividad de las
enzimas implicadas en el metabolismo de la xilosa.
Sobre este tema, Girio et al. (1996) indicaron que Ca *
2, Mg * 2 y Mn * 2 no afectaron la actividad XDH,
mientras que Zn * 2, Cd * 2 y Co "2 inhibieron
fuertemente esta enzima.
30 JC Parajó et Alabama.
ESTRATEGIAS PARA MEJORAR LA
BIOCONVERSIÓN DE HIDROLIZADOS POR
LEVADURAS
La naturaleza de la materia prima afecta en gran
medida la fermentación de hidrolizados. Clark y
Mackie (1984) destacaron la diferencia entre maderas
blandas y frondosas en relación con la menor
generación de compuestos fenólicos de la fracción de
lignina de las maderas blandas. Este comportamiento
se deriva de las diferencias existentes entre ambos
tipos de ligninas, particularmente en términos de peso
molecular y reactividad.
Para obtener hidrolizados útiles para la fabricación
de medios de fermentación, la hidrólisis ácida debe
realizarse en condiciones operativas que permitan:
(i) concentraciones de xilosa tan altas como sea
posible; (ii) concentraciones de subproductos
inhibidores (incluido ácido acético, furfural y
productos derivados de la lignina) en los rangos
tolerados por los microorganismos; y (iii) alta
selectividad hacia la degradación de la celulosa, un
factor importante cuando se desea un beneficio
integral de la materia prima.
La adaptación de microorganismos es una
alternativa interesante para mejorar la fermentación de
medios a base de hidrolizados. Esta metodología se
basa en fermentaciones sucesivas, utilizándose los
microorganismos de cada experimento como inóculos
en el siguiente. La adaptación celular fue utilizada por
Chen y Gong (1985) en la bioconversión de
hidrolizados de bagazo de caña de azúcar con Candida
sp. B-22 y por Amartey y Jeffries (1996) en la
fermentación de hidrolizados de mazorcas de maíz
con P. stipitis. En este último caso, las células se
transfirieron a medios con concentraciones crecientes.
Roberto y col. (1991b), trabajando con cultivos de P.
stipitis en hidrolizados de bagazo de caña de azúcar,
no observaron producción de xilitol en un primer paso
y alcanzaron 2-7 g xilitol / l en el siguiente. Parajó y
col. (1995) encontraron un aumento de 3-6 veces en la
productividad volumétrica de xilitol y un aumento de
dos veces en el rendimiento de xilitol después de
cinco fermentaciones de hidrolizados de madera de
Eucaliptus neutralizados con células recicladas de
Debaryomyces hansenii. Felipe y col. (1996b)
confirmaron la influencia favorable de la aireación en
la asimilación de inhibidores durante la adaptación de
C. guilliermondii a hidrolizados de bagazo de caña de
azúcar.
Una variedad de tratamientos fisicoquímicos han
Se ha utilizado para mejorar la fermentación, ya sea
transformando inhibidores en compuestos inactivos o
eliminándolos. La Tabla 4 resume los datos de la
literatura sobre la capacidad de los tratamientos de
"refinación" o "desintoxicación" para reducir la
concentración de compuestos no deseados y las
pérdidas de azúcar provocadas, y la Tabla 5 muestra
el efecto de los inhibidores sobre la producción de
xilitol.
Se han propuesto algunos pretratamientos previos a
la etapa de hidrólisis para reducir las concentraciones
de inhibidor de los hidrolizados. Etanol: se utilizó la
extracción de benceno para eliminar extractos de
madera de roble rojo (Tran y Chambers, 1986) y
alcalinos
La extracción de madera de Eucaliptus fue utilizada
por Parajó et al. (1996b, 1997a) tanto para eliminar
extractos como para escindir los enlaces acetilo con el
fin de disminuir la concentración de ácido acético
obtenido como subproducto de hidrólisis. Sin
embargo, los hidrolizados hechos de madera extraída
con álcali contenían inhibidores derivados de la
lignina que dificultaban la bioconversión. Los
pretratamientos con soluciones de amoniaco diluido a
temperatura ambiente son útiles para eliminar 80-90%
de lignina así como casi todos los extractos solubles
en acetato y álcali (Cao et al., 1996; Domínguez et al.,
1997a, b).
Adición de sustancias reductoras (como Na2SO „
NaHSO „Na2S 2 3 ' 5 H 2 N / A 2S 2 S > N ílz S 2 4 ›
KHSO „NaSe ha propuesto 2S, dietanolamina,
trietanolamina, piridina, anilina, dimetilanilina o
compuestos similares) a hidrolizados como un método
para superar los efectos no deseados sobre la
fermentación causados por compuestos oxidados. Se
ha ensayado la sulfitación para mejorar la
bioconversión tanto de hidrolizados celulósicos de
madera blanda catalizados por ácido (Leonard y
Hajny, 1945) como de hidrolizados hemicelulósicos
(Tran y Chambers, 1985, 1986; Perego et al., 1990),
sus efectos beneficiosos estando relacionado con la
modificación del potencial redox de los medios
(Leonard y Hajny, 1945; Perego et al., 1990).
El procedimiento de neutralización utilizado para
elevar el pH ácido de los hidrolizados hasta valores
neutros adecuados para la actividad microbiana
influye en la fermentación posterior. Leonard y Hajny
(1945) encontraron hidróxidos de bario, calcio, sodio
y amonio adecuados para obtener hidrolizados
neutralizados susceptibles de bioconversión. Otros
autores informaron que la fermentabilidad de los
hidrolizados dependía del tipo de tratamiento y del
agente neutralizante empleado. Wilson y col. (1989)
informaron rendimientos de etanol más bajos después
de la neutralización de hidrolizados de hemicelulosa
de madera de álamo con NH4OH que en el caso de
usar Ca (OH) 2 Roberto et al. (1991b) observaron que
el álcali utilizado para elevar el pH afectó la
fermentación posterior con C. guilliermondii: la
neutralización con CaO o Ca (OH) 2 condujo a un
mejor consumo de xilosa y producción de xilitol en
comparación con los resultados obtenidos utilizando
KOH como agente neutralizante. Estudios realizados
por Roberto et al. (1991a) con P. stipitis mostró que el
crecimiento celular se favorecía cuando se usaba
NaOH como agente neutralizante en lugar de KOH,
mientras que el CaO conducía a resultados pobres en
comparación con los compuestos anteriores. El
método de sobrelimado se basa en la adición de óxido
o hidróxido de calcio hasta que el pH alcance 10-10,5,
condiciones bajo las cuales se forma un precipitado
(Roberto et al., 1994; Beck, 1986a, b; Frazer y
McCaskey, 1989 ; du Preez, 1994). El sobrelimado
causa varios efectos beneficiosos, incluida la
eliminación parcial de ácidos (ácido acético y tánico)
y compuestos fenólicos (Roberto et al., 1991a),
precipitación de iones de metales pesados (Strickland
y Beck,
 Producción biotecnológica de xilitol. Parte3 31

Tabla 4. Tratamientos para mejorar la susceptibilidad de los hidrolizados hemicelulósicos a la fermentación

Tecnología Agente de Compuesto Concentrac Referencia

tratamiento ión (g
/ l)
Antes después
Intercambio IRA-45 Xilosa 40-533-6 Watson y col. (1984)
iónico
glucosa (aniónica) 55 5 07
Arabinosa 51 4 35
Ácido acético 10 4 5 52
Furfural 3-6
Iones Fe 0-5 0-001
Iones Cu 002
Iones Cr 01 0-001
Iones de Ni 0 08 0-001
Ion intercambio IRA-45Xilosa 33 3 26-9 Watson et al. (1984)
(aniónica) Gluocosa 2 74 2-88
Arabinosa 3 01 3-52
Ácido acético 6-55 3 88
Furfural 0 33
Iones Fe 0-27 001
Iones Cu 001
Iones Cr 0- 0-001
001
Iones de Ni 001
Furfural1 30-7
Intercambio AG-501-XS Xilosa24 122 4Tran y Chambers (1986)
iónico Acético acid11-39 0
Furfural0-610-49
(D) IRA-400 Acético acid11 08 0 Frazer y McCaskey (1989)
Intercambio Furfural1 20-7
iónico Sulfato1 00-2
(aniónico) Monomerie fenoles4 5 21
Polimérico fenoles2-61-2
Intercambio Amberlite IRA-45Xilosa5049-45van Zyl y col.
iónico (1991) Acéticoacid101-6
(aniónico) Dowex 50WXylose5047-45van Zyl y col. (1991)
Intercambio Acéticoácido106-3
de iones Amberlite IRA-45Xilosa 5049-25van Zyl y col. (1991)
(aniónico) Dowex50Wcético acid102-7
Intercambio
iónico (aniónico Dowex 2-X8-200 Azúcares 36-6 3 Ferrari y col. (1992)
followed 5-
por catiónico) S-115 4
Intercambio Ácido acético 10-3 76
iónico Xilosa 36-8 3 Tran y Chambers (1985)
(aniónico) Vuela-Salto-115 1-
Adsorción (tamiz 3
Ácido acético 12-1 61
molecular) Furfural0 610-11

Adsorción (tamiz
molecular)
Evaporación- Xilosa 23 721 8 Wilson et al. (1989)
Glucosa1 71-8
Acético ácido 6 12 8
Furfural0 280
p-hidroxibenzoico a.1 071-04
Vanillin0 210-15
Extracció Acetato de Xilosa 23 719-3 Wilson et al. (1989)
n etilo Glucosa1 71 6
Acético acid6 12 7
Furfural0 280
p-hidroxibenzoico a.1 070
Vanillin0 210
Extracción TricloroetilenoAcético acid11 05-0 Frazer y McCaskey (1989)
Furfural1 20-9
Sulfato1008
Monomérico fenoles4 54-1
Polimérico fenoles2-624
Adsorción Activado carbón de leña xilosa 17 16-05 Parajó y col. (1996c)
Acéticoacid4 54-35
Fenoles1 "0 108 °
32 1. C. Parajó et al.

Mesa 4 -
Continuación
Tecnología Tratamiento Compuesto Concentraci Referencia
agente ón

Antes
después
Furfural1 3 I -3
Neutralización y Ca Acético ácido 11 011-0 Frazer y McCaskey (1989)
(OH) precipitación Furfural1 21 2
Sulfato l -0 1-0
Monomérico fenoles 4-53-4
Polimérico fenoles 2-6 l -9
Precipitación, Gil (OH ) z ›NilOH Xilosa 40 533 6 Watson ct al. (1984)
superposici Ainberlite IRA- Glucosa 5-49 5 07
ón de 45 / Dowex 50W Arabinosa 5 08 4 35
capas, Acético ácido 10-45-52
intercambio Furfural 3 58 Dakota del Norte
iónico Cá (OH) z IRA-400 Acético ácido 11 0 80 Frazer y McCaskey (I 989)
Furfural1-2 07
Sulfato1 00-2
Neutralización, Monomérico fenoles 4 5l S
precipitación, Polimérico fenoles 26 10
intercambio Éter Xilosa11-0 10 1 Delgenes et al. (1990) "
iónico Glucosa1-3 12
(aniónico) Arabinosel S1 9
Furfural 0-011 0
Extracción y Acético ácido2 4 2 05
concentració
n de vacío

'Cantidades
relativas.

ácido furfurílico (Strickland y Beck, 1984; Tran y bioconversión de hidrolizados conduciendo a mejores
Chambers, 1985; Perego et al., 1990). Los azúcares resultados que los obtenidos en medios elaborados con
pueden degradarse parcialmente durante el sobrelimado: xilosa comercial. Roberto e / al. (1995a), en experimentos
por ejemplo, Amartey y Jeffries (1996) informaron con 1994) propuso la adición de sulfito de sodio a alta
pérdidas de glucosa (14%), xilosa (4%) y arabinosa (8%) temperatura hasta que el pH alcance 10 para mejorar la
después de sobrelimar hidrolizados de mazorca de maíz. eliminación de los ácidos acético y tánico y para
Roberto ef al. (1991b) estudiaron el efecto de la precipitar los metales pesados. Algunos pretratamientos
neutralización en la producción de xilitol por C. mejoraron la bioconversión de hidrolizados conduciendo
guilliermondii a partir de hidrolizados de bagazo de caña a mejores resultados que los obtenidos en medios
de azúcar y encontraron que la fermentación era más elaborados con xilosa comercial. Roberto e / al. (1995a),
efectiva cuando los hidrolizados eran sobrelimados y en experimentos con C. guilliemiondii, reportaron una
luego sometidos a ajuste de pH a valores neutros con mayor productividad y rendimiento de xilitol utilizando
ácido sulfúrico que cuando se neutralizaron directamente hidrolizados de bagazo de caña de azúcar
a pH neutro. La sobrevaloración con CaO y Ca (OH) 2 sobrevalorados con CaO o hidrolizados de paja de
mejoró las tasas de consumo de xilosa en la fermentación arroz
posterior, pero la producción de xilitol mejoró solo
cuando se utilizó Ca (OH) 2 para la sobrevaloración.
Mayerhoff et al. Utilizaron NaOH. (1997) como un
agente de sobrevaloración para ajustar el pH de los
hidrolizados de paja de arroz a 9,5 antes de reajustar el
pH a 5,4. Perego et al. (1990, 1994) propusieron la
adición de sulfito de sodio a alta temperatura hasta que el
pH alcance 10 para mejorar la eliminación de los ácidos
acético y tánico y para precipitar los metales pesados.
Algunos pretratamientos mejoraron la bioconversión de
hidrolizados conduciendo a mejores resultados que los
obtenidos en medios elaborados con xilosa comercial.
Roberto e / al. (1995a), en experimentos con 1994)
propuso la adición de sulfito de sodio a alta temperatura
hasta que el pH alcance 10 para mejorar la eliminación
de los ácidos acético y tánico y para precipitar los
metales pesados. Algunos pretratamientos mejoraron la
sobrevalorados con NaOH que los obtenidos en
experimentos con medios sintéticos.
La evaporación y la extracción con vapor
eliminan el furfural (casi por completo), el ácido
acético (en más del 50%) y otros compuestos
volátiles (Perego et al., 1990; Roberto y col., 1991a;
Wilson et al., 1989), permitiendo una fermentación más
rápida (Parekh et al., 1987).
La adsorción de carbón vegetal disminuye las
concentraciones de ácido acético y fenólicos derivados
de la lignina soluble en ácido de la madera (Tran y
Chambers, 1986; Browning, 1967). Se observó una
reducción en el pico de absorbancia a 279 nm
(correspondiente a compuestos derivados de la fracción
de lignina soluble) después de tratamientos de
hidrolizados de roble rojo con tamices moleculares y
resinas de lecho mixto (Tran y Chambers, 1985, 1986)
e hidrolizados de madera de Eucaliptus. con carbón
activado (Parajó et al., 1996c). La adsorción de carbón
vegetal y el intercambio iónico mejoraron el consumo
de azúcar en medios hechos a partir de hidrolizados de
madera de pino (Clark y Mackie, 1984) y madera de
eucalipto (Parajó et al., 1997a). Domínguez er al.
(1996) también observaron un mejor consumo de xilosa
y productividad de xilitol cuando los hidrolizados de
bagazo de caña de azúcar se sometieron a
neutralización y adsorción de carbón que en ensayos
realizados con hidrolizados sujetos únicamente a
neutralización.
La capacidad de los tratamientos con carbón vegetal
para mejorar la bioconversión fue mayor que la de otras
tecnologías como la sulfitación y el sobreencalado
(Parajó et al., 1997a). Un material que contiene 87 Wo
SiO y 13% Al O, con poros
 Cuadro 5. Producción de xilitol a partir de drolizados lignocelulósicosC 7
Levadura Fermentación Materia prima Procesamiento de T E Q 9r PAG Q Vr s Añ Referencia
condiciones hidrolizados i nt n S t r (8 os
e o ( ) c ° nsumpti ° n 8 (s s) (Y
m n 1 l 8)
p ce 1
s 1
o
(a'
)
(
h
)
P. tannophilus 3t1'C / v / V = 100/250 Bagazo de caña de Pasteuización 1 40 0- 12 5 0 0 - Watson er ml. (1984)
NRRL azúcar 9 26
C. parapsilosis
Y-2460 Sorgum bagazo 7250 028 t ›015 0 20 0 72— Strehaiano y Dupuy
ATCC 28474 (19
90)
P. tannophilus 32 ° C / v / V = 3/5/300 Madera dura OV '+ WF "+ SU' 96 63 ses 0-07 —— Perego ed Alabama.
NRRL rpm ent (1990)
ay
cin
co
Y 2460
OV ' 120 58 - 11 0 09
OV '+ WF' + SU ' 120 62 - 70 0 06
7
+ TPT •
C. iropicalis ATCC 30 ° C / v / V = - / 1001 / Hardwcod 91 76 100 212 0 23 —— Heikkilà et al. (1991)
5
9968 100 rpm / pHb = 6
D. hansenii 30 ° C / 200 rpm / pHt, Madera dura 25'4 - —— Heikkilà et ul. (1991)
=6
UTI por C. 30 ° C / v / V = 50 / Bagazo de caña de azúcar Neutralización de Ca 130 ses 9 30 0 23 0 48— Roberto y col.
guilliermondii (OH) ent 5 (1991a)
ay
cin
co
20037 125/200 rpm
Neutralización de 130 ses 0 47 98 22 0-17 0-36
CaO ent
ay
cin
co
Neutralización de KOH 13U 64 0 29 56 18 0 14 0 48 -
Estipitis de Pichia 30 ° C / v / V = 50 / Bagazo de caña de azúcar Carbón activado - 50 100 27 - - —Roberto el o /. (109
CBS TB) Bi
5773 125/150 rpm
Estipitis por Pichia 32'CJvJV = 1 / Eucalipto madera Hidrolizados crudos t 4t 36 0 25 99 1-4 0 01 0 04 - Ferrari el o /. (1992) og
4-1124 1 te
2-5 / 150 rpm
Intercambio iónico 69 35 0-50 99 24 0 04 0- ch
litro 07 no
s
C. tropicalis ATCC Madera dura 120 76 0 54 S8 62 0 50 0- - Heikkilà et al. (1992)
92
9968
C. giii // iermondii 30 ° C / v / V = 50 / Bagazo de caña de azúcar CaO + PO Ha - 35 94 - 0-45 06 - Felipe et cl. (1993) ic
FTI al
20037 125/200 rpm + CaO
C. giil / fierznondii 30 ° C / v / V = 50 / Paja de arroz 48 45 0 81 27 fl'56 0 69 0 12 Roberto em ri /. (1994)
FTl
20037 125/200 rpm / pHt, = 5
5
C. giiiffiermondii FT 30 ° C / v / V = 50 / Bagazo de caña de azúcar 55 54- 0 91 91 35 0 64 tl 70 - Robetto ed al.
I 5 (1995a)
20037 I 25/20 (l rpm / pH „=
5-3
C. guilliermondii FTI 30 ° C / v / V = 5fl / Paja de arroz 72 61 0 79 91 7 40 0'56 0 71 - Roberto et al. (1995
a)
20 (137 125/200 rpm / pHq = 5
3
C. guilliemiondii 30 ° C / v / V = 50 / Paja de arroz 72 79 0-79 90 39 3 0 54 0 68 - Roberto et a/.
PIEl 3 (1995b)
20037 125/200 rpm
sulfato de amonio/
Salvado de arroz
D. hansenii NSUL 30 ° C / pHt = 5 5 / v / Eucalipto madera - - 0,13 - 0 OU › 0 43 - Parajó et ul. (1995)
Y-7426 V = 50/250/200 rpm
C. guilliermondii FTI 30 ° C / v / V = 50 / Paja de arroz 72 62 0-79 9 41 0-57 0 11 - Roberto et al.
2 (1996a)
20037 125/20 fl rpm
C. guilliermondii FTI 30 ° C / v / V = 50 / Paja de arroz' 72 64 0 59 - 23 Li-32 0 54 0-05 Roberto el ul.
(1906b)
2 (l037 125/200 rpm
72 fi4 0-75 36 7 0 51 0f 0-07
›8
72 64 tJS6 35-3 0 49 0-57 0-08
72 64 058 27 4 0-38 0 66 0 07
72 64 0-79 35 3 0'49 0 62 0 07
72 64 084 34 6 0-48 0 57 0 (19
Carid / da sp. 11-2 28 ° C / v / V = 10 / Bagazo de caña de azúcar Charcoa1 + íon 48 51 0 90 84? 28 9 0 60 0- - Domínguez et al.
activado 67
50/180 rpm intercambio (1996)
 Mesa 5 - Continuación
Levadura Fermentación Materia prima Procesamiento de Tie E Qz 7o PAG Q Añ Año Referencia
hidrolizados mpo n S z os s
t
o
n
c
e
s
condiciones (h) t (8 consumo II) (/ *) (8/ ts /
& / 8) g)
'+)
Saccharomyces 30 ° C / v / V = 50/250 Elote Pretratado con 24 5 1 75 76- 4-8 0-2 0- - Cao y col. (1996)
1400 2 2 11
(pLNH33) NH OH
C. guilliermondii 30 ° C / 0-8 vvm / 300 Bagazo de caña de 48 29 5 0 100 18-4 0-38 0- 0 085 Pfeifer ef al. 1996)
FTI rpm azúcar 61 62
20037 @=1g/1
C. entomaea NRRL 34 ° C / pH ¢ = 5'6 / 200 Fibra de maiz 39 6-5 0 33 (1- 0 02 0- - Sa ha y Bothast
rpm 05 9 65 ' 30
6
Y-7785 (1996)
P. guilliermondii 34 ° C / pHq = 4 6/200 Fibra de maiz 24 6-2 0- 30 0- 0 026 0'3 - Saha y Bothast
rpm 07 -7 62 " 3
9
NRRL Y — 2075 (1996) .J
C. guilliemtondii ftl 30 ° C / v / V = 50 / Eucalipto madera 88 5 0 55 90 13-8 0 lfi 0'2 - Felipe y col. (1996a)
3 9
20037 125/200 rpm
C. yuilliennondii ftl 30 ° C / 0-6 vvm Bagazo de caña de - 0 65 - - Felipe er al. (1996b)
azúcar
20037
C. tropicalis IZ 1824 30 ° C / v / V = 500/1000 Bagazo de caña de - - 0 65 - 0-20 0- - Pessoa y col. (1996)
azúcar 31 C.
20037 125/200
400 rpm rpm
/ pH = 6/2 vvm
C. tropicalis IZ 1824 30 ° C 0-5 vvm hasta Bagazo de caña de - - 0- - Molwitz cl c /. (1996)
azúcar 46
0-05 vvm después de 14 h
D. hansenii NRRL 30 ° C / pHt, = 6-5 v / Madera de eucalipto Carbón 8 13 5 1- 72 59 0 58 0- - Parajó et a /. (1996a)
Y-7426 V = 10/50/200 rpm 23 4 47
D. hansenii NRRL30'C / pHq =55v/ 200 2 0- 66 115 0 0- - Parajó el n /.
Eucalipto madera Y-7426 V = 0-5L / l 4 08 7 053 63 (t996b)
L / 100 rpm
D. hansenii NRRL 30 ° C / pHq = 5 5 v / Madera de eucalipto Carbón 31 38-2 0- 76' 18 8 0 57 0- 0 14 Parajó et o /. (1996c)
Y-7426 V = 10/50/200 rpm 94 4 6t
= 33 g / yo
'Obtenido como subproducto; «levaduras adaptadas; «azúcares tratados
Carbón con xilosa-isomerasa; dOV = sobrelimado; * WF = filtración en caliente; 'SU = adición de sulfito de
sodio; gT T = postratamiento térmico; fermentación realizada con diferentes suplementos de nutrientes. Pa
Nomenclatura: S, concentración inicial de sustrato; QS, tasa volumétrica de consumo de sustrato; P, concentración de xilitol; @p, tasa volumétrica de producción de xilitol; é p / S, p r oducto raj
producir; Yp, rendimiento de biomasa; v / V = (medio de volumen / sistema de volumen).
ó

et

Al
 Producción bioiecnológica ofliiol. Almohadilla 3 35

La estructura ha sido informada por Perego et al.

(1994) para actuar como tamiz molecular para También se ha propuesto el uso de
inhibidores macromoleculares derivados de la lignina microorganismos para eliminar selectivamente
y como adsorbente de sustancias orgánicas. Perego y inhibidores de hidrolizados lignocelulósicos.
col. (1994) encontraron una fermentación mejorada de Schneider (1996) informó sobre la eliminación
hidrolizados hemicelulósicos ácidos por P. selectiva de ácido acético (de 68 g / 1 a menos de 0-4
tannophilus después del sobrecalentamiento y el g / l) en licor de sulfito de madera dura extraído al
tratamiento con un material que contenía SiO2 y vapor por una cepa mutante de S. cerevisiae.
Al2O3 que actuaba como tamiz molecular y Trichodemia reesei consumió ácido acético y degradó
adsorbente. Watson y col. (1984) emplearon resinas de compuestos inhibidores de hidrolizados
intercambio iónico para la desintoxicación de hemicelulósicos de sauce con producción simultánea
hidrolizados de bagazo de caña de azúcar. Trabajando de celulasas (Palmqvist et al., 1997).
con el mismo tipo de hidrolizados, van Zyl et al. Tanto la desintoxicación como la adaptación de la
(1991) alcanzaron hasta un 84% de eliminación de levadura son específicas, mostrando una fuerte
ácido acético con resinas de intercambio aniónico. dependencia del tipo de hidrolizado, de la cepa
Comparativamente, las resinas de intercambio utilizada y del producto considerado. Mientras que los
catiónico eliminaron más xilosa con menor procedimientos de desintoxicación se pueden
eliminación de ácido acético. Parekh y col. generalizar para eliminar un tipo determinado de
La extracción con disolventes orgánicos (como inhibidores, la adaptación de microorganismos no es
tricloroetileno, benceno, acetato de etilo, éter dietílico, necesaria.
cloroformo y hexano) se ha utilizado para eliminar
selectivamente inhibidores de hidrolizados, ya sea
solos o en combinación con otros tratamientos físico- 1,2
químicos. Wilson y col. (1989) encontraron que la
extracción con acetato de etilo era más eficaz que la 0,8
rotoevaporación para eliminar inhibidores distintos del 0,6
ácido acético y el furfural. Delgenes et al. (1990) 0,4
informaron que la extracción con éter eliminó el 100% 0,2
de furfural y el 15% de ácido acético, lo que dio como
resultado una mayor producción de etanol, pero OVL
también una disminución del rendimiento de xilitol. NEU
La extracción con acetato de etilo eliminó B)
completamente los compuestos fenólicos y furfural 0,7
(tales como ácido p-hidroxibenzoico y vainillina) y 0,6
redujo en 50% la concentración de ácido acético de los
hidrolizados (Wilson et al., 1989). El tricloroetileno y 0,4
el benceno fueron los mejores disolventes para la
eliminación del ácido acético ensayados por Frazer y 0,2
McCaskey (1989), mientras que el tricloroetileno y el
acetato de etilo condujeron al mayor grado de
extracción de furfural (75-83%). Sin embargo, se OVL NEU
eliminaron menos del 40% de compuestos fenólicos
con disolventes, una fracción limitada en comparación
con los grados de eliminación logrados con carbón
activado (73%) o resinas de adsorción (53-71%). 0,7
Parajó y col. (1997c) consideraron las capacidades de 0,6
0,5
varios disolventes orgánicos para eliminar inhibidores
0,4
de hidrolizados de madera de EuCalyptus y 0,3
compararon sus efectos sobre la fermentación de D. 0,2
hansenii con los causados por simple neutralización
con carbonato de calcio o por sobrelimado. Acetato de
etilo, el tricloroetileno y el cloroformo eliminaron OY
entre el 28 y el 50% de los compuestos fenólicos NEU
presentes en los hidrolizados previamente sometidos
tanto a neutralización como a sobrecalentamiento. La
Figura 1 muestra que la neutralización por sí sola no Fig. 1. Efecto de la extracción por solvente, adsorción de
es suficiente para la desintoxicación de hidrolizados, carbón vegetal, neutralización y sobrelimado sobre las
producciones volumétricas de xilitol y biomasa y sobre el
mientras que el sobreencalado solo fue útil para rendimiento de xilitol durante la fermentación de hidrolizados
mejorar el crecimiento celular, pero no la producción de madera de Eucaliptus por
de xilitol. La extracción con éter dietílico de D. hansenii (Parajó et al., 1997b). Nomenclatura: CON:
hidrolizados sobrelimados permitió una mejor ensayo de control; CHLE: extracción con cloroformo;
TCEE: extracción de tricloroetileno; EAE: extracción con
productividad y rendimiento de xilitol que los acetato de etilo; DEE: extracción con éter dietílico; HE:
procedimientos alternativos. extracción de hexano; CHA: adsorción de carbón vegetal;
OVL: overliming; NEU:
neutralización.
36 JC Parajó et al
universal y presenta limitaciones derivadas de la
estabilidad de las cepas adaptadas (Olsson y Hahn-
Hàgerdal, 1996).
VARIABLES QUE AFECTAN AL FERMENTATIVO
PRODUCCIÓN DE XILITOL A PARTIR DE
HIDROLIZADOS LIGNOCELULÓSICOS
La Tabla 5 resume los datos de la literatura sobre la
bioconversión de hidrolizados lignocelulósicos en
xilitol, incluido el procedimiento de desintoxicación
cuando se aplica. Dado que la naturaleza y la
composición de los hidrolizados varían ampliamente,
es difícil establecer comparaciones de la eficiencia de
la fermentación.
Roberto y col. (1995a) consideraron el efecto de la
concentración celular en la bioconversión de
hidrolizados, informando tasas de captación de xilosa
mejoradas en ensayos realizados con inóculos que
conducen a concentraciones celulares elevadas. El uso
de alta densidad celular potenció la productividad
volumétrica y superó (al menos en parte) el efecto
tóxico de los inhibidores, limitando la muerte celular
provocada por su asimilación o degradación. Una
concentración celular inicial de 3 g / l fue suficiente
para superar el efecto inhibidor del ácido acético
presente en los hidrolizados de madera de eucalipto
sobre C. guilliermondi (Felipe et al., 1996a). Una
mayor densidad celular inicial dio como resultado
notables mejoras en la utilización del sustrato y la
producción de xilitol, con aumentos en la
productividad volumétrica de 0,1 a 0,16 g / l / h. Con
este procedimiento se evitó la fase de rezago,
Palmqvist y col. (1996) utilizaron medios que
contenían 10 g células / l, mientras que 50 g células / 1
tienen estado empleado para fermentar hidrolizados
de madera de eucalipto (Parajó et al., 1996b) y la
productividad más alta se puede lograr con
concentraciones celulares de hasta 75 g / 1 (Olsson y
Hahn-Hàgerdal, 1996). La utilización de altas
concentraciones de células mejoró notablemente la
bioconversión de hidrolizados de madera de eucalipto
con D. hansenii (Parajó et al., 1996d y Parajó et al.,
1997b). En medios que contienen altas densidades
celulares, una reducción en la disponibilidad de
oxígeno en el medio podría ser responsable de la
disminución de rendimientos y productividades, esta
idea sugiere la existencia de una concentración celular
óptima para condiciones operativas dadas.
La fermentación de hidrolizados también fue
significativa afectado por el pH. Trabajando con la
bioconversión de hidrolizado de bagazo de caña de
azúcar en medios sin control de pH, Pfeifer et al.
(1996) observaron un aumento continuo del pH
durante la fermentación, como resultado de la
utilización de ácido acético por las células. En la
fermentación de hidrolizados de paja de arroz por C.
guilliermondii, Roberto et al. (1996b) observaron una
fase de retraso a pH 4-5 debido al efecto inhibidor del
ácido acético,
que podría superarse trabajando con valores de pH
iniciales de 5-3 o 6 0.
La suplementación de medios con nutrientes es un
factor influyente en la bioconversión de hidrolizados.
Roberto y col. (1995b) estudiaron el efecto de la
composición de los medios de cultivo elaborados a
partir de hidrolizados de hemicelulosa de paja de
arroz sobre la fermentación por
C. guilliermondii. La adición de sulfato de amonio y
salvado de arroz afectó tanto al consumo de xilosa
como a la producción de xilitol, pero la
suplementación con cloruro de calcio no influyó en el
proceso general, lo que sugiere que algunos
componentes esenciales ya estaban presentes en los
hidrolizados. De la misma forma, Pessoa et al. (1996)
concluyeron que los oligoelementos y vitaminas
estaban presentes en los hidrolizados de bagazo de
caña de azúcar y que solo era necesaria la
suplementación con fosfato. Durante la bioconversión
de hidrolizados de paja de arroz por C. guilliermondii,
Roberto et al. (1996b) alcanzó 21,86 g de xilitol / l en
medios suplementados con urea, en comparación con
27,11 g de xilitol/1 en medios que contienen sulfato
de amonio, comportamiento que podría atribuirse al
aumento de pH provocado por la liberación de
amoniaco en el segundo caso. En medios con pH
inicial de 5,3 o 6,0, el uso de sulfato de amonio o urea
no provocó variaciones significativas, alcanzándose
los valores más altos (37,6 g xilitol / 1) en medios
suplementados con urea a pH = 5,3. Parajó y col.
(1995) encontraron incrementos en la productividad
de 0,034 a 0,049 g de xilitol / l / h cuando la
concentración de nutrientes (extracto de levadura y
peptona) se incrementó de 3,5 a 6 g / l. Roberto y col.
(1996a) encontraron una productividad volumétrica
de xilitol mejorada con C. guilliermondii en medios
que contienen sulfato de amonio, mientras que la
fuente de nitrógeno no influyó significativamente en
la fermentación en medios semisintéticos.NH @ )
2SO4 y urea (Silva et al., 1994).
Se han observado efectos combinados de pH y
nutrientes para hidrolizados hemicelulósicos de paja
de arroz, correspondiendo el mejor rendimiento y
productividad a los medios suplementados con sulfato
de amonio y a pH = 5,3 (Roberto et al., 1996b) (ver
Fig. 2).
El grado de concentración de los hidrolizados
afecta las concentraciones tanto del sustrato como de
los inhibidores, y sus efectos combinados suelen
conducir a un óptimo definido de producción de
xilitol. En estudios sobre los efectos inhibidores
causados por hidrolizados de bagazo de caña de
azúcar concentrados sobre la tasa de producción
celular de Candida sp. B-22, Chen y Gong (1985)
determinaron 008 g / l / h en hidrolizados de
concentración completa, 0-17 g / l / h en hidrolizados
de concentración media y 0-19 g / l / h en
hidrolizados de concentración de un cuarto.
Domínguez et al. (1996) encontraron que la
concentración de hidrolizados de bagazo de caña de
azúcar tratados con carbón vegetal para alcanzar 60 g
de xilosa / 1 aumentó la producción de xilitol, pero
que una concentración más alta inhibió el consumo de
xilosa incluso después de incluir tratamientos
adicionales con resinas de intercambio catiónico y
neutralización.
 Producción biotecnológica de xilitol. Parte3
agentes de izing. Perego y col. (1994) informaron de
una baja eficiencia de fermentación en medios
elaborados con hidrolizados concentrados de madera
dura, como resultado del aumento de la concentración
de inhibidor. Parajó y col. (1996b) estudiaron el efecto
del grado de concentración en la bioconversión de
hidrolizados de madera de eucalipto con D. hansenii.
Los resultados obtenidos
Qp g / Lh
50
Xilitol g / L
20
0,6
0.4
0,2
Nutrientes
Fig. 2. Efecto de la suplementación con medios sobre la
concentración y productividad de xilitol: (a) D. hansenii,
hidrolizados de madera de Eucalyptus globulus; S —— 15 g /
l; v / V (volumenmedio / volumen sistema) = 1/5; 200 rpm;
30 ° C; (Parajó et al., 1995). (b) Candida sp.
L-102; paja de arrozhidrolizados; S -— 79-3 gol; v / V =2/5;
200 rpm; 30 ° C: (Roberto et al., 1995b). (c) C.
guilliermondii ', paja de arrozhidrolizados; S —— 64 g / l;
v / V = 2/5; 200 rpm; 30 ° C; (Roberto
etal., 1996b) .Nomenclatura: SÍ
(1) + P (1) = extracto de levadura, 3-5 g / l + peptona,
3-5 g / l; SÍ (2) + P (2) = extracto de levadura, 6
g / l + peptona, 6 g / l; RB
= salvado de arroz, 20 g / l; CC = cloruro de calcio, (1-1 g /
l;COMO = sulfato de amonio, 3 g / l; U = urea, 13 g / l.
37
se comparan en la Fig. 3 (a), que muestra la existencia
de una concentración óptima. Se observaron
tendencias experimentales similares para hidrolizados
concentrados a proporciones (volumen final) /
(volumen inicial) en el rango de 1/2 a 1/4 (Parajó et
al., 1997a). La concentración al 50% del volumen
inicial seguido de sulfitación y adsorción de carbón
mejoró la productividad de 0 a 22a 0 53 g / 1 / h (ver
Fig. 3b). En medios elaborados con hidrolizados de
bagazo de caña de azúcar, un aumento en la
concentración inicial de xilosa de 37-6 a 54-5 g / 1
aumentó la concentración celular en un 40%, el
rendimiento de xilitol en un 20% y la productividad de
xilitol en un 44% ( Felipe et al., 1997); pero los grados
de concentración más altos redujeron tanto la
concentración celular como la productividad del xilitol.
De la misma forma que se indicó anteriormente
para los medios sintéticos, el oxígeno disuelto juega
un papel crucial en la fermentación de la xilosa en
xilitol, siendo un factor de control para superar los
efectos provocados por los inhibidores. En la
fermentación de hidrolizados de madera de roble con
P. tannophilus, Perego et al. (1990) encontró
B)
Q øg / L- h
Concentración inicial de xilosa (g / L)
a'
Concentración inicial de xilosa (g / L)
Fig. 3. Efecto de la concentración inicial de xilosa sobre la
productividad volumétrica de xilitol (Qp): (a) D. hansenii ',
E. globulus madera; 30 ° C; pHq = 5-5; (Parajó et al., 1996b).
(B)
D. hansenii ', E. glohulus madera; 30 ° C; pHp = 5 5; (Parajó
et al., 1997c). (c) Candida sp .; bagazo de caña de azúcar; 8 °
C;
(Domínguez et al., 1996).
38 JC Parajó et al.
las concentraciones más altas de xilitol a la aireación
más baja ensayada (Fig. 4a). Parajó y col. (1996b)
observaron una tendencia similar con D. hansenii en
la bioconversión de hidrolizados de madera de
Eucaliptus en bruto: en experimentos con
fermentadores discontinuos, los mejores resultados se
obtuvieron a una velocidad de agitación de 100 rpm
(Fig.4c), mientras que en ensayos con matraces
Erlenmeyer agitados, la velocidad óptima de agitación
fue de 200 rpm (Fig. 4d) (Parajó et al., 1995). Un
ajuste fino de la aireación en el rango de estos valores
óptimos confirmó el efecto beneficioso de la baja
concentración de oxígeno (mantenida por las purgas
de nitrógeno después del muestreo) sobre la obtención
de xilitol (Parajó et al., 1997b) (Fig. 4e). Un poco
0025 0,05 0,09 018
vvm
0,05
0,04
0,03
S 0.02
0,01
0 0
100200300
jpg
Se han reportado mejoras en la tasa específica de
consumo de sustrato y aumentos en las tasas máximas de
crecimiento específico (de 0,057 a 0,137 h ') cuando la
aireación se incrementó de 1 a 2 vvm (Pessoa et al.,
1996), agotamiento más rápido de ácido acético y mayor
concentración de xilitol observándose en experimentos
llevados a cabo con la mayor aireación. Mayerhoff y col.
(1997) informaron que el aumento de la oxigenación
resultó en un mejor consumo de xilosa por las cepas
Candida, Debaryomyces, Hansenula y Pichia, mientras
que los efectos simultáneos causados en la producción
de xilitol dependían de la levadura que se usaba. En la
bioconversión de
B)
0
0,6 1,2 1,92,47
kpa-C • (inmol / L h)
0,04
0,03
100300500700
rpm
 mi)
0,1

Q „G / L- h
0,05

0
norte2 en el norte2 afterO 2
después comienzo de la muestra
muestreo
Fig. 4. Efecto del oxígeno sobre la producción de xilitol y la productividad volumétrica (@p) en fermentaciones con: (a)
Pachysolen tannophilus, - hidrolizados de madera de roble; 32 ° C; v / V = 3/5, concentración inicial de xilosa, 43 5 g / l (Perego et
al., 1990). b) Pachysolen tannophifus, hidrolizados de madera de E. gfobu / us; 32 ° C; v / V = 1/2 5, concentración inicial de xilosa,
30 g / l (Ferrari et al., 1992).
(c) D. hansenii, E. g / obr / es hidrolizados de madera; 30 ° C; v / V = 1/5, concentración inicial de xilosa, 43 5 g / l (Parajó et al.,
1995).
(d) D. hansenii, E. globulus hidrolizados de madera; 30 ° C; v / V = 1/2, concentración inicial de xilosa, 15-17 g / l (Parajó et al.,
1996b).
(e) D. hansenii, E. globulus hidrolizados de madera; 30 ° C; v / V = 2/5, concentración inicial de xilosa, 15 g / l (Parajó et al., 1997b).
Nomenclatura: C '": concentración de equilibrio de oxígeno disuelto en las condiciones operativas consideradas, mmol / l.
 Producción biotecnológica de xilitol. ' Parte3
Eucalipto hidrolizados de madera por P. stipitis, la
concentración máxima de xilitol aumentó de 0,5 a 2,8
g / l cuando la tasa de transferencia de oxígeno
aumentó de 0,6 a 7 mmol / l / h (Ferrari et al., 1992).
PURIFICACIÓN DE XILITOL
Heikkilä y col. (1991) propuso la separación
cromatográfica para obtener una solución que
contenía 82-5% en peso de xilitol, seguida de
cristalización para obtener cristales de xilitol con 99-
4% en peso de contenido de sólidos secos. De manera
similar, Cultor (1990) propuso el intercambio
catiónico para la purificación de xilitol y Gurgel et al.
(1995) compararon varias tecnologías para la
purificación de xilitol: las resinas de intercambio
iónico no permitieron clarificar el caldo, la
cristalización se vio afectada por la presencia de
sustancias coloreadas en soluciones viscosas y la
adsorción de carbón vegetal fue el método más
eficiente ensayado.
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