Manual de Procedimientos Operativos Estándar Del Laboratorio de Micologia

APOE
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS
Fecha: agosto 2011
GOBIERNO DE LA CIUDAD
DE BUENOS AIRES
OPERATIVOS ESTÁNDAR
Versión: 2
HOSPITALES DE LA
RED DE MICOLOGIA
MANUAL DE
PROCEDIMIENTOS
OPERATIVOS ESTÁNDAR DEL
LABORATORIO DE MICOLOGIA
RED DE MICOLOGIA
GCBA
Elaborado por: Dra. S. Cataldi, L. Guelfand, M. Perrone Aprobado por: Integrantes y Coordinador de la RM
Fecha: mayo 2008 Fecha:
Versión original
Revisado por: Dra. Alicia Arechavala, L. López Moral
Fecha: junio 2011
APOE
Fecha: agosto 2011
DE BUENOS AIRES
Versión: 2
HOSPITALES DE LA
RED DE MICOLOGIA
PRÓLOGO
El objetivo de este manual es normalizar de una manera clara y sencilla los

procesos que se realizan en el Área de Micología y que puedan ser
interpretados por profesionales capacitados de la especialidad, para permitir la
resolución del trabajo diario del Sector.
Por último, la finalidad principal es implementar un Sistema de Gestión de
Calidad basado en Normas ISO 9000:2000 teniendo como objetivo principal la
mejora continua de los procesos, tratando de lograr la máxima satisfacción de
los usuarios de la Red de Micología y otras partes relacionadas.
APOE
Fecha: agosto 2011
DE BUENOS AIRES
Versión: 2
HOSPITALES DE LA
RED DE MICOLOGIA
CONTENIDO
PROCEDIMIENTO OPERATIVO PARA EXAMEN MICOLÓGICO DE:
9 PIEL
9 CUERO CABELLUDO
9 UÑAS
9 MUESTRAS RESPIRATORIAS
9 ORINAS
9 MUCOSAS Y SEMIMUCOSAS
9 SANGRE
9 MÉDULA ÓSEA
9 LIQUIDOS DE PUNCIÓN
9 LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO
9 INMUNODIAGNÓSTICO
9 PRUEBAS DE SENSIBILIDAD ANTIFÚNGICA
APOE- P
Fecha: agosto 2011
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS Versión: 2
DE BUENOS AIRES
RED DE MICOLOGIA EXAMEN MICOLOGICO DE PIEL
Página 1 de 8
HOSPITAL.:....................
1. OBJETIVOS:
Desarrollar el procedimiento a seguir para el examen directo y cultivo de los

hongos presentes en muestras superficiales de piel
2. ALCANCE:
Todas las muestras de piel extraídas de acuerdo a las indicaciones de toma

de muestra (PATT), para confirmar o descartar el diagnóstico clínico
presuntivo de micosis superficiales de las lesiones de piel.
3. PERSONAL AFECTADO:
Bioquímicos y técnicos del sector Microbiología, área Micología,

pertenecientes a los Laboratorios de los Hospitales del GCBA
4. REFERENCIAS:
Micología Médica Ilustrada, Roberto Arenas Guzmán, Nueva Editorial

Interamericana, 3a edición, México, 2008
Manual de Procedimientos para Laboratorios de Micología Médica, Prof. Dr.
Ricardo Negroni, Dra. Liliana Guelfand y col. Acta Bioquímica Clínica
Latinoamericana supl. 1, editado por la Federación Bioquímica de la Pcia.
De Bs. As. Argentina, 1999
Guía Práctica de Identificación y Diagnóstico en Micología Clínica, Pemán
J. , Martín Mazuelos E., Rubio Calvo M.C., 1ª ed. Revista Iberoamericana
de Micología, 2001, Bilbao, España
5. DEFINICIONES:
Elaborado por: S.Cataldi, M.Carmen Perrone,L.Guelfand Aprobado por: Integrantes y Coordinador de la RM

Fecha: 8 de enero 2008 Fecha: agosto 2011
Versión Original
Revisado: L.L Moral, I.Maldonado
Fecha: julio 2011
APOE- P
Fecha: agosto 2011
DE BUENOS AIRES
Página 2 de 8
HOSPITAL.:....................
Etapa Pre- Analítica

PAMR: Manual de Medios y Reactivos
PATT: Manual de Toma y Transporte de muestras
Etapa Analítica
AMID: Manual de Identificación
01. Dermatofitos
02. Levaduras
03. No Dermatofitos
04. Levaduras Lipofílicas
APOE: Manual de procedimiento Operativo
Etapa Post- Analítica

PPFI: Formularios e Informes
MC: Manual de Calidad

MB: Manual de Bioseguridad
ANEXOS
PLANILLAS
6. RESPONSABILIDADES:
Jefe de Sector ó Sección Microbiología / Micología, Bioquímicos a cargo

del área Micología
7. DESARROLLO:
7.1 FUNDAMENTO DEL MÉTODO
El diagnóstico de las micosis superficiales se basa en el hallazgo de hifas o

levaduras características, en el examen microscópico directo y el aislamiento del
agente causal en los cultivos.
7.2 EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS:
Microscopio con objetivos de 10x, 40x y 100x (inmersión)

Heladera 2- 8 º C
APOE- P
Fecha: agosto 2011
DE BUENOS AIRES
Página 3 de 8
HOSPITAL.:....................
Estufa de cultivo a 35- 37 ºC

Estufa de cultivo a 28 ºC
Mechero a gas o eléctrico
Gradillas para tubos
Portaobjetos
Cubreobjetos
Hojas de bisturí descartables estériles y/o sindesmótomos estériles
Cinta adhesiva transparente
Ansa bacteriológica
Gancho en L
Agujas de disección
Guantes de látex descartables
Agar Sabouraud glucosado con cloranfenicol (SAB+C)
Agar Miel Sabouraud (SAB-M) con cloranfenicol (SAB+C)
Agar lactrimel con cloranfenicol (LAC)
Agar Dermatophyte Test Medium (DTM)
Agar Sabouraud glucosado con cloranfenicol y cicloheximida (SAB+C+A)
Agar Sabouraud glucosado con cloranfenicol y aceite de oliva (SAO)
Agar Bilis de Buey (ABB)
Agar Dixon (ADX)
Agar Danker (ADK)
7.3 PREPARACIÓN Y CONSERVACIÓN DE LOS REACTIVOS Y MEDIOS:
Ver Manual operativo de Medios y Reactivos (PAMR)
7.4 MUESTRA A ANALIZAR:
Escamas de piel recolectadas en forma estéril
7.5 SECUENCIA OPERATIVA:
7.5.1 Precauciones de seguridad:
Consultar el Manual de Bioseguridad (MB)
7.5.2 Procesamiento de la muestra:

APOE- P
Fecha: agosto 2011
DE BUENOS AIRES
Página 4 de 8
HOSPITAL.:....................
A cada muestra se le asigna un número interno correlativo, siguiendo el orden

consecutivo del libro correspondiente o sistema informático propio de cada
Laboratorio. La muestra obtenida se destinará una parte para el examen directo
microscópico, otra para el cultivo y de ser posible reservar material para confirmar
-si hiciera falta- el resultado del examen directo.
a) Examen microscópico directo: para aclarar la capa córnea de la piel

es indispensable recurrir a diversas soluciones que disuelve la
queratina sin afectar la morfología de los elementos fúngicos. Las más
comunes son las de hidróxido de potasio (KOH) en concentraciones
del 10% al 40%, solo o con tinta azul negra permanente de PARKER,
KOH con dimetilsulfóxido o blanco calcoflúor para muestras poco
parasitadas. Ver (PAMR). Si se emplea KOH, suspender las escamas
en una gota del mismo con o sin tinta Parker, cubrir con un
cubreobjetos, calentar en la llama del mechero, (evitando llegar a
ebullición y formación de burbujas en el preparado), enfriar
rápidamente sobre la mesada. Si las escamas fueron obtenidas con
cinta adhesiva transparente, colocar una gota de la mezcla KOH y tinta
azul Parker para que penetre por capilaridad entre la cinta y el
portaobjetos. Para determinar la presencia de bacterias filamentosas
que parasitan la piel, se pueden realizar preparaciones teñidas. Para
ello, una vez examinada la preparación con KOH sacar el cubreobjetos
y resuspender las escamas digeridas en agua destilada, luego colocar
la suspensión en un tubo cónico y centrifugar a 2000r.p.m. durante 5
minutos, volcar el sobrenadante y tomar con una pipeta Pasteur el
precipitado para realizar un extendido sobre portaobjeto. Dejar secar y
luego fijar y teñir con Giemsa al 10%, 30 minutos o con Azul de
metileno al 1% durante 5 minutos.
b) Cultivos: La segunda parte del material, se utiliza para la realización

de los cultivos en medios sólidos. Se sugieren dos o tres medios: (SA
B+C), (LAC), (ABAL), (DTM), con y sin cicloheximida (Ver PAMR).
Cuando se sospecha pitiriasis versicolor, se debe sembrar el material
en medios ricos en lípidos (ácidos grasos de cadena larga) como el
Medio de Dixon (ADX), en su defecto Agar miel Sabouraud con el
agregado de aceite de oliva estéril (al 2%) (SAO), Medio de Danker
(ADK), Agar Sabouraud con bilis de buey (ABB).
APOE- P
Fecha: agosto 2011
DE BUENOS AIRES
Página 5 de 8
HOSPITAL.:....................
Para sembrar el material, se deben fragmentar las escamas lo más

posible, para inocularlas en la superficie del medio de cultivo con un
gancho metálico fino, esterilizado a la llama y enfriado en la superficie
del agar. Si se emplean tubos, efectuar tres toques en el medio
separados por lo menos por 1 cm de distancia entre ellos. Emplear dos
o tres tubos con los medios de cultivo elegidos.
La incubación se lleva a cabo a temperatura ambiente o en estufas
reguladas a 25º ó 28º C.
Si de acuerdo a los datos epidemiológicos del paciente se sospecha
Trichophyton verrucosum se deberá incubar a 37º C uno de los tubos
sembrados.
Cuando se siembran medios para búsqueda de Malassezia spp, se
incubarán de 32 a 35 º C durante 7 días en aerobiosis.
Examinar los cultivos una ó dos veces por semana hasta completar las
tres semanas de incubación.
7.5.3 Resultados:
a) Examen directo:
Si no hubo hallazgo se informa: “No se observan elementos micóticos” o

“Negativo”
Si hubo hallazgo se informa según el caso:

“Se observan hifas hialinas tabicadas y/o ramificadas”.
“ Se observan hifas hialinas tabicadas y/o ramificadas, características

compatibles con de dermatofitos”
“ Se observan elementos levaduriformes y/o seudohifas”
“Se observan levaduras y filamentos cortos característicos de

“Malassezia spp”
b) Cultivos:
Si durante el lapso indicado de incubación no se obtuvo desarrollo se
descartan los cultivos y se informan “No se obtuvo desarrollo de hongos” o
“Cultivo Negativo para hongos”
APOE- P
Fecha: agosto 2011
DE BUENOS AIRES
Página 6 de 8
HOSPITAL.:....................
Si hubo desarrollo se debe recurrir al POE de identificación (AMID)

correspondiente a cada caso : POE Identificación Levaduras (AMID02),
POE Identificación Dermatofitos (AMID01), POE Identificación no
Dermatofitos (AMID03), POE Identificación Levaduras Lipofílicas (AMID04)
c) Interpretación:
Examen directo Cultivo Jerarquizar

Negativo Negativo Si
Positivo Negativo Si
Negativo Positivo Sólo si se aísla dermatofito
Si hay desarrollo en los 3
puntos de siembra y compatibi-
Negativo Positivo para levaduras lidad con las características
clínicas.
d) Tiempo de entrega :
El examen directo puede entregarse dentro de 48 horas

El cultivo debe entregarse entre los 20 y 30 días.
8. FORMULARIOS Y REGISTROS:
Registro de pacientes:
General del Laboratorio (libro, informático, etc)
Libro interno de Micología
Ficha de derivación de la Red de Micología GCBA
Ficha de derivación fuera de la Red
Informes:
Protocolo resultado de Micosis Superficiales
Fotocopia de informe de Hospital emisor de resultado a través de la Red
9. DOCUMENTOS ASOCIADOS:
APOE- P
Fecha: agosto 2011
DE BUENOS AIRES
Página 7 de 8
HOSPITAL.:....................
PA ( Manual de Procedimiento Pre- analítico)

PAMR (Manual de Procedimiento : Medios de cultivo y Reactivos)
AMID (Manual de Procedimiento: Identificación Micológica )
MB (Manual de Procedimiento: Bioseguridad)
10. ANEXOS
Flujograma
Planillas
11. CRITERIOS DE RECHAZO:
Si continuó con la aplicación de pomadas, cremas o polvos sobre la piel

desde 3 días anteriores a la toma de muestra.
APOE- P
Fecha: agosto 2011
DE BUENOS AIRES
Página 8 de 8
HOSPITAL.:....................
APOE-CC
Fecha: agosto 2011
DE BUENOS AIRES
RED DE MICOLOGIA EXAMEN MICOLÓGICO
Página 1 de 7
HOSPITAL.:.................... DE CUERO CABELLUDO
1. OBJETIVOS:
Desarrollar el procedimiento a seguir para el examen directo y cultivo de

los hongos presentes en muestras de cuero cabelludo.
2. ALCANCE:
Todas las muestras de cuero cabelludo extraídas de acuerdo a las

indicaciones de toma de muestra (PATT), para confirmar o descartar el
diagnóstico clínico presuntivo de micosis.

4. REFERENCIAS:

Interamericana, 3ra edición, México, 2008
Manual de Procedimientos para Laboratorios de Micología Médica, Prof.
Dr. Ricardo Negroni, Dra. Liliana Guelfand y col. Acta Bioquímica Clínica
Latinoamericana supl. 1, editado por la Federación Bioquímica de la Prov.
de Bs. As. Argentina, 1999
5. DEFINICIONES:

Elaborado por: S.Cataldi, M.C.Perrone , L.Guelfand Aprobado por: Integrantes y Coordinador de la RM

Fecha: 8 de febrero 2008 Fecha: agosto 2011
Versión Original
Revisado: S.Cataldi,L.L.Moral,I Maldonado, L.Guelfand
Fecha: julio 2011
APOE-CC
Fecha: agosto 2011
DE BUENOS AIRES
Página 2 de 7
Etapa Analítica
01 Dermatofitos
04 Levaduras Lipofílicas


Jefe de Sector ó Sección Microbiología/ Micología, Bioquímicos a cargo del

área Micología
7. DESARROLLO:
El diagnóstico de las micosis superficiales de cuero cabelludo se basa en el

hallazgo de hifas o levaduras características del género Malassezia, en el
examen microscópico directo y el aislamiento del agente causal en los cultivos.
Microscopio con objetivos de 10x, 40x y opcional 100x (inmersión)

Heladera 2- 8º C
Estufa de cultivo a 30 a 34 ºC (para Malassezia)
Portaobjetos
Cubreobjetos
Pinza de depilar
APOE-CC
Fecha: agosto 2011
DE BUENOS AIRES
Página 3 de 7
Gancho en L
Agar Sabouraud glucosado con cloranfenicol u otro antibiótico o Agar lactrimel
con cloranfenicol
Agar Dermatophyte Test Médium o Agar Sabouraud glucosado con cloranfenicol
y cicloheximida
Agar Dixon
Agar Bilis de Buey (ABB)
Agar Danker (ADK)
Escamas de cuero cabelludo y pelos arrancados de raíz, recolectadas en forma

estéril
Precauciones de seguridad:
Procesamiento de la muestra:
Laboratorio. De la muestra obtenida se destinará una parte para el examen
directo microscópico, otra para el cultivo y de ser posible reservar material para
confirmar -si hiciera falta- el resultado del examen directo.
a) Examen directo microscópico: para aclarar la capa córnea del

cuero cabelludo, es indispensable recurrir a diversas soluciones
que disuelve la queratina sin afectar la morfología de los elementos
fúngicos. Las más comunes son las de hidróxido de potasio (KOH)
APOE-CC
Fecha: agosto 2011
DE BUENOS AIRES
Página 4 de 7
en concentraciones del 10% al 40%, solo o con tinta azul negra
permanente de PARKER, KOH con dimetilsulfóxido o blanco de
calcoflúor para muestras poco parasitadas. Ver (PRMR). Si se
emplea KOH, suspender las escamas en una gota del mismo con o
sin tinta Parker, cubrir con un cubreobjeto, calentar en la llama del
mechero, (evitando llegar a ebullición y formación de burbujas de
aire en el preparado), enfriar rápidamente sobre la mesada.
b) Cultivos: La segunda parte del material, se utiliza para la

realización de los cultivos en medios sólidos. Se sugieren dos o tres
medios: Sabouraud – miel, Lactrimel, Dermatofitos medios: con y
sin cicloheximida (Ver PAMR).
Cuando se sospecha dermatitis seborreica, se debe sembrar el
material en medios ricos en lípidos (ácidos grasos de cadena larga)
como el Medio de Dixon, o en su defecto agar miel Sabouraud con
el agregado de aceite de oliva estéril (al 2%) (SAO), Medio de
Danker (ADK), medio de Dixon (ADX) ó agar Sabouraud con bilis
de buey (ABB).
Para sembrar el material, se deben fragmentar las escamas lo más
posible, para inocularlas a la superficie del medio de cultivo con un
gancho metálico fino, esterilizado a la llama y enfriado en la
superficie del agar. Si se emplean tubos, efectuar tres toques en el
medio separados por lo menos por 1 cm de distancia entre ellos.
Emplear dos o tres tubos con los medios de cultivo elegidos. La
incubación se lleva a cabo a temperatura ambiente o en estufas
reguladas a 25º ó 28º C.
Trichophyton verrucosum se deberá incubar a 37 º C uno de los
tubos sembrados.
incubarán de 32 a 35 º C durante 7 días en aerobiosis.
Examinar los cultivos una ó dos veces por semana hasta completar
las 3 semanas de incubación.
RESULTADOS:
a) Examen directo:
Si no hubo hallazgo se informa:
• “ No se observan elementos micóticos”

APOE-CC
Fecha: agosto 2011
DE BUENOS AIRES
Página 5 de 7
“Se observan hifas hialinas tabicadas y/o ramificadas.

“Se observan hifas hialinas tabicadas y/o ramificadas, características
de dermatofitos”
“Se observan levaduras compatibles con “ Malassezia spp”
"Se observa pelo endothrix" (cadenas de artrosporos dentro del tallo
piloso)
"Se observa pelo ectothrix" (vaina de esporas en mosaico o cadenas de
artrosporos por fuera del tallo del pelo)
"Se observa pelo endo-ectothrix" (cadenas de artrosporos dentro y fuera
del tallo piloso)
“Se observa pelo fávico” (hifas y burbujas de aire dentro del tallo del
pelo)
b) Cultivo:
descartan los cultivos y se informan “No se obtuvo desarrollo de
hongos” o “Cultivo negativo para hongos”
correspondiente a cada caso:
POE Identificación Dermatofitos (AMID01), POE Identificación
filamentosos (AMID04), POE Identificación Levaduras Lipofílicas
(AMID03)
c) Interpretación:

El examen directo puede entregarse dentro de 48 horas o junto con el

cultivo
APOE-CC
Fecha: agosto 2011
DE BUENOS AIRES
Página 6 de 7
General del Laboratorio (libro, informático, etc.)
Informes:
PA ( Manual de Procedimiento Pre- analítico)

10. ANEXOS
Flujograma
Planillas
Cuando el paciente no suspendió la medicación antifúngica sistémica (de

10 a 15 días) o local (de 3 a 5 días) los días anteriores a la toma de
muestra.
Si continuó con la aplicación de pomadas, cremas o polvos sobre el cuero
cabelludo durante los 3 días anteriores a la toma de muestra.
APOE-CC
Fecha: agosto 2011
DE BUENOS AIRES
Página 7 de 7
APOE- UN
Fecha: julio 2011
DE BUENOS AIRES
RED DE MICOLOGIA EXAMEN MICOLÓGICO DE UÑAS
Página 1 de 8
HOSPITAL.:....................
1. OBJETIVOS:
Desarrollar el procedimiento a seguir para el examen directo y cultivo de los

hongos presentes en muestras superficiales de uñas.
2. ALCANCE:
Todas las muestras de uñas extraídas de acuerdo a las indicaciones de

toma de muestra (PATT), para confirmar o descartar el diagnóstico clínico
presuntivo.

4. REFERENCIAS:

Interamericana, 3 a edición, México, 2008
De Bs. As. Argentina, 1999
5. DEFINICIONES:

Elaborado por: S.Cataldi, M.C Perrone, L.Guelfand Aprobado por: Integrantes y Coordinador de la RM
Fecha: 6 de marzo 2008 Fecha: julio de 2011
Versión Original
Revisado: ,L.L.Moral, I.Maldonado
Fecha: julio 2011
APOE- UN
Fecha: julio 2011
DE BUENOS AIRES
Página 2 de 8
HOSPITAL.:....................
Etapa Analítica
01. Dermatofitos
02. Levaduras
03. Hongos Filamentosos
APOE: Manual de procedimientos operativos Estándar


MA: Manual Administrativo
ANEXOS
PLANILLAS
Jefe de Sección Microbiología, Bioquímico a cargo del área Micología
7. DESARROLLO:
El diagnóstico de las micosis superficiales de uñas se basa en el hallazgo de hifas

o levaduras características, en el examen microscópico directo y el aislamiento del
agente causal en los cultivos.

Heladera 2- 8º C
Estufa de cultivo a 35- 37ºC
Estufa de cultivo a 28ºC
APOE- UN
Fecha: julio 2011
DE BUENOS AIRES
Página 3 de 8
HOSPITAL.:....................
Portaobjetos de vidrio
Cubreobjetos de vidrio
Hojas de Bisturí descartables estériles o sindesmótomo estéril
Gancho en L
Aguja de disección
Agar Sabouraud glucosado con cloranfenicol
Agar lactrimel con cloranfenicol
Agar Dermatophyte Test Medium
Agar Sabouraud glucosado con cloranfenicol y actidiona
Agar Miel Sabouraud
Escamas de uñas recolectadas en forma estéril.
PRECAUCIONES DE SEGURIDAD:
PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA:

Laboratorio. La muestra obtenida se destinará una parte para el examen directo
microscópico, otra para el cultivo y de ser posible reservar material para confirmar
si hiciera falta el examen directo.
APOE- UN
Fecha: julio 2011
DE BUENOS AIRES
Página 4 de 8
HOSPITAL.:....................
a) Examen directo microscópico: para aclarar la estructura córnea

de la uña es indispensable recurrir a diversas soluciones que
disuelve la queratina sin afectar la morfología de los elementos
fúngicos. Las más comunes son las de hidróxido de potasio (KOH)
en concentraciones del 10% al 40%, con tinta azul negra
permanente de PARKER, KOH con dimetilsulfóxido o blanco
calcoflúor para muestras poco parasitadas . Ver (PAMR). Si se
emplea KOH, suspender las escamas en una gota del mismo con o
sin tinta Parker, cubrir con un cubreobjeto, calentar en la llama del
mechero, (evitando llegar a ebullición y formación de burbujas de
aire en el preparado) enfriando rápidamente sobre la mesada.
b) Cultivos: La segunda parte del material, se utiliza para la
realización de los cultivos en medios sólidos. Se sugieren dos o tres
medios: Sabouraud- miel, lactrimel, Agar banana- avena,
Dermatofitos medio con y sin actidiona (Ver PAMR). Para sembrar el
material, se deben fragmentar las escamas lo más posible, para
inocularlas a la superficie del medio de cultivo con un gancho
metálico fino, esterilizado a la llama y enfriado en la superficie del
agar. Si se emplean tubos, efectuar tres toques en el medio
separados por lo menos por 1 cm de distancia entre ellos. Emplear
dos o tres tubos con los medios de cultivo elegidos. La incubación
se lleva a cabo a temperatura ambiente o en estufas reguladas a 25º
ó 28º C.
Trichophyton verrucosum se deberá incubar a 37º C uno de los
tubos sembrados.
Examinar los cultivos una ó dos veces por semana hasta completar
las tres semanas de incubación.
RESULTADOS:
a) Examen directo: Es conveniente entregar este resultado dentro de las 48

horas.
• “ No se observan elementos micóticos”

APOE- UN
Fecha: julio 2011
DE BUENOS AIRES
Página 5 de 8
HOSPITAL.:....................
“Se observan hifas hialinas tabicadas y/o ramificadas.

“ Se observan hifas hialinas tabicadas y/o ramificadas, características
de dermatofitos”
“ Se observan elementos levaduriformes”
b) Cultivo:
• Si durante el lapso indicado de incubación no se obtuvo desarrollo se

descartan los cultivos y se informan : “No se obtuvo desarrollo de
hongos” o “Cultivo negativo para hongos”
• Si hubo desarrollo se debe recurrir al POE de identificación (AMID)

correspondiente a cada caso :
POE Identificación Levaduras (AMID02), POE Identificación Dermatofitos

(AMID01), POE Identificación no Dermatofitos (AMID03).
• Si hubo desarrollo de un hongo micelial no dermatofito se debe pedir:

“Nueva muestra para confirmar el diagnostico”. En la segunda muestra
se propone informar junto al genero (y especie) del hongo aislado:
“Hongo infrecuente como agente etiológico de onicomicosis, pero se

jerarquiza el resultado por haberse aislado en dos muestras consecutivas
con directos positivos”.
Interpretación:

Positivo Positivo Sí
Si es una muestra de uñas de
Negativo Positivo para mano, si hay desarrollo en los
APOE- UN
Fecha: julio 2011
DE BUENOS AIRES
Página 6 de 8
HOSPITAL.:....................
levaduras 3 puntos de siembra de todos

los tubos sembrados y si es
compatible con las
características clínicas.
c) Tiempo de entrega :
El examen directo puede entregarse dentro de 48 horas o junto con el

cultivo
Libro interno de Micología o sistema informatico
Ficha de derivación fuera de la Red (ej: Inst. C.Malbran)
Informes:

AMID (Manual de Procedimiento: Identificación Micológica)
10. ANEXOS
Flujogramas
Planillas

APOE- UN
Fecha: julio 2011
DE BUENOS AIRES
Página 7 de 8
HOSPITAL.:....................
Si continuó con la aplicación de pomadas, cremas o polvos sobre la piel

desde 3 días anteriores a la toma de muestra.
Si se trata de uñas de pies y el paciente concurrió sin medias y con calzado
abierto.
Si el paciente no efectuó la preparación previa. Ver (PATT).
APOE- UN
Fecha: julio 2011
DE BUENOS AIRES
Página 8 de 8
HOSPITAL.:....................
APOE- RE
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS Fecha: abril 2011
Versión: 2
DE BUENOS AIRES EXÁMEN MICOLÓGICO DE
RED DE MICOLOGIA Página 1 de 9
MATERIALES RESPIRATORIOS
HOSPITAL.:....................
1. OBJETIVOS:

los hongos presentes en muestras respiratorias
2. ALCANCE:
Todas las muestras respiratorias como material de estudio para el

diagnóstico de las micosis broncopulmonares.

4. REFERENCIAS:

Interamericana, 3a edición, México, 2008

Latinoamericana supl. 1, editado por la Federación Bioquímica de la
Pcia. De Bs. As. Argentina, 1999
Guía práctica de Identificación y Diagnóstico en Micología Clínica. Javier

Pemán, Estrella Martín-Mazuelos, María del Carmen Calvo. Revista
Iberoamericana de Micología. 1a edición. Bilbao, España. 2001
5. DEFINICIONES:

Elaborado por: M.Carmen Perrone,S.Cataldi, L.Guelfand Aprobado por: Integrantes y Coordinador de la RM

Fecha: 6 de marzo 2008 Fecha: abril 2011
Versión Original
Revisado por: L.López Moral, L.Guelfand
Fecha: enero 2011
APOE- RE
Versión: 2
HOSPITAL.:....................
Etapa Analítica

Bioquímico a cargo a cargo del área Micología.
7. DESARROLLO:
El diagnóstico de las micosis del aparato respiratorio se basa en el hallazgo de

hifas o levaduras características, en el examen microscópico directo y el
aislamiento del agente causal en los cultivos.
Microscopio con objetivos de 10x, 40x, 100x (inmersión)

Heladera 2- 8 ºC
Estufa de cultivo a 35 - 37 ºC
Portaobjetos
Cubreobjetos
Hojas de bisturí descartables estériles o sindesmótomos estériles
Gancho en L
APOE- RE
Versión: 2
HOSPITAL.:....................
Agar Sabouraud glucosado con cloranfenicol (SAB+C) (Obligatorio) o Agar Miel

Sabouraud (SAB-M)
Agar Sabouraud glucosado con cloranfenicol y actidiona (SAB+C+A)
Agar BHI con ó sin 5% sangre ovina, con cloranfenicol
Agar sangre
Otros medios: Agar girasol, Agar glicerinado, Agar tabaco, Agar opacidad, etc.
N-acetil cisteína
7.4 MUESTRA A ANALIZAR
Muestras obtenidas por expectoración espontánea o por procedimientos

invasores según instrucciones del manual (PATT)
7.5 SECUENCIA OPERATIVA

Utilizar guantes o manoplas descartables para el procesamiento de
la muestra.

Laboratorio. La muestra remitida se destinará una parte para el examen directo
microscópico, otra para el cultivo
A. ESPUTO –ASPIRADO TRAQUEAL

a) Examen microscópico: Volcar el esputo en una placa de Petri
estéril, examinar macroscópicamente, seleccionar una parte
purulenta y separarla con un ansa estéril o con agujas de
disección. Colocar una gota del material así obtenido entre porta
y cubreobjeto para realizar el examen microscópico al estado
fresco. Con la porción restante efectuar extendidos para
coloración de Giemsa, Gram-Weigert, Ziehl Neelsen, Grocott,
Azul de Toluidina-O. El examen en fresco se realiza inicialmente
APOE- RE
Versión: 2
HOSPITAL.:....................
con 100x a fin de recorrer rápidamente varios campos y

reconocer si la muestra es representativa, para ello la muestra de
esputo apropiada debe tener > de 25 leucocitos
(polimorfonucleares neutrófilos) y < 25 células epiteliales
escamosas por campo de 100x dependiendo del agente causal.
Sin embargo en los pacientes inmunosuprimidos (neutropenicos,
VIH +, trasplantados, con tratamientos prolongados con
corticoides) aún las muestras poco representativas deben ser
sometidas a estudios mediante tinciones, en busca de hongos.
Completar el estudio mediante la observación con 400x. de la
muestra. Este paso permite la visualización de hongos de
dimensiones medianas o grandes, con pared celular gruesa y
refringente tales como: seudohifas y blastoconidias de Candida,
hifas ramificadas y tabicadas de Aspergillus, Pseudallescheria,
etc, filamentos ramificados no septados de zigomicetos,
elementos de las formas parasitarias de Paracoccidioides
brasiliensis, Histoplasma capsulatum var duboisii, Blastomyces
dermatitidis, Coccidioides immitis y acúmulos de Pneumocystis
jirovec i, (estos últimos se ven mejor en el BAL). Los extendidos
teñidos deben examinarse con óptica de inmersión a 1000x.
La coloración de Giemsa es útil para observar elementos
levaduriformes de Histoplasma capsulatum, la fase parasitaria de
Penicillium marneffei, las formas tróficas de Pneumocystis jiroveci
y es también la mejor tinción para reconocer las células de la
muestra. De estas últimas tienen particular interés los eosinófilos
en la aspergilosis broncopulmonar alérgica y los macrófagos en la
histoplasmosis y penicilosis. Una variante de la observación al
estado fresco es la preparación con tinta china, ver (PAMR) útil
para ver las levaduras capsuladas de Cryptococcus neoformans ó
C. gatti. Para la búsqueda de P. jiroveci, el material ideal es el
BAL, pero cuando éste no puede realizarse, como segunda
opción puede recurrirse al esputo inducido mediante
nebulizaciones tibias con solución salina isotónica. Este
microorganismo puede observarse en fresco a 400x, pero debe
confirmarse con extendidos teñidos por las técnicas descriptas
en el manual de medios y reactivos (PAMR) Las muestras muy
viscosa oueden fluidificarse antes de la siembra empleando algún
agente mucolitico (N-acetil cisteína), dejándola actuar a
temperatura ambiente hasta que se consigue la fluidificación..
b) Cultivo: Una vez finalizado el examen microscópico se puede
agregar al esputo 10 ml de una solución de antibióticos
antibacterianos, conteniendo 100 ug/ml de cloranfenicol-
estreptomicina y dejar en la heladera a 4ºC durante 24 hs.
centrifugar antes de sembrar. La otra opción es realizar
APOE- RE
Versión: 2
HOSPITAL.:....................
directamente la siembra del material en tubos de ensayo con

medio de SAB glucosado o miel y agar BHI. Se emplean 6 tubos
por muestra, la mitad se incuba a 28ºC y los restantes a 37ºC.
Los medios de cultivo deben contener cloranfenicol-
estreptomicina en la concentración final de 100 ug/ml, en general
no se usa la cicloheximida porque puede impedir el desarrollo de
Aspergillus, Cryptococcus, Penicillium, etc.
B. : Lavado broncoalveolar (BAL), MiniBAL y Lavado bronquial (LB)

a) Examen microscópico: El BAL es un material de gran utilidad
para el estudio de las micosis broncopulmonares. Se obtiene por
fibrobroncoscopía y reduce al mínimo la presencia de elementos
contaminantes de la boca y vías aérea superiores. Si la muestra
fue adecuadamente obtenida exhibe, un neto predominio de
macrófagos alveolares ó células inflamatorias, prácticamente no
se observan células bronquiales o epiteliales planas de la boca. El
BAL se considera significativo cuando el recuento de células
epiteliales planas es < 1 %. Si la muestra no va a ser examinada
inmediatamente, se la refrigera a 4ºC. Centrifugar toda la
muestra, separar el sobrenadante y con el sedimento llevar a
cabo los mismos pasos propuestos para el examen de esputo. El
sobrenadante podrá ser utilizado para la detección de ciertos
antígenos de hongos patógenos como. Aspergillus fumigatus, y
Cryptococcus neoformans por aglutinación de partículas de látex
o por técnicas de ELISA.
El valor diagnóstico del hallazgo de las diferentes especies
fúngicas que colonizan o parasitan el aparato respiratorio es muy
distinto. La presencia de ciertas especies, aunque sólo sea en
cultivos, tiene importancia cuando se trata de patógenos primarios
como: P. brasiliensis, H. capsulatum, C. immitis, B, dermatitidis y
P. marneffei . Otras especies sólo tienen valor cuando se los
encuentra en el examen microscópico directo y se los cultiva en
forma reiterada de diferentes muestras, como son las especies
del género Aspergillus, Fusarium spp, Pseudallescheria boydii y
Nocardia asteroides. Finalmente algunos hongos sólo pueden ser
considerados responsables de la patología respiratoria cuando
son observados como invasores de los tejidos en los estudios
histopatológicos de biopsia, piezas quirúrgicas, en pacientes
inmunosuprimidos; en este caso se encuentran C. albicans y
otras especies del género.
APOE- RE
Versión: 2
HOSPITAL.:....................
7.5.3 Resultados:
a) Examen microscópico:
Directo: Es conveniente entregar un resultado de los elementos

observados lo más rápido posible como informe preliminar.
Si no hubo hallazgo se informa: “No se observan elementos

micóticos”

¾ Se observan células levaduriformes con blastoconidias y
/ o seudomicelios
¾ Se observan células levaduriformes esféricas de
brotación múltiple o en rueda de timón
¾ Se observan células esféricas de brotación simple
(unigemantes) de cuello ancho
¾ Se observan cuerpos esféricos con endosporos ó
esférulas
¾ Se observan hifas hialinas tabicadas y/o ramificadas
¾ Se observan hifas cenocíticas
¾ Se observan elementos compatibles con P. jiroveci.
Tinta china:
Si no hubo hallazgo se informa: “Negativa”
Si hubo hallazgo se informa: “Se observan levaduras capsuladas”
Coloración de Giemsa:

/ o seudomicelios.
brotación múltiple o en rueda de timón.
(unigemantes) de cuello ancho.
APOE- RE
Versión: 2
HOSPITAL.:....................

esférulas.
¾ Se observan hifas hialinas tabicadas y/o ramificadas.
¾ Se observan hifas cenocíticas.
¾ Se observan levaduras en casquete intracelulares.
¾ Se observan elementos compatibles con P. jiroveci
Coloración de Gram-Weigert:
Si hubo hallazgo se informa: “Elementos compatibles con

P. jiroveci”
Coloración de Azul de Toluidina-O:

P. jiroveci”
Coloración de Grocott

P. jiroveci”
/ o seudomicelios.
brotación múltiple o en rueda de timón.
(unigemantes) de cuello ancho.
esférulas.
¾ Se observan hifas hialinas tabicadas y/o ramificadas.
¾ Se observan hifas cenocíticas.
b) Cultivo:
APOE- RE
Versión: 2
HOSPITAL.:....................
¾ Si no hubo desarrollo durante el lapso indicado de incubación

se descartan los cultivos y se informa: “No se obtuvo
desarrollo de hongos”
¾ Si hubo desarrollo recurrir al manual de identificación (AMID)

según el caso e informar: “Género y especie”
7.5.4 Interpretación:
El hallazgo de un hongo tiene valor diagnóstico por si solo si se

trata de un patógeno primario
El hallazgo de un hongo saprófito ó comensal, tiene valor
diagnóstico cuando se conjuga con los datos clínicos y
epidemiológicos del paciente.
Tiempo de entrega:
De 1 a 4 semanas
General de laboratorio ( libro, informático, etc)

Ficha de examen micológico
Informes:
Protocolo de examen micológico
Fotocopia de informe de Hospital emisor de resultado cuando es

procesado a través de la Red de Micología GCBA
PATT: Manual de toma y transporte de muestra

PAMR: Manual de medios y reactivos
AMID: Manual de identificación
APOE- RE
Versión: 2
HOSPITAL.:....................
MB: Manual de bioseguridad

MC: Manual de calidad
MA: Manual administrativo
10. ANEXOS:
Flujogramas
Planillas
Si la muestra no cumple con las condiciones de toma,

conservación y transporte de muestra ver (PATT)
POE-OR
Fecha: julio 2011
DE BUENOS AIRES
RED DE MICOLOGIA EXAMEN MICOLÓGICO DE
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HOSPITAL.:.................... ORINA
1. OBJETIVOS:

los hongos presentes en muestras de orina
2. ALCANCE:
Todas las muestras de orina extraídas de acuerdo a las indicaciones de

toma de muestra (PATT), para confirmar o descartar el diagnóstico
clínico presuntivo.

4. REFERENCIAS:
Candida Urinary Tract Infections- Epidemiology, Patogenesis, Diagnosis,

and Treatment: Executive Summary. Fisher J. Clinical Infections
Diseases 2011; 52 (Suppl 6) S 429-S432.
Diagnosis, prevention and treatment of catheter-associated urinary tract

infection in adults. 2009 International Clinical Practice Guideline from the
Infectious Diseases Society America. Urinary Catheter Guidelines.
Hooton et al. CID 2010:50 (1 March)
• Cumitech 2C: Laboratory Diagnosis of Urinary Tract . Infections.Yvette S.

McCarter, Eileen M. Burd , Gerri S. Hall , Marcus Zervos , Susan E.
Sharp. March 2009.
• INFORME TÉCNICO.Consenso Argentino Intersociedades para el

Manejo de la Infección del Tracto Urinario – Parte III. (Sociedades
participantes: Soc. Argentina de Infectología (SADI), Soc. Argentina de
Urología (SAU), Soc. Argentina de Medicina (SAM), Soc. Argentina de
Bacteriología Clínica (SADEBAC), Soc. de Ginecología y Obstetricia de
Elaborado por: M.C. Perrone.,S.Cataldi, L.Guelfand Aprobado por: Integrantes y Coordinador de la RM

Fecha: 6 de marzo 2008 Fecha: julio 2011
Revisado por Ivana Maldonado, L. Guelfand
Fecha: junio 2011
POE-OR
Fecha: julio 2011
DE BUENOS AIRES
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HOSPITAL.:.................... ORINA
Buenos Aires (SOGIBA). Rev Panam Infectol 2008; 10(1):48-57.

Pcia. De Bs. As. Argentina, 1999.
5. DEFINICIONES:

Etapa Analítica
APOE: Manual de procedimientos operativos
Estándar
Jefe de Sección Microbiología, Bioquímico a cargo del área Micología
7. DESARROLLO:

POE-OR
Fecha: julio 2011
DE BUENOS AIRES
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HOSPITAL.:.................... ORINA
La confirmación microbiológica del diagnóstico de infección urinaria por
agentes micóticos cuando se observan en el sedimento de la muestra y / o se
aísla el agente causal en los cultivos.
Microscopio con objetivos de 10x, 40x y opcional 100x ( inmersión )

Heladera 2- 8º C
Ansa bacteriológica de 5 ul (factor de dilución 1/200) o de 10 ul
Agar CLDE
Agar cromogénico para levaduras
Agar semilla de girasol ó Agar tabaco
Tinta China
Coloración de Giemsa
Muestras de orina recolectadas en forma estéril (PATT)

Utilizar guantes o manoplas descartables para la toma de muestra y
procesamiento.

POE-OR
Fecha: julio 2011
DE BUENOS AIRES
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HOSPITAL.:.................... ORINA
consecutivo del libro correspondiente ó sistema informático propio de cada
Laboratorio.
a) Examen microscópico: Se centrifugan 10 ml de orina a baja

velocidad (2000 r.p.m.) durante 10 minutos. El sedimento es
examinado el estado fresco, entre porta y cubreobjetos, sin
ningún agregado ó con una gota de tinta china diluida cuando
se sospecha una criptococosis. La observación se lleva a cabo
con óptica seca de 400X. El examen microscópico del
sedimento permite observar seudohifas y blastoconidias de las
especies de Candida, así como también elementos
levaduriformes capsulados de Cryptococcus en las
preparaciones con tinta china. Paracoccidioides brasilensis se
visualiza en las preparaciones al estado fresco al igual que el
Blastomyces dermatitidis Si por datos epidemiológicos la
sospecha es Histoplasma capsulatum se debe realizar un
extendido teñido con la coloración de Giemsa.
b) Cultivos: Para realizar el urocultivo se utiliza un ansa calibrada

de 5 µl (factor de dilución 1/200 ) o un ansa de 10 µl (factor de
dilución 1/100). Se siembra la orina (sin centrifugar) en una
placa de Petri con agar CLDE. En pacientes sondados y en
muestras de punción suprapúbica se siembra además 100 µl
de orina en CLDE y Agar sangre. Si en directo se observaron
levaduras, sembrar tambien en Sabouraud glucosado y/o agar
cromogénico. La incubación se efectúa de 35 a 37ºC durante
48hs. Cada colonia crecida equivale a 200 UFC/ml. cuando
usamos ansa de 5 µl y equivale a 100 UFC/ml cuando se utiliza
un ansa de 10 µl. Si en el examen directo se observan agentes
micóticos diferentes a levaduras, se puede sembrar el
sedimento urinario en Sabouraud glucosado y agar BHI a 2
temperaturas (28 y 35-37 ºC. Con el objeto de acelerar la
identificación de C. neoformans, la muestra de orina puede ser
sembrada directamente en medios que detecten la presencia de
fenoloxidasa ver (PRMR), e incubados por 7 días.
c) Reacciones imnumológicas: El sobrenadante de la orina

puede ser utilizado para la búsqueda de antígenos fúngicos,
especialmente polisacárido capsular de C. neoformans, por la
técnica de aglutinación de partículas de látex sensibilizadas con
gamma-globulina de conejo anti-C. neoformans. También
pueden buscarse otros antígenos, como las glucoproteínas de
Aspergillus spp .
POE-OR
Fecha: julio 2011
DE BUENOS AIRES
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HOSPITAL.:.................... ORINA
7.5.3 Resultados:

“ No se observan elementos micóticos” o “Negativo para
hongos”

“ Se observan levaduras y/o seudomicelios”
“ Se observan levaduras capsuladas”
“Se observan elementos levaduriformes esféricos de
brotación múltiple, anisométrica o en rueda de timón”
“Se observan elementos levaduriformes con artrosporas o
blastoartrosporas.
“ Se observan hifas hialinas tabicadas y/o ramificadas”
“ Se observan hifas cenocíticas”
“ Se observan cuerpos esféricos con endosporas ó
esférulas”
NOTA: Sólo en el caso de sospecha epidemiológica de histoplasmosis se

informa lo observado en la coloración de Giemsa
Si no hubo hallazgo: “ No se observan elementos micóticos” o
“Negativo”
Si hubo hallazgo: “Se observan levaduras intracelulares en
casquete”
b) Cultivo:
Si no hubo desarrollo durante el lapso indicado de incubación se

descartan los cultivos y se informa “Sin desarrollo” ó “Negativo”
Monoespecie:
Si hubo desarrollo recurrir al manual de identificación (AMID) e

informar: “género y especie”
Recuento de colonias: se informa en el caso de candidurias
Se expresa en UFC/ml
Cuando se siembran 5ul, cada colonia crecida equivale a 200 UFC/ml.

Cuando se siembran 10ul, cada colonia crecida equivale a 100 UFC/ml.
Cuando se siembran 100 ul, cada colonia crecida equivale a 10UFC/ml
POE-OR
Fecha: julio 2011
DE BUENOS AIRES
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HOSPITAL.:.................... ORINA
A diferencia de lo que sucede en las bacteriurias, no hay consenso sobre la
utilidad de los cultivos cuantitativos cuando el agente patógeno es un
hongo, algunos autores sugieren que el recuento de 1.000 a 10.000 UFC/ml es
significativo para las candidurias y cuando se trata de pacientes sondados se
habla de un recuento de 100 UFC/ml.
Polimicrobiano:
Solicitar nueva muestra según manual de toma y transporte de

muestra (PATT), en el caso de pacientes sondados, con reciente
recambio de sonda o por punción suprapúbica.
7.5.4 Interpretación:
Es importante la repetición del urocultivo para confirmar el diagnóstico

de candiduria en particular en aquellos pacientes con sonda vesical o
en muestras obtenidas por catéter.
En el caso de muestras provenientes de punción suprapúbica se
jerarquiza el desarrollo de cualquier hongo, sin tener en cuenta el
recuento de colonias y NO se solicita una segunda muestra.
En el caso de muestras de neonatología, se jerarquiza el desarrollo de
cualquier hongo, sin tener en cuenta el recuento de colonias y NO se
solicita una segunda muestra.
En los cultivos polimicrobianos (más de una especie) se jerarquiza el
resultado si se obtienen las mismas especies en más de una muestra.
El hallazgo de un hongo tiene valor diagnóstico por si solo si se trata de
un patógeno primario.
El hallazgo de un hongo saprofito ó comensal tiene valor diagnóstico
cuando se conjuga con los datos clínicos y epidemiológicos del
paciente.
Tiempo de entrega:
Entre 3 a 5 días hábiles en el caso de levaduras y hasta 30 días

cuando se trata de patógenos de lento crecimiento.
General de laboratorio ( libro, informático, etc.)

Libro interno de Micología o sistema informático
Ficha de examen micológico
POE-OR
Fecha: julio 2011
DE BUENOS AIRES
Página 7 de 8
HOSPITAL.:.................... ORINA
Informes:
Protocolo examen Micológico

Fotocopia de informe de Hospital emisor de resultado cuando es
procesado a través de la Red de Micología
PATT: Manual de toma y transporte de muestra

PAMR: Manual de medios y reactivos
AMID: Manual de identificación
MB: Manual de bioseguridad
MC: Manual de calidad
10. ANEXOS:
Flujograma
Planillas
Si el paciente no cumple con las condiciones de toma, conservación y

transporte de muestra según (PATT)
Si el paciente tiene medicación antifúngica sistémica previa a la toma de
la muestra.
POE-OR
Fecha: julio 2011
DE BUENOS AIRES
Página 8 de 8
HOSPITAL.:.................... ORINA
ANEXO 1: FLUJOGRAMA ORINAS
MUESTRA DE ORINA
Chorro medio Sonda (OSV)
(OCM) Al acecho Punción suprapúbica Nefrosomía
EXAMEN CULTIVO
MICROSCÓPICO del (OCM :siembra 5 µl/10 µl CLDE)
sedimento (OSV, PSP:siembra 100µl CLDE – AS)
agregar Sab. o agar

cromogénico
Se observan crece?
Si
hongos?
“Se observan Si No
levaduras y/o
No seudomicelios”
“Sin desarrollo”
“No se observan ó “Negativo”
elementos micóticos” Poli Mono
microbiano microbiano
Nueva muestra
por mezcla
polimicrobiana
Recuento de colonias
Desarrollo de levaduras (ID Pres)
Se solicita 2° muestra para confirmar Candida albicans
el hallazgo (menos PSP) Levadura no Calbicans
2° muestra Positiva
(con la misma identificación presuntiva)
1.000 a 10.000 UFC/ml (OCM)
100 UFC/ml (OSV)
Identificación: Género y especie

APOE-MUC
Fecha: agosto 2011
DE BUENOS AIRES
RED DE MICOLOGIA EXAMEN MICOLOGICO
DE MUCOSAS Y SEMIMUCOSAS Página 1 de 6
HOSPITAL.:....................
1. OBJETIVOS:
• Desarrollar el procedimiento a seguir para el examen directo y cultivo de los

hongos presentes en muestras superficiales tanto de mucosas bucofaríngea y
vaginal, como de semimucosas de labios, vulva y glande.
2. ALCANCE:
• Todas las muestras de mucosas y semimucosas extraídas de acuerdo a las

indicaciones de toma de muestra (PATT), para confirmar o descartar el
diagnóstico clínico presuntivo.
• Bioquímicos y técnicos del sector Microbiología, área Micología,

4. REFERENCIAS:

Interamericana, 3ra edición, México, 2008

de Bs. As. Argentina, 1999
5. DEFINICIONES: Etapa Pre- Analítica
MR: Manual de Medios y Reactivos

Elaborado por: S.Cataldi, M.C.Perrone, L.Guelfand Aprobado por: Integrantes y Coordinador de la RM
Fecha: 8 de enero 2008 Fecha: agosto de 2011
Versión Original
Revisado por: : I.Maldonado, L.López Moral
Fecha: agosto 2011
APOE-MUC
Fecha: agosto 2011
DE BUENOS AIRES
HOSPITAL.:....................
Etapa Analítica
01. Levaduras

Jefe de Sector ó Sección Microbiología / Micología, Bioquímico/s a cargo

del área Micología
7. DESARROLLO:
El diagnóstico de las micosis superficiales de mucosas y semimucosas se basa en

el hallazgo de seudohifas o levaduras, en el examen microscópico directo y el
aislamiento del agente causal en los cultivos.

Heladera 2-8 º C
Estufa de cultivo a 35-37 º C
Estufa de cultivo a 28 º C
Portaobjetos
APOE-MUC
Fecha: agosto 2011
DE BUENOS AIRES
HOSPITAL.:....................
Cubreobjetos
Gancho en L
Agar lactrimel con cloranfenicol
Agar Miel Sabouraud
Agar cromogénico
Hisopados y frotis obtenidos en forma estéril, a partir de lesiones o secreciones de

mucosas o semimucosas. Ver PATT.
PRECAUCIONES DE SEGURIDAD:
• Consultar el Manual de Bioseguridad (MB)
PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA:

Laboratorio.
La muestra recolectada en el hisopo humedecido en SF o en medio de Stuart, se
destina al cultivo, y la depositada en portaobjetos para el examen microscópico
a) Examen directo microscópico:
• Observar la muestra en fresco entre porta y cubreobjetos con objetivo de
APOE-MUC
Fecha: agosto 2011
DE BUENOS AIRES
HOSPITAL.:....................
10x y 40x
• Luego, dejar secar, fijar y teñir con Giemsa al 10%, 30 minutos o con Azul
de metileno al 1% durante 30 minutos y si es necesario, realizar coloración
de Gram.
b) Cultivos:
• Sembrar el hisopo en agar Sabouraud (SDA) y/o en agar cromogénico.
• Incubar a 35º - 37º C durante 10 días.
• Examinar los cultivos una ó dos veces por semana hasta completar el
período de incubación.
• Luego del cultivo primario es recomendable la siembra en un medio
cromogénico (si no se hizo como siembra primaria).El medio cromogénico
permite reconocer si en la muestra hay una o más especies.Con la
colonia/s aisladas se puede iniciar la identificación presuntiva
RESULTADOS:
a) Examen directo: Es conveniente entregar este resultado dentro de las 24

horas.

“No se observan elementos micóticos”
Si hubo hallazgo se informa:

“Se observan elementos levaduriformes y/o seudohifas”
Debe consignarse además, la presencia de leucocitos o piocitos, células,

bacterias y parásitos.
b) Cultivo:
• Si durante el lapso indicado de incubación no se obtuvo desarrollo se

descartan los cultivos y se informan “ Negativo”
correspondiente: POE Identificación Levaduras (AMID01)
APOE-MUC
Fecha: agosto 2011
DE BUENOS AIRES
HOSPITAL.:....................
c) Interpretación:

Sólo si hay desarrollo masivo y
Positivo para en concordancia con las
Negativo
levaduras características clínicas.
1 El examen directo puede entregarse dentro de 24 horas o junto con el

cultivo
2 El cultivo debe entregarse cumplidos los 10 días.
General del Laboratorio (libro, sistema informático, etc.)
Informes:
Protocolo examen Micológico
.
PAMR: etapa Pre-analítica- Manual de Medios y Reactivos
PATT: etapa Pre-analítica- Manual de Toma y Transporte de muestras
AMID: etapa Analítica -Manual de Identificación.
APOE: etapa Analítica -Manual de Procedimientos Operativos Estándar
PPFI: etapa Post-Analítica -Formularios e Informes
APOE-MUC
Fecha: agosto 2011
DE BUENOS AIRES
HOSPITAL.:....................

10. ANEXOS
Planillas
Cuando el paciente no suspendió la medicación antifúngica sistémica (10 a

15 días) o local (3 a 5 días) los días anteriores a la toma de muestra.
Si continuó con la aplicación de pomadas, cremas o polvos sobre la
mucosa afectada durante los 3 días anteriores a la toma de muestra.
Si los hisopos llegan al laboratorio secos, sin medio de transporte (agua
destilada estéril, solución fisiológica estéril o Stuart)
APOE-HEMO
Fecha: agosto 2011
DE BUENOS AIRES
PARA EL EXÁMEN MICOLÓGICO
RED DE MICOLOGIA DE HEMOCULTIVO
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1. OBJETIVO:
Desarrollar el procedimiento a seguir para el cultivo de hongos presentes en
muestras de sangre.
2. ALCANCE:
Todas las muestras de sangre recolectadas de acuerdo a las indicaciones de
toma de muestra (PRTT).
Personal profesional y Técnicos del sector Microbiología y Guardia
4. REFERENCIAS:
Esencial Procedures for Clinical Microbiology. H.D. Isenberg. ASM press,
American Society for Mirobiology, Washington, D.C. 1998.
De Bs. As. Argentina, 1999.
Manual of Clinical Microbiology. Murray y col. 8th Edition ASM press U.S.A
2003.
Bianchi M, Robles AM, Vitale R, Helou S, Arechavala A, Negroni R. The
usefulness of blood culture in the diagnosis of HIV-related systemic
mycoses: evaluation of a manual lysis centrifugation method. Med Mycol
2000; 38: 77-80.
5. DEFINICIONES:
PAMR: etapa Pre-analítica- Manual de Medios y Reactivos

PATT: etapa Pre-analítica- Manual de Toma y Transporte de muestras
Elaborado por: L.Guelfand, M.Carmen Perrone,S.Cataldi Aprobado por: Integrantes y Coordinador de la RM

Fecha: 6 de marzo 2008 Fecha: 3 de agosto de 2011
Versión Original
Revisado por Laura López Moral, Liliana Guelfand.
Fecha: junio 2011
APOE-HEMO
Fecha: agosto 2011
DE BUENOS AIRES
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HOSPITAL.:....................

LC: Lisis Centrifugación
Jefe de Sección Microbiología o Micología
Bioquímico a cargo del área Micología
7. DESARROLLO:
El cultivo de sangre se basa en la detección de hongos que desarrollan en los

frascos comerciales de equipos automatizados (Bactec o Bact Alert), en
frascos de hemocultivos comerciales no automatizados (Britania) o por la
técnica de lisis centrifugación (Isolator o de preparación en el laboratorio, ver
PAMR). Este método es el más sensible y rápido para la recuperación de
algunos hongos de la sangre, especialmente Histoplasma capsulatum,
Cryptococcus neoformans y Fusarium spp.Presenta mejores resultados para
los hongos filamentosos, que los obtenidos por las técnicas automatizadas o
comerciales no automatizadas.
El hemocultivo para la búsqueda de hongos, se indica en caso de sospecha
de fungemia en un huésped inmunocomprometido grave y en pacientes VIH
positivos para la investigación de Histoplasma capsulatum, Cryptococcus
neoformans, Fusarium spp, Candida spp y otras levaduras.
Cuando el paciente esta recibiendo alimentación parenteral hiperlipídica y se
sospecha fungemia por Malassezia spp., se debe sembrar el material en
medios ricos en ácidos grasos de cadena larga

Heladera 2- 8º C
APOE-HEMO
Fecha: agosto 2011
DE BUENOS AIRES
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HOSPITAL.:....................

Portaobjetos
Cubreobjetos
Gancho en L
Aguja vacutainer
Agar Infusión Cerebro Corazón con cloranfenicol
Agar Dixon (ADX) o similares

7.4 MUESTRAS A ANALIZAR:

Sangre:
La sangre es tomada en forma estéril y recolectada en tubo para la técnica
de lisis centrifugación (LC) o en botellas de hemocultivos o en frascos
especiales de equipos automatizados de acuerdo a las indicaciones del
Manual de toma de muestra (PATT).
El método de LC se realiza colocando:

• 9 ml de sangre en un tubo estéril con 1 ml de saponina 5% y
polianetol sulfonato de sodio al 0.4 % o EDTA para pacientes adultos
• 1 a 3 ml de sangre para pacientes neonatos y pediátricos en 0,5 ml
de saponina 5% y polianetol sulfonato de sodio al 0.4 % o EDTA (Ver
Anexo I Tabla de volemia)
7.5.1 Precauciones de Seguridad Biológica

7.5.2 Procesamiento de la Muestra:

A cada muestra se le asigna un número interno correlativo, siguiendo el
orden consecutivo del libro correspondiente o sistema informático propio del
Laboratorio. O bien se la prepara para su derivación de acuerdo a las
indicaciones del PRTT.
APOE-HEMO
Fecha: agosto 2011
DE BUENOS AIRES
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HOSPITAL.:....................
Los tubos de LC se centrifugan a 3000 r.p.m. durante 30 minutos y se

descarta el sobrenadante.
a) Examen directo microscópico

No aplica
b) Cultivos:
En el método de LC, se siembra todo el sedimento en 4 tubos conteniendo
medio de Sabouraud y agar infusión de cerebro y corazón (Ver PRMR).
Cuando el paciente esta recibiendo alimentación parenteral hiperlipídica y

se sospecha fungemia por Malassezia spp., se debe sembrar el material en
medios ricos en ácidos grasos de cadena larga, como el Agar miel
Sabouraud con el agregado de aceite de oliva estéril (SAO), Medio de
Danker (ADK), Medio de Dixon (ADX) ó Agar Sabouraud con bilis de buey
(ABB) . Ver Manual PAMR.
La sangre que se recolecta en los frascos comerciales de equipos

automatizados o en frascos de hemocultivos comerciales no automatizados
(ver PATT), se incuban directamente en estos envases.
La incubación de los tubos de LC se realiza a 28º C y 35-37º C, durante 3

a 4 semanas. Es necesario efectuar controles macroscópicos al menos 2
veces por semana para ver, si existe desarrollo micológico.
Los frascos de hemocultivos automatizados (Bactec, BacT-Alert) para

gérmenes comunes, se incuban en su equipo de 5 días (para búsqueda de
levaduras) a 3 semanas (para hongos sistémicos endémicos o
filamentosos), a 35ºC.
Los frascos de Hemocultivos automatizados (Bactec, BacT Alert) especiales

para micobacterias y hongos, se incuban en su equipo correspondiente
durante 3 a 4 semanas, a 35-37ºC.
Los frascos de Hemocultivos comerciales no automatizados para gérmenes

comunes, se incuban en estufa durante 3 a 4 semanas, a 35ºC.

incubarán de 32 a 35º C durante 3 semanas.
APOE-HEMO
Fecha: agosto 2011
DE BUENOS AIRES
Página 1 de 8
HOSPITAL.:....................
7.5.3 Resultados:
descartan los cultivos y se informan “Negativo”
Si durante la incubación se observa desarrollo en los medios sólidos o

líquidos, se realiza un examen microscópico en fresco y un informe
“preliminar” describiendo los elementos vistos en la microscopia.
A los frascos de los hemocultivos automatizados que den un aviso de

crecimiento microbiano, se le debe realizar un fresco y un Gram. Si se
observan elementos micóticos (levaduras o hifas), se repican a 2 tubos de
Agar Sabouraud glucosado con cloranfenicol y a 2 tubos de Agar infusión
cerebro corazón con cloranfenicol; se incuban a 28 y 35 ºC durante 3-4
semanas).
Si en el examen directo del frasco, se observan levaduras redondas sin

seudomicelio, se debe preparar un examen de tinta china para ver si se
visualizan levaduras capsuladas. Si se observan levaduras compatibles
morfológicamente con Malassezia, debe sembrarse en los medios
especiales para poder recuperar este género, en los cultivos.
Las colonias que desarrollen en los medios sólidos, deben ser examinadas
al microscópico para su reconocimiento preliminar.
Si son colonias de aspecto levaduriforme y se observaron levaduras
redondas, se efectúa una preparación montada en tinta china y se
determina la producción de ureasa por un método rápido, así como la
detección de fenoloxidasa en el medio de extracto de semillas de girasol
(ver PRMR). En las colonias que dan resultados negativos se seguirá la
secuencia de identificación de levaduras (POE ID Lev).
Si se trata de colonias de aspecto micelial debe hacerse una preparación
por disociación montada en azul lactofenol o en líquido de Gueguen,
teniendo las precauciones descriptas en el Manual de bioseguridad y
continuar su tipificación de acuerdo al flujograma de hongos filamentosos
(AMID 04)
7.5.4 Interpretación
El hallazgo de un hongo tiene valor diagnóstico por si solo si se trata de un
patógeno primario.
APOE-HEMO
Fecha: agosto 2011
DE BUENOS AIRES
Página 1 de 8
HOSPITAL.:....................
El hallazgo de un hongo saprófito ó comensal tiene valor diagnóstico

cuando se conjuga con los datos clínicos y epidemiológicos del paciente.
7.5.5 Tiempo de entrega del resultado:

El resultado del cultivo debe entregarse luego de 1 a 4 semanas de
incubación si no hay desarrollo fúngico.
Si se observa crecimiento de un hongo durante la incubación, se realiza
un informe preliminar o definitivo cuando se concluye con la
identificación.
8. FORMULARIOS Y REGISTROS
8.1 Registro de pacientes:

Libro interno de Micología ( y/o Libro de hemocultivos / o sistema
informático)
8.2 Informes:
Protocolo resultado de Hemocultivos
9. DOCUMENTOS ASOCIADOS
PR ( Manual de Procedimiento Pre- analítico)
PRMR (Manual de Procedimiento : Medios de cultivo y Reactivos)
PAID (Manual de Procedimiento: Identificación Micológica )
10. ANEXOS
Tabla de Volemia
Planillas

APOE-HEMO
Fecha: agosto 2011
DE BUENOS AIRES
Página 1 de 8
HOSPITAL.:....................
Cuando las muestras llegan al laboratorio coaguladas, volcadas, en

condiciones no estériles o en recipientes no adecuados
APOE-HEMO
Fecha: agosto 2011
DE BUENOS AIRES
Página 1 de 8
HOSPITAL.:....................
ANEXO I: TABLA DE VOLEMIA
Volumen de sangre requierido en pacientes pediátricos (RN a 15 años)
Peso del Pérdida

paciente Volumen de sangre (ml) volumen
(Kg) (%)
SET 1 SET 2
Isolator Aerobio Anaerobio Isolator Aerobio Anaerobio
<1 1.5 0.5 1.5 4
1.1- 2 1.5 1.5 1.5 4.5
2.1-12.7 1.5 3 1.5 3
12.8- 36 1.5 5 5 1.5 5 5 2.9
>36 10 10 10 10 10 10 2.8
Kellog J, Manzella J, Bankert D.

J Clin Microbiol 38, 2000
APOE-MO
Fecha: agosto de 2011
DE BUENOS AIRES
EXÁMEN MICOLÓGICO DE
RED DE MICOLOGIA MÉDULA ÓSEA
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HOSPITAL.:....................
1. OBJETIVO:
muestras de médula ósea.
2. ALCANCE:
Todas las muestras de medula ósea recolectadas de acuerdo a las indicaciones
de toma de muestra (PRTT).
4. REFERENCIAS:
Esencial Procedures for Clinical Microbiology. H.D. Isenberg. ASM press,
De Bs. As. Argentina, 1999.
Manual of Clinical Microbiology. Murray y col. 8th Edition ASM press U.S.A
2003.
Bianchi M, Robles AM, Vitale R, Helou S, Arechavala A, Negroni R. The
usefulness of blood culture in the diagnosis of HIV-related systemic
mycoses: evaluation of a manual lysis centrifugation method. Med Mycol
2000; 38: 77-80.
5. DEFINICIONES:
PAMR: etapa Pre-analitica- Manual de Medios y Reactivos

PATT: etapa Pre-analitica- Manual de Toma y Transporte de muestras
LC: Lisis Centrifugación
Elaborado por: L.Guelfand, S.Cataldi, M.C.Perrone Aprobado por: Integrantes y Coordinador de la RM

Fecha:10 de abril 2008 Fecha: agosto de 2011
Revisado por: L. guelfand, L.López Moral
Fecha: 20 de agosto 2011
APOE-MO
DE BUENOS AIRES
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HOSPITAL.:....................
MO: Médula Ósea

Jefe de Sección Microbiología
7. DESARROLLO:
El cultivo de medula ósea es útil para el diagnóstico de micosis sistémicas con

compromiso del sistema monocítico-histiocitario, en especial para la
histoplasmosis, la paracoccidioidomicosis de tipo juvenil y la criptococosis
diseminada. Brinda elevados índices de positividad en los pacientes
inmunocomprometidos. Debe reconocerse, sin embargo, que no es una
investigación de rutina. La detección de los hongos se realiza utilizando la
técnica de Lisis Centrifugacion (Isolator® o de preparación en el laboratorio,
ver PAMR).
El aislamiento de hongos en médula ósea tiene un gran significado clínico,
dado que se trata de muestras que normalmente son estériles.

Microscopio con objetivos de 10x, 40x y opcional 100x (inmersión )
Heladera 2- 8º C
Estufa de cultivo a 32- 35º C
Estufa de cultivo a 28º C
Portaobjetos
Cubreobjetos
Gancho en L
Agar Sabouraud glucosado con cloranfenicol (SDA)
Agar Miel Sabouraud (SAB+M)
Agar Infusión Cerebro Corazón con cloranfenicol (BHI Agar)

APOE-MO
DE BUENOS AIRES
Página 3 de 6
HOSPITAL.:....................

Médula ósea:
La MO se recolecta en forma estéril, en un tubo para la técnica de lisis
centrifugación (LC) o en botellas de hemocultivos o en frascos especiales de
equipos automatizados de acuerdo a las indicaciones del Manual de toma de
muestra (PATT).


Laboratorio. O bien se la prepara para su derivación de acuerdo a las
El método de LC se realiza colocando aproximadamente 1 ml de médula
ósea en un tubo estéril con 0.1 ml de saponina 5% y polianetol sulfonato de
sodio al 0.4 %.
Los tubos de LC se centrifugan a 3000 r.p.m. durante 30 minutos y se
descarta el sobrenadante.

Se preparan 3 extendidos del sedimento y se colorean por Giemsa (para
hongos y parásitos, Gram (para gérmenes comunes) y Ziehl Neelsen (para
BAAR).
b) Cultivos:
Se siembra todo el sedimento. Para el cultivo de hongos se utiliza los
medios de agar Sabouraud y agar Infusión de cerebro y corazón (Ver
PRMR). Es aconsejable sembrar 4 a 6 tubos. También deben sembrarse en
medios para micobacterias (Lowenstein Jensen, Bactec®, Bact’Alert® u
otros) y para gérmenes intracelulares como Salmonella, Listeria, etc. (agar
sangre y agar Levine).
La incubación de los tubos de LC se realiza a 28º C y 37º C, durante 3 a 4

semanas. Es necesario efectuar controles macroscópicos 2 veces por
APOE-MO
DE BUENOS AIRES
Página 4 de 6
HOSPITAL.:....................
semana para ver, si existe desarrollo micológico.
Si la muestra fue sembrada en frascos de Hemocultivos automatizados

(Bactec, Bac’Alert) para gérmenes comunes, se incuban en su equipo
durante 3 semanas, a 35ºC.
Si se utilizan los frascos de Hemocultivos automatizados especiales para

micobacterias y hongos (Bactec®, Bac’Alert®), se incuban en su equipo
correspondiente durante 3 a 4 semanas, a 35ºC.
7.5.3 Resultados:
descartan los cultivos y se informan “Negativo”
Si durante la incubación se observa desarrollo en los medios sólidos o

líquidos, se realiza un informe “preliminar” describiendo los elementos
vistos en la microscopia.
A los frascos de los hemocultivos automatizados que den un aviso de

crecimiento microbiano, se le debe realizar un fresco y un Gram. Si se
observan elementos micóticos (levaduras o filamentos), se repican a 2
tubos de Agar Sabouraud glucosado con cloranfenicol y a 2 tubos de Agar
Infusión Cerebro Corazón con cloranfenicol; se incuban a 28 y 35 ºC
durante 3-4 semanas).
Si en el examen directo del frasco, se observan levaduras redondas, se

debe preparar una tinta china para ver si se visualizan levaduras
capsuladas.
Las colonias que desarrollen en los medios sólidos, deben ser examinadas
al microscópico para su reconocimiento preliminar.
Si son colonias de aspecto levaduriforme y se observaron levaduras
redondas, se efectúa una preparación montada en tinta china y se
determina la producción de ureasa por un método rápido, así como la
detección de fenoloxidasa en el medio de extracto de semillas de girasol
(ver PRMR). En las colonias que dan resultados negativos se seguirá la
secuencia de identificación de levaduras (AMID Lev). Si se observan
levaduras redondas, de pared gruesa y refringente, multibrotadas, en “oreja
de Mickey” o catenuladas, se debe pensar en Paracoccidioides brasiliensis.
APOE-MO
DE BUENOS AIRES
Página 5 de 6
HOSPITAL.:....................
Si se trata de colonias de aspecto micelial debe hacerse una preparación

por disociación montada en azul lactofenol o en líquido de Gueguen,
teniendo las precauciones descriptas en el MB y continuar su tipificación de
acuerdo al flujograma de hongos filamentosos (AMID hongos miceliares)
patógeno primario.
7.5.5 Tiempo de entrega:

El cultivo debe entregarse luego de 3 a 4 semanas de incubación.
Si hay desarrollo durante la incubación, se realiza un informe preliminar
describiendo los elementos vistos en la microscopia.

Libro interno de Micología ( y/o Libro de hemocultivos)
8.2 Informes:
Protocolo resultado de Medula Ósea o Hemocultivos
APOE-MO
DE BUENOS AIRES
Página 6 de 6
HOSPITAL.:....................
10. ANEXOS
Planillas

No aplica
APOE- LP
Fecha: julio 2011
DE BUENOS AIRES
Página 1 de 7
HOSPITAL.:.................... LÍQUIDOS DE PUNCIÓN
1. OBJETIVO:
muestras de líquidos de punción.
2. ALCANCE:
Todas las muestras de líquidos de punción recolectadas de acuerdo a las
indicaciones de toma de muestra (PRTT).
4. REFERENCIAS:
• Esencial Procedures for Clinical Microbiology. H.D. Isenberg. ASM press,

• Manual de Procedimientos para Laboratorios de Micología Médica, Prof.
Latinoamericana supl. 1, editado por la Federación Bioquímica de la Prov.
de Bs. As. Argentina, 1999.
• Guía práctica de Identificación y Diagnóstico en Micología Clínica. Javier
a
Iberoamericana de Micología. 1 edición. Bilbao, España. 2001
• A 15 year-review of peritoneal dialysis-related peritonitis: Microbiological
trends and patterns of infection in a teaching hospital in Argentina. J. E.
Santoianni1*, S. C. Predari1, D. Verón2, A. Zucchini2, A. N. De Paulis1
Revista Argentina de Microbiología (2008) 40: 17-23 ISSN 0325-751417
5. DEFINICIONES:

Elaborado por: S.Cataldi, M.Carmen Perrone Aprobado por: Integrantes de la RM y Coordinador

Fecha: 10 septiembre de 2009 Fecha: julio de 2011
Versión Original
Revisado por: Claudia Garbaz y L.Guelfand
Fecha: julio de 2011
APOE- LP
Fecha: julio 2011
DE BUENOS AIRES
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PPFI: : etapa Post-Analítica -Formularios e Informes
Jefe de Sección Microbiología
7. DESARROLLO:
El diagnóstico de micosis en estos materiales se basa en el hallazgo de hifas o

levaduras características, en el examen microscópico directo y el aislamiento
del agente causal en los cultivos.

Cabina de bioseguridad tipo II
Microscopio óptico o de contraste de fase con objetivos de 100x, 400x y
1000x.
Heladera 2- 8º C
Centrífuga
Tubos estériles de propileno con tapa a rosca
Ansas estériles descartables o ansa metálica de platino
Gancho en L
Agar Infusión Cerebro Corazón con cloranfenicol (BHI +C)
Solución fisiológica
Azul de lactofenol
APOE- LP
Fecha: julio 2011
DE BUENOS AIRES
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Otros medios según resultado de examen directo o sospecha clínica


Líquidos: pleural, pericárdico, articular y ascítico.
Estas muestras serán obtenidas respetando las técnicas de asepsia y enviadas
al laboratorio en tubos cónicos de polipropileno estériles con tapa a rosca. Para
su recolección se emplearán jeringas heparinizadas a fin de evitar su
coagulación. Ver PRTT


consecutivo del libro correspondiente o sistema informático propio del
Laboratorio, o bien, se la prepara para su derivación de acuerdo a las
Tomar hasta 10 ml de la muestra en tubo estéril con tapa a rosca, centrifugar a
2000 r.p.m. durante 10 minutos y procesar en cabina de bioseguridad.
Descartar el sobrenadante y con el sedimento efectuar preparaciones al estado
fresco, extendidos para teñir por los métodos de Gram, Ziehl Neelsen, Kinyoun
y Giemsa. Ver PAMR. A continuación proceder a la siembra.

Los hallazgos del examen microscópico varían con la muestra examinada, en el
estudio al estado fresco es posible comprobar la presencia de seudohifas y
blastoconidias de Candida, levaduras capsuladas de Cryptococcus, levaduras
multibrotantes de Paracoccidioides, esférulas de Coccidioides, hifas
cenocíticas e hifas hialinas y septadas de Eumycetes. Las preparaciones
teñidas con Gram y con Kinyoun permiten observar filamentos de los
Actinomycetales, y en los extendidos coloreados con Giemsa pueden
APOE- LP
Fecha: julio 2011
DE BUENOS AIRES
Página 4 de 7
detectarse macrófagos con levaduras intracelulares que corresponden a

Histoplasma capsulatum o Penicillium marneffei.
Las pericarditis de origen micótico son habitualmente serofibrinosas y en
ellas raramente se observa al agente causal. Por el contrario en los últimos
años, se ha comprobado un número creciente de pericarditis purulentas
producidas por Nocardia que se observa en los extendidos teñidos con
Kinyoun.
El líquido ascítico se obtiene principalmente de pacientes con diálisis
peritoneal intermitente. Cabe recordar que en estos casos se analiza tanto el
líquido ascítico como el contenido de las bolsas de diálisis. Resulta de
fundamental importancia, concentrar esta muestra para obtener una mejor
recuperación. En estos casos se centrifugan 100 ml de muestra a 2000 r.p.m.
durante 10 minutos.
La presencia de leucocitos en el líquido ascítico aboga en favor de una
peritonitis. En el examen microscópico directo al estado fresco se puede
observar la presencia de seudohifas o de hifas. La mayor parte de los casos
son producidos por hongos del género Candida, siguiéndole en orden de
frecuencia las infecciones producidas por Fusarium o Acremonium. En los
casos de infección fúngica debe ser estudiada la cánula de diálisis una vez que
ésta haya sido extraída.
b) Cultivos:
La siembra debe realizarse por toques (por lo menos tres) en tubos de ensayo
con medio de SDA y agar BHI. Se emplean en general 6 tubos por muestra, la
mitad se incuba a 28º C y los restantes a 37º C, ambos durante 4 semanas. Los
medios de cultivo deben contener cloranfenicol-estreptomicina en la
concentración final de 100 µg/ml, en general no se utiliza la cicloheximida
porque puede impedir el desarrollo de Aspergillus, Cryptococcus,
Penicillium, etc.
Cuando se observan actinomicetos en el examen microscópico no debe
utilizarse esta técnica de cultivos pues los antibióticos antibacterianos son
letales para estos microorganismos. Si se trata de elementos ácido-resistentes,
sospechosos de ser Nocardia, se siembra la muestra en tres placas de Petri
con agar infusión de cerebro-corazón sin antibióticos, agar Thayer Martin,
Lowestein- Jensen y agar sangre. La incubación puede hacerse a 37º C o de
preferencia a 42º C. Las colonias se observan microscópicamente al estado
fresco, aquellas que acusen la presencia de bacterias filamentosas son
examinadas en extendidos teñidos por la técnica de Gram y repicadas en el
APOE- LP
Fecha: julio 2011
DE BUENOS AIRES
Página 5 de 7
mismo medio de cultivo para obtener un desarrollo no contaminado y poder

completar la identificación.
c) Identificación:
Se observan los cultivos, al menos una vez por semana y se identifican por
disociación de la colonia desarrollada en solución fisiológica con o sin azul de
lactofenol y observación microscópica.
7.5.3 Resultados:
Directo: Es conveniente entregar un resultado de los elementos observados lo

más rápido posible como informe preliminar.
Si no hubo hallazgo se informa: “No se observan elementos micóticos”.

Se observan células levaduriformes con blastoconidias y / o
seudomicelios.
Se observan células levaduriformes esféricas de brotación múltiple o en
rueda de timón.
Se observan células esféricas de brotación simple (unigemantes) de
cuello ancho.
Se observan cuerpos esféricos con endosporos ó esférulas.
Se observan hifas hialinas tabicadas y/o ramificadas.
Se observan hifas cenocíticas.

Se observan células levaduriformes con blastoconidias y / o seudomicelios.
rueda de timón.
Se observan hifas hialinas tabicadas y/o ramificadas.
APOE- LP
Fecha: julio 2011
DE BUENOS AIRES
Página 6 de 7
Se observan levaduras en casquete intracelulares.

Se observan hifas cenocíticas.
b) Cultivo:
Si no hubo desarrollo durante el lapso indicado de incubación se descartan los

cultivos y se informa: “No se obtuvo desarrollo de hongos”
Si hubo desarrollo, informar: “Género y especie”
patógeno primario.
cuando se conjuga un examen directo positivo, con los datos clínicos y
epidemiológicos del paciente.

El cultivo debe entregarse luego de 3 semanas de incubación.

General del Laboratorio (libro foliado, informático, etc.)
8.2 Informes:
Protocolo resultado de Líquidos de punción
APOE- LP
Fecha: julio 2011
DE BUENOS AIRES
Página 7 de 7
PRMR (Manual de Procedimiento : Medios de cultivo y Reactivos)
10. ANEXOS

Planillas

No aplica
APOE- LCR
Fecha: agosto 2011
DE BUENOS AIRES
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HOSPITAL.:.................... LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO
1. OBJETIVO:
muestras de líquido cefalorraquídeo (LCR).
2. ALCANCE:
Todas las muestras de líquido cefalorraquídeo recolectadas de acuerdo a las
Personal profesional y Técnicos del sector Microbiología/ Micología y Guardia
4. REFERENCIAS:
Esencial Procedures for Clinical Microbiology. H.D. Isenberg. ASM

press, American Society for Mirobiology, Washington, D.C. 1998.
Prov. de Bs. As. Argentina, 1999.
Guía práctica de Identificación y Diagnóstico en Micología Clínica. Javier
a
Iberoamericana de Micología. 1 edición. Bilbao, España. 2001
5. DEFINICIONES:

PPFI: : etapa Post-Analítica -Formularios e Informes
Elaborado por: S.Cataldi,, M.Carmen Perrone Aprobado por: Integrantes y Coordinador de la RM

Fecha: 10 septiembre 2009 Fecha: agosto de 2011
Versión Original
Revisado por: L.Lopez Moral, L Guelfand, M. López
APOE- LCR
Fecha: agosto 2011
DE BUENOS AIRES
Página 2 de 8
Fecha: julio de 2011
Jefe de Sección Microbiología o Micología
7. DESARROLLO:
El diagnóstico de micosis en LCR se basa en el hallazgo de levaduras

características, en el examen microscópico directo, el aislamiento del agente
causal en los cultivos y en la detección de antígenos o anticuerpos.

Cabina de bioseguridad tipo II
Microscopio óptico o de contraste de fase con objetivos de 100x, 400x y
1000x Heladera 2- 8º C
Centrífuga
Estufa de cultivo a 35-37ºC
Tubos estériles de propileno con tapa a rosca
Ansas estériles descartables o ansa metálica de platino
Gancho en L
Agar Infusión Cerebro Corazón con cloranfenicol (BHI +C)
Tinta china
Azul de lactofenol
APOE- LCR
Fecha: agosto 2011
DE BUENOS AIRES
Página 3 de 8
Urea de Christensen
Fenol oxidasa
Agar tabaco
Agar cromogénico para identificación presuntiva de levaduras
Tarjetas de identificación de levaduras,tipo Vitek o Api


LCR remitido en un tubo de polipropileno estéril con tapa a rosca, el
volumen de la muestra no debe ser menor a 3 ml. (Ver PRTT)


Laboratorio o bien se la prepara para su derivación de acuerdo a las
El material se centrifuga entre 2000 a 3000 por 10-15 minutos y se procesa
en cabina de bioseguridad. El sobrenadante se separa y se guarda para
realizar, en caso necesario, reacciones en busca de antígenos o anticuerpos.
Con el sedimento se realiza:
- Colocar una gota del sedimento con una gota de tinta china diluida
(PAMR), entre porta y cubreobjetos y observar al microscopio con objetivo
40x, en busca de levaduras capsuladas de Cryptococcus.
- Colocar una gota del sedimento entre porta y cubre y observar con
microscopio óptico de 400x o de contraste de fase, en busca de elementos
micóticos (ya sean levaduras, levaduras multibrotadas, cuerpos redondos
con endosporos o filamentos).
APOE- LCR
Fecha: agosto 2011
DE BUENOS AIRES
Página 4 de 8
- Colocar una gota del sedimento y realizar un extendido, dejar secar y

colorear con solución Giemsa, observar al microscopio con aceite de
inmersión con objetivo 1000x en busca de levaduras intracelulares
compatibles con Histoplasma, levaduras, levaduras multibrotadas, cuerpos
redondos con endosporos.
b) Cultivos:
El remanente del sedimento es resuspendido en agua destilada estéril y

sembrado por toques (2-3) en tubos con agar-miel o agar glucosado de
Sabouraud a 28º y 35-37º y agar infusión de cerebro y corazón a 35-37º C
durante 3 a 4 semanas. Deben sembrarse 4 tubos de ensayo por muestra.
Los tubos se observar todos los días o por lo menos, tres veces por semana
para verificar si hay desarrollo.
c) Identificación:
-Observación macroscópica: se observa el aspecto y color de las colonias

desarrolladas en los tubos de Sabouraud tanto en anverso como en el
reverso de los mismos.
- Si no se llega a definir realizar macrocolonia (preparar una placa de Petri
con Sabouraud y sembrar en el centro de la misma el hongo, incubar 10
días a 37°C y observar).
- Observación microscópica: Se coloca entre porta y cubreobjetos una gota
de solución fisiológica con o sin agregado de azul de lactofenol y la colonia
desarrollada en Sabouraud procediendo a su disociación con ayuda de
ansa y ansa en L, se observa al microscopio con objetivo de 200 o 400x la
morfología.
- Prueba de ureasa (ver PAMR): Para género Cryptococcus
- Prueba de fenoloxidasa y/o Agar Tabaco (ver PAMR): Para identificación
de especie del género Cryptococcus.
-Agar cromogénico: para identificación presuntiva de levaduras. Se realiza
una suspensión en solución fisiológica tocando varias colonias
desarrolladas en Agar Sabouraud, se siembra la placa de agar
cromogénico, se incuba 48-72hs a 28º /35°C y se observa el color
desarrollado siguiendo las indicaciones del fabricante.
- Inoculación de paneles o tarjetas de identificación tipo Api o Vitek según
indicaciones del producto comercial.
APOE- LCR
Fecha: agosto 2011
DE BUENOS AIRES
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d) Pruebas inmunológicas (Ver APOE- INMU)
e) Estudios especiales:
Es frecuente, en los casos de meningitis crónica, la necesidad de colocar

válvulas de derivación ventrículo-atrial o ventrículo-peritoneal y también es
común que dichas válvulas deban ser reemplazadas. Estas circunstancias
serán aprovechadas para obtener una muestra de LCR de gran volumen,
mayor a 20 ml, lo que incrementa la posibilidad de aislamiento de los agentes
causales. Es también aconsejable cultivar las válvulas reemplazadas.
Debe tenerse siempre en cuenta que las meningitis crónicas son focos
secundarios de micosis sistémicas, que tienen con frecuencia otras
localizaciones, algunas de ellas fácilmente abordables para la obtención de
materiales de biopsia que permiten el diagnóstico etiológico. Estos focos no
neurológicos son encontrados con diferente frecuencia según las micosis, en
orden decreciente serían paracoccidioidomicosis, histoplasmosis,
coccidioidomicosis y criptococosis.
7.5.3 Resultados:
Directo:
Es conveniente entregar un resultado de los elementos observados lo más
rápido posible como informe preliminar.
Si no hubo hallazgo se informa: “No se observan elementos micóticos”
Se observan células levaduriformes con o sin blastoconidias y sin

seudomicelios
seudomicelios
rueda de timón
Se observan cuerpos esféricos con endosporos ó esférulas
Tinta china:
APOE- LCR
Fecha: agosto 2011
DE BUENOS AIRES
Página 6 de 8

Si hubo hallazgo se informa: “Se observan levaduras capsuladas
compatibles con Cryptococcus spp”
Se observan células levaduriformes con o sin blastoconidias y sin
seudomicelios
seudomicelios.
rueda de timón.
Se observan levaduras en casquete intracelulares compatibles con
Histoplasma.
b) Cultivo:
Si no hubo desarrollo durante el lapso indicado de incubación se descartan

los cultivos y se informa: “No se obtuvo desarrollo de hongos” o
“Negativo para el cultivo micológico”
Si hubo desarrollo, informar: Género y especie.
c) Pruebas inmunológicas:
A) Búsqueda de anticuerpos:
Serología para (Paracoccidioides brasiliensis, Histoplasma capsulatum,
Coccidioides posadasii) según el caso
Método:
– Inmunodifusión Cualitativa:
Resultado: Negativa o
Positiva
– Inmunodifusión cuantitativa:
Resultado: Título (la mayor dilución del suero que tenga reacción de
identidad)
APOE- LCR
Fecha: agosto 2011
DE BUENOS AIRES
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– Contrainmunoelectroforésis:
Resultado: Negativa o
Positiva (informar el número de bandas con movilidad catódica y /
o número de bandas con movilidad anódica según el caso).
B) Búsqueda de antígenos:
Detección de antígeno capsular de Cryptococcus
Método:
– Aglutinación de partículas de látex:
Material: LCR (antigenorraquia)
– Antigenorraquia cualitativa:
Resultado: Negativo ó
Positivo
– Antigenorraquia cuantitativa: Título (informar la mayor dilución del LCR

que tenga reacción positiva)
Material: Suero (antigenemia)
– Antigenemia cualitativa:
Resultado: Negativo ó
Positivo
– Antigenemia cuantitativa: Título (informar la mayor dilución del suero

que tenga reacción positiva)
El hallazgo de un hongo tiene valor diagnóstico por sí solo si se trata de
un patógeno primario.

El cultivo debe entregarse luego de 3 a 4 semanas de incubación.
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Fecha: agosto 2011
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Pruebas serológicas realizarlas siempre que sea posible y ante la

sospecha según epidemiología del paciente y caso clínico. Informar
dentro de las 72 hs.

General del Laboratorio (libro foliado, informático, etc.)
Libro interno de Micología o sistema informático
Ficha de derivación fuera de la Red (ej : al Instituto C.Malbran)
8.2 Informes:
Protocolo resultado de Líquidos de punción
10. ANEXOS
Planillas

No aplica
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RED DE MICOLOGIA INMUNODIAGNÓSTICO DE LAS
HOSPITAL.:.................... MICOSIS SISTÉMICAS
1. OBJETIVO:
Desarrollar el procedimiento a seguir para el inmunodiagnóstico de las micosis
sistémicas.
2. ALCANCE:
Todas las muestras de suero, líquido cefalorraquídeo (LCR), orina, lavado
broncoalveolar, según el tipo de prueba a realizar y recolectadas de acuerdo a las
Personal profesional y técnicos del sector Microbiología, Micología
4. REFERENCIAS:
Guía de Diagnóstico de Micosis Sistémicas. “El Laboratorio y el Diagnóstico de
las Micosis Sistémicas”. Curso Teórico-Práctico. Departamento Micología.
INEI. ANLIS “Carlos G. Malbrán”. Canteros C., Davel G. y Rodero L. 2001
Manual de Procedimientos para Laboratorios de Micología Médica, Prof. Dr. R.
Negroni, Dra. L.Guelfand y col. Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana supl.
1, ed. Federación Bioquímica de la Prov. de Bs. As. Argentina, 1999.
Guía práctica de Identificación y Diagnóstico en Micología Clínica. J. Pemán,
a
E.Martín-Mazuelos, MC Calvo. Rev Iberoamericana Micol. 1 ed. Bilbao,
España. 2001
• Conti-Díaz IA, Somma-Moreira RE, Gezuele E, Giménez AC de, Pena MI,
Mackinnon JE. Immunoelectroosmophoresis-immunodiffusion in
paracoccidioidomicosis. Sabouraudia 1973, 11: 39-41.
• Kaufman L, Reiss E. Serodiagnosis of fungal diseases. En: Rose N, Conway
de Macario E, Fahey J, Friedman H, Penn G. Manual of Clinical Laboratory
Immunology, 4th. Ed. ASM, Washington, 1992, p.506-528.
• Manual of standardized serodiagnostic procedures for systemic micosis. Part I:
Immunodiffusion test. Pan American Health Organization, Washington, 1972.
• Manual of standardized serodiagnostic procedures for systemic micosis. Part II:
Complement fixation test. Pan American Health Organization, Washington,
1974.
• Ouchterlony O. Handbook of immunodiffusion and immunoelectrophoresis. Ann
Arbor Science Publisher Inc. 1970
Elaborado por: S.Cataldi, M.C Perrone, A.Arechavala Aprobado por: Integrantes y Coordinador de la RM
Fecha: julio 2011 Fecha: agosto 2011
Versión Original
Revisado por: L.Guelfand , L López Moral
Fecha: agosto 2011
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• Zaror L, Robles AM, Negroni R. Pruebas de inmunodifusión en medios

gelosados con el agregado de polietilenglicol 6000 para el serodiagnóstico de
las micosis. Rev Argent Microbiol 1978, 10: 61-64.
5. DEFINICIONES:
PAMR: Etapa Pre-analítica- Manual de Medios y Reactivos

PATT: Etapa Pre-analítica- Manual de Toma y Transporte de muestras
AMID: Etapa Analítica -Manual de Identificación.
APOE: Etapa Analítica -Manual de Procedimientos Operativos Estándar
PPFI: : Etapa Post-Analítica -Formularios e Informes
Jefe de Sección Micología/Microbiología (según hospital)
7. DESARROLLO:

Los métodos serológicos permiten detectar anticuerpos específicos que
pueden ser el primer elemento diagnóstico de micosis sistémicas endémicas u
oportunistas y corroboran la sospecha de las últimas. Ademas complementan al
hallazgo del hongo por métodos directos y son de gran utilidad en el seguimiento de
las micosis. Cuando el paciente presenta lesiones casi inaccesibles o donde es muy
difícil la toma de muestra, la serologia puede convertirse en el único elemento de
diagnóstico. Por otra parte, proporciona información rápida y fiable y se utiliza como
prueba tamiz, que permite discriminar entre varias micosis a bajo costo.
La detección de antígenos circulantes es un método que se utiliza para el diagnóstico

rápido de micosis invasoras en huéspedes inmunocomprometidos. Estos pacientes
habitualmente no pueden formar anticuerpos y la toma de muestras para el
diagnóstico directo puede ser muy difícil o peligrosa. Estos marcadores biológicos
permiten iniciar el tratamiento en muchos casos sin la confirmación micológica.
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Por su parte la realización de pruebas cutáneas con antígenos fúngicos permite

identificar a individuos infectados por los diversos agentes de micosis profundas y
aún superficiales. Otra utilidad es su uso para estudiar la capacidad de respuesta de
inmunidad mediada por células en enfermos con algún tipo de inmunodeficiencia. No
son útiles para el diagnóstico de enfermedad pero estas pruebas de hipersensibilidad
retardada sirven como elemento pronóstico en los pacientes con diagnóstico de
certeza. Otro uso es para la realización de encuestas epidemiológicas y para
determinar áreas endémicas.
La aspergilina tiene un valor diferente ya que se utiliza para estudiar la sensibilización
de individuos atópicos con antígenos de Aspergillus y mide la respuesta inmediata
(Hipersensibilidad tipo I).
Pipetas automáticas
Perforadores de metal de 1 mm y 3mm de diámetro
Pipetas serológicas de 10 ml y 5 ml graduadas 1/10 o pipetas automáticas
Cuba de electroforesis
Fuente de corriente continua
Cámara húmeda
Lente de aumento o lupa
Papel de filtro tipo Whatman Nº 1 o similar cortado en tiras y en cuadrados
Heladera
Placas de Petri de 15 mm x 100 mm ó 60 mm x 12 mm
Cortador de gel de 7 hoyos ó perforador metálico de 4 mm de diámetro
Centrífuga
Crioviales con tapa a rosca
Lector de placas de ELISA con filtros 405 y 620 nm
Placas con oquedades circulares para pruebas de aglutinación
Centrífuga para tubos Eppendorf
Luz
Agitador horizontal tipo VDRL
Baño termostatizado 56 °C y 100 °C
Jeringas y agujas intradérmicas
Reactivos:
Se indican los reactivos para cada una de las técnicas que se explican más abajo
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a. Inmunodifusión (ID)
Agar purificado (Agar Noble Difco, Agar Oxoid N°3)/ Agarosa
Cloruro de sodio
Citrato de sodio
Fenol
Polietilenglicol 6000
Fosfato monobásico de sodio
Fosfato dibásico de sodio
Azida sódica 1:1000 o mertiolato-borato de sodio 1:10 000
Antígenos estandarizados
Agua destilada
Sueros control positivo
Azul de Coomasie
Acido acético glacial
Etanol
a.1. Preparación de los reactivos de ID
Preparación de solución buffer de fosfatos pH 7,4

M/15 Na2HPO4 80,8 ml
M/15 NaH2PO4 19,2 ml
Preparación de solución fisiológica fenolada 3‰

NaCl 0,85 g
Fenol 3 ml
Agua destilada c.s.p. 100 ml
Preparación del agar para inmunodifusión

Agar purificado 1g
PEG 6000 1g
Solución buffer de fosfatos 1 ml
Solución fisiológica fenolada 99 ml
Se prepara la solución fisiológica fenolada al 3‰: Al agua destilada se le

agregan el NaCl y el fenol. Luego se agrega el agar y el PEG y se mezclan
durante 5 minutos. Se lleva a baño de agua a 100 °C hasta su disolución
completa y se distribuye en tubos con tapa a rosca con 5 y 15 ml por tubo y se
conserva a 4 °C hasta su utilización.
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Preparación de la solución buffer de citrato-cloruro de sodio pH 8,2

Citrato trisódico 5g
Solución salina isotónica 100 ml
Mezclar bien hasta disolución total del citrato, envasar en un frasco con tapa a
rosca. Mantener a temperatura ambiente.
Preparación de azul de Coomasie

Azul brillante de Coomasie R-250 1g
Etanol 90 ml
Ácido acético glacial 20 ml
Agua destilada 90 ml
Disolver el azul en etanol y luego añadir el ácido acético y el agua destilada.

Esta solución puede reutilizarse muchas veces.
Para decolorar se utiliza la misma solución sin azul.
a.2. Preparación de las placas o láminas para ID
• Se funde el agar en baño de agua a ebullición y se deja enfriar hasta 55-60 °C.
• Se vierte un tubo de 15 ml si se realiza la ID en placa
• Para preparar portaobjetos, primero se diluye 1 ml de agar en 7 ml de agua
destilada y se cubre el portaobjetos con una capa muy fina y se deja secar
hasta formar una película seca y opaca. Luego se agregan 2,5 ml de agar sin
diluir.
• Se deja solidificar y se puede mantener a 4 °C hasta una semana. Los
portaobjetos así preparados deben conservarse en cámara húmeda.
b. Contrainmunoelectroforesis (CIE)
b.1. Preparación de los reactivos para CIE
Preparación de la agarosa para CIE

Agarosa 1g
Polietilenglicol 6000 1g
Buffer veronal pH 8,2 100 ml
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Se disuelve la agarosa y el polietilenglicol en el buffer calentando suavemente

en baño de agua hasta ebullición. Se envasa en tubos con tapa a rosca,con 10
ml de agarosa y se conserva a 4 °C.
b.2. Preparación de las láminas para CIE

• Se preparan portaobjetos de la misma manera que para la ID colocando
primero una fina película de agar diluido y luego cubriendo con 2,5 ml de la
agarosa.
• Se deja solidificar y se mantiene en heladera a 4 °C en cámara húmeda
hasta una semana.
c. Aglutinación de partículas de látex (AL)

Esta técnica se utiliza para la detección de antígeno polisacárido capsular de
Cryptococcus con equipos comerciales.
Preparación de los reactivos

• Pronasa: Esta enzima viene liofilizada, cada frasco se reconstituye con
1,75 ml de agua destilada y se fracciona en tubos Eppendorf con 50
μl/tubo y se conserva congelado a – 20 °C. Este reactivo dura así hasta
un mes como máximo. Siempre debe comprobarse su actividad con el
control correspondiente.
• Buffer: El buffer de dilución de muestras 10X debe diluirse para obtener
la solución 1X, en general se preparan 10 ml agregando 9 ml de agua
destilada a 1 ml de buffer concentrado.
• Control negativo: El contenido de este frasco control debe ser
inactivado a 56 °C durante 30 minutos antes de comenzar a usarlo.
d. ELISA doble sándwich

Este método se usa para la detección de antígeno galactomanano de
Aspergillus mediante un equipo comercial.
7.3 CONSERVACIÓN DE LOS REACTIVOS Y MEDIOS:

Para la detección de anticuerpos: Suero y LCR remitido en un tubo plástico con
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cierre hermético a rosca, el volumen de la muestra debe ser de por lo menos 5 ml de

sangre y 2-3 ml de LCR dentro de lo posible. Excepcionalmente se pueden utilizar
otras muestras. (Ver PRTT)
Para detección de antígenos: Suero, LCR, Orina, LBA o algún otro fluido orgánico.
Deben ser remitidos en tubos plásticos, apirógenos, estériles con cierre hermético a
rosca. El volumen de la muestra debe ser por lo menos de 5 ml de suero, orina, LBA
y 2-3 ml de LCR. (Ver PRTT).

consecutivo del libro correspondiente o sistema informático propio del Laboratorio ó
bien se la prepara para su derivación de acuerdo a las indicaciones del PRTT.
La sangre, LCR, orina, LBA, se centrifugan a 2.000 r.p.m. durante 10 minutos. Se
separa el suero o sobrenadante y se mantiene refrigerado a 4 ºC. Si su
procesamiento se demora más de una semana se conserva a -20ºC. A las muestras
de suero que se utilizan para la detección de anticuerpos se les añade una gota de
azida o mertiolato como conservador.
Pruebas inmunológicas
Son métodos de diagnóstico indirecto (independientes del cultivo) esencialmente de
dos tipos
I. Reacciones cutáneas in vivo

II. Pruebas inmunológicas in vitro
I. Reacciones cutáneas: Llamadas pruebas intradérmicas, sólo tienen valor

epidemiológico y pronóstico. El resultado de la intradermorreacción sirve para
pronóstico y no indica evolución, porque aún con buena evolución con el tratamiento
adecuado, un paciente que mantiene prueba cutánea negativa tiene mayor
probabilidad de recidivas, en tanto el que en el momento del diagnóstico tiene prueba
positiva o se positiviza con el tratamiento es indicador de buen pronóstico de la
enfermedad. También sirve para medir capacidad de respuesta inmune.
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Tipo de antígenos utilizados en estas pruebas:
a) histoplasmina d) aspergilina g) tricofitina

b) coccidioidina e) esporotriquina
c) paracoccidioidina f) candidina
La aspergilina tiene un uso y significado diferente ya que se utiliza para medir

hipersensibilidad inmediata (tipo I de Gell y Coombs) y semidemorada (tipo III).
Determina la sensibilización de un paciente frente a antígenos de Aspergillus
(respuesta mediada por IgE) o la formación de complejos inmunes (Fenómeno de
Arthus mediado por IgG). Para la primera, la lectura se efectúa a los 15 minutos y
usando un control; la lectura semidemorada se realiza a las 6 horas y se observa la
presencia de roncha urticariana.
El resto de las intradermorreacciones miden hipersensibilidad retardada (inmunidad
mediada por células) y se leen a las 48 h midiendo el infiltrado, no interesa el eritema.
II. Pruebas inmunológicas in vitro:

A. Detección de anticuerpos
B. Detección de antígenos circulantes
Como ya fue mencionado, aún no está totalmente comprendido el papel de los

anticuerpos en la respuesta inmune frente a los agentes fúngicos; sin embargo, la
producción de inmunoglobulinas específicas contra los distintos agentes etiológicos
de las micosis es de gran utilidad para el diagnóstico serológico.
En las micosis sistémicas endémicas se producen anticuerpos en concentración
elevada y proporcional a la gravedad de la infección. Estos anticuerpos pueden ser
fácilmente detectados por diferentes reacciones inmunológicas que se convierten así
en herramientas de gran valor para el diagnóstico y también para el seguimiento de
estas patologías.
En las formas agudas o subagudas pueden utilizarse técnicas que permiten la
detección de anticuerpos de tipo IgM, como la aglutinación directa, hemaglutinación o
precipitación en tubo.
Sin embargo, sus resultados son positivos solamente en las primeras etapas de la
enfermedad y se negativizan en plazos cortos independientemente de la evolución de
la afección. Las técnicas que permiten evidenciar anticuerpos IgG son las más
utilizadas para el diagnóstico de formas subagudas y crónicas y además permiten
seguir la evolución de estas enfermedades.
El incremento de micosis en huéspedes inmunocomprometidos que no tienen
capacidad para formar anticuerpos adecuadamente, ha requerido el desarrollo de
técnicas inmunológicas que permitan detectar antígenos y/o metabolitos circulantes.
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En ocasiones, la combinación de métodos destinados a detectar anticuerpos con

técnicas de demostración de antígenos permite llegar o acercarse al diagnóstico de
formas graves de estas micosis.
II.A.1. Métodos de detección de anticuerpos circulantes
II.A.1.1. Inmunodifusión (ID)

La prueba más difundida y mejor estandarizada es la inmunodifusión en medios
gelosados (agar o agarosa), ya que para su realización no es necesario contar con
equipos costosos, es muy fácil de realizar y permite obtener resultados en 48-72 h.
Esta es una técnica que se puede emplear como tamiz, probando diferentes
antígenos fúngicos, ya que posee sensibilidad adecuada y gran especificidad (< 1%
de reacciones cruzadas con antígenos bien controlados). Además puede servir en el
seguimiento, como técnica semicuantitativa mediante diluciones seriadas del suero
del paciente.
En nuestro medio se utiliza para el diagnóstico serológico de paracoccidioidomicosis,
histoplasmosis, coccidioidomicosis, aspergilosis broncopulmonar, candidiasis
sistémica y en América del Norte también se usa para diagnóstico de blastomicosis.
Siempre deben emplearse controles positivos y negativos simultáneamente con las
muestras clínicas.
Permite diagnosticar el 90 % de candidiasis sistémicas, 90 % de pacientes con
aspergilomas, 70 % de las aspergilosis pulmonares alérgicas, 85 % de
histoplasmosis, 94 % de paracoccidioidomicosis y 90 % de coccidioidomicosis.
Realización de la ID
Sacar las placas de la heladera
Cortar con la matriz de 7 hoyos o con los perforadores de metal de 4 mm de
diámetro según Esquema 1
Retirar los siete cilindros del gel con aguja o una pipeta Pasteur. No dañar las
paredes porque provoca una difusión desigual y las bandas luego son difíciles de
interpretar.
Enumerar los hoyos con marcador indeleble como indica el esquema I (anverso
del porta)
Con pipeta automática llenar los hoyos 1 y 4 con suero control positivo de
referencia
Esquema 1
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6 2
5 3
Los antígenos y sueros no deben sobrepasar el límite del hoyo.

Llenar los hoyos 2, 3, 5 y 6 con los sueros que se van a ensayar
Revisar que no queden burbujas de aire
Tapar la placa e incubar en cámara húmeda una hora a temperatura ambiente
Con capilar o pipeta Pasteur colocar el antígeno específico en el hoyo central
Colocar la placa en cámara húmeda a temperatura ambiente que no exceda los
25 ºC o en estufa a dicha temperatura
Leer diariamente durante tres días las bandas de precipitación antígeno-
anticuerpo
Transcurridas las 72 h a 25 ºC se cubre el gel con buffer citrato de sodio, durante
2-3 h para eliminar bandas inespecíficas.
Si la reacción se realiza sobre láminas o portaobjetos, luego del tratamiento con el
buffer de citrato, se lavan con agua destilada y luego se envuelven con cuadrados
de papel de filtro Watmann previamente humedecido, se dejan secar en estufa, se
moja nuevamente el papel para despegarlo y se colorean con azul de Coomasie.
Luego se decoloran y así se visualizan mejor las bandas de precipitación.
Resultados posibles:
Reacción de identidad
Reacción de no identidad
Identidad parcial
Ausencia de bandas de precipitación
Interpretación de los resultados de la ID

La primera lectura debe realizarse a simple vista, buscando la presencia y el número
de arcos de precipitación entre el suero problema y los extractos antigénicos.
Las líneas de precipitación específica (antígeno-suero control), se utilizan como
patrones de referencia en cada prueba. La aparición de una o más bandas de
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identidad por la interacción del suero del paciente con el antígeno constituye una
“reacción positiva”. Los sueros que dan bandas de precipitación, pero no dan
identidad con el suero control (línea específica de referencia) deben considerarse
sospechosos y requieren nuevos estudios
Ver esquema 2
Pocillo 1: Suero control positivo
Pocillo 2: Suero de paciente
Pocillo 3: Antígeno
Esquema 2
1 1 1
2 2
2 3
3
3
Identidad Identidad parcial No Identidad
II.A.1.2. Contrainmunoelectroforesis (CIE)

La contrainmunoelectroforesis es una técnica que tiene mayor sensibilidad que la
inmunodifusión pero que mantiene casi la misma especificidad. Se realiza la prueba
de la manera recomendada por Conti-Díaz que consiste en la
contrainmunoelectroforesis a la que se agrega una inmunodifusión secundaria, de
este modo es posible detectar anticuerpos contra parcelas antigénicas de movilidad
catódica que, de otra manera, se perderían. Para su realización se requiere agarosa,
y contar con una cuba y fuente de poder para poder realizar la corrida electroforética.
Tiene gran valor en pacientes con formas localizadas, aspergilosis broncopulmonar
alérgica y es la que brinda mayor proporción de resultados positivos en enfermos con
histoplasmosis asociada al SIDA, también puede aplicarse al diagnóstico de la
esporotricosis.
Realización de la prueba
Habitualmente se realiza sobre portaobjetos pero puede realizarse en placas de
mayor tamaño si deben analizarse varios sueros simultáneamente.
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Sobre portaobjetos se realizan 2 orificios en el centro del portaobjetos de 2 mm de

diámetro separados por 1 cm, luego se realizan 2 orificios de uno de los lados de 4
mm y separados 6 mm de los orificios pequeños. Se coloca el portaobjetos en la cuba
y se hacen puentes con tiras de papel de filtro, los orificios grandes deben quedar del
lado del polo positivo. Se cargan los orificios pequeños con el antígeno y los grandes
con el suero de los pacientes. Se corre durante 1 hora con 5 mA por portaobjetos o
100 V fijos. Una vez terminada la corrida se realizan otros 2 orificios de 4 mm del lado
catódico y también a 6 mm de los orificios pequeños, estos últimos orificios se llenan
nuevamente con suero (inmunodifusión secundaria). Se mantiene en cámara
húmeda, se hacen lecturas diarias y la definitiva se hace a las 72 h luego de cubrir el
portaobjetos con buffer de citrato de sodio durante 2 horas.
Resultados: Se informa el número de bandas anódicas y catódicas que se observan

(Esquema 3).
Estos portaobjetos se pueden teñir de la misma forma que las láminas de ID
Esquema 3:
II.A.1.3. Prueba de fijación de complemento (FC)

Otra prueba, estandarizada desde la década de 1970, es la fijación de complemento,
que tiene mayor sensibilidad que la inmunodifusión pero tiene hasta un 25% de
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reacciones cruzadas, en especial con títulos bajos. Cuando esto sucede, se

recomienda repetirla en tres semanas ya que el título de anticuerpos específicos
suele aumentar 4 ó más veces en tanto que las reacciones cruzadas con antígenos
heterólogos suelen mantener títulos estables o aumentar mucho menos
que con el antígeno homólogo. El uso combinado de esta técnica con la ID también
permite excluir las reacciones cruzadas.
FC es la técnica ideal para el seguimiento ya que permite confeccionar curvas
serológicas.
Sin embargo, en las últimas décadas ha disminuido su empleo ya que es una técnica
engorrosa, con muchos pasos, utilización de mucho material y varias causas de error.
En ocasiones podría ser reemplazada por el EIA, pero todavía no existen muchos
equipos comerciales y los métodos caseros son más difíciles de estandarizar y
comparar resultados interlaboratorios. Esta última técnica también presenta el mismo
inconveniente que la FC con respecto a las reacciones cruzadas y por lo tanto su uso
es más adecuado para seguimiento o acompañada de otros métodos más
específicos.
II.B.2. Métodos de detección de antígenos
II.A.2.1. Aglutinación de partículas de látex (AL)

Este método es utilizado universalmente para la detección de antígeno polisacárido
capsular de Cryptococcus neoformans. En la actualidad existen equipos comerciales
que cuentan con controles positivos y negativos y proteasa para destruir complejos
inmunes, y así aumentar la sensibilidad y especificidad, evitando los falsos positivos,
en especial por factor reumatoideo.
Esta técnica puede utilizarse con suero o LCR y es útil, tanto para el diagnóstico
como para el seguimiento de la criptococosis, ya que los títulos suelen ser
proporcionales a la gravedad de la enfermedad y van disminuyendo conforme el
tratamiento es efectivo. También es un alerta acerca de las recaídas ya que aumenta
en esos casos. El seguimiento debe realizarse siempre con el mismo reactivo, ya que
como fue mencionado, no todos tienen el mismo nivel de detección y por lo tanto los
títulos no son comparables.
La AL también ha sido usada para el diagnóstico de la candidiasis, aunque en ese
caso la sensibilidad es baja debido a que los antígenos mananos de Candida se
combinan rápidamente con anticuerpos y forman complejos inmunes que son
eliminados de circulación (corta vida media). Para aumentar la sensibilidad de esta
prueba se requiere la concentración de muestras (suero u orina) o la determinación
en varias muestras seriadas.
II.B.2.2. Elisa
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Este método es apto para la detección de antígenos o anticuerpos, tiene gran

sensibilidad aunque presenta reacciones cruzadas si se intenta buscar anticuerpos.
Se han utilizado diversas variables de esta metodología para aumentar especificidad
y sensibilidad y muchas de ellas incluyen el uso de anticuerpos monoclonales con
ese objetivo. En la actualidad es una técnica difundida para detectar galactomanano
de Aspergillus (para diagnóstico de aspergilosis invasora) y también hay equipos para
evidenciar glucuronoxilomanano de Cryptococcus, mananos de la pared de Candida y
para diagnóstico de histoplasmosis en huéspedes inmunocomprometidos.
II.B.3. Otras técnicas:

Numerosos investigadores han desarrollado gran variedad de pruebas inmunológicas
para el diagnóstico de las micosis, la mayoría de ellas no se han comercializado y se
han empleado solamente en centros especializados.
La inmunofluorescencia se utiliza en equipos comerciales para el diagnóstico de
neumocistosis, también por esta técnica se detectan anticuerpos antimicelio de
Candida.
La utilización de Western blot y Dot blot ha sido exitosa en el diagnóstico de algunas
formas clínicas de histoplasmosis, blastomicosis y paracoccidioidomicosis.
En la actualidad hay equipos comerciales que utilizan la inmunocromatografía para la
detección de antígeno capsular de Cryptococcus.
Valor e interpretación de las pruebas en las distintas micosis
A. Detección de antígenos
Criptococosis
La detección de antígeno capsular en líquidos orgánicos y especialmente en LCR es

importante en meningitis por Cryptpococcus y en otras formas de criptococosis
diseminada. Ello se debe a la gran rapidez, sencillez y especificidad de la técnica,
que puede hacerse en forma cualitativa o cuantitativa.
Cualitativa: Se utiliza para diagnosticar nuevos casos o confirmar reinfección en
pacientes inmunocomprometidos (SIDA y otras entidades). Se detecta antígeno
capsular que es de naturaleza polisacárida, mediante anticuerpos monoespecíficos,
dirigidos frente a él y unidos a partículas de látex. La reacción antígeno-anticuerpo se
detecta a simple vista como aglutinación.
Cuantitativa: Se emplea en el momento del diagnóstico, para contar con un valor

inicial, y para seguimiento de la evolución del paciente ya diagnosticado. Permite
evaluar la eficacia del tratamiento antifúngico empleado. Generalmente se realiza en
LCR y / o suero.
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Consultar el inserto del equipo comercial y seguir las instrucciones de su fabricante.

La sensibilidad de las diferentes técnicas comercializadas varía entre el 93% y el
100% con una especificidad del 93-98%. Pueden ocurrir falsos positivos debido a la
presencia de factor reumatoideo o en pacientes con lupus o sarcoidosis, que
desaparecen al tratar el suero con 2-mercaptoetanol. También se han descrito falsos
positivos al arrastrar medio de cultivo de agar chocolate junto con la colonia, ansas de
platino o desinfectantes, así como en la infección sistémica por Trichosporon beigelii.
Actualmente se comercializan tiras de inmunocromatografía (IMMY) que tienen muy
buena sensibilidad, con resultado muy rápido y sirven para diagnóstico. No tienen
utilidad como método cuantitativo ni para seguimiento.
Aspergilosis invasora
La detección de galactomanano se realiza por técnica de doble sándwich ELISA

(Platelia Aspergillus-Bio Rad) con un límite de detección de 1 ng/ml y una sensibilidad
de 83-100 % y una especificidad de 71-89 %. Esta técnica reconoce el
galactomanano de A. fumigatus, A. flavus y A. niger.
La variabilidad en los valores de sensibilidad y especificidad es dependiente de la
población examinada, de las condiciones en que se realiza la prueba y el régimen de
inmunosupresión que tiene el paciente.
Esta prueba sólo se realiza en centros de referencia, ya que el costo del equipo es
alto y tiene una fecha de vencimiento corta.
II. B Detección de anticuerpos
Candidiasis
Se ha cuestionado la utilidad de la detección de anticuerpos anti-Candida en
pacientes con candidiasis invasora (CI) por presentar dos limitaciones:
• la detección en pacientes que están sólo colonizados por Candida. Con
antígenos citoplasmáticos habitualmente en pacientes colonizados la ID es
negativa y hay títulos altos en endocarditis, u otras formas diseminadas.
• la respuesta de anticuerpos puede estar retrasada, reducida o no existir en
pacientes inmunodeprimidos.
A diferencia de los anticuerpos antimicelio, los anticuerpos anticitoplasmáticos no se

positivizan en colonización.
Otra metodología que es detecta anticuerpos antimicelio es la inmunofluorescencia,
existen equipos comerciales (Vircell), aunque no están disponibles en nuestro país.
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Esta prueba al igual que la CIE se deben aplicar a pacientes con candidemias
persistentes, neumonitis, endocarditis, abscesos por heridas intra-abdominales,
pacientes con catéteres urinarios o intravenosos, pacientes debilitados, aquellos que
reciben tratamiento inmunosupresor antibiótico o antineoplásico prolongado, que
presentan fiebre de origen desconocido o cuya enfermedad siga un curso no habitual.
Las pruebas serológicas se usan para determinar la significación clínica de los
aislamientos de C. albicans y otras especies del género a partir de muestras no
estériles. La detección de anticuerpos precipitantes se considera presuntiva de
candidiasis sistémica, pero también puede indicar candidemia transitoria o
colonización.
La ID y la CIE tienen una sensibilidad del 90 % para casos comprobados de
candidiasis sistémica, son específicas para todo el género Candida.
Cuando se sospecha candidiasis y las reacciones de ID son negativas con el
antígeno de C. albicans la prueba debe repetirse con el antígeno de C. krusei.
La decisión de tratar al paciente no debe basarse sólo en los datos serológicos, sino
en todos los datos clínicos y de laboratorio disponibles. En las pruebas de CIE se
debe probar el suero del paciente frente a diluciones del antígeno al ½ y ¼ para
determinar la concentración óptima de éste (el exceso de antígeno o de anticuerpo
provoca ausencia completa de bandas de precipitación por el llamado fenómeno de
zona y se redisuelven por exceso de antígeno o anticuerpo). Un aumento cuádruple
del título o uno mayor de 1/8 se considera sugerente de candidiasis invasora. El
antígeno de Candida da bandas de precipitación A, B y C frente al suero control. Los
sueros de los pacientes que forman de una a tres bandas de identidad con el suero
control se consideran positivos. Debe sospecharse candidiasis sistémica cuando el
estudio de muestras seriadas de suero muestre conversión de negativo a positivo o
aumento del número de bandas de precipitación.
Descensos del número de bandas puede indicar éxito de la terapia antifúngica o
eliminación de la colonización por remoción de catéteres, sondas o válvulas
contaminadas.
Aspergilosis crónicas
La detección de anticuerpos específicos en suero, es complementario para confirmar

el diagnóstico de aspergiloma pulmonar (AP) y de la aspergilosis bronco pulmonar
alérgica (ABPA) y en la aspergilosis semiinvasora crónica. También tiene gran
utilidad en el seguimiento de estas micosis ya que los títulos descienden o las
pruebas se negativizan cuando se logra la curación (ej. después de la cirugía).
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Sólo se consideran positivos los sueros que dan una o más bandas de identidad con
el suero control. Cuando hay reacciones de no identidad, pero sí las bandas de
precipitación, se consideran sospechosas y se continúa investigando el caso. Una de
las causas de esto último puede ser la presencia de proteína C reactiva (PCR) en el
suero del paciente. Esta proteína aparece aumentada en enfermedades inflamatorias
y puede reaccionar con un glucopéptido presente en algunos antígenos aspergilares
y se denomina sustancia C.
Esta sustancia se disuelve en presencia de buffer citrato de sodio al 5 % en solución
salina, razón por la cual se lavan las placas con citrato y solución fisiológica (Sol.Fis)
durante 2 horas.
Las bandas que persisten luego de los lavados y no dan identidad con el suero
control, justifican nuevos estudios ya que pueden estar igualmente asociadas a
aspergilosis.
La presencia de una o más bandas puede indicar aspergiloma (bola fúngica),
aspergilosis broncopulmonar alérgica (ABPA) o aspergilosis invasora crónica.
Cuando se observan una o dos bandas puede indicar cualquier forma clínica de la
enfermedad.
Cuando aparecen tres a cuatro bandas está asociada invariablemente a bola fúngica
o aspergilosis invasora crónica.
Los sueros de los pacientes deben probarse frente a los antígenos específicos de A
.fumigatus, A. níger y A. flavus, por este método ya que no hay prácticamente
reacciones cruzadas entre estos antígenos
Las reacciones de ID son positivas en el 90 % de los casos de aspergilomas y en el
70 % de aspergilosis broncopulmonar alérgica.
Coccidioidomicosis
Los enfermos con coccidioidomicosis habitualmente forman anticuerpos
específicos que pueden ser detectados por las técnicas serológicas convencionales
tanto en suero como en LCR. Los métodos estandarizados son la inmunodifusión en
gel de agar, la fijación de complemento, también puede utilizarse la precipitación en
tubo en las formas agudas o de primoinfección, esta reacción puede ser reemplazada
por la inmunodifusión con antígeno calentado (fracción termoestable) que detecta
IgM, en tanto que la fijación de complemento puede suplirse con la inmunodifusión
CF (con antígeno no calentado) que permite detectar los anticuerpos IgG que
persisten luego de la etapa aguda. Los títulos de la fijación de complemento son
proporcionales a la gravedad de la afección pero cuando éstos son ≤ 1/8 puede
tratarse de reacciones cruzadas con antígenos de H. capsulatum o B. dermatitidis. En
las formas diseminadas los títulos serológicos suelen ser superiores a 1/32; en
general cuando el título es ≥ 1/16 se sospecha compromiso extrapulmonar. También
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se han desarrollado pruebas de enzimoinmunoensayo que son de alta sensibilidad

pero menos específicas que las anteriores; recientemente se detectó antigenuria
utilizando ELISA para H. capsulatum en 58,3% de pacientes con cocidioidomicois y
en base a este equipo se desarrolló uno similar que detecta galactomanano de
Coccidioides con un 70,8% de sensibilidad y que solamente presentaba 10,7% de
reacciones cruzadas en pacientes con otras micosis sistémicas y la reacción fue
negativa en 99,4% de individuos sanos o pacientes con patologías no micóticas.
Paracoccidioidomicosis
El diagnóstico serológico de esta afección se basa fundamentalmente en las pruebas
de inmunodifusión cuali o semicuantitativa y la contrainmunoelectroforesis en tanto
que la fijación de complemento es un método que puede realizarse en centros
especializados.
Los antígenos que brindan mejores resultados son los provenientes de cultivos de
fase levaduriforme, sin embargo también pueden utilizarse filtrados de la fase
micelial. Una de las principales fracciones antigénicas con alta especificidad es una
glicoproteína de 43 kDa, también puede utilizarse el exoantígeno E7. Algunos
antígenos crudos pueden dar reacciones cruzadas.
Los títulos de anticuerpos son proporcionales a la gravedad de la afección y
disminuyen a medida que el paciente mejora. Como habitualmente esta enfermedad
no se presenta en inmunodeprimidos graves (que no forman bien anticuerpos),
generalmente no se requiere la utilización de técnicas serológicas más sensibles y
solamente en laboratorios de investigación se han implementado métodos de
detección de antígenos circulantes.
En caso de compromiso del SNC se puede emplear la ID o la CIE para evidenciar
anticuerpos en el LCR.
Histoplasmosis
La prueba tamiz es la ID y se consideran pacientes con histoplasmosis activa los que
dan reacciones de identidad para una o más bandas con el suero control
(especificidad de la 100 %) (bandas M y H). La banda M se encuentra cerca del hoyo
del antígeno y la banda H cerca del hoyo del suero. Esta última es menos frecuente y
se encuentra con mayor frecuencia en pacientes con histoplasmosis activa y
progresiva. La banda M puede ser indicio de una histoplasmosis aguda o crónica, de
una infección pasada o de una prueba cutánea reciente. Si no hubo una reacción
cutánea previa y aparece la banda M se interpreta como infección precoz, ya que
este anticuerpo aparece antes que la banda H y desaparece más lentamente. El 70 %
de los pacientes con histoplasmosis comprobada tienen la banda M y sólo el 10 % las
bandas M y H.
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Si no hay bandas M y / o H el resultado se interpreta “negativo”. Es necesario tener la

precaución de realizar la extracción de sangre para estas pruebas antes de realizar
pruebas intradérmicas ya que si estas últimas son positivas pueden positivizar la ID
(banda M).
Esta prueba junto con la CIE son de gran valor en el diagnóstico de meningitis y dan
resultados positivos en el LCR.
Las técnicas serológicas estandarizadas para la detección de anticuerpos anti-
Histoplasma son la inmunodifusión y la fijación de complemento, también puede
utilizarse la contrainmunoelectroforesis con muy buenos resultados y en algunos
países, también se comercializan equipos para detectar anticuerpos por ELISA. En
los enfermos con SIDA estas pruebas solo brindan resultados positivos en menos del
50% de los casos, excepto el ELISA donde la proporción de resultados positivos es
mayor. En los pacientes trasplantados también el uso es limitado ya que los títulos
suelen ser bajos y ocasionalmente podría ser difícil diferenciar entre histoplasmosis
aguda o infección previa.
En otros grupos de inmunocomprometidos estas pruebas serán de mayor o menor
utilidad según la capacidad de respuesta inmune humoral de los pacientes. Si el
resultado es negativo no excluye la enfermedad pero un resultado positivo de alguna
de las pruebas de precipitación puede ser el primer elemento de diagnóstico en estos
pacientes. También se han utilizado otros métodos de detección de anticuerpos como
el Western blot que han demostrado una sensibilidad del 90% en las formas
pulmonares agudas con 100% de especificidad utilizando un antígeno deglicosilado.
La detección de antígenos en suero y especialmente en orina mediante
pruebas de ELISA es ya rutinaria en algunos países, existen al menos 3 equipos
comerciales de primera y segunda generación, aunque todavía no se ha logrado la
especificidad deseada (hay reacciones cruzadas con paracoccidioidomicosis y
blastomicosis, ya que aún no se identificado completamente el antígeno liberado en
orina; además pueden encontrarse resultados contradictorios según el equipo
utilizado. La sensibilidad mejoraría cuando se tratan las muestras con EDTA y calor
para romper los complejos inmunes, También el uso de anticuerpos monoclonales
que reconoce epitopes especie-específicos en un ELISA de inhibición ha demostrado
una sensibilidad de 71% y especificidad de 98%. También puede detectarse antígeno
en LCR y lavado broncoalveolar.
Algunos trabajos demuestran que en el 90% de las formas diseminadas se encuentra
antígeno en orina y en el 75% de los pacientes con histoplasmosis pulmonar aguda;
los títulos de antigenuria serían mayores en las formas diseminadas y su disminución
se correlaciona con la mejoría clínica.
En nuestro país, aún no se cuenta con equipos comerciales para realizar esta
técnica. Los equipos de detección de antígeno galactomanano de Aspergillus también
presentan reacciones cruzadas en pacientes con histoplasmosis porque
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probablemente en histoplasmosis también el carbohidrato eliminado por orina sea

galactomanano.
Exoantígenos
La producción de exoantígenos puede utilizarse para la identificación de cultivos de
fase micelial de Histoplasma, Coccidioides, Paracoccidioides que no presenten la
morfología característica e independientemente de su capacidad de esporulación.
Estos hongos tienen la capacidad de producir antígenos libres de células
(exoantígenos). Estos antígenos se detectan por ID utilizando la misma metodología
que para la detección de anticuerpos. Se obtienen mediante la extracción con una
solución acuosa (1:5000) de mertiolato de sodio que se añade sobre la superficie de
un cultivo de 8-10 días y se deja 24-48 h a 25 °C. Se concentra el extracto por
ultrafiltración y luego se prueba la presencia de bandas de identidad con un antisuero
específico.
En la actualidad muchos exoantígenos se utilizan para detectar anticuerpos
específicos.
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GOBIERNO DE LA CIUDAD DE
BUENOS AIRES
RED DE MICOLOGIA PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A LOS
ANTIFÚNGICOS Página 1 de 20
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1.0) OBJETIVO
Determinar la sensibilidad a los antifúngicos frente levaduras de los géneros

Candida y Cryptococcus.
2.0) ALCANCE
Todos los aislamientos de levaduras de los géneros Candida y Cryptococcus

aislados de materiales en donde estos microorganismos pueden ser causa de
infección sistémica o infecciones recidivantes por estos agentes.
3.0) PERSONAL AFECTADO
Bioquímicos y técnicos del área Micología, pertenecientes a los laboratorios de

los Hospitales del GCBA.
4.0) REFERENCIAS
1. Arechavala AI, Ochiuzzi ME, Borgnia MD, Santiso GM. Fluconazole

and amphotericin B susceptibility testing of Cryptococcus neoformans:
Results of minimal inhibitory concentrations against 265 isolates from
HIV:positive patients before and after two or more months of antifungal
therapy.Rev. Iberoam. Micol. 2009; 26: 194-197.
2. Cantón Lacasa E, Martín-Mazuelos E, Espinel-Ingroff A. Métodos
estandarizados por el CLSI para el estudio de la sensibilidad a los
antifúngicos (documentos M27-A3, M38-A y M44-A). En: Pemán J,
Martín-Mazuelos E, Rubio Calvo MC. Guía práctica Identificación y
diagnóstico en Micología Clínica. Rev Iberoam Micol Edición en CD
2010
3. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Reference method
for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts. Approved
standard Third Edition, 2008; M27-A3. Wayne, Pa 19087-1898 USA.
Elaborado por: Ivana Maldonado Aprobado por: Integrantes y Coordinador de la RM

Fecha: noviembre de 2010 Fecha: julio de 2011
Versión Original
Revisado por: Liliana Guelfand, Alicia Arechavala
Fecha: abril de 2011
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Fecha: julio 2011
BUENOS AIRES
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4. Cuenca-Estrella M, Mellado E, Gómez-López A. et al. Evaluation of the

Commercial Method ATB® F2 for the Detection in Vitro of Antifungal
Resistance and its Correlation with the Reference Method of the
European and the Micromethod of the NCCLS. Poster M-1601, 45th
Annual ICAAC, New Orleans, September 2005.
5. European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases.
EUCAST. Method for the determination of Minimum Inhibitory
Concentration MIC) by Broth Dilution of Fermentative Yeasts.
Discussion Document E Dis 7.1; 2002.
6. Manual del Curso a distancia y taller: “Determinación de la resistencia
a los antifúngicos en el laboratorio”. Departamento Micología INEI.
ANLIS. Dr Carlos G. Malbrán. Buenos aires, Argentina, 2006.
7. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Method for
antifungal disk diffusion susceptibility testing of yeasts; Approved
guideline, 2004; M44-A. Wayne, Pa, USA.
8. Rodero L, Córdoba S, Vivot W, Campo M, Corfield P, Olguín C, et al.
Métodos de difusión con discos para la determinación de sensibilidad
a fluconazol en aislamientos de Candida spp. Rev Argent Microbiol
2006, 38: 155-163.
9. Rodriguez- Tudela JL,Donnelly JP, Arendrup MC, Arikan S, Barchiesi
F, Bile J, et al. 2008. EUCAST technical Note on fluconazole. Clin
Microbiol Infect. 14:193–5.
10. Ochiuzzi ME, Santiso GM, Arechavala AI. Correlation of Etest and
Neo-Sensitabs diffusion assays on Mueller-Hinton-methylene blue
agar with broth microdilution reference method (CLSI-M27-A2) for
testing susceptibilities of Cryptococcus neoformans to amphotericin
B and fluconazole.Medical Mycology, 2010; 48:893-896.
11. User’s Guide NEO-SENSITABS TM Susceptibility testing, 18th Ed.
2005/2006. Rosco Diagnostica A/S.
5.0) DEFINICIONES
Pruebas de sensibilidad a los antifúngicos.
6.0) RESPONSABILIDADES
Jefe de Sección Microbiología, Bioquímico a cargo del área Micología.

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7.0) DESARROLLO
7.1) FUNDAMENTO
Se basa en determinar la sensibilidad de las levaduras frente a los antifúngicos

habituales. Las pruebas de sensibilidad se podrán realizan por los siguientes
métodos:
¾ Microdilución en caldo (CLSI y EUCAST): A partir de los ‘80, el

CLSI (Clinical Laboratory Standard Institute, antes National Committee for
Clinical Laboratory Standards (NCCLS)) inició los trabajos de estandarización
de técnicas que permitieran detectar la resistencia in vitro a los antifúngicos.
Luego de publicar distintos documentos, M27-T, M27-P, M27-A, en 2002 dio a
conocer el documento M27-A2 (estándar aprobado) que sienta las bases para
la determinación de la concentración inhibitoria mínima (CIM) para las
levaduras de géneros Candida y Cryptococcus. En 2008 se conoció la última
actualización, el M27-A3.
Existe otro estándar del European Committee for Antimicrobial Susceptibility
Testing (EUCAST) documento E. Def 7.1 que permite obtener la CIM para las
levaduras del género Candida. Ambos estándares son fiables, reproducibles y
muy útiles para la vigilancia epidemiológica y gracias a ellos se puede conocer
el perfil de sensibilidad de las distintas especies, y establecer cual sería el
tratamiento inicial más adecuado. Sin embargo, la realización de estas técnicas
es onerosa y muy laboriosa, por lo que su implementación se ve limitada a los
centros de referencia.
¾ ATB® Fungus 3 (ATB F3): técnica no colorimétrico comercial, basado en el

método de referencia National Committee for Clinical Laboratory Standards
(CLSI). Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of
yeasts. Approved standard. 2002; Document M27-A2. Villanova, Pa. USA y
Discusión 7.1 (MR). El ATB® Fungus 3 consiste en una galería de 16 pares de
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cúpulas, que contienen 5 antifúngicos: anfotericina B (AMB), fluconazol (FCZ),

itraconazol (ITZ), Voriconazol (VCZ), 5 fluorocitosina (5FC), en distintas
concentraciones. Según el valor de CIM se pueden categorizar los aislamientos
como sensibles (S), sensibles dependientes de la dosis o intermedios (SDD) y
resistentes (R). En el caso de 5 fluorocitosina (5FC) sólo puede obtenerse a la
categoría de sensible (S) o resistente (R). Las galerías y los medios se
conservan a 2-8°C en oscuridad hasta la fecha de caducidad indicada sobre el
equipo.(Ver inserto)
¾ Discos de fluconazol Malbrán (DM): es un método de difusión en agar para

FCZ. El Departamento de Micología INEI, ANLIS “Dr. C. Malbrán" desarrolló y
estandarizó este método de difusión en agar, utilizando discos de papel
cargados con FCZ. Esta técnica es aplicable a la rutina de los laboratorios y
permite realizar el tamizaje para detectar los aislamientos de levaduras del
género Candida, sensibles al FCZ.
¾Tabletas de Neo-Sensitabs Rosco® (T): es un método de difusión en agar.

En las Tabletas de Neo-Sensitabs Rosco®, el antifúngico se encuentra en
forma cristalina y se mezcla con una sustancia inerte sin actividad
antimicrobiana que no interfiere con ningún aspecto del proceso. Existen varias
tabletas para los antifúngicos más habituales en el mercado; pero las más
usadas son FCZ y VCZ. Este método se basa en el estándar M44-A que
público el CLSI en el 2004. Las tabletas se pueden conservar en heladera entre
2 y 8 °C hasta la fecha de caducidad indicada por su fabricante o a temperatura
ambiente por 2 meses. (Ver inserto)
¾ Tiras con gradiente de concentración de un Antifúngico (Etest): Es una

técnica cuantitativa para la determinación de la CIM a los antimicrobianos.
Consiste en la utilización de una tira de plástico que lleva un gradiente de
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concentración del antifúngico en µg/ml. El valor de la CIM se indica por la

formación de una elipse en la intersección entre el crecimiento del
microorganismo y la zona de inhibición. (Ver inserto)
¾ Tarjetas de sensibilidad Vitek 2: es un sistema automatizado, que utiliza

tarjetas plásticas descartables, que contienen una serie pareada de diluciones
de los siguientes antifúngicos: anfotericina B (rango de concentración 0.25 a 16
g/ml), 5 fluorocitosina (rango de concentración, 1 a 64 g/ml), y voriconazol
(rango de concentración 0.125 a 8 g/ml).
Deben mantenerse en sus sobres a temperatura entre 2-8ºC hasta ser
utilizadas.
La lectura y la interpretación se realizan en forma automática, a través del
software del equipo.
7.2) REACTIVOS:
¾ Microdilución en caldo (CLSI, EUCAST):
• Medio RPMI 1640

• Glucosa al 2% (solo EUCAST)
• 0.165 M buffer ácido morfolino propano sulfónico (MOPS)
• Drogas antifúngicas
• Placas para cultivo celular estériles
• Lector de microplacas a 405 nm (solo EUCAST)
¾ATB® Fungus 3 (ATB F3):

● ATB Fungus 3 (bioMérieux, Marcy I`Etoile, France)
- 25 galerias de ATB FUNGUS 3 en embalaje individual
- 25 tapas de incubación
- 25 ampollas de ATB F2 Medium
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- 25 fichas de resultados
- 1 ficha técnica
¾Discos de fluconazol Malbrán (DM), Tabletas de Neo-Sensitabs Rosco®

(T):
• Placas de Petri de 10 cm de diámetro

• Solución 0,15 M de cloruro de sodio estéril (solución salina 0,85%) (SSE)
• Agar Muller- Hinton
• Glucosa
• Azul de metileno
• Discos de fluconazol Malbrán (DM) 25µg
TM
• Tabletas de Neo Sensitabs Rosco (T): fluconazol 25 µg, voriconazol
1µg y itraconazol 8 µg, ketoconazol 15 µg, anfotericina 10 µg, 5-
fluorocitocina 1µg, caspofungina 5 µg.
¾ Tiras con gradiente de concentración de un Antifúngico (Etest):
• Solución 0,15 M de cloruro de sodio estéril (solución salina 0,85%) (SSE)

• Placas de Petri de 10 cm de diámetro
• Medio RPMI 1640, o Mueller Hinton con azul de metileno.
• Glucosa al 2%
• Bacto agar
• Tiras con los antifúngicos: anfotericina, fluconazol, itraconazol, 5-
fluorocitocina, caspofungina, anidulafungina, voriconazol, posaconazol,
ketoconazol
¾ Tarjetas de sensibilidad Vitek 2:

• Tarjetas de sensibilidad Vitek 2 (AST YSO1)Solución fisiológica estéril
• Tubos de poliestireno
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7.3) MUESTRA:
Aislamiento previamente identificado de Candida spp o Cryptococcus spp
76.4) TÉCNICA
Es muy importante que el inoculo se prepare de colonias aisladas

independientemente de la metodología utilizada.
Concentración Inhibitoria Mínima (CIM)
¾ CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute) Método de referencia de

microdilución M27-A3
Medio de cultivo: RPMI 1640 con glutamina y sin bicarbonato (Gibco, ICN,
Oxoid, Sigma), tamponado a pH 7 con 0.165 M de buffer ácido morfolino
propano sulfónico (MOPS) (ICN, Sigma)
Antifúngicos: Anfotericina B, Azólicos, Equinocandinas. Debe tenerse en
cuenta la potencia de la droga utilizada para calcular la concentración de la
solución madre a preparar. Las soluciones concentradas de antifúngicos
insolubles en agua se preparan en DMSO. Los antifúngicos solubles en agua:
FCZ, 5-FC, caspofungina (CPF) y micafungina (MCF) se disuelven en agua. La
solución madre en el primer caso debe ser de 1 600 μg/ml (100 veces superior
a la concentración más alta de antifúngico a ensayar) y en el caso de drogas
solubles debe ser 10 veces superior a la mayor concentración de antifúngico a
ensayar. Las soluciones madre se guardan en alícuotas de 1,1 ml en crioviales
estériles y se congelan a -70 °C (máximo 6 meses) o a -40 °C (hasta 2 meses)
Placas: se utilizan placas de 96 pocillos estériles con tapa con fondo en U.
Preparación de la dilución de antifúngicos: se recomienda el método de las
diluciones dobles seriadas aditivas.
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Para antifúngicos solubles las concentraciones finales van de 64 a 0,12 μg/ml.

A partir de la solución madre se prepara la serie de diluciones 10 veces
superiores a las que se utilizarán y luego se diluyen 1/5 añadiendo 4 ml de
RPMI a cada tubo con 1 ml de la correspondiente solución de antifúngico y se
dispensan 100 μl de cada una de ella en los pocillos de 1 a 10
(concentraciones de 128 a 0,25 μg/ml) que es el doble de las concentraciones
finales deseadas.
En el caso de drogas insolubles, se preparan de la misma manera los tubos
con diluciones a una concentración 100 veces superior a cada concentración
final deseada en DMSO. Luego se diluye 1/50 (100 μl de esta dilución en 4,9 ml
de RPMI) y así quedan preparados en concentración doble a la concentración
final deseada (entre 32 y 0,06 μg/ml).
Se llenan los pocillos de 1 a 10 de cada de todas las filas con las distintas
concentraciones de antifúngico, en el pocillo 11 se colocan 100 μl de RPMI
(para utilizar como control de crecimiento) y en el pocillo 12 se colocan 200 μl
de RPMI que sirve como control de esterilidad.
Una vez preparadas, las placas se conservan envueltas en bolsas plásticas o
papel de aluminio y se congelan a – 70°C o – 40 °C hasta el momento de su
uso (la caducidad de la placa debe referirse al momento de preparación de la
solución madre).
Preparación del inóculo: Cada aislamiento almacenado o congelado debe
tener al menos 2 pases por agar de Sabouraud glucosado (SDA).
El inóculo se prepara tomando 5 colonias > 1 mm de un cultivo de 24 h en SDA
que se resuspenden en SSE (NaCl 0,85%), se agita y se lee en
espectrofotómetro a 530 nm para ajustar a densidad óptica de 0,5 McFarland
(1-5 x 106 UFC/ml), se diluye 1:1000 en medio RPMI (1-5 x 103 UFC/ml) y esta
es la suspensión que se utiliza para inocular las placas (doble de la
concentración final). Se siembran 100 μl en cada pocillo del 1 al 11.
En el caso de Cryptococcus el cultivo es de 48 h en SDA.
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Siempre debe realizarse un control del inóculo utilizado sembrando una placa
de agar cromogénico con 10 μl del pocillo control (11) y a las 24 h se cuentan
las colonias, esto permite controlar pureza y concentración del inóculo.
Incubación: las placas se incuban a 35 °C durante 48 h para Candida y 72 h
para Cryptococcus.
Lectura: la lectura visual se realiza con la ayuda de un espejo.
Para los azoles y 5-FC la CIM es la concentración más baja de droga que
produce una reducción aparente del crecimiento de la levadura ≥ 50%
comparada con el control de crecimiento a las 48 h de incubación.
Para las equinocandinas: la lectura es igual que para azoles pero se realiza a
las 24 h.
La CIM de AMB es la concentración más baja de antifúngico que inhibe el
crecimiento de la levadura totalmente (100% de inhibición).
Cepas control de calidad: C. parapsilosis ATCC 22019 y C. krusei ATCC
6258.
Puntos de corte: Se dispone de puntos de corte para: FCZ, VCZ, ITZ,
equinocandinas y 5-FC.
Intervalos de las CIM (μg/ml)
Antifúngico
Sensible S-DD Intermedio Resistente
Fluconazol ≤8 16 - 32 ≥ 64
Itraconazol ≤ 0,12 0,25 - 0,5 ≥1
Voriconazol ≤1 2 ≥4
5-fluorocitosina ≤4 8 – 16 ≥ 32
Caspofungina ≤2 >2
Micafungina ≤2 >2
Anidulafungina ≤2 >2
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¾ EUCAST (European Society of Clinical Microbiology and Infectious

Diseases): método de referencia E. Def 7.1 del EUCAST
Medio de cultivo: RPMI 1640 con 2 % de glucosa tamponado a pH 7 con
0.165 M buffer ácido morfolino propano sulfónico (MOPS) (Sigma, Chemical
Co, St. Luis EUA).
Antifúngicos: se ensaya la actividad in vitro de AMB (potencia 80%) y 5-FC
(potencia 99,9%) (Sigma, Chemical Co, St. Luis EUA), FCZ (Pfizer, S. A.,
Argentina) (potencia 99,9%) e ITZ (Janssen, Argentina) (potencia 99,9%). Las
soluciones stock de AMB, ITZ y FCZ se preparan en dimetilsulfóxido (DMSO)
(Sigma, Chemical Co, St. Luis EUA) y la de 5-FC en agua destilada estéril
(ADE). Los rangos de concentraciones en μg/mL : AMB e ITZ 0,015-16, 5-FC y
FCZ 0,13-128.
Micrométodo: se utilizan placas para cultivo celular estériles (96 celdas de
fondo plano) (Nunclon 167008, Nunc, Naperville, IL, EUA). Se dispensan 50 µL
por pocillo de las distintas concentraciones de antifúngicos desde la columna 1
a la 11, la columna 12 se reserva para ser cargada con medio de cultivo sin
inóculo (control de esterilidad y blanco de lectura). Las placas así preparadas
se conservan a –70ºC durante un tiempo máximo de 2 meses.
Inóculo: para todos los métodos, el testeo se realiza a partir de un cultivo de
24 h a 35ºC en agar Sabouraud.
Se prepara un inóculo de turbidez 0,5 McFarland en solución 0,15 M de cloruro
de sodio estéril (solución salina 0,85%) (SSE) (aproximadamente 1-5 x 106
UCF/mL). Se siembran las microplacas y se incuban 24 y 48 h. La lectura se
realiza en un lector de microplacas a 405 nm (Labsystems Multiskan Multisoft,
Basingstoke, UK). Se calcula el 100% de crecimiento promediando la
absorbancia de las celdas controles sin droga, y se considera la CIM para AMB
cuando la disminución de la densidad óptica sea de un 95% comparada con el
control de crecimiento, mientras que para los azoles se considera una
reducción del 50%.
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Fecha: julio 2011
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Se consideraran los siguientes puntos de corte en μg/mL:

Antifúngico
Fluconazol ≤2 4 ≥4
Itraconazol ≤ 0,13 0,25 - 0,5 ≥1
5-fluorocitosina ≤4 8 – 16 ≥ 32
Anfotericina* ≤1 >2
*No hay puntos de corte disponibles, estos son valores sugeridos según las
CIM poblacional de los aislamientos.
¾ATB® F3: la técnica se lleva a cabo siguiendo estrictamente las indicaciones

del fabricante.
ATB® F3 consiste en una galería que contiene 16 pares de cúpulas. El primer
par, sin antifúngico, sirve de control de crecimiento. Las 15 cúpulas siguientes
contienen 5 antifúngicos en las siguientes concentraciones: 5-FC 4 y 16 μg/ml,
AMB 0,5-16 μg/ml; FCZ 0,25- 128 μg/ml; ITZ 0,125- 4 μg/ml y VCZ 0,06- 8
μg/ml. Inóculo: a partir de un cultivo puro de hasta 96 hs se realiza una
suspensión de turbidez equivalente a 2 de la escala McFarland, luego se
transfiere 20 μl de esta suspensión al ATB F3 Medium y se procede a inocular
las galerías distribuyendo 135 μl de ATB F3 Medium por cúpula
(aproximadamente 3x104 levaduras/ml o 4x103 levaduras por cúpula). Se
coloca la galería en un contenedor hermético con un papel absorbente
humedecido. Se incuba 24 hs (+/- 2 horas) en aerobiosis a 35ºC. Cuando el
crecimiento es insuficiente se incuba 24 hs más. En todos los ensayos se
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verifica la presencia de un crecimiento suficiente en las cúpulas testigo. La

lectura se realizará de manera visual.
Se tomaran como puntos de corte los siguientes valores de CIM para

Candida spp.:

Antifúngico
Fluconazol ≤8 16 - 32 ≥ 64
Itraconazol ≤ 0,13 0,25 - 0,5 ≥1
5-fluorocitosina ≤4 8 - 16 ≥ 32
Anfotericina* ≤1 >2
*No hay disponibles puntos de cortes, estos son valores sugeridos según las
Para Cryptococcus neoformans:

Antifúngico
Fluconazol ≤4 8 ≥ 16
Métodos de difusión en agar
¾Discos BD-BBL, Oxoid, Discos de fluconazol Malbrán y Tabletas de Neo-

Sensitabs Rosco® (T):
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A partir de un cultivo de 24 h a 35ºC en Agar Sabouraud glucosado, se prepara

un inóculo de turbidez 0.5 McFarland en SSE.
Se utilizan placas de Petri de 10 cm de diámetro, con 25 ml de agar Muller-
Hinton, suplementado con 2 % de glucosa y con el agregado de azul de
metileno, en una concentración final de 0.5 μg/ml (medio MHm).
La superficie de la placa de petri con medio MHm se hisopa en tres direcciones
con el inoculo correspondiente. Luego se colocan los discos/tabletas de
antifúngico, con la ayuda de pinza estéril. Se incuban las placas invertidas a 36
± 2°C, durante 24 horas. Si transcurridas las 24 hs de incubación, los halos no
son claramente distinguibles, se prolonga la incubación 24 horas más para dar
lugar a especies de desarrollo más lento
Lectura e interpretación de los resultados:
Lectura:
Se utiliza un calibre o una regla para medir el diámetro del halo externo de la
zona de inhibición.
Importante: realizar la lectura de las colonias con desarrollo confluente. Dentro
de la zona de inhibición pueden crecer colonias que muestren un diámetro
menor al de las colonias externas. Estas colonias no deben ser consideradas
mutantes resistentes.
Interpretación de los resultados:
Discos de Fluconazol Malbrán
Diámetro del halo en mm

Antifúngico
Sensible A determinar por CIM
Fluconazol ≥ 16 < 16
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Tabletas de fluconazol Neo Sensitabs TM Rosco

Antifúngico
Anfotericina B* ≥ 15 14-10 <10
Fluconazol ≥ 22 21-15 ≤14
Itraconazol ≥16 15-10 <10
Voriconazol ≥17 16-14 ≤13
5-fluorocitosina ≥20 19-12 ≤11
Caspofungina ≥15 14-12 ≤11
Ketoconazol ≥30 29-23 ≤22
¾ Tiras con gradiente de concentración de un Antifúngico (Etest):

A partir de un cultivo de 24 h a 35ºC en Agar Sabouraud glucosado , se
prepara un inóculo de turbidez 0.5 McFarland en SSE.
El medio empleado es RPMI-2% glucosa con 1,5% de Bacto agar. La superficie
de la placa de petri con RPMI-2% glucosa con 1,5% de Bacto agar se hisopa
en tres direcciones con el inoculo correspondiente. Luego se coloca la tira de
plástico con el antifúngico, con la ayuda de una pinza estéril. Se incuba a 36 ±
2°C, durante 24 horas. Si el crecimiento es lento se incubaran 24 horas más.
Los criterios de interpretación son los siguientes:
Se tomaran como puntos de corte los siguientes valores de CIM para Candida
spp.: AMB*, sensible (S) ≤ 1μg/ml y resistente (R) > 2 μg/ml ; 5-FC, S ≤ 4 μg/ml,
sensible dependiente de la dosis o intermedio (SDD) 8-16 μg/ml y R ≥ 32
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μg/ml; FCZ, S ≤ 8 μg/ml, SDD 16-32 μg/ml y R ≥64 μg/ml e ITZ, S ≤0.125μg/ml,
SDD 0.25-0.50 μg/ml y R ≥1 μg/ml, VCZ S ≤ 1μg/ml, SDD 2 μg/ml y R ≥ a
4μg/ml.
*No hay disponibles puntos de cortes, estos son valores sugeridos según las
Antifúngico
Fluconazol ≤8 16 - 32 ≥ 64
Itraconazol ≤ 0,125 0,25 - 0,5 ≥1
Caspofungina ≤2
Anidulafungina ≤2 >2
Anfotericina B ≤ 1
¾ Tarjetas de sensibilidad Vitek: Realizar en un tubo estéril de poliestireno,

una suspensión en S.F. estéril, de un subcultivo de la levadura, obtenido luego
de 24 hs de incubación en agar Sabouraud a 35°C. Ajustar la turbidez a 2.0
de escala McFarland, usando el instrumento provisto por bioMérieux,
DensiChek, y diluir según las indicaciones del fabricante Una vez preparado el
inóculo, se introducen a lo largo del cassette del equipo, el tubo y una tarjeta
para cada microorganismo a evaluar.
Los cassettes cargados se introducen en el aparato ; a continuación y de
manera automática se produce el llenado de las tarjetas, su incubación y
lectura.
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El tiempo de incubación varía entre 9.1 a 27.1 hs, según la velocidad de

crecimiento del pocillo control libre de antifúngico. Los resultados se expresan
como CIM en µg/ml.
Análisis de resultados: según los puntos de corte de CLSI
Antifúngico
Fluconazol ≤8 16 - 32 ≥ 64
Itraconazol ≤ 0,13 0,25 - 0,5 ≥1
6.5) PRECAUCIONES DE SEGURIDAD:
• Consultar el Manual de Bioseguridad (MB)
6.8) CONTROL DE CALIDAD
Candida krusei ATCC 6258 y Candida parapsilosis ATCC 22019
ATB F3:
Antifúngico CIM μg/ml

C. parapsilosis C. krusei
Fluconazol 1-4 8-32
Itraconazol 0,125-0,5 0,125 - 0,5
Voriconazol 0,06-0,125 0,125 - 0,5
5-fluorocitosina S I/R
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Anfotericina B ≤ 0.5 0,5-2
Tabletas de fluconazol Neo Sensitabs TM Rosco:

Antifúngico
Fluconazol 22-23 -
Itraconazol 19-26 16-22
voriconazol 28-37 16-25
anfotericina 20-26 17-23
ketoconazol 26-35 22-29
Discos de Fluconazol Malbrán:

Antifúngico
Fluconazol 8-10 25-32
Tiras con gradiente de concentración de un Antifúngico (E-test):

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Fecha: julio 2011
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CIM µg/ml, 48 hs
Antifúngico
Anfotericina B 0.25-1 0.5-2
Anidulafungina 0.5-4 0.016-0.125
Caspofungina 0.25-2 0.25-1
Fluconazol 1-4(8)* -
5-fluorocitocina 0.064-0.25 -
Itraconazol 0.064-0.25 0.25-1
Ketoconazol 0.032-0.125 0.25-1
Posaconazol 0.032-0.125 0.125-0.5
Voriconazol 0.016-0.064 0.25-1
*algunas colonias ocasionalmente podría dar 8 µg/ml
6.9) VALORES NORMALES
No corresponde a esta práctica.
6.10) INTERFERENCIAS
Existen aislamientos poco habituales que podrían no ser evaluados por estos
métodos y deben ser enviados a centros de referencia.
6.11) INTERPRETACION
Discos Malbrán Esta técnica es accesible a la rutina de los laboratorios y

permite detectar los aislamientos de levaduras del Género Candida, sensibles
al fluconazol.
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Tabletas de Neo-Sensitabs Rosco® (T) Varios estudios encontraron algunos

errores very major con aislamientos de C. tropicalis cuando se ensayo FCZ, por
este motivo este test nunca debe ensayarse como única prueba, siempre se
debe largar en paralelo con otro método.
ATB® Fungus 3 (ATB F3) La categoría de sensible dependiente de la dosis

(DD) se refiere a aquellos aislamientos que responden al tratamiento cuando se
utilizan dosis más elevadas de la droga.
Algunas recomendaciones deben tenerse en cuenta a la hora de interpretar los
resultados de las pruebas de sensibilidad:
ATB F 3 recomienda interpretar como intermedias las cepas de C. glabrata que
presenten un resultado sensible (S) al fluconazol y/o itraconazol, debido a la
sensibilidad media natural de esta especie a estos antifúngicos. También se
debe tener en cuenta que C. krusei es una especie intrínsecamente resistente
al fluconazol, el test debe ser interpretado resistente automáticamente.
Algunas especies como C. albicans y C. tropicalis pueden presentar el
fenómeno de crecimiento residual (trailing) que implica una sobreestimación de
la CIM de los antifúngicos nitrogenados (fluconazol, itraconazol).
Los métodos de difusión por disco o tabletas son asequibles, de fácil
realización y detectan aislamientos susceptibles a FCZ. Pero el método de
difusión con disco de Malbrán es más eficaz para detectar aislamientos
sensibles a FCZ que las Tabletas de Neo-Sensitabs Rosco®.
6.12) INFORME
Para los métodos de difusión en agar: Discos de Fluconazol Malbrán se

informará como S o a determinar por CIM y Tabletas de Neo-Sensitabs
Rosco®, el resultado si informará como S, SDD o R a FCZ y/o VCZ.
APOE-AF
Fecha: julio 2011
BUENOS AIRES
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Para ATB F 3 se informará el valor de la CIM en μg/ml, para AMB, FCZ, ITZ y
VCZ y la categoría de S, SDD o R. Para 5FC si es S o R.
Para las tiras de plástico (E-test) se informará el valor de la CIM en μg/ml, y la
categoría de S, SDD o R. Y de la misma forma para las tarjetas Vitek 2.
7.0) REGISTROS
Cuaderno de Micología.
8.0) ANEXOS
No posee.

Manual de Procedimientos Operativos Estándar Del Laboratorio de Micologia

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APOE

El objetivo de este manual es normalizar de una manera clara y sencilla los

PROCEDIMIENTO OPERATIVO PARA EXAMEN MICOLÓGICO DE:

 Desarrollar el procedimiento a seguir para el examen directo y cultivo de los

 Todas las muestras de piel extraídas de acuerdo a las indicaciones de toma

 Bioquímicos y técnicos del sector Microbiología, área Micología,

 Micología Médica Ilustrada, Roberto Arenas Guzmán, Nueva Editorial

Elaborado por: S.Cataldi, M.Carmen Perrone,L.Guelfand Aprobado por: Integrantes y Coordinador de la RM

Etapa Pre- Analítica

Etapa Post- Analítica

MC: Manual de Calidad

 Jefe de Sector ó Sección Microbiología / Micología, Bioquímicos a cargo

7.1 FUNDAMENTO DEL MÉTODO

El diagnóstico de las micosis superficiales se basa en el hallazgo de hifas o

7.2 EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS:

Microscopio con objetivos de 10x, 40x y 100x (inmersión)

Estufa de cultivo a 35- 37 ºC

7.3 PREPARACIÓN Y CONSERVACIÓN DE LOS REACTIVOS Y MEDIOS:

Ver Manual operativo de Medios y Reactivos (PAMR)

7.4 MUESTRA A ANALIZAR:

Escamas de piel recolectadas en forma estéril

7.5 SECUENCIA OPERATIVA:

7.5.1 Precauciones de seguridad:

Consultar el Manual de Bioseguridad (MB)

7.5.2 Procesamiento de la muestra:

A cada muestra se le asigna un número interno correlativo, siguiendo el orden

a) Examen microscópico directo: para aclarar la capa córnea de la piel

b) Cultivos: La segunda parte del material, se utiliza para la realización

Para sembrar el material, se deben fragmentar las escamas lo más

Si no hubo hallazgo se informa: “No se observan elementos micóticos” o

Si hubo hallazgo se informa según el caso:

 “ Se observan hifas hialinas tabicadas y/o ramificadas, características

 “ Se observan elementos levaduriformes y/o seudohifas”

 “Se observan levaduras y filamentos cortos característicos de

 Si hubo desarrollo se debe recurrir al POE de identificación (AMID)

Examen directo Cultivo Jerarquizar

 El examen directo puede entregarse dentro de 48 horas

 PA ( Manual de Procedimiento Pre- analítico)

11. CRITERIOS DE RECHAZO:

 Si continuó con la aplicación de pomadas, cremas o polvos sobre la piel

 Desarrollar el procedimiento a seguir para el examen directo y cultivo de

 Todas las muestras de cuero cabelludo extraídas de acuerdo a las

 Bioquímicos y técnicos del sector Microbiología, área Micología,

 Micología Médica Ilustrada, Roberto Arenas Guzmán, Nueva Editorial

Etapa Pre- Analítica

Elaborado por: S.Cataldi, M.C.Perrone , L.Guelfand Aprobado por: Integrantes y Coordinador de la RM

 APOE: Manual de procedimiento Operativo

Etapa Post- Analítica

MC: Manual de Calidad

 Jefe de Sector ó Sección Microbiología/ Micología, Bioquímicos a cargo del

7.1 FUNDAMENTO DEL MÉTODO

El diagnóstico de las micosis superficiales de cuero cabelludo se basa en el

7.2 EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS:

Microscopio con objetivos de 10x, 40x y opcional 100x (inmersión)

7.3 PREPARACIÓN Y CONSERVACIÓN DE LOS REACTIVOS Y MEDIOS:

Ver Manual operativo de Medios y Reactivos (PAMR)

7.4 MUESTRA A ANALIZAR:

Escamas de cuero cabelludo y pelos arrancados de raíz, recolectadas en forma

7.5 SECUENCIA OPERATIVA:

a) Examen directo microscópico: para aclarar la capa córnea del

b) Cultivos: La segunda parte del material, se utiliza para la

• “ No se observan elementos micóticos”

Si hubo hallazgo se informa según el caso:

 “Se observan hifas hialinas tabicadas y/o ramificadas.

Desarrollar el procedimiento a seguir para el examen directo y cultivo de los

Todas las muestras de piel extraídas de acuerdo a las indicaciones de toma

Bioquímicos y técnicos del sector Microbiología, área Micología,

Micología Médica Ilustrada, Roberto Arenas Guzmán, Nueva Editorial

Jefe de Sector ó Sección Microbiología / Micología, Bioquímicos a cargo

“ Se observan hifas hialinas tabicadas y/o ramificadas, características

“ Se observan elementos levaduriformes y/o seudohifas”

“Se observan levaduras y filamentos cortos característicos de

Si hubo desarrollo se debe recurrir al POE de identificación (AMID)

El examen directo puede entregarse dentro de 48 horas

PA ( Manual de Procedimiento Pre- analítico)

Si continuó con la aplicación de pomadas, cremas o polvos sobre la piel

Desarrollar el procedimiento a seguir para el examen directo y cultivo de

Todas las muestras de cuero cabelludo extraídas de acuerdo a las

Bioquímicos y técnicos del sector Microbiología, área Micología,

Micología Médica Ilustrada, Roberto Arenas Guzmán, Nueva Editorial

APOE: Manual de procedimiento Operativo

Jefe de Sector ó Sección Microbiología/ Micología, Bioquímicos a cargo del

“Se observan hifas hialinas tabicadas y/o ramificadas.

El examen directo puede entregarse dentro de 48 horas o junto con el

PA ( Manual de Procedimiento Pre- analítico)

Cuando el paciente no suspendió la medicación antifúngica sistémica (de

Desarrollar el procedimiento a seguir para el examen directo y cultivo de los

Todas las muestras de uñas extraídas de acuerdo a las indicaciones de

Bioquímicos y técnicos del sector Microbiología, área Micología,

Micología Médica Ilustrada, Roberto Arenas Guzmán, Nueva Editorial

Jefe de Sección Microbiología, Bioquímico a cargo del área Micología

“Se observan hifas hialinas tabicadas y/o ramificadas.

El examen directo puede entregarse dentro de 48 horas o junto con el

PAMR (Manual de Procedimiento : Medios de cultivo y Reactivos)

Si continuó con la aplicación de pomadas, cremas o polvos sobre la piel

Desarrollar el procedimiento a seguir para el examen directo y cultivo de

Todas las muestras respiratorias como material de estudio para el

Bioquímicos y técnicos del sector Microbiología, área Micología,

Micología Médica Ilustrada, Roberto Arenas Guzmán, Nueva Editorial

Manual de Procedimientos para Laboratorios de Micología Médica, Prof.

Guía práctica de Identificación y Diagnóstico en Micología Clínica. Javier

Etapa Pre- Analítica

PAMR: Manual de Medios y Reactivos

Etapa Post- Analítica

MC: Manual de Calidad

MB: Manual de Bioseguridad

MA: Manual Administrativo

Bioquímico a cargo a cargo del área Micología.

Consultar el Manual de Bioseguridad (MB)