Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
Manual de Analisis Basico de Semen ESHRE 2002
Manual de Analisis Basico de Semen ESHRE 2002
Editores
U. Kvist y L. Björndahl
Este manual ha sido revisado para adaptarse a la edición de 1999 del manual de la OMS
Monografías de la ESHRE
Editor en Jefe de la serie de monografías
Maas Jan Heineman
La Serie de Monografías ESHRE
[1] WHO (1999) WHO Laboratory Manual for the Examination of Human Semen and Sperm-Cervical Mucus interaction. 4th edn. Cambridge
University Press, Cambridge, UK
Traductores:
Manuel Ardoy Vilches
Licenciado en Biología. Responsable del Laboratorio de FIV
Hospital Universitario La Paz, Madrid
Grupo de trabajo de Seminología y técnicas de reproducción asistida: Jose Antonio Castilla Alcalá, Amparo Galán
Ortega, Maria Luisa Hortas, Carmen Mar Medina (presidenta), Isabel Sánchez Prieto, Maria del Valle Lozano
Vera, Inmaculada Martín Navas, Mercedes Marcos, Carlos Aulesa Martínez y Maria del Carmen Gonzalvo López.
Comité de Publicaciones: Felipe Antoja Ribó, Francisco Cañizares Hernández, José M. Egea Caparrós, Román
Galimany Solé Miguel García Montes, Luis Gregorio Gómez-Cambronero López, José M. González de Buitrago,
José M. Hernández Pérez, Jordi Huguet Ballester (presidente), Joan B. Ortolà Devesa, Anna Padrós Fluvià y
Eulàlia Urgell Rull.
Prefacio
Este Manual de Análisis Básico de Semen es el resultado de un esfuerzo de colaboración entre los miem-
bros de la Asociación Nórdica de Andrología (NAFA) y del Grupo de Interés Especial en Andrología
(SIGA) de la ESHRE.
Este manual está dirigido a todos aquellos que trabajan en el campo de la biología y la medicina
de la reproducción, y especialmente a los que tienen responsabilidad en el control y garantía de calidad en
el laboratorio de Seminología.
El manual detalla los fundamentos y principios básicos del análisis de semen en la actualidad. Los
primeros seis capítulos se centran en la concentración espermática, movilidad, vitalidad, morfología, y los
anticuerpos antiespermatozoide. Se pone especial énfasis en los procedimientos, cálculos, resultados, reac-
tivos, equipos y materiales. El capítulo final se dedica al control y garantía de calidad. El manual conclu-
ye con algunos apéndices útiles.
Aunque el Manual de Análisis Básico de Semen se publica en las páginas web de la NAFA
(http://www.ki.se/org/nafa) y la ESHRE (http://www.eshre.com)* se consideró útil disponer también de
una versión del mismo en Monografías ESHRE. Espero que este manual sea de utilidad tanto en la clíni-
ca como en el laboratorio. Se invita a aquellos clínicos que no estén familiarizados con la actividad del
laboratorio de semen a conocer los principios básicos del análisis de semen. Para otros puede ser de ayuda
en la revisión de sus técnicas.
Agradezco a los miembros del grupo de trabajo NAFA-ESHRE por este valioso Manual de Análisis
Básico de Semen.
La versión en inglés se encuentra también disponible de forma gratuita en el sitio de internet: http//eshremonographs.oupjournals.org
Prólogo
La Asociación Nórdica de Andrología (NAFA) decidió en Turku en Agosto de 1995 crear el Grupo de
Calidad de Laboratorio de Andrología en Análisis de Semen. La misión de este grupo fue desarrollar un
manual técnico detallado con métodos basados en las recomendaciones de la Organización Mundial de la
Salud (WHO 1992). El objetivo era que el manual pudiera constituir la base para un control de calidad
externo y para la colaboración científica en este campo.
Los miembros del grupo NAFA fueron : Ulrik Kvist (coordinador), Alexander Giwercman, Trine
B. Haugen, Jyrfki Suominen, y Lars Björndahl (secretario). Otros colaboradores fueron: Birute Zilaitiene,
Margus Punab, Øystein Magnus, Åse Strutz, Trine Henrichsen, Turid Vollen, Ingmarie Sundgren, Inger
Söderlund, Maiken Simonsen, Lene Andersen, Majbrit Kvist y Antero Horte.
La primera edición de este manual se publicó en 1997. La segunda edición se publicó en 1998 y la
tercera, reeditada con el fin de adaptarse a la edición de 1999 de las recomendaciones de la OMS, en el
año 2000.
Durante la reunión de trabajo anual del Grupo de Interés Especial en Andrología (SIGA) de la
ESHRE en Bolonia, en Julio de 2000, se decidió aunar esfuerzos para realizar un Manual de Análisis
Básico de Semen conjunto NAFA-ESHRE. Se constituyó un grupo de trabajo con representantes de la
ESHRE SIGA, formado por Usha Punjabi, David Mortimer, Chistopher Barrat y Lars Björndahl por parte
de la ESHRE, y el Grupo de Calidad de Laboratorio de Andrología en Análisis de Semen de la NAFA.
Ulrik Kvist coordinó el trabajo y Lars Björndahl actuó como secretario.
Este manual NAFA-ESHRE constituye una aplicación de las directrices de la OMS (WHO 1999)
para facilitar el establecimiento de métodos y materiales comunes y estandarizados en los laboratorios de
andrología de los países europeos, como requisito previo para la colaboración científica y el control exter-
no de calidad. No existe ningún método único que resulte ideal, y el grupo ha discutido diferentes posibi-
lidades para alcanzar un consenso en métodos, que sea posible usar en los laboratorios de andrología clí-
nica, y a la vez sean aceptables desde el punto de vista metodológico (eliminación de las fuentes de error).
Los métodos en el manual también se adecuan con el currículo del curso estandarizado para ense-
ñanza de Análisis Básico de Semen desarrollado e implementado por el SIGA. Estos cursos se han cele-
brado como cursos conjuntos ESHRE-NAFA en Estocolmo (1995, 1996 y 2001), Åarhus (1997),
Gothenburg (1998), Oslo (1998) y Helsinki (2001).
Referencias
WHO (1992) WHO Laboratory Manual for the Examination of Human Semen and Sperm-Cervical Mucus Interaction. 3rd edn.
Cambridge University Press, Cambridge, UK.
WHO (1999) WHO Laboratory Manual for the Examination of Human Semen and Sperm-Cervical Mucus interaction. 4th edn.
Cambridge University Press, Cambridge, UK.
Direcciones
ii
© European Society Human Reproduction and Embryology 2002
ESHRE Monographs: Manual on Basic Semen Analysis p.iii, 2002
Contenido
Editorial. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vi
For any citations from this Manual, the source must be given as the original chapter with full bibliographic details as given as the top of the
first page of each chapter.
Cualquier cita de este Manual deberá mencionar la fuente de la versión original en inglés, con todos los detalles bibliográficos tal como se
mencionan en la cabecera de la primera página de cada capítulo.
Editorial
1Department of Women and Child Health, Andrology Center, Karolinska Hospital and Institute, Box 140,
SE-171 76 Stockholm, Sweden and 2Assisted Conception Unit, Birmingham Women’s Hospital, and
Reproductive Biology and Genetics Group, University of Birmingham, Birmingham B15 2TG, UK
Históricamente, el análisis de semen ha surgido extenso trabajo de Eliasson, que publicó directrices
como una disciplina que acompaña a aquellas que para los métodos y la buena práctica del laborato-
se ocupan del hombre o de la pareja infértil. En la rio, y Mortimer, que añadió guías para adiestra-
medicina moderna, el análisis de semen es por tanto miento orientado a objetivos y control de calidad en
realizado en una amplia variedad de circunstancias. los laboratorios de andrología (Eliasson, 1971a,b,
En consecuencia, el microscopio para el análisis de 1975, 1977, 1981; Mortimer, 1994). Los manuales
semen puede estar en la poyata del urólogo, gine- de análisis de semen de la Organización Mundial de
cólogo, dermatólogo o endocrinólogo, en el labora- la Salud (WHO 1987, 1992, 1999; Belsey y cols.,
torio de urología, patología o análisis clínicos, en el 1980) han sido fundamentales para iniciar la estan-
departamento de medicina del trabajo y actualmen- darización global del análisis de semen. Sin embar-
te también en gran medida en el creciente número go, al inicio de un curso de análisis básico de semen
de clínicas que ofrecen tratamientos para la inferti- (Björndahl y cols., 2002), una muestra de semen
lidad. Un técnico a tiempo parcial puede realizar fue examinada por 20 participantes que trabajaban
algunos análisis al año, mientras que los facultati- en análisis de semen y usaban métodos recomenda-
vos experimentados de los centros de andrología dos por la OMS. Sus resultados fueron tan dispares
pueden realizar varios miles de análisis. Como como 1-71 x 106/mL, aunque el valor diana obteni-
resultado de esta amplia variedad de tradiciones y do por técnicos entrenados utilizando métodos con-
situaciones, el análisis de semen no ha alcanzado trolados fue de 41 x 106/mL.
siempre la atención y desarrollo técnico que la La falta de exactitud en los resultados de
medicina moderna exige de la buena práctica en el análisis básicos de semen es todavía un problema
laboratorio. urgente. El origen de esta situación se encuentra en
Ha habido diversas e importantes contribu- la falta de una estandarización global y detallada de
ciones a los esfuerzos para mejorar los estándares los métodos para el análisis de semen (De Jonge y
en el análisis básico de semen. Sólo para mencionar Barrat, 1999). Un sólo laboratorio puede controlar
algunos hitos: Freund y Carol sugirieron mejoras su propia calidad y proporcionar atención adecuada
fundamentales en los métodos de recuento esper- a sus propios pacientes, pero cuando hay que com-
mático (Freund y Carol, 1964). MacLeod y Freund parar entre laboratorios y publicaciones científicas
realizaron mejoras relacionadas con la morfología e interpretar publicaciones de laboratorios que apli-
espermática (MacLeod, 1964; Freund, 1966). El can variantes de los métodos recomendados por la
vii
Orlando, FL, USA, pp. 169-188. MacLeod, J. (1964) Human seminal cytology as a sensitive
indicator of the germinal epithelium. Int. J. Fertil., 9, 281.
Eliasson, R. (1981) Analysis of semen. In Burger H. and de
Kretser D.M. (eds) The Testis. Raven Press, New York, Mortimer D. (1994) Laboratory standards in routine clini-
USA, pp. 381-399. cal andrology. Reprod. Med. Rev., 3, 97-111.
Franken, D.R., Smith, M., Menkveld, R. Kruger, T.F., Neuwinger, J., Behre, H. y Nieschlag, E. (1990) External
Sekadde-Kigondu, C., Mbizvo, M. y Akande, E.O. (2000) quality control in the andrology laboratory: an experimen-
The development of a continuous quality control program- tal multicenter trial. Fertil. Steril., 54, 308-314.
me for strict sperm morphology among sub-Saharan
African laboratories. Hum. Reprod., 15, 667-671. WHO (1987) WHO Laboratory Manual for the
Examination of Human Semen and Semen-Cervical Mucus
Freund, M. (1966) Standards for rating of human sperm Interaction, 2nd edn. Cambridge University Press,
morphology. A cooperative study. Int. J. Fertil., 2, 97-118. Cambridge, UK.
Freund, M. y Carol, B. (1964) Factors affecting haemocy- WHO (1992) WHO Laboratory Manual for the
tometer counts of sperm concentration in human semen. J. Examination of Human Semen and Sperm-Cervical Mucus
Reprod. Fertil., 8, 149. Interaction, 3rd edn. Cambridge University Press,
Cambridge, UK.
Keel, B.A., Quinn, P., Schmidt, C.F. Jr, Serafy, N.T. Jr,
Serafy, N.T. Sr y Schlaue, T.K. (2000) Results of the WHO (1999) WHO Laboratory Manual for the
American association of bioanalysts national proficiency Examination of Human Semen and Sperm-Cervical Mucus
testing program in andrology. Hum. Reprod, 15, 680-686. Interaction, 4th edn. Cambridge University Press,
Cambridge, UK.
viii
ESHRE Monographs: Manual on Basic Semen Analysis pp.1-4, 2002
2
Análisis del semen: visión general
después de la eyaculación; ver Tratamiento de las después de 60 s, hay que descartar la preparación y
muestras viscosas, más adelante). Las desviacio- realizar una nueva. Es necesaria una óptica con
nes de los hallazgos normales se anotan en la hoja contraste de fases. Si se encuentra una media de <1
de trabajo. Si el olor de la muestra difiere clara- espermatozoide por campo de visión (objetivo 40x
mente de la mayoría de las muestras, también se con ocular de campo amplio), la muestra debe ser
anotará en la hoja de trabajo. tratada como sospechosa de azoospermia. Para
detalles y determinación de la movilidad en moni-
La viscosidad de la muestra se evalúa esti- tor de vídeo, ver Sección 3 en este manual.
mando la rapidez con que sale de la pipeta. Llenar
una pipeta con semen (p.ej. una pipeta de 5 mL. Si Azoospermia u oligozoospermia severa: Si hay
el volumen no se mide por peso, la pipeta usada muy pocos o ningún espermatozoide en la prepara-
para medir el volumen puede servir) y dejar que el ción en fresco debe anotarse * (asterisco) en la hoja
semen se vacíe de nuevo en el contenedor. Si las de trabajo y, como texto libre, anotar cuantos esper-
gotas forman “filamentos” cuya longitud es >2 matozoides móviles e inmóviles se han observado
cm, anotar “viscosidad aumentada” en la hoja de en la preparación en fresco. Si se encuentran pocos
trabajo. o ningún espermatozoide móvil en la preparación
Tratamiento de las muestras viscosas en fresco hay que centrifugar la muestra a 1000 g
por lo menos durante 15 min. y examinar el sedi-
Para las muestras con viscosidad moderada a muy mento nuevamente al microscopio (objetivo 40x,
aumentada, es suficiente comentar este hallazgo óptica de contraste de fases). Si se pueden identifi-
en la hoja de trabajo como texto libre. La viscosi- car espermatozoides móviles o inmóviles después
dad aumentada interfiere con la determinación de de examinar toda la superficie del cubreobjetos (al
la movilidad espermática, la concentración y los menos 400 campos en un cubreobjetos de 22x22
anticuerpos que recubren los espermatozoides. En mm), se anotarán en la hoja de trabajo el número de
las muestras en las que la elevada viscosidad difi- espermatozoides y su movilidad.
culta el análisis, la adición de un volumen conoci-
do de suero salino, solución salina tamponada Evaluación de la movilidad espermática: La prime-
(PBS) o medio de cultivo, seguida de un mezclado ra función espermática que hay que evaluar en la
cuidadoso con una pipeta de calibre ancho, debe- preparación en fresco es la movilidad. Se debe
ría dar una dilución homogénea para el análisis. Se empezar inmediatamente para evitar la caída de la
debe tener en cuenta el volumen original para cal- temperatura o la deshidratación de la preparación.
cular la concentración espermática original en la Los métodos se describen en detalle en la Sección 3
muestra no diluida. Si los espermatozoides van a de este manual.
ser utilizados para fecundación asistida, debe evi-
tarse contaminación de la muestra, y ha de usarse Agregación espermática y aglutinación espermáti-
para la dilución el medio habitual para preparar el ca: La agregación o aglutinación espermática se
semen con vistas a la fecundación asistida. N.B. determina en 10 campos escogidos al azar, lejos de
Cuando las muestras se diluyen, las características los bordes del cubreobjetos. Se realiza una estima-
de la movilidad espermática se verán afectadas. ción del porcentaje promedio (estimado al 5% más
Preparación en fresco próximo) de espermatozoides atrapados en grupos.
Examen de la preparación en fresco: Colocar 6 µL Aglutinación significa que los espermatozoides se
de semen bien mezclado sobre un portaobjetos lim- adhieren entre sí, sin otras células o detritus. Los
pio y poner un cubreobjetos encima (18x18 mm, anticuerpos antiespermáticos polivalentes causan
#1.5; si se usa un cubreobjetos de 22x22, el volu- aglutinación espermática. Si los grupos son muy
men del semen en el portaobjetos será de 10 µL). grandes, puede ser difícil determinar si los patrones
Esto confiere a la preparación una profundidad de de unión son específicos (p.ej. cabeza-cabeza o
~20 µm. El examen de esta preparación en fresco cola-cola). Si hay células, detritus y espermatozoi-
ha de empezar tan pronto como cesa el “flujo” en la des inmóviles incluidos, el aglomerado está proba-
preparación. Si el desplazamiento no se ha detenido blemente causado por agregación. Las aglutinacio-
3
Análisis del semen: visión general
nes están producidas por anticuerpos antiespermá- • Las bacterias y protozoos no se encuentran
ticos y a menudo contienen una cierta proporción habitualmente en el semen, pero si hay signos
de espermatozoides móviles, mientras que los agre- de microorganismos, debe anotarse en el informe.
gados habitualmente contienen sólo espermatozoi- Extensiones para tinción de eosina-nigrosina
des muertos. Los pequeños agregados de esperma-
tozoides muertos y otros materiales se encuentran Según el manual de la OMS, si la proporción de
con frecuencia en semen de hombres normales, espermatozoides móviles es <50%, debe determinar-
mientras son anormales los grandes agregados, a se la proporción de espermatozoides vivos. La razón
menudo conteniendo centenares de espermatozoi- para evaluar la proporción de espermatozoides vivos
des. Cuando la presencia de agregados o aglutina- es diferenciar entre los espermatozoides muertos y los
ciones espermáticas está claramente aumentada, espermatozoides vivos pero inmóviles. Esta diferen-
debe anotarse en forma de comentario libre en el cia sólo tiene interés clínico cuando hay muy pocos o
informe. ningún espermatozoide móvil. Por tanto, un límite de
decisión de <40% de espermatozoides móviles no
Otras células y detritus: Otras células y detritus conducirá a ningún diagnóstico erróneo, pero dismi-
que pueden encontrarse en el semen se evalúan en nuirá la carga de trabajo al reducir el número de eva-
varios campos y los hallazgos inusuales se expre- luaciones de vitalidad en muestras con espermatozoi-
san como comentarios libres en el informe median- des vivos. El método detallado para la evaluación de
te diversas expresiones estandarizadas: la vitalidad espermática se encuentra en la Sección 4
• Ausencia de detritus es una situación muy rara, en este manual.
algún grado de detritus es típico, pero una con- Prueba de anticuerpos
taminación moderada con detritus no es necesa- La parte secretora de los anticuerpos tipo IgA se une
riamente anormal. Mayores cantidades de detri- al moco cervical. Por ello, la presencia de IgA unida
tus son, sin embargo, anormales. Tener cuidado a espermatozoides ocasiona una reducción de la capa-
de diferenciar entre partículas acelulares y bac- cidad para penetrar el moco cervical.
terias. Anticuerpos en espermatozoides: La IgG y la IgA
• Los glóbulos rojos (eritrocitos) no deben unidas a los espermatozoides pueden ser evaluadas
encontrarse en el semen, aunque pueden encon- directamente en semen mediante, por ejemplo,
trase unos pocos sin que ello indique patología. SpermMAR™ para IgG e IgA y, después de lavar,
• Las células epiteliales (escamosas, cúbicas y mediante la prueba de Immunobead™.
transicionales) son habituales en pequeño Anticuerpos en plasma seminal: En las muestras de
número en el semen. Su aumento no está rela- semen sin espermatozoides la presencia de anticuer-
cionado con ninguna alteración funcional espe- pos antiespermáticos puede evaluarse indirectamente
cífica o presencia de infección. exponiendo espermatozoides de donante, sin anti-
• Las “células redondas” se observan a menudo cuerpos, a plasma seminal de un paciente con sospe-
en el semen y es importante diferenciar los leu- cha de anticuerpos antiespermáticos. Los espermato-
cocitos de los gametos inmaduros o grandes zoides de donante se procesan a continuación como
fragmentos celulares (habitualmente sin en el análisis directo de anticuerpos.
núcleo) con citoplasma exfoliado del túbulo Todos los métodos dependen de la movilidad
seminífero del testículo. También, las células de espermática. Deben evaluarse por lo menos 200
origen prostático tienen un aspecto redondeado espermatozoides móviles.
en el eyaculado. Si hay >1x106 células redon- Los resultados de las pruebas SpermMAR y de
das/mL, contadas en la cámara de Neubauer (al Immunobead no son totalmente concordantes. Un
mismo tiempo que se realiza la concentración hallazgo positivo de IgA (p.ej. >50% espermatozoi-
espermática), debe realizarse la detección de des móviles con immunobeads adheridas) debe veri-
leucocitos mediante un método específico para ficarse con una prueba de interacción moco-semen.
identificar la presencia de “células inflamato-
rias”.
4
Análisis del semen: visión general
5
Análisis del semen: visión general
aEl volumen seminal también puede ser determinado con una pipeta graduada con una precisión de 0,1 mL;
en este caso no es necesario pesar.
bLas etiquetas deben contener en general dos identificadores únicos, p.ej. nombre y un número exclusivo.
cLa pipeta usada para la determinación del volumen seminal puede ser usada para evaluar la viscosidad cuando
se deja caer el semen de la pipeta.
dLimitaciones acordadas por el grupo de trabajo.
eEstos pasos son opcionales.
6
ESHRE Monographs: Manual on Basic Semen Analysis pp.5-9, 2002
2. Concentración espermática
8
Concentración espermática
cubreobjetos. Después, se toma una segunda cada cámara. Para > 40 espermatozoides,
alícuota para la otra cámara del hemocitómetro. contar 5 cuadros en cada cámara (por
Cada cámara deberá rellenarse completamente. ejemplo las cuatro esquinas y el centro). El
Sin embargo, si se llena en exceso se debe des- objetivo es contar 200 espermatozoides en
cartar y rellenar una nueva. No se debe eliminar cada cámara y que éste número sea sufi-
el volumen sobrante de la cámara, ya que se ciente para comparar los dos recuentos.
puede alterar la concentración de espermatozoi- • Si se observa con claridad una cabeza de
des en ella. Posteriormente se comparan los espermatozoide, se recomienda que sea
recuentos de las dos alícuotas. incluida en el recuento de espermatozoi-
4. Dejar el hemocitómetro reposar durante 10-15 des. Las “cabezas de alfiler” deberán con-
minutos en una cámara húmeda, para permitir tarse aparte y ser comentadas en el infor-
a los espermatozoides sedimentar en la cuadrí- me. No deben contarse células germinales
cula. inmaduras (serán valoradas en el recuento
diferencial de la morfología), no obstante
Tabla II: las células redondas y las células inflama-
torias deberían contarse independiente-
Factor para dividir el número
mente en el hemocitómetro.
total de espermatozoides contados • “Células en el borde de línea”: únicamente
los espermatozoides cuya cabeza esté
Nº de cuadros contados localizada sobre las líneas limitantes más
superiores o izquierdas (marcadas “OK”
Dilución 25 10 5 en la Figura 1) deberán contarse como
“pertenecientes” al cuadro. De éste modo,
1+1 100 40 20 no se contarán los espermatozoides locali-
1+4 40 16 8
zados en las líneas limitantes más inferio-
1+9 20 8 4
1+19 10 4 2
res o derechas (marcadas “out” en la
1+49 4 1,6 0,8 Figura 1).
Cálculos
5. Contar los espermatozoides con un objetivo de Los recuentos de las dos alícuotas se comparan
20-40x (contraste de fase) según el siguiente como se describe en el Apéndice I. Se calcula el
criterio: un “cuadro grande” en una cámara de número total de espermatozoides contados (suma)
Neubauer está limitado, en todos los lados, por y la diferencia entre los dos recuentos. Se acepta la
líneas triples (ver Figura 1: apariencia visual valoración si la diferencia entre los dos recuentos
de la cuadrícula central de una cámara del es menor o igual que el valor obtenido en el
hemocitómetro de Neubauer mejorado). Para Apéndice I. En caso contrario, hay que descartar
definir cada cuadro grande, deben usarse como los recuentos, mezclar bien la dilución de semen,
límite las líneas situadas más arriba y más a la rellenar dos nuevas cámaras del hemocitómetro y
izquierda. Hay que tener en cuenta que se realizar nuevas medidas.
necesita un objetivo de 40x con una distancia La suma de los dos recuentos (número total
de trabajo grande cuando usamos una cámara de espermatozoides en ambas cámaras) se divide
de Neubauer. por el factor apropiado (Tabla II) para calcular la
• Determinar el número de cuadros que se concentración de espermatozoides en la muestra
deben contar. Primero, contar el número de semen (expresado en 106 espermatozoides/mL)
de espermatozoides en el cuadro superior Nota. En éste manual, el número total de
de la esquina izquierda. Si hay < 10 esper- espermatozoides contados se divide por los facto-
matozoides, contar toda la cuadrícula (25 res dados en la Tabla II. En el manual de la OMS,
cuadros en cada cámara). Para 10-40 el número total de espermatozoides contados se
espermatozoides, contar 10 cuadros en divide primero por 2, para obtener una media, y
9
Concentración espermática
luego ésta media es dividida por otro factor. Por lo incompleta y la variación en los días de abstinencia,
tanto, los factores que se dan en el manual de la hay otros muchos factores externos que influyen en
OMS son la mitad de los valores aportados aquí y el número total de espermatozoides en el eyacula-
con este procedimiento se elimina un paso de divi- do, por ejemplo haber tenido fiebre, consumir algún
sión y por ello reduce posibles errores aritméticos. tipo de droga y ciertas situaciones profesionales de
[Si los dos recuentos son aceptados, hay tres cál- estrés. Para evaluar correctamente los aspectos
culos para obtener la concentración de esperma- cuantitativos de la producción de espermatozoides,
tozoides en 106/mL de semen. Esos pasos pueden los resultados del laboratorio deben contener datos
ser realizados uno a uno, pero es preferible unifi- sobre la concentración de espermatozoides, el volu-
carlos en un cálculo simple. men de eyaculado (o el número total de espermato-
1. En primer lugar, se calcula el número medio de zoides), los días de abstinencia, y si la recogida de
espermatozoides contados, dividiendo la suma la muestra fue completa.
de espermatozoides contados por 2 (x1/2). Cuando no se encuentra “ningún espermato-
2. En segundo lugar, se calcula la concentración zoide” en la valoración, es preferible que el resulta-
de espermatozoides en el hemocitómetro (por do no se exprese como 0,0 x 106 espermatozoi-
ejemplo en la muestra diluida). Para ello se des/mL, sino que se escriba un asterisco (*) en el
debe conocer el volumen que se ha examinado. lugar de la concentración y del número total de
El volumen de un cuadro grande en el hemoci- espermatozoides. Como comentario adicional,
tómetro de Neubauer mejorado es de 4 nL [200 debe indicarse en el informe si no se ha encontrado
x 200 x 100 µm (profundidad)]. Así, 5, 10, y 25 ningún espermatozoide, o si se ha encontrado algún
cuadros corresponden a volúmenes de 20, 40, y espermatozoide inmóvil o de movilidad baja en el
100 nL respectivamente. eyaculado o en el sedimento obtenido tras la centri-
El número medio de espermatozoides contados fugación. Si no se ha encontrado ningún esperma-
se divide por el volumen en el cual han sido tozoide en 100 µL de sedimento, debe hacerse
contados (x 1/20; 1/40; 1/100). constar el número máximo de espermatozoides que
La concentración de espermatozoides obtenida podrían estar presentes en el eyaculado (los detalles
es el número de espermatozoides por nL, lo sobre los cálculos vienen recogidos en las últimas
que equivale a 10 6 espermatozoides/mL secciones de éste capítulo), por ejemplo, si no se ha
(espermatozoides/10-9L = espermatozoides x observado ningún espermatozoide; podemos decir
106 / 10-3L). que lo más probable es que haya < 188 espermato-
3. En tercer lugar, como se ha diluido la muestra zoides en la muestra completa.
de semen original, para obtener la concentra-
ción de espermatozoides en el semen, se multi- Control de calidad
plica por el factor de dilución: (x 2; 5; 10; 20; Se deberá realizar los recuentos duplicados para
50). Por esto, diluciones de 1 + 1, 1+ 4, 1 + 9, detectar errores al azar en la toma de la alícuota o
1 + 19 y 1 + 49 corresponden a factores de x 2, en el recuento en el hemocitómetro.
5, 10, 20 y 50 respectivamente. Se deben calibrar regularmente las pipetas
Estos 3 pasos pueden realizarse con una simple de desplazamiento positivo (a veces llamadas pipe-
división, donde el número total de espermato- tas PCR) y las pipetas empleadas rutinariamente
zoides en las dos cámaras se dividide por un para realizar las medidas de los diluyentes. Las
factor combinado simple que es dado en la pipetas que muestren resultados erróneos se deben
Tabla II]. recalibrar, según las instrucciones del fabricante, o
ser enviadas a reparar y ajustar. Se deben anotar, en
Resultados una lista separada para cada pipeta, los resultados
La concentración de espermatozoides se anota en de los controles de calibración, así como de las
el informe de la muestra, y se calcula el número reparaciones y de los ajustes.
total de espermatozoides en el eyaculado (multi- Se debe ser muy cuidadoso al mezclar y al
plicando la concentración por el volumen de eya- diluir el semen, al mezclar la muestra diluida y al
culado). Además de la recogida de la muestra preparar y ajustar el hemocitómetro. Los hemocitó-
10
Concentración espermática
Equipo y materiales
• Agitador (vortex)
• Microscopio de contraste de fases (objetivos
20x ó 40x, y 10x para enfocar fácilmente).
• Cámara húmeda: cualquier caja con una tapa y
una gasa o papel que se mantenga húmedo,
11
Concentración espermática
12
Concentración espermática
zoides para contar que en la cámara de 10 nL. Esto informe. Por ejemplo, si se obtiene 2 x 106/mL en
tiene una especial importancia cuando obtenemos una valoración en un hemocitómetro de Neubauer
concentraciones de espermatozoides bajas después mejorado se expresa como 2 x 106/mL (rango 1,7-
de la selección espermática. Con las recomendacio- 2,3) o ± 14%. Si aplicamos buenas prácticas de
nes de rutina para valorar la concentración esper- laboratorio, y buscamos, por ejemplo, una incerti-
mática, contando todos los espermatozoides en dumbre menor del ± 10%, se necesitan realizar
ambos lados de un hemocitómetro de Neubauer valoraciones de dos hemocitómetros de Neubauer.
mejorado, se obtienen unos resultados precisos Si el mismo resultado se obtiene tras su valoración
desde ≥ 4 x 106/mL. Por el contrario, si contamos en una cámara de 10 nL, el resultado debería ser
todos los espermatozoides que hay en una cámara expresado como 2 x 106/mL (rango 1,1-2,9) o ±
de 10 nL, obtenemos unos resultados precisos den- 44%. Para conseguir el resultado de 2 x 106/mL ±
tro del ± 10%, únicamente cuando la concentración 10% con la cámara de 10 nL, se necesitan realizar
espermática es ≥ 40 x 106/mL. Para obtener un 20 valoraciones. Si en un protocolo de FIV, el obje-
resultado dentro del 10% en las muestras que se tivo es inseminar, por ejemplo, con 50.000 esper-
encuentren en el rango de concentración de 4 x matozoides todos los ovocitos y en la valoración
106/mL, se necesitan evaluar 10 cámaras de 10 nL. obtenida en una cámara de 10 nL propociona el
La Tabla V proporciona el intervalo de con- resultado de 1 x 106/mL (rango 0,4-1,6) ± 62%,
fianza al 95% para aquellas concentraciones de contamos realmente con 20.000-80.000 espermato-
espermatozoides que han sido obtenidas después de zoides en una gota de 50 µL. Únicamente en el 24%
contar todos los espermatozoides presentes en un de las veces, se adicionan 50.000 ± 10%, es decir,
hemocitómetro de Neubauer mejorado y en una 45.000-55.000 espermatozoides. Por tanto, en la
cámara de 10 nL. Cuando la variación excede de ± mayoría de los casos (76%), se adicionan >55.000
10%, se recogerá el rango de incertidumbre en el o <45.000 espermatozoides.
13
Concentración espermática
Tabla V:
Expresión de los resultados de concentración espermática en el intervalo de confianza del 95% según el número de
espermatozoides evaluados en una cámara de 10 nL (cámara de Makler por ejemplo) y en un hemocitómetro de
Neubauer (2 cámaras).
Una cámara de 10 nL (suspen- Una hemocitométrica de Neubauer (2 cámaras, muestra diluida
sión espermática no diluida) 1+1 para inmovilizar espermatozoides)
Número de Concentra- 95% de todas las medidas inclui- Número de Concentra- 95% de todas las medidas inclui-
espermato- ción esper- das en el intervalo (x106/mL) espermato- ción esper- das en el intervalo (x106/mL)
zoides conta- mática zoides conta- mática
dos (x106/mL) dos (x106/mL)
Bajo Alto ±% Bajo Alto ±%
1 0,1 0,0 0,3 148 10 0,1 0,0 0,2 62
2 0,2 0,0 0,5 119 20 0,2 0,1 0,3 44
3 0,3 0,0 0,6 107 30 0,3 0,2 0,4 36
4 0,4 0,0 0,8 98 40 0,4 0,3 0,5 31
5 0,5 0,1 0,9 88 50 0,5 0,4 0,6 28
6 0,6 0,1 1,1 80 60 0,6 0,4 0,8 25
7 0,7 0,2 1,2 74 70 0,7 0,5 0,9 23
8 0,8 0,2 1,4 69 80 0,8 0,6 1,0 22
9 0,9 0,3 1,5 65 90 0,9 0,7 1,1 21
10 1,0 0,4 1,6 62 100 1,0 0,8 1,2 20
11 1,1 0,4 1,8 59 110 1,1 0,9 1,3 19
12 1,2 0,5 1,9 57 120 1,2 1,0 1,4 18
13 1,3 0,6 2,0 54 130 1,3 1,1 1,5 17
14 1,4 0,7 2,1 52 140 1,4 1,2 1,6 17
15 1,5 0,7 2,3 51 150 1,5 1,3 1,7 16
16 1,6 0,8 2,4 49 160 1,6 1,4 1,8 16
17 1,7 0,9 2,5 48 170 1,7 1,4 2,0 15
18 1,8 1,0 2,6 46 180 1,8 1,5 2,1 15
19 1,9 1,0 2,8 45 190 1,9 1,6 2,2 14
20 2,0 1,1 2,9 44 200 2,0 1,7 2,3 14
25 2,5 1,5 3,5 39 250 2,5 2,2 2,8 12
30 3,0 1,9 4,1 36 300 3,0 2,7 3,3 11
35 3,5 2,3 4,7 33 350 3,5 3,1 3,9 11
40 4,0 2,8 5,2 31 400 4,0 3,6 4,4 10
45 4,5 3,2 5,8 29 >400 <10
50 5,0 3,6 6,4 28
55 5,5 4,0 7,0 26
60 6,0 4,5 7,5 25
65 6,5 4,9 8,1 24
70 7,0 5,4 8,6 23
75 7,5 5,8 9,2 23
80 8,0 6,2 9,8 22
85 8,5 6,7 10,3 21
90 9,0 7,1 10,9 21
95 9,5 7,6 11,4 20
100 10,0 8,0 12,0 20
150 15,0 12,6 17,4 16
200 20,0 17,2 22,8 14
250 25,0 21,9 28,1 12
300 30,0 26,6 33,4 11
350 35,0 31,3 38,7 11
400 40,0 36,1 43,9 10
>400 <10
14
ESHRE Monographs: Manual on Basic Semen Analysis pp.10-11, 2002
3. Movilidad espermática
16
Movilidad espermática
17
Movilidad espermática
den contarse por cada campo. Repetir los pasos muestra, grabar un periodo de tiempo más largo,
10-12 hasta que se cuenten >200 espermatozoides. 10 s, de campo oscuro.
11. Cambiar el campo de observación del microsco- 14. Repetir desde el paso 7 hasta que la cinta se ter-
pio y colocar el controlador del haz de luz de mine (en una cinta de 60 min podrían grabarse
forma que le entre luz a la cámara. ~10-12 muestras, en el caso que éstas tengan una
12. Grabar 5 s con el campo oscuro después de haber concentración de espermatozoides razonable).
grabado cada campo de observación. 15. Después de la última muestra grabar el mensa-
13. Después de haber completado la grabación de una je “fin”.
18
ESHRE Monographs: Manual on Basic Semen Analysis pp.12, 2002
4.Vitalidad espermática
Equipo y material
• Microscopio con objetivo de 100x para inmer-
sión en aceite.
• Portaobjetos de tamaño estándar, y cubreobje-
tos, p.ej 24x60 mm.
20
ESHRE Monographs: Manual on Basic Semen Analysis pp.13-17, 2002
5. Morfología espermática
Las extensiones teñidas con la hematoxilina y 2,5-3,5 µm de ancho) con una parte pálida ante-
de Harris (la habitual en la tinción de Papanicolau) rior (acrosoma: 40-70% del área de la cabeza) y una
se conservan durante años si se guardan en oscuri- región más oscura posterior. La relación
dad. Sin embargo la intensidad del color va dismi- largo/ancho de la cabeza debe ser entre 1,5-1,75. La
nuyendo después de un almacenamiento prolonga- cola debe estar simétricamente unida a la base de la
do, tal como se ha explicado previamente. cabeza. La base de la cabeza debe ser ancha y no
similar a una flecha. Solo debe haber una cola
Tinción citoplasmática unida, de aproximadamente 45 µm de largo, no
Se realiza con el naranja G6 (OG6), que es una enrollada, rota ni doblada sobre sí misma.
solución ácida que permite la unión del OG6 a las Inmediatamente tras la cabeza, la primera parte de
proteinas citoplasmáticas cargadas negativamente. la cola, la pieza intermedia deberá ser algo más
ancha (1 µm aprox.) y de 7-8 µm de largo. Una gota
Tinción citoplasmática y nucleolar citoplasmática normal tiene un contorno liso (no
El EA 50 es una mezcla policromática de coloran- irregular), aparece en la base de la cabeza y su
tes: verde claro (SF amarillento), eosina Y y marrón tamaño es inferior a un tercio de una cabeza nor-
Bismarck Y. El verde claro y la eosina son coloran- mal.
tes ácidos: el verde claro se une a las cadenas late- Todas las formas límite o dudosas deben
rales de la proteínas básicas. La eosina es una xan- clasificarse como defectuosas. Estos criterios se
tina cargada negativamente en soluciones acuosas y ajustan a los “criterios” estrictos para formas mor-
que tiñe los componentes citoplasmáticos, los fológicamente normales (Menkveld et al, 1990).
nucleolos (ausentes en el espermatozoide) y los En la página 19 del manual de la OMS
cilios. Su absorción máxima es a 515-520 nm. (1999) el tamaño de una gota citoplasmática normal
debe ser inferior a un medio del área de una cabeza
Consideraciones para la evaluación de la morfo- normal. En la página 21 el límite es un tercio. La
logía espermática recomendación del presente manual es la de un ter-
Cada espermatozoide sin “defectos” morfológicos cio del área de una cabeza normal.
es definido como ideal. Todas las desviaciones de la En el manual de la OMS las leyendas de las
morfología ideal son clasificadas como defectos. La figuras 2.9-2.10 no son congruentes con el texto de
presencia de defectos en cada región del esperma- las páginas 19-21. Este manual recomienda que se
tozoide se expresa como “defectos por 100 esper- apliquen los criterios dados en el presente texto.
matozoides” para esa región. Un espermatozoide
con un defecto en la cabeza, en la pieza intermedia Recuento de formas defectuosas
y en la cola es registrado como un espermatozoide Esta valoración está relacionada con las partes prin-
con tres defectos pero sigue siendo un único esper- cipales del espermatozoide (cabeza, pieza interme-
matozoide defectuoso. Según esto, el número total dia y cola). No se realiza diferenciación entre las
de defectos será mayor al número de células defec- diferentes anormalidades. Si predomina una anor-
tuosas. malidad concreta, deberá comentarse en el informe.
Sólo se cuentan los espermatozoides com- Se valoran las siguientes cuatro categorías principa-
pletos, con cabeza y cola. Las cabezas solas se les.
cuentan de forma separada. Si hay muchas formas
“cabeza de alfiler” o colas sueltas (>20% de todos Defectos de cabeza
los espermatozoides) deberá ser anotado aparte. Las Incluyen formas grandes, pequeñas, alargadas
células germinales inmaduras deben ser contadas (cociente largo/ancho>2), con forma de pera (piri-
separadamente, y no como espermatozoides. formes), redondas, amorfas, vacuoladas (>20% del
área de la cabeza ocupada por vacuolas no teñidas),
¿Qué es un espermatozoide ideal? acrosomas pequeños (<40% del área de la cabeza)
Un espermatozoide maduro ideal, tal como fue o dobles cabezas, o combinaciones de estos defec-
adoptado por la OMS en 1999, tiene una cabeza con tos. Los espermatozoides “cabeza de alfiler” no se
forma oval y contorno regular (4,0-5,0 µm de largo cuentan.
22
Morfología espermática
Defectos de cuello y de pieza intermedia gía deben estar totalmente libres de grasa para ase-
Incluyen cola doblada (cuando la pieza intermedia gurar que la extensión se adhiere al cristal. Si la
y la cola forman un ángulo >90º con el eje longitu- extensión se desprende durante la fijación y la tin-
dinal de la cabeza espermática = originada a partir ción, los portaobjetos que van a usarse deberán ser
de un centríolo anormal), con inserción asimétrica, prelavados con etanol 95% (o absoluto) para permi-
pieza intermedia ancha, irregular o estrecha (ausen- tir que la extensión quede firmemente unida al por-
cia o desplazamiento de la vaina mitocondrial) o la taobjetos.
combinación de estas anormalidades. Si una extensión se hace a partir de esper-
matozoides lavados procedentes de un swim-up,
Defectos de cola resulta muy difícil que quede firmemente adherida
Incluyen cola corta, doble, horquilla (“hairpin”), al portaobjetos si la solución no contiene proteínas.
rota, doblada (ángulo >90º), irregular o enrollada, o En esos casos deben usarse portaobjetos recubiertos
las combinaciones de estas anomalías. Las colas con albúmina o poli-L-lisina, o bien añadir albúmi-
sueltas no se cuentan. Una frecuencia alta de colas na a la solución (concentración final 1% p/v).
enrolladas puede indicar que el espermatozoide ha
estado sometido a estrés hipoosmótico. La cola Realización de la extensión
enrollada está también relacionada con el envejeci- Para realizar una extensión, se coloca una alícuota
miento del espermatozoide. Una frecuencia >20% de 6 µL en el portaobjetos. A continuación se arras-
de formas enrolladas deberá comentarse en el infor- tra a lo largo del portaobjetos con la ayuda de otro
me. portaobjetos o un cubreobjetos. Esto debe hacerse
con mínima fuerza para evitar la posible ruptura de
Gotas citoplasmáticas las colas de los espermatozoides. De cada muestra
Pueden permanecer restos citoplasmáticos sobresa- deben prepararse dos extensiones. Si la concentra-
liendo de la base de la cabeza en el cuello-pieza ción estimada de espermatozoides es < 20 millo-
intermedia. Las gotas con contorno liso, y un tama- nes/mL se utilizarán 10-20 µL de semen. Con
ño no superior a la tercera parte de la cabeza del muestras muy viscosas pueden usarse otros méto-
espermatozoide son clasificadas como normales. Si dos. Se puede diluir la muestra con una solución de
el tamaño de la gota es mayor o el contorno es irre- NaCl 170 mmol/L y preparar la extensión como se
gular (teñida verde o roja), se trata de un residuo ha comentado o bien depositar una gota de semen
citoplasmático anormal y se clasifica como gota sobre el portaobjetos, colocando a continuación
citoplasmática. Algunos espermatozoides inmadu- otro portaobjetos sobre el primero y posteriormente
ros pueden tener gotas citoplasmáticas en otras separarlos por deslizamiento.
posiciones a lo largo de la cola. Dejar las extensiones secar al aire. En diag-
nóstico citológico se utiliza una preparación húme-
Defectos específicos da para la mayoría de las extensiones de modo que
Entre los animales domésticos se han descrito dife- la preparación húmeda se sumerge en el fijador o se
rentes defectos esterilizantes en los que práctica- le añade éste mediante aerosol. De este modo se
mente todos los espermatozoides producidos por un evita la contracción de las células. Este método
determinado animal tienen un defecto estructural puede usarse también para extensiones seminales
específico que perjudica la función espermática. En (pero debe tenerse en cuenta como complicación
los hombres se han descrito pocos casos equivalen- que las células pueden quedar flotando sobre el por-
tes; el más conocido es probablemente el denomi- taobjetos y perderse).
nado “defecto de cabeza redonda” o “globozoos- Las extensiones seminales pueden secarse
permia”. Este defecto se ha visto en algunos hom- completamente al aire antes de ser fijadas, pero si
bres y afecta a todos los espermatozoides en sus se dejan secar durante demasiado tiempo pueden
eyaculados. producirse cambios morfológicos en el espermato-
zoide. (por ejemplo, discontinuidad entre la cola y
Preparación de las extensiónes la cabeza, o pérdida de acrosoma por excesiva
Los portaobjetos para las extensiones de morfolo- retracción). Por lo tanto, las extensiones deberían
23
Morfología espermática
ser transferidas al fijador inmediatamente después Tan pronto como la humedad se evapora, la
de que la humedad de la extensión se haya evapo- extensión debe ser fijada.
rado. Este “incompleto” secado al aire normalmen-
te permite un mejor anclaje de la extensión al por-
taobjetos.
Tabla I. Esquema para la tinción de las extensiones
Etanol 50% 10 inmersiones o 10 s Extensiones transferidas directamente desde una solución fijadora de etanol 95% (sin secar)
deben ser transferidas a través de al menos un contenedor con etanol 50%.
La rehidratación de extensiones secadas al aire necesita más tiempo, 2-3 min en etanol 50%
si el tiempo de secado ha sido largo (días o semanas).
Agua destilada 10 inmersiones
Hem. de Harris 3 minutos exactamente Las extensiones fijadas y secas pueden ser transferidas directamente a la hematoxilina pero
el tiempo de incubación debe aumentarse.
La hematoxilina es un colorante nuclear, y se consume con el uso. Si la tinción nuclear es débil,
el tiempo de exposición debe aumentarse o, preferiblemente, usar una solución fresca.
Agua corriente 5 min Eliminación de la hematoxilina no unida.
Etanol ácido
(HCl 0.25% en
etanol 70%) 2 inmersionesa Después de la tinción la hematoxilina se une a toda la célula. El tratamiento ácido elimina la tinción
inespecífica gracias a que el color unido a componentes citoplasmáticos es desplazado por iones H+. Sin
embargo, un tiempo excesivo de exposición al ácido disminuye el color en el núcleo. Tras el tratamiento
ácido, los portaobjetoss deben ponerse en agua corriente inmediatamente para aumentar el pH y prevenir la
desaparición de toda la hematoxilina. (La intensidad de la tinción puede ser verificada aquí, antes de
continuar la tinción. Si el núcleo aparece demasiado oscuro este paso –etanol ácido– puede repetirse).
Las tinciones muy débiles indican que la exposición a la hematoxilina fue insuficiente.
Agua corriente
(o agua alcalina) 5 min El color de la hematoxilina depende del pH. Después del tratamiento ácido es rojiza.
Al lavar los portaobjetos en agua corriente el pH aumenta y la hematoxilina unida al núcleo
recobra el color azuladob.
(a)Puede probarse el tiempo adecuado de tratamiento ácido pero normalmente 2 inmersiones son suficientes para eliminar tinciones inespecíficas (esto puede
comprobarse directamente en el microscopio)
(b)A veces el agua del grifo es demasiado ácida (pH 4-5) por lo que este cambio de color (a azulado) no se produce. En esos casos las extensiones se introdu-
cen en solución de Scott (contiene 3,5 g de bicarbonato sódico, 20 g de sulfato de magnesio, 1000 mL de agua corriente y 1 pequeño cristal de Tymol para evi-
tar crecimiento microbiano). Otro método para alcalinizar el agua es sumergir el portaobjetos una vez en una solución preparada añadiendo 2-3 gotas de amo-
nio líquido (NH4OH) en 200 mL de agua corriente. Esto desarrolla rápidamente el color azul y acorta el procedimiento.
24
Morfología espermática
Etanol 95% 5 inmersiones Pasos de deshidratación para preparar el montaje con el disolvente inorgánico
Etanol 95% 5 inmersiones
Etanol 95% 5 inmersiones
Etanol 98-99.5%
(etanol absoluto) 2 minutos
Medio de montajea 2-3 gotitas Mountex Cuando el medio de montaje es soluble en etanol (Mountex, Eukitt), puede colocarse directamente
Eukitt sobre la extensión, que estará todavía húmeda de etanol.
DePex Si el medio es insoluble en etanol (DePex, Pertex Permount) dejar la extensión secar al aire
Pertex (el etanol se evapora), añadir el medio y montar. Si las extensiones no están totalmente secas el
etanol debe ser eliminado sumergiendo primero el portaobjetos en solución etanol-xileno (v/v) y
después en dos cambios en xileno 100%. Puede usarse “Bioclear” en lugar de xileno para eliminar
el etanol. El etanol debe eliminarse totalmente. Comprobar colocando el portaobjetos contra
la luz que no hay fase líquida debida a la presencia de etanol. Si hay gotas de etanol en el
portaobjetos que se va a montar con un medio insoluble en etanol, se forma un fondo con áreas
ricas en eosina. Sin embargo, cuando las extensiones se secan al aire, no hay necesidad de xileno
ni “Bioclear”.
Cubreobjetos de 24x60 mm • Un cubreobjetos de 24x60 mm es lo más conveniente, y puede colocarse directamente sobre la
extensión después de añadir 2 o 3 gotitas de medio de montaje.
• Colocar el cubreobjetos de tal modo que el primer contacto con el medio de montaje empiece por
uno de los extremos del cubreobjetos. De este modo se evita la formación de burbujas.
Las burbujas pueden evitarse también presionando fuertemente sobre el cubreobjetos y retirando el
medio sobrante. Dejar secar el portaobjetos antes de mirarlo al microscopio, como norma habitual,
durante toda la noche. Si se necesitan urgentemente los resultados de la morfología
espermática, se puede estudiar al microscopio tras 30 minutos de secado. Pero debe evitarse
cualquier presión o deslizamiento del cubreobjetos.
a El último paso del proceso de tinción es el montaje de la extensión, esto es, cubrir el portaobjetos con un cubreobjetos que se pega con un medio de montaje.
25
Morfología espermática
taobjetos, por ejemplo, podría aumentarse el tiem- tienen un solo núcleo centralmente localizado.
po de tinción o añadir una cantidad de colorante Las formas inmaduras pueden expresarse
fresco al recipiente. En las tres soluciones de colo- por 100 espermatozoides y puede calcularse su con-
rantes (hematoxilina, OG6 y EA50) suele aparecer centración en la muestra de semen a partir de la
material sedimentado; cuando esto ocurra deben fil- concentración de espermatozoides. La fórmula para
trarse las soluciones para evitar que estos sedimen- este cálculo es:
tos se depositen en los portaobjetos. concentración de células germinales inmaduras =
número de células inmaduras contadas por 100
Montaje de la extensión teñida espermatozoides(%)/100*concentración de esper-
El montaje permite el almacenamiento de las exten- matozoides.
siones durante largos períodos de tiempo mante-
niéndose una aceptable calidad. Las extensiones
Control de calidad
deberán ser montadas directamente usando un El manual de la OMS recomienda que se cuenten
medio de montaje permanente. La extensión mon- 200 espermatozoides por duplicado (2x200) si el
tada debe dejarse secar durante al menos toda la diagnóstico y tratamiento del paciente dependen
noche antes de ser examinada. Puede guardarse crucialmente de este análisis. La ESHRE/NAFA
durante muchos meses a temperatura ambiente. Las recomienda realizar también el recuento duplicado
extensiones que no se montan pueden examinarse cuando los datos derivados vayan a usarse en publi-
tan pronto como se secan al aire. Se recomienda el caciones científicas. En la práctica de rutina se estu-
uso de medios solubles en alcohol como medios de dian sólo 200 espermatozoides y no por duplicado.
montaje en lugar de xileno, que supone peligro para Cuando se hacen recuentos por duplicado, los cál-
la salud. Los detalles de la técnica de montaje se culos se realizan como sigue:
dan en la Tabla II. 1. Calcular el porcentaje de formas normales y
anormales y seleccionar el mayor de estos dos
Evaluación de la morfología espermática grupos para la comparación de los duplicados.
Deben estudiarse al menos 200 espermatozoides. 2. Calcular las diferencias entre las dos valoracio-
Cada extensión es valorada usando un microscopio nes en el grupo seleccionado.
con un aumento total de 1000x usando un objetivo 3. Si la diferencia es menor al valor obtenido en el
de alta calidad 100x sin contraste de fases con acei- Apéndice II, el resultado puede ser aceptado. Si
te de inmersión y con un correcto ajuste de campo la diferencia es mayor a ese valor, deben reali-
claro (iluminación Köhler). El objetivo deberá ser zarse dos nuevas valoraciones.
de óptica plana. Los objetivos de contraste de fases Si la tinción es técnicamente difícil de leer,
no proporcionan suficiente resolución para el estu- se deberá teñir la extensión guardada de reserva con
dio de la morfología espermática debido a la pre- soluciones frescas y valorarla.
sencia de anillos de fase en la cara posterior de las Si la extensión ha desaparecido durante el
lentes. Solo se consideran los espermatozoides proceso de teñido, una razón podría ser que era
completos, con cabeza y cola. Esto incluye situa- demasiado gruesa, o bien que los portaobjetos no
ciones en las que la cantidad de citoplasma y la estaban lo suficientemente limpios. La presencia de
corta longitud de la cola indican que el espermato- pequeños cristales azul oscuros sobre la extensión
zoide es inmaduro (por ejemplo cuando está en un teñida indica que la hematoxilina no ha sido filtra-
estadío de espermátide elongada). da antes de su uso.
26
Morfología espermática
2. Porcentaje de defectos de cabeza, porcentaje de peligro de explosión. Etanol ácido: 150 mL etanol
defectos de cuello/pieza intermedia, porcentaje 70% (v/v); 1 mL de HCl concentrado (36%); 50 mL
de defectos de cola, porcentaje de gotas cito- de agua destilada.
plasmáticas. Colorantes: Hematoxilina de Harris, EA50
3. Índice de teratozoospermia (TZI92: media del y naranja G6 que pueden adquirirse listos para su
número de defectos por espermatozoide defec- uso y guardarse a temperatura ambiente protegidos
tuoso); se calcula dividiendo la suma de por- de la luz. La hematoxilina debe ser filtrada (papel
centajes de todos los defectos (defectos de de filtro Reeve 802) justo antes de usarse. Se puede
cabeza, defectos de cuello/pieza intermedia, realizar un máximo de 25-30 series de tinción y
defectos de cola y gotas citoplasmáticas) entre después desechar la solución de trabajo. Los reacti-
el porcentaje de espermatozoides anormales. vos deben cambiarse por soluciones frescas cuando
El manual de la OMS-1999 clasifica el cálculo la intensidad de color se vuelve demasiado débil o
del TZI como opcional. La recomendación de la disminuye rápidamente en los portaobjetos (espe-
ESHRE/NAFA es que debería ser calculado cialmente el azul). Después de 10 series las solu-
incluyendo todos los grupos de defectos, tal ciones de colorante deben filtrarse para eliminar los
como se define en la OMS-1992. Sin embargo, residuos (fragmentos que se despegan de las exten-
para evitar confusiones con el índice anterior, siones) y las partículas de colorante sedimentadas.
que incluía también las gotas citoplasmáticas, la Montaje: Mountex, Eukitt, DePex, Per-
ESHRE/NAFA sugiere que el TZI debería darse mount, Pertex (Ver Tabla II).
con el índice 92, TZI92 para referirse claramen-
te a la recomendación anterior de la OMS. Equipo y materiales
• Microscopio: Objetivo de 100x para aceite de
inmersión, con corrección de irregularidades de
Reactivos la superficie de la lente, sin contraste de fases.
Nota: El agua destilada significa que ha sido desio- • Portaobjetos para microscopio (tamaño están-
nizada o bidestilada (la ausencia de iones debe pro- dar), cubreobjetos (24x60 mm).
vocar una resistencia de >10 MΩ/cm). • Equipo citológico convencional para fijación y
Fijación: etanol, 95% (ver más adelante). tinción de extensiones.
Tinción: se usa etanol con diferentes grados
de pureza en solución acuosa: 50, 70, 80, 95, 99.5%
v/v. Estas soluciones se preparan por dilución volu- Referencias
métrica de etanol 99.5% con agua destilada y se Menkveld, R, Stander F.S., Kotze, T.J., Kruger, T.F. y van Zyl,
J.A. (1990). The evaluation of morfological characteristics of
guardan en botellas de cristal bien cerradas a tem- human spermatozoa according to stricter criteria. Hum.
peratura ambiente. No guardar refrigeradas por el Reprod., 5 586-592.
27
ESHRE Monographs: Manual on Basic Semen Analysis pp.18-20, 2002
6. Anticuerpos anti-espermatozoide
30
Anticuerpos anti-espermatozoide
pués de 3 y de 10 minutos bajo objetivo de 40x IgG humana) se pueden conseguir de forma independiente.
de contraste de fases y examinar, al menos, 200
espermatozoides móviles (con colas móviles); Prueba Immunobead
determinar cuántos tienen partículas adheridas.
Principios básicos
Prueba SpermMAR indirecta Los anticuerpos unidos a la superficie de los esper-
1. La prueba SpermMAR indirecta se emplea para matozoides humanos pueden ser detectados por
detectar anticuerpos anti-espermatozoides en otros anticuerpos que han sido producidos contra
líquidos libres de espermatozoides (el suero moléculas de inmunoglobulinas humanas: IgG, IgA
debe ser previamente inactivado con calor: o IgM. Las immunobeads son microesferas de plás-
56ºC, 45 minutos en un tubo de plástico). tico con anticuerpos anti-Ig humana unidas. Así,
2. Preparar el semen de donante mediante swim- immunobeads anti-IgG, IgA o IgM detectan esper-
up o centrifugación en gradientes de densidad. matozoides con anticuerpos anti-espermatozoide de
Ajustar la concentración de espermatozoides los isotipos IgG, IgA e IgM, respectivamente. Para
móviles finales a 20 x 106/mL. el cribado, se pueden utilizar immunobeads diseña-
3. Diluir la muestra que se va a analizar de forma dos para marcaje de células B (GAM beads) puesto
seriada, por ejemplo, a 1/16 para la prueba de que están recubiertos con anticuerpos dirigidos
IgG y un cuarto para la prueba de IgA. Diluir contra los tres isotipos de inmunoglobulinas.
con el medio utilizado en el swim-up, como por
ejemplo, medio de Earle (pH 7.4) sin albúmina Prueba indirecta
ni suero. Los anticuerpos unidos a espermatozoides de
4. Mezclar 100 µL de la suspensión espermática donante, tras su incubación con el fluido a analizar,
con 100 µL del espécimen a estudiar diluido e se pueden detectar como se describió anteriormen-
incubar durante 60 minutos a 37ºC. te para la prueba directa.
5. Añadir 2 mL de medio, mezclar bien y centrifu-
gar a 400 g durante 10 minutos. Procedimientos
6. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedi- Prueba Immunobead directa
mento espermático con 50 µL de medio. 1. Para cada tipo de Immunobead, añadir 0,2 mL
7. Proceder como se describió anteriormente en la de la suspensión de microesferas a 10 mL de
prueba SpermMAR directa, pasos 1 y 2, pero tampón I en tubos separados de centrífuga de
empleando una gota de la suspensión de esper- base cónica.
matozoides preparada en lugar del semen fres- 2. Determinar la cantidad de semen a usar según la
co. Tabla I, y depositar el volumen determinado en
un tubo y completar hasta 10 mL de tampón I.
Cálculos y resultados 3. Centrifugar todos los tubos a 500 g durante 6
Contar al menos 200 espermatozoides móviles (con minutos a temperatura ambiente.
colas en movimiento). El resultado se expresa como 4. Tubos con semen: decantar los sobrenadantes.
el porcentaje de espermatozoides móviles que lle- Resuspender los sedimentos espermáticos en 10
van partículas unidas. Si ≥ 50% de espermatozoides mL de tampón I fresco y centrifugar de nuevo
tienen partículas de látex unidas, se debe considerar como antes. Decantar los sobrenadantes y
que existe un factor inmunológico. resuspender los sedimentos espermáticos en
200 µL de tampón II.
Reactivos 5. Tubos con microesferas: decantar los sobrena-
Los reactivos para la prueba SpermMAR IgG e IgA se pue- dantes y resuspender las microesferas en 200
den obtener de FertiPro N. V., Beernem, Bélgica (Grupo µL de tampón II.
Equipos Médico-Biológicos, España; Quermed, España). 6. Poner gotas de 5 µL de cada tipo de
Los kits contienen todos los materiales necesarios. Para un
Immunobead sobre portaobjetos limpios.
laboratorio de andrología a gran escala, los frasos que con-
tienen 0,7 mL de las soluciones de partículas de látex con Añadir 5 µL de la suspensión de espermatozoi-
IgG o anti-IgA y 0,7 mL de soluciones de antisuero (anti- des lavados a cada gota y mezclar bien usando
31
Anticuerpos anti-espermatozoide
una punta de pipeta amarilla. Poner un cubreob- Tabla II: Soluciones de Tyrode y Dulbecco
jetos de 22x22 mm #1.5 de grosor sobre cada
una de las mezclas. Constituyentes Solución de PBS de
7. Dejar los portaobjetos 10 minutos a temperatu- Tyrode (g/L) Dulbecco (g/L)
ra ambiente en una cámara húmeda y luego eva-
CaCl2 0,2 0,1
luar bajo un objetivo 20x de contraste de fases.
KCl 0,2 0,2
Tabla I: Volumen de semen necesario para el análisis de NaCl 8,0 8,0
anticuerpos anti-espermatozoide NaH2PO4 0,05 -
MgCl2·6H2O 0,2 0,1
Concentración esper- Movilidad grados Cantidad de semen
mática (106/mL) a + b (%) para a usar (µL) NaHCO3 1,0 -
Na2HPO4·7H2O - 2,2
KH2PO4 - 0,2
> 50 200
20-50 > 40 400 Glucosa 1,0 -
20-50 < 40 800
< 20 > 40 1000
< 20 < 40 2000 Reactivos
< 10 > 2000 • Immunobeads: microesferas anti-IgG, IgA e
IgM (Irvine Scientific, Santa Ana, California,
USA; Izasa, España).
Prueba Immunobead indirecta • Para el cribado, se pueden emplear microesfe-
Lavar el semen de donante dos veces en Tampón I ras con anti-IgGAM.
como se describió anteriormente, pasos 2-4, o pre- • Reconstituir las microesferas según las instruc-
pararlos de entrada mediante swim-up o centrifuga- ciones del fabricante. Las microesferas pueden
ción en gradientes de densidad y lavarlos a conti- ser almacenadas durante varios meses a 4ºC en
nuación. Ajustar las suspensiones de espermatozoi- el tampón original el cual contiene conservan-
des lavados a una concentración final de esperma- tes (azida).
tozoides móviles de 50 x 106/mL en tampón II. • Tampón de stock: puede usarse solución de
Diluir 10 µL del fluido a analizar con 40 µL Tyrode o solución tamponada de fosfato (PBS)
de tampón II y mezclar con 50µL de la suspensión de Dulbecco (Tabla II).
de espermatozoides lavados de donante. Incubar a • Tampón I (0,3% BSA): tampón para el lavado
37ºC durante 60 minutos. de Immunobeads (10 mL) y lavado de esper-
Lavar los espermatozoides dos veces como matozoides (2 x 10 mL para cada muestra de
describimos anteriormente (pasos 2-4) y realizar la semen). Añadir 0.6 g de albúmina sérica bovi-
prueba según las indicaciones dadas en el paso 6. na (BSA; fracción V Cohn) a 200 mL de tam-
pón stock. Son suficientes 200 mL de tampón I
Cálculos y resultados para lavar y analizar la presencia de IgA e IgG
Evaluar únicamente los espermatozoides móviles y en 6 muestras, un control positivo y uno nega-
valorar el porcentaje de espermatozoides que tienen tivo.
dos o más microesferas unidas (ignorar uniones a la • Tampón II (5% BSA): tampón para resuspender
punta de la cola). Contar al menos 200 espemato- las Immunobeads y los sedimentos de esperma-
zoides móviles por duplicado para cada prepara- tozoides, 200 µL para cada espécimen.
ción. Anotar el porcentaje de espematozoides que Adicionar 250 mg de BSA a 5 mL del stock de
llevan microesferas unidas, la clase de Ig (IgG o tampón. Se necesitan un total de 2 mL de tam-
IgA) y el sitio de unión (cabeza, pieza intermedia, pón II para analizar la presencia de IgA e IgG
cola). en 6 muestras y 2 controles.
• Filtrar todas las soluciones con filtros de 0,22 ó
0,45µm y calentar a 25-35ºC antes de su uso.
32
Anticuerpos anti-espermatozoide
33
ESHRE Monographs: Manual on Basic Semen Analysis pp.21-24, 2002
Durante la última década se ha hecho más evidente • Medias mensuales de los resultados.
la importancia de una política diferenciada para la • Control del equipamiento (calibración de pipe-
garantía de la calidad (GC). Este capítulo tratará tas, mantenimiento regular de los instrumentos
algunos aspectos de la GC y procedimientos impor- y otros materiales como las cámaras de recuen-
tantes relacionados con la técnica subyacente de to).
control de calidad (CC).
El CC es solo una parte de la GC. La des- Control a nivel intra-análisis
cripción detallada de la GC escapa a los objetivos Un aspecto básico del CCI es hacer mediciones por
de este manual, por lo que nos centraremos sólo en duplicado y verificar que los duplicados no difieren
algunos aspectos básicos del CC en relación con el demasiado. Una diferencia importante incrementa
manual de la OMS. el riesgo de que se haya producido un error aleato-
La cuarta edición del Manual del rio en algún paso del proceso. Con el método reco-
Laboratorio para el Examen del Semen Humano y mendado para la comparación, el factor más impor-
la Interacción entre el Semen y el Moco Cervical tante es el número de células valoradas. En el
(1999) tiene un capítulo nuevo que revisa principal- Apéndice II se muestra el intervalo de confianza al
mente los aspectos técnicos del CC. 95% (IC) para proporciones en relación con el
número de espermatozoides valorados. Es obvio
CC que el intervalo –y la incertidumbre de los resulta-
Pueden distinguirse dos partes principales del CC: dos– es grande cuando se valoran <200-400 esper-
interno (CCI) y externo (CCE). Todos los laborato- matozoides. En el apéndice I se muestra el IC 95%
rios deben tener un CCI para ser capaces de emitir relativo (%) para la concentración espermática. La
resultados fiables. El CCE es necesario para permi- incertidumbre de las mediciones es grande cuando
tir la comparación de resultados entre diferentes se han contado <200-400 espermatozoides.
laboratorios. Sin embargo, el CCE sólo es útil y Otro aspecto igualmente importante del CCI
válido si el laboratorio dispone también de un pro- a nivel analítico es el conocimiento de las fuentes
grama efectivo de CCI. Si el control interno básico de error, las debilidades de los métodos y el equi-
no funciona adecuadamente, los resultados del CCE pamiento usado, y también la comprensión del con-
serán erráticos. Por lo tanto, la participación en un texto clínico y biológico del análisis.
programa de CCE no puede sustituir al componen-
te de CCI en un laboratorio concreto. Programa básico de CCI
Un programa básico de funcionamiento de CCI
CCI debe incluir mediciones duplicadas de las principa-
El CCI tiene niveles muy diferentes: les variables seminales realizadas por diferentes
• Control a nivel del intra-análisis. técnicos. Esto podría organizarse de diferentes
• Programa básico de CCI maneras en función de la estructura del laboratorio
36
Control de calidad y garantía de calidad
37
Control de calidad y garantía de calidad
39
Control de calidad y garantía de calidad
Tabla I. Se acepta la valoración si la diferencia entre las dos Tabla II. Intervalo de confianza del 95% con relación al
observaciones es menor o igual a la diferencia límite. número de espermatozoides observados
40