CURSO

Evaluación de calidad
de productos a base
de Trichoderma

10 al 13 de Marzo 2014
Universidad de Concepción - Concepción
 ÍNDICE

INTRODUCCIÓN

METODOLOGIA PARA CONTROL DE CALIDAD DE PRODUCTOS

BIOLÓGICOS A BASE DE Trichoderma.

I. METODOLOGIAS PARA CONTROL DE CALIDAD DE PRODUCTOS

BIOLÓGICOS A BASE DE Trichoderma FORMULADOS EN POLVO
MOJABLE, GRANULOS DISPERSABLES Y SUSPENSIÓN CONCENTRADA.
I. I - METODOLOGIA PARA A CONTEO DE NÚMERO DE CONÍDIOS.
I.II-METODOLOGIA PARA LA VIABILIDAD DE CONÍDIOS – PORCENTAJE
DE CONÍDIOS VIABLES.
I.III-METODOLOGIA PARA LA VIABILIDAD DE CONÍDIOS – UNIDAD
FORMADORA DE COLONIA.

REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA

BIBLIOGRAFÍA SUGERIDA
 METODOLOGIA PARA EL CONTROL DE CALIDAD DE PRODUCTOS
BIOLÓGICOS A BASE DE Trichoderma.
Wagner Bettiol, Marcelo Augusto Boechat Morandi, Zayame Vegette Pinto, Cleusa
Maria Mantovanello Lucon, Murillo Lobo Júnior, João de Cássia do Bomfim Costa,
Trazilbo, José de Paula Júnior, Hudson Teixeira, Andréa Bittencourt Moura.

INTRODUCCIÓN

En los últimos años la demanda por agentes biológicos viene creciendo en Brasil
y en el mundo debido a la preocupación por la seguridad alimentaria y la sustentabilidad
de la producción agrícola. Esto porque la intensificación del uso de bioproductos para el
control de fitopatógenos, contribuye directamente la reducción de la utilización de
agrotóxicos en los sistemas agrícolas, disminuyendo los impactos negativos de esos
productos en el ambiente y en la salud humana.
Entre los agentes de biocontrol los hongos del género Trichoderma se
encuentran entre los más conocidos y comercializados en todos los países debido al gran
potencial que poseen para mejorar la sanidad de las plantas y la producción vegetal
(Harman, 2004a; Bettiol et al. 2012).
Aunque sean conocidos hace más de 80 años el aumento en las investigaciones
para comprender mejor el potencial biotecnológico de estos hongos ocurrió apenas en
las últimas tres décadas. Revisiones recientes describen la evolución de los estudios
realizados sobre el género Trichoderma, justificando la importancia de estos hongos en
la producción agrícola mundial (Brotman et al., 2012; Carreras-Villasen et al., 2012;
Gruber e Seidl-Seiboth, 2012; Harman et al., 2012; Hermosa et al., 2012, Lorito et al.,
2010; Ryder et al., 2012; Rubio et al., 2012).
Los bioprodutos a base de Trichoderma se han utilizado con éxito para controlar
los patógenos principalmente de suelo, pertenecientes a los géneros Fusarium, Pythium,
Rhizoctonia y Sclerotinia, en cultivos importantes como soja, frijol, algodón, maíz,
varias hortalizas y plantas ornamentales (Bettiol et al., 2012).
Entre las características responsables del éxito de estos hongos pueden ser
mencionadas la facilidad con que son aislados, multiplicados y manipulados en
condiciones de laboratorio; la producción abundante de conidios en varios tipos de
medios y substratos; la capacidad que poseen de colonizar el suelo y el sistema radicular
de las plantas; los diversos mecanismos que pueden utilizar en el control de
fitopatógenos y en la promoción de crecimiento de las plantas (Melo, 1991; Howell,
2003; Harman et al., 2004a; Harman et al., 2012).

Aunque sean considerados como hongos habitantes del suelo, viviendo

saprofíticamente o parasitando otros hongos , algunas cepas son reconocidas como
simbiontes endofíticos multifuncionales de plantas y responsables por causar cambios
marcados en la fisiología y morfología vegetal (Chaverri et al., 2011; Salmoski et al.,
2012).
Algunas cepas pueden modificar la arquitectura del sistema radicular, con
aumentos de biomasa y número de ramificaciones de las raíces, mejorando la eficiencia
del agua en la adquisición de nutrientes minerales del suelo y de la tasa de fotosíntesis
(Harman et al., 2004b; Contreras-Cornejo et al., 2009, Rubio et. al., 2012). Otras son
capaces de aumentar la resistencia de las plantas a estrés bióticos, abióticos y
fisiológicos durante el proceso de germinación de las semillas y desarrollo de las mudas
(Mastouri et al., 2010).
En el mercado brasileño se encuentran disponibles varios productos a base de
agentes de biocontrol, siendo los formulados a base de Trichoderma spp. destacados
(Bettiol & Ghini, 2003; Morandi et al., 2006, Bettiol et al., 2008; Bettiol et al., 2012).

Entre los principales obstáculos para la ampliación de la utilización de los

bioproductos en la producción agrícola nacional; la escasez de las formulaciones
debidamente registradas junto al Ministerio de la Agricultura, Pecuaria y Abastecimento
– MAPA – es considerado como el más serio (Machado et al., 2012). Segundo de
acuerdo a Melo y Costa (2005), la baja oferta de bioproductos registrados debido a la
aplicación de los mismos criterios que rigen los agrotóxicos de base química, tornando
el proceso costoso y lento.

La comercialización y utilización de productos no registrados dificulta la

fiscalización y propicia el surgimiento de productos de baja calidad y que terminan por
generar pérdida en la credibilidad por parte de los agricultores en la eficiencia de
Trichoderma en el control de enfermedades en las plantas. Además, las empresas de
renombre se han visto perjudicadas por la competencia en el mercado brasileño con
productos de baja calidad y menor costo. Además la ausencia de registro de los
productos impide que los mismos sean utilizados en sistemas certificados para la
exportación, lo que puede generar barreras no tarifarias en el desarrollo del agronegocio
brasileño.
 A pesar de los avances significativos en la legislación federal de agrotóxicos,
especialmente por la publicación de la IN Conjunta nº 03/2006, que regula el proceso de
registro de agentes microbiológicos de control fitosanitario, en Brasil aun no existen
metodologías validadas para el análisis de conformidad y control de calidad de estos
productos. La ausencia de metodologías estandarizadas dificulta la realización de los
test y emisión de informes exigidos para el registro de los organismos demandantes
(MAPA, ANVISA e IBAMA). También en Brasil no hay especificaciones mínimas
oficializadas para este grupo de productos, siendo todos los agentes de control biológico
(entomopatógenos, parasitoides, predadores y nematoides) enmarcados en el contexto
de “agrotóxicos y afines” (Castro, 2006).

Por tanto, es urgente y necesario el desarrollo de metodologías para evaluar la

calidad de los productos biológicos comercializados en Brasil de forma de promover la
legalización de los productos y garantizar su calidad y efectividad. Una vez
desarrolladas y estandarizadas esas metodologías podrán ser utilizadas para la
inspección y fiscalización por los organismos y laboratorios oficiales, repercutiendo en
la mejoría de los productos biológicos nacionales.
Así, en el ámbito de proyecto Qualibio fueron desarrolladas metodologías para
realizar esas evaluaciones (Figura 1), con la participación de Embrapa Medio Ambiente,
Embrapa Arroz e Feijão, Empresa de Investigación Agropecuaria de Minas Gerais -
Epamig/Viçosa, Instituto Biológico - IB, Ceplac/Cepec y Universidad Federal de
Pelotas – UFPel.
Estas metodologías están siendo transferidas a la sociedad por medio del
“Curso Teórico y Práctico – Evaluación de la calidad de productos a base de
Trichoderma”. Hasta el momento fueron realizados algunos cursos, con retorno positivo
de los participantes, que ya están utilizando las metodologías como rutina en los
laboratorios.
El uso de las metodologías estandarizadas está ayudando a la promoción y
legalización de los productos, así como en garantizar su calidad y efectividad,
repercutiendo en la mejoría de los productos biológicos nacionales y consecuentemente
aumentando su mercado consumidor.
Figura 1. Esquema de las metodologías propuestas para productos a base de
Trichoderma.
 I. METODOLOGIAS PARA EL CONTROL DE CALIDAD DE PRODUCTOS
BIOLÓGICOS A BASE DE Trichoderma FORMULADOS EN POLVO
MOJABLE, GRANULOS DISPERSABLES Y SUSPENSIÓN CONCENTRADA.

I. I - METODOLOGIA PARA EL CONTEO DE NÚMERO DE CONÍDIOS

1. PRINCIPIO
Este es un método cuantitativo en que el resultado es expresado en número de conidios
por masa o volumen de producto biológico formulado. Tiene como base la preparación
de suspensión de conidios de Trichoderma y conteo de número de conidios con ayuda
de una Cámara Neubauer (hemacitómetro) en microscopio óptico.

2. APLICACIÓN
Aplicable a los productos en las formulaciones polvo mojable, gránulos dispersables y
suspensión concentrada que tienen como ingrediente activo estructuras del hongo
Trichoderma.

3. MUESTREO
La muestra debe ser enviada para su análisis en paquete sellado comercial que contenga
la siguiente información: la formulación, la concentración del ingrediente activo,
número de lote, fecha de fabricación, fecha de caducidad, nombre del producto, nombre
de la empresa, el responsable técnico, y el ingrediente activo inerte, así como la forma
de almacenamiento. En el laboratorio, las muestras se pueden almacenar a temperatura
ambiente o, preferiblemente, en un refrigerador. Las muestras no deben ser congeladas.
Se debe tomar muestras de acuerdo con los principios microbiológicos establecidos. Por
lo tanto, las muestras son representativas del producto que se está analizando.

4. EQUIPAMIENTOS Y MATERIALES
- Erlenmeyer con capacidad para 250mL;
- Tubos de ensayo de 25 mL;
- Tapas para tubo de ensayo;
- Estante para tubos de ensayo;
- Autoclave;
- Balanza semi analítica calibrada con campo de trabajo de 1 a 2000± 0,04g;
- Agitador de tubo de ensayo – tipo vortex;
- Baño de ultrasonido y frecuencia de 40 kHz;
- Agitador orbital para Erlenmeyer;
- Micropipeta calibrada de 10 ± 0,5 mL e 1000 ± 50 µL;
- Puntas esterilizadas para micropipetas de 10 mL e 1000 µL;
- Cámara de Neubauer (o hemacitómetro);
- Microscopio óptico;
- Contador manual de conidios;
- Agitador magnético;
- Barra magnética.

5. SOLUCIONES
Solución salina con Tween 80 (diluente):
Ingredientes:
- NaCl P.A.: 9,0 g;
- Agua destilada: 1000mL;
- Tween 80: 1 mL.
Preparación:
En frasco de Erlenmeyer suspender el NaCl en 1000 mL de agua destilada y añadir
Tween 80. Mezclar bien y autoclavar el diluente a 121°C y 1 atm por 20 minutos.

Observación: todos los materiales y soluciones deben ser esterilizadas en autoclave

antes de ser utilizadas.

6. PROCEDIMENTO
6.1 Las muestras a ser testadas deben ser colocadas a temperatura ambiente por 30 a 40
minutos antes del inicio del análisis.
6.2 Pesar 10g de producto a ser testado en Erlenmeyer de 250mL y completar con 90 g
de diluente (corresponde a dilución 10-1). Deben ser realizados dos pesajes para cada
muestra y una serie de dilución para cada pesaje. El segundo pesaje debe ser realizado
10 minutos después de la colocación de agua en la primera muestra para evitar mayor
tiempo de hidratación.
6.3 Colocar el Erlenmeyer con la suspensión en agitador orbital por 60 minutos a 120
rpm.
6.4 Colocar el Erlenmeyer con la suspensión en baño de ultrasonido, por 5 minutos. El
nivel de agua de baño de ultrasonido debe ultrapasar el volumen de la suspensión
contenida en Erlenmeyer.
6.5 Mezclar el contenido de Erlenmeyer en agitador de tubo de ensayo, colocando y
tirando tres veces del aparato hasta ver observada turbulencia de la suspensión, en cada
uno de los pesajes. Colocar en agitador magnético por 5 minutos.
6.6 Transferir 1,0 mL da suspensión contenida en Erlenmeyer (10 -1), con ayuda de
micropipeta con punta esterilizada para el tubo de ensayo conteniendo 9,0 mL de
diluente (10-2). Descartar la punta enseguida.
6.7 Homogenizar el contenido en agitador de tubo de ensayo, colocando y tirando tres
veces del aparato hasta ver observada turbulencia de la suspensión, en cada uno de los
pesajes.
6.8 Para obtener la dilución 10-3 repetir los items 6.6 y 6.7 (dilución seriada), utilizando
el tubo de la dilución anterior (10 -2). Proceder así repetidamente hasta alcanzar la
dilución apropiada para conteo de conidios (Tabla 1). Para cada dilución se debe
cambiar la punta de la micropipeta.

Tabla 1. Dilución apropiada a ser utilizada para el conteo de número de conidios, de

acuerdo con la concentración mencionada en el rótulo del producto.
Concentración de conidios* Dilución para conteo
≥ 109 10-4
≤ 108 10-3
*Cuando la concentración del producto no es conocida se debe utilizar las dos
diluciones y escoger para el conteo la que presente más de 10 conidios por
subcompartimento de cámara de Neubauer, conforme se observe al microscopio
óptico.

6.9 Mezclar el contenido de tubo de ensayo con la suspensión apropiada en agitador de

tubo de ensayo colocando y tirando tres veces. El tubo debe ser retirado cuando ocurre
turbulencia;
6.10 Retirar inmediatamente una alícuota representativa de la suspensión con ayuda de
una micropipeta;
6.11 Colocar la suspensión en la canaleta da cámara de Neubauer, ya cubierta con
cubreobjeto hasta llenar todo el espacio existente entre éste y la cámara Neubauer;
6.12 Antes de iniciar el conteo, dejar la cámara de Neubauer con la suspensión de
conidios en reposo por 5 minutos, para que los conidios precipiten, facilitando el conteo
y reduciendo errores;
6.13 Realizar el conteo de conidios al microscopio óptico, en el aumento de 250X o
400X, en los campos 1 y 2 de la cámara de Neubauer (Figura 1), en los cinco cuadrados
(subcompartimentos) demarcados en la Figura 2, totalizando cinco conteos por campo
da cámara de Neubauer (E1, E2, E3, E4 e E5).

Observación: Muchos conidios quedan exactamente sobre las líneas de demarcación

internas de los subcompartimentos. Se recomienda contar apenas los conidios que estén
en las líneas de la izquierda y superior del mismo campo de observación para evitar que
ellos sean contados dos veces.

Campo 1

Campo 2

Figura 1. Localización de los campos 1 y 2 en la cámara de Neubauer.

 E1 E2 E5

E3 E4

Figura 2. Área dentro de los subcompartimentos rojos para conteo de conidios

de Trichoderma- E1, E2, E3, E4 y E5.

7. CÁLCULO DEL NÚMERO DE CONÍDIOS

Para determinar el número de conidios utilizar la siguiente fórmula para cada repetición:
Conidios/mL={[(Campo 1+Campo 2)/2] x 2,5 x 105}
Campo 1=(E1+E2+E3+E4+E5)/5 e Campo 2=(E1+E2+E3+E4+E5)/5

Cuando se utiliza la dilución 10-3, se multiplica el resultado por 10 3 y cuando es

utilizada la dilución 10-4, por 104.

Observación: El software CALIBRA, desarrollado en el ámbito del proyecto Qualibio,

está disponible para copia en el sitio www.cnpma.embrapa.br (Productos y servicios –
softwares). Este software realiza cálculos y almacena las informaciones para la emisión
de informes. Se sugiere que siempre se utilice el software para una mayor facilidad en la
precisión de los análisis.
8. REPETICIÓN
Debe ser realizado dos pesajes del producto y para cada pesaje se debe realizar una
serie de dilución seriada (Figura 3). La dilución seleccionada, se debe colocar en la
cámara de Neubauer para conteo.

Figura 3. Esquema de las repeticiones utilizadas en la metodología para análisis de la

calidad de productos a base de Trichoderma.

9. PRESERVACIÓN DE LAS MUESTRAS DESPUÉS DE ANÁLISIS Y

DESCARTE.
Después de los análisis las muestras deberán ser selladas y almacenadas conforme la
recomendación del fabricante hasta la fecha de validez, en el caso que haya necesidad
de repetición de los procedimientos. Después de este periodo o si no hubiera interés en
las muestras, éstas deben ser autoclavadas a 120º C por 20 minutos, y enseguida
descartadas.

10. LIMPIEZA
Antes de realizar y después del término de la metodología la cámara de flujo laminar (o
lugar donde será realizado el procedimiento) debe ser limpiada con toalla de papel
embebida en alcohol 70% y después en hipoclorito 2%.

I.II - METODOLOGIA PARA LA VIABILIDADE DE CONIDIOS – PORCENTAJE

DE CONIDIOS VIABLES.

1. PRINCIPIO
Este es un método cuantitativo donde el resultado es expresado en porcentaje de
conidios viables (germinados y activos). Tiene como base la alícuota de la suspensión
de conidios de Trichoderma en áreas delimitadas de la placa de Petri con medio de Agar
papa dextrosa (APD), incubación en temperatura adecuada para la germinación de los
conidios y conteo de número de conidios viables al microscopio óptico.

2. APLICACIÓN
Aplicable a los productos en las formulaciones polvo mojable, gránulos dispersables y
suspensión concentrada que tienen como ingrediente activo estructuras del hongo
Trichoderma.

3. MUESTREO
La muestra debe ser enviada para su análisis en paquete sellado comercial que contenga
la siguiente información: la formulación, la concentración del ingrediente activo,
número de lote, fecha de fabricación, fecha de caducidad, nombre del producto, nombre
de la empresa, el responsable técnico, y el ingrediente activo inerte, así como la forma
de almacenamiento. En el laboratorio, las muestras se pueden almacenar a temperatura
ambiente o, preferiblemente, en un refrigerador. Las muestras no deben ser congeladas.
Se debe tomar muestras de acuerdo con los principios microbiológicos establecidos. Por
lo tanto, las muestras son representativas del producto que se está analizando.

4. EQUIPAMIENTOS Y MATERIALES.
- Erlenmeyer con capacidad para 250mL;
- Tubos de ensayo de 25 mL;
- Tapa para tubo de ensayo;
- Estante para tubos de ensayo;
- Autoclave;
- Balanza semi analítica calibrada con campo de trabajo de 1 a 2000± 0,04g;
- Agitador de tubo de ensayo – tipo vortex;
- Baño de ultrasonido e frecuencia de 40 kHz;
- Agitador orbital para Erlenmeyer;
- Incubadora operando 25 ± 2 ºC (BOD);
- Micropipeta de 10 ± 0,5 mL, 20 ± 1 µL e 1000 ± 50 µL;
- Puntas esterilizadas para micropipeta de 10 mL, 15 µL e 1000 µL;
- Placas de Petri desechables esterilizadas;
- Agitador magnético;
- Barra magnética.

5. SOLUCIONES
Solución salina con Tween 80 (diluente):
Ingredientes:
- NaCl P.A.: 9,0 g;
- Agua destilada: 1.000mL;
- Tween 80: 1 mL
Preparación:
En frasco de Erlenmeyer suspender el NaCl en 1000 mL de agua destilada y añadir
Tween 80 (0,1%). Mezclar bien y autoclavar el diluente a 121 °C y a 1 atm por 20
minutos.

Azul de Lactofenol
Ingredientes:
- Fenol: 20g;
- Ácido láctico: 20g;
- Agua destilada: 20g;
- Glicerol: 40 g;
- Azul de metilo (o azul de algodón o azul de Trypan): 0,1g
Preparación:
Adicionar los ingredientes en un frasco y homogeneizar durante 5 minutos en agitador
magnético dentro de cámara extractora de gases.
6. MEDIO DE CULTIVO
Medio de Agar papa dextrosa (APD):
Ingredientes:
-Medio de Agar papa dextrosa comercial: recomendación del fabricante;
-Agua destilada: 1000 mL;
Preparación:
En frascos de Erlenmeyer mezclar el agua destilada con el medio APD y autoclavar a
121° C a 1 atm por 20 minutos. Verter aproximadamente 10 mL de medio por placa
desechable esterilizada. Después de solidificado el medio, las placas deben ser
invertidas e incubadas a 25 ± 2° C por una noche para secar y para evaluar la condición
de esterilidad del medio. Las placas preparadas con APD pueden ser almacenadas en
lugar oscuro y bajo refrigeración (2ºC - 8° C) por siete días.

Observación: todos los materiales y soluciones deben ser esterilizados en autoclave

antes de ser utilizados.

7. PROCEDIMIENTO
7.1 Las muestras a ser testadas deben ser colocadas a temperatura ambiente por 30 a 40
minutos antes del inicio del análisis.
7.2 Pesar 10g de producto a ser testado en Erlenmeyer de 250mL y completar con 90 g
de diluente (corresponde a dilución 10-1). Deben ser realizadas dos pesajes para cada
muestra y una serie de dilución para cada pesaje (item 8). El segundo pesaje debe ser
realizado 10 minutos después de la colocación de agua en la primera muestra para evitar
mayor tiempo de hidratación.

7.3 Colocar el Erlenmeyer con la suspensión en agitador orbital por 60 minutos a 120
rpm.
7.4 Colocar el Erlenmeyer con la suspensión en baño de ultrasonido, por 5 minutos. El
nivel de agua de baño de ultrasonido debe ultrapasar el volumen de la suspensión
contenida en Erlenmeyer.
7.5 Mezclar el contenido de Erlenmeyer en agitador de tubo de ensayo, colocando y
tirando tres veces del aparato hasta ver observada turbulencia de la suspensión, en cada
uno de los pesajes. O colocar en agitador magnético por 5 minutos.
7.6 Transferir 1,0 mL da suspensión contenida en Erlenmeyer (10 -1), con ayuda de
micropipeta con punta esterilizada para el tubo de ensayo conteniendo 9,0 mL de
diluente (10-2). Descartar la punta enseguida.
7.7 Homogenizar el contenido en agitador de tubo de ensayo, colocando y tirando tres
veces del aparato hasta ver observada turbulencia de la suspensión, en cada uno de los
pesajes.
7.8 Para obtener la dilución 10-3 repetir los items 7.6 y 7.7 (dilución seriada), utilizando
el tubo de la dilución anterior (10 -2). Proceder así repetidamente hasta alcanzar la
dilución apropiada para viabilidad de conidios (Tabla 1). Para cada dilución se debe
cambiar la punta de la micropipeta.

Tabla 1. Dilución apropiada a ser utilizada para viabilidad de conidios, de acuerdo con
la concentración mencionada en el rótulo del producto.
Concentración de conidios* Dilución para conteo
9
≥ 10 10-4
8
≤ 10 10-3
*Cuando la concentración del producto no es conocida se debe utilizar las dos
diluciones y escoger para el conteo el que tuviese mejor visualización de los
conidios al observar por medio de microscopio óptico.

7.9 Mezclar el contenido de tubo de ensayo con la suspensión apropiada en agitador de

tubo de ensayo colocando y tirando tres veces. El tubo debe ser retirado cuando ocurre
turbulencia.
7.10 Pipetear inmediatamente cinco veces 20 µL de la dilución apropiada en placas de
Petri con medio de agar papa dextrosa (Figura 1). Repetir este paso para más de una
placa.
Figura 1. Placa de petri con medio APD con las marcaciones y los 20µL de la
suspensión para análisis de la viabilidad – porcentaje de conidios viables.

7.11 Transferir las placas en BOD a 25 ± 2º C, en oscuridad.

7.12 Después de iniciar la germinación (presenta variación de 9 a 20 h después del
plaqueamiento en función de producto) en una de las placas, colocar una gota de azul
de lactofenol (8µL) en cada punto (lugar donde fue colocada la dilución apropiada) con
la suspensión (cinco puntos por placa) (Figura 1).
7.13 Evaluar la viabilidad usando microscopio óptico en aumento de por lo menos 400x.
7.14 El conidio es considerado viable, cuando estuviera activo o germinado (Figura 2 -
Glosario).
7.15 Contar los conidios viables y no viables en los cinco puntos. Contar por lo menos
100 conidios por punto.
7.16 Si es necesario, hacer nueva evaluación en la segunda placa, siguiendo el item 7.10
a 7.13.
7.17 Calcular la tasa media de viabilidad utilizando a fórmula:

Viabilidad (%)=(media de número de conidios viables de los pesajes/total de conidios) X 100

Debe ser realizado el cálculo para cada gota de cada pesaje de cada dilución,
separadamente. Posteriormente, obtener la media aritmética de cada pesaje.
 Conídio ativo
não germinado
Conídio germinado

Conídio inativo

Figura 2. Vista de los conidios de Trichoderma viables (germinados y activos no

germinados) o inactivos en microscopio óptico, después de las 14 horas de incubación.

8. REPETICIÓN
Deben ser hechos dos pesajes de producto (item 7.2), siendo que de cada pesaje debe ser
realizada una dilución seriada (itens 7.6 e 7.8). De la dilución seleccionada, se debe
colocar cinco gotas por placa en dos placas diferentes (item 7.10 e Figura 1 e 3).

Figura 3. Esquema de las repeticiones utilizadas en la metodología para análisis de la

calidad de productos a base de Trichoderma.
9. PRESERVACIÓN DE LAS MUESTRAS DESPUÉS DE ANÁLISIS Y
DESCARTE.
Luego después de los análisis las muestras deberán ser selladas y almacenadas conforme
la recomendación del fabricante hasta la fecha de validez, en el caso que haya necesidad
de repetición de los procedimientos. Después de este periodo o si no hubiera interés en
las muestras, éstas deben ser autoclavadas a 120º C por 20 minutos, y enseguida
descartadas.

10. LIMPIEZA
Antes de realizar y después del término de la metodología la cámara de flujo laminar (o
lugar donde será realizado el procedimiento) debe ser limpiada con toalla de papel
embebida en alcohol 70% y después en hipoclorito 2%.

11. GLOSSÁRIO
Conidio: estructura no sexual de reproducción de hongos.
Conidio activo o en proceso de germinación: el conidio que aumento de tamaño en
relación al no germinado y que aún no emitió tubo germinativo.
Conidio germinado: el conidio presenta tubo germinativo con por lo menos el mismo
tamaño de la longitud del conidio.
Conidios inactivos: conidios no viables.
Conidios no germinados: conidios que pueden o no estar viables, sin embargo no
formó tubo germinativo con por lo menos la misma longitud que el tamaño del conidio.
Conidios viables: son los conidios activos y los germinados.
Conidióforo: estructura de hongo productora de conidios.
Gránulos: tipo de formulación de producto biológico en forma de gránulos que se
deshacen en la presencia de agua.
Polvo mojable: tipo de formulación de producto biológico compuesto por el ingrediente
activo e inerte que permite la mezcla con agua, formando suspensión de gran
estabilidad.
 I. III - METODOLOGIA PARA LA VIABILIDAD DE CONIDIOS – UNIDAD
FORMADORA DE COLONIA

1. PRINCIPIO
Este es un método cuantitativo, donde el resultado es expresado en unidades formadoras
de colonia (UFC/mL). Tiene como base la homogenización del producto biológico con
el diluente esterilizado (solución salina con adición de Tween 80). A partir de ésta es
realizado diluciones seriadas, las cuales son distribuidas en placas sobre medio APD
con Triton e incubadas a 25 ± 2 °C en oscuridad para posterior conteo de número de
colonias formadas por Trichoderma.

2. APLICACIÓN
Aplicable a los productos en las formulaciones polvo mojable, gránulos dispersables y
suspensión concentrada que tienen como ingrediente activo estructuras de hongos
Trichoderma.

3. MUESTREO
La muestra debe ser enviada para su análisis en paquete sellado comercial que contenga
la siguiente información: la formulación, la concentración del ingrediente activo,
número de lote, fecha de fabricación, fecha de caducidad, nombre del producto, nombre
de la empresa, el responsable técnico, y el ingrediente activo inerte, así como la forma
de almacenamiento. En el laboratorio, las muestras se pueden almacenar a temperatura
ambiente o, preferiblemente, en un refrigerador. Las muestras no deben ser congeladas.
Se debe tomar muestras de acuerdo con los principios microbiológicos establecidos. Por
lo tanto, las muestras son representativas del producto que se está analizando.

4. EQUIPAMIENTOS Y MATERIALES
- Erlenmeyer con capacidad para 250mL;
- Tubos de ensayo de 25 mL;
- Tampa para tubo de ensayo;
- Estante para tubos de ensayo;
- Autoclave;
- Balanza semi analítica calibrada con campo de trabajo de 1 a 2000 ± 0,04g;
- Agitador de tubo de ensayo – tipo vortex;
- Baño de ultrasonido y frecuencia de 40 kHz;
- Agitador orbital para Erlenmeyer;
- Incubadora operando 25 ± 2 ºC (BOD);
- Micropipeta para 10± 0,5 mL, 20± 1L, 100 ± 5µL y 1000± 50 µL;
- Puntas estériles para micropipeta de 10 mL, 20 L, 100 µL e 1000 µL;
- Placas de Petri desechable esterilizada;
- Asa de Drigalski esterilizada;
- Agitador magnético;
- Barra magnética;
- Microscopio óptico;
- Lámina de microscopia y cinta adhesiva transparente.

5. SOLUCIONES
Solución salina con Tween 80 (diluente):
Ingredientes:
- NaCl P.A.: 9,0 g;
- Agua destilada: 1000mL;
- Tween 80: 1mL.
Preparación:
En frasco de Erlenmeyer suspender el NaCl en 1000 mL de agua destilada y añadir
Tween 80 (0,1%). Mezclar bien y autoclavar el diluente a 121°C e 1 atm por 20
minutos.

6. MEDIO DE CULTIVO
Medio de Agar papa dextrosa (APD):
Ingredientes:
-Medio de Agar papa dextrosa comercial: recomendación de fabricante;
-Agua destilada: 1000 mL;
Preparación:
En frascos de Erlenmeyer mezclar el agua destilada con el medio APD y autoclavar a
121° C a 1 atm por 20 minutos. Verter aproximadamente 10 mL de medio de cultivo en
placa desechable esterilizada. Después de solidificado el medio, las placas deben ser
invertidas e incubadas a 25 ± 2° C por una noche para secar y para evaluar la condición
de esterilidad del medio. Las placas preparadas con APD pueden ser almacenadas en
lugar oscuro y en refrigeración (2ºC - 8° C) por siete días.

Medio de Agar papa dextrosa con adición de Triton X-100 (APD + T):
Ingredientes:
-Medio de Agar papa dextrosa comercial: recomendación de fabricante;
-Agua destilada: 1000 mL;
-Triton X-100: 25 g;
Preparación:
El modo de preparación del medio debe seguir la recomendación del fabricante. En
frascos de Erlenmeyer mezclar el agua destilada y Triton X-100 (reductor de colonia) al
medio de agar papa dextrosa y autoclavar a 121° C a 1 atm por 20 minutos. Verter
aproximadamente 20 mL por placa desechable esterilizada. Después de solidificado el
medio, las placas deben ser invertidas e incubadas a 25 ± 2° C por una noche para secar
y para evaluar La condición de esterilidad del medio. Las placas preparadas con APD+T
pueden ser almacenas en lugar oscuro y refrigerado (2ºC - 8° C) por siete días.

Observación: todos los materiales y soluciones deben ser esterilizados en autoclave

antes de ser utilizados.

7. PROCEDIMIENTO
7.1 TEST DE MICROGOTAS:

7.1.1 Las muestras a ser testadas deben ser colocadas a temperatura ambiente por 30 a
40 minutos antes del inicio del análisis.
7.1.2 Pesar 10g de producto a ser testado en Erlenmeyer de 250mL y completar con 90g
de diluente (corresponde a dilución 10-1). Deben ser realizados dos pesajes para cada
muestra y dos series de diluciones para cada pesaje (item 8). El segundo pesaje debe ser
realizado 10 minutos después de la colocación de agua en la primera muestra para evitar
mayor tiempo de hidratación.

7.1.3 Colocar el Erlenmeyer con la suspensión en agitador orbital por 60 minutos a 120
rpm.
7.1.4 Colocar el Erlenmeyer con la suspensión en baño de ultrasonido, por 5 minutos. El
nivel de agua del baño de ultrasonido debe ultrapasar el volumen de la suspensión
contenida en Erlenmeyer.
7.1.5 Mezclar el contenido de Erlenmeyer en agitador de tubo de ensayo, colocando y
tirando tres veces del aparato hasta ver observada turbulencia de la suspensión, en cada
uno de los pesajes. O colocar en agitador magnético por 5 minutos.
7.1.6 Transferir 1,0 mL da suspensión contenida en Erlenmeyer (10 -1), con ayuda de
micropipeta con punta esterilizada para el tubo de ensayo conteniendo 9,0 mL de
diluente (10-2). Descartar la punta enseguida.
7.1.7 Homogenizar el contenido en agitador de tubo de ensayo, colocando y tirando tres
veces del aparato hasta ver observada turbulencia de la suspensión, en cada uno de los
pesajes.
7.1.8 Para obtener la dilución 10-3 repetir los items 7.1.6 y 7.1.7 (dilución seriada),
utilizando el tubo de la dilución anterior (10-2). Proceder así repetidamente hasta
alcanzar la dilución apropiada para viabilidad de conidios (Tabla 1). Para cada dilución
se debe cambiar la punta de la micropipeta.

Tabla 1. Máximo de dilución seriada que debe ser realizado para obtención de la
dilución apropiada.
Información de fabricante Diluir hasta
105 10-6
106 10-7
107 10-8
108 10-9
109 10-10
1010 10-11
1011 10-12
1012 10-13

7.1.9 Con lápiz marcador dividir en 4 cuadrantes la base de las placas con medio APD.
7.1.10 Mezclar el contenido de Erlenmeyer en agitador de tubo de ensayo, colocando y
tirando tres veces del aparato hasta ver observada turbulencia de la suspensión, en cada
uno de los pesajes.
7.1.11 Pipetar inmediatamente tres alícuotas de 20 L de cada dilución preparada para
la superficie del medio de APD de cada uno de los cuadrantes, representado en la
Figura1.
Figura 1. Placa de Petri con medio de APD dividida en 4 cuadrantes con tres alícuotas
de 20L de la dilución seriada referente a la marcación de la placa.

7.1.12 Los tubos con las diluciones deben ser guardados sobre refrigeración (2ºC - 8°C)
por un máximo de 48 horas para ser utilizados en el test de unidad formadora de
colonia;
7.1.13 Esperar para que los 20µL de cada dilución sean absorbidos en el medio de
cultivo y transferir las placas en BOD por 24 a 48 horas, 25 ± 2° C, en oscuridad antes
de continuar el procedimiento;
7.1.14 Observar en cuales diluciones hubo crecimiento de colonias de Trichoderma y
seleccionar las tres últimas diluciones que presentaran el crecimiento del hongo en las
tres gotas de los dos pesajes realizados para a realización del test de unidad formadora
de colonia.

7.2 TEST DE UNIDAD FORMADORA DE COLONIA (UFC):

7.2.1 Retirar los tubos con las diluciones seriadas del refrigerador por 30 a 40 minutos
antes del inicio del análisis.
7.2.2 Mezclar el contenido de los tubos con las diluciones escogidas en agitador para
tubos de ensayo colocando y tirando tres veces del aparato. El tubo debe ser retirado
cuando ocurre turbulencia;
7.2.3 Transferir de cada dilución apropiada, con una micropipeta estéril, 100µL para la
superficie de cinco placas de Petri con medio de Agar papa dextrosa con adición de
Triton;
7.2.4 La dilución es distribuida uniformemente sobre la superficie del medio con un asa
de Drigalski esterilizada. Para cada grupo de cinco placas utilizar un asa de Drigalski
diferente.
7.2.5 Hacer una placa control antes de iniciar el item 7.2.3, extendiendo 100µL de la
solución salina con Tween en placa con medio de Agar papa dextrosa con adición de
Triton con asa de Drigalski esterilizada;
7.2.6 Incubar los cultivos a 25 ± 2ºC, en oscuridad por 48 horas a 72 horas, y contar el
número de colonias crecidas;
7.2.7 Incubar en BOD a 25 ± 2ºC, en oscuridad nuevamente los cultivos hasta 7 días
para verificar se las colonias formadas son realmente de Trichoderma, por medio de la
visualización de la colonia en la placa y de las estructuras de hongo en microscopio
óptico.
7.2.8 Para observar en microscopio óptico las estructuras el hongo, se debe colocar la
parte adhesiva transparente sobre la colonia desarrollada en la placa de Petri con medio
de APD + T y transferir en un portaobjetos, con el lado adhesivo sobre el portaobjetos.
Observar las estructuras del hongo (generalmente, conidióforos e conidios) en
microscopio óptico en aumento entre 200 a 500X. Para confirmar se la estructura
observada es de Trichoderma utilizar libros o sitios de identificación de hongos, como:
Barnett, H. L. & Hunter, B. B. 1998. Illustrated genera of imperfect fungi. APS Press,
1998.

8. REPETICIÓN
Deben ser hechos dos pesajes de producto (item 7.1.2), siendo que de cada pesaje debe
ser realizada una dilución seriada (itens 7.1.6) de las tres diluciones seleccionadas se
debe plaquear un minimo de cinco repeticiones por dilución (item 7.2.3 e Figura 2).
Figura 2. Esquema de las repeticiones utilizadas en la metodología para análisis de la
calidad de productos a base de Trichoderma.

9. CONTEO DE LAS COLONIAS

Hacer conteo de número de unidades formadoras de colonias por placa a las 72 horas
(facultativo en las 96 horas), segun la fórmula:

UFC/mL= número medio de colonias en las placas X dilución escogida de la muestra X 10*
* Éste 10 se refiere al hecho de haber sido plaqueados apenas 100µL de suspensión.

Observación: Ideal es que cada placa tenga de 30 a 300 colonias.

Otra sugerencia es la utilización de la “Planilla Bacillus” para el cálculo de la
unidad formadora de colonia, desarrollada en el ámbito de proyecto Qualibio. A planilla
permite una mayor facilidad y precisión en los análisis (Figura 3). Esta puede ser
obtenida en el sitio: http://www.cnpma.embrapa.br/, no link: “Eventos”, en la parte de
“Fórum” – “Bacillus subtilis - 2012”.
Figura 3. Planilla para cálculo y evaluación de unidad formadora de colonias de micro-
organismos.

10. PRESERVACIÓN DE LAS MUESTRAS DESPUÉS DE ANÁLISIS Y

DESCARTE.
Luego después de los análisis las muestras deberán ser selladas y almacenadas conforme
la recomendación del fabricante hasta la fecha de validez, en el caso que haya necesidad
de repetición de los procedimientos. Después de este periodo o si no hubiera interés en
las muestras, éstas deben ser autoclavadas a 120º C por 20 minutos, y enseguida
descartadas.

11. LIMPIEZA
Antes de realizar y después del término de la metodología la cámara de flujo laminar (o
lugar donde será realizado el procedimiento) debe ser limpiada con toalla de papel
embebida en alcohol 70% y después en hipoclorito 2%.
REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA

BETTIOL, W.; GHINI, R. Proteção de plantas em sistemas agrícolas alternativos. In:

CAMPANHOLA, C.; BETTIOL, W. Métodos alternativos de controle fitossanitário.
Jaguariúna, Embrapa Meio Ambiente, 2003, p. 80-96.

BETTIOL, W.; GHINI, R.; MORANDI, M.A.B.; STADNIK, M.J.; KRAUS, U.;
STEFANOVA, M.; PRADO, A.M.C. Controle biológico de doenças de plantas na
América Latina. In: ALVES, S.B.; LOPES, R.B. (eds.). Controle Microbiano de Pragas
na América Latina – Avanços e Desafios. Piracicaba, Fealq, 2008, p. 303-331.

BETTIOL, W.; MORANDI, M.A.B.; PINTO, Z.V.; PAULA JÚNIOR, T.J.; CORREA,
E.B.; MOURA, A.B.; LUCON, C.M.M.; COSTA, J.C.B.; BEZERRA, J.L. Produtos
Comerciais à Base de Agentes de Biocontrole de Doenças de Plantas. Jaguariúna, SP,
Embrapa Meio Ambiente, 2012, 155 p. — (Documentos / Embrapa Meio Ambiente;
88).

BROTMAN, Y.; LISEC, J.; MÉRET, M.; CHET, I.; WILLMITZER, L.; VITERBO, A.
Transcript and metabolite analysis of the Trichoderma-induced systemic resistance
response to Pseudomonas syringae in Arabidopsis thaliana. Microbiology vol. 158, p.
139–146, 2012.

CARRERAS-VILLASENÕR, N.; SÁNCHEZ-ARREGUIN, A.; HERRERA-

ESTRELLA, A.H.Trichoderma: sensing the environment for survival and dispersal.
Microbiology vol. 158, p. 3-16, 2012.

CASTRO, M.L.M.P. Regulamentação e registro de produtos biológicos. In: VENZON,

M.; PAULA JR., T.J.; PALLINI, A. Tecnologias alternativas para o controle de pragas
e doenças. Viçosa: Epamig, 2006, p.367-378.

CHAVERRI, P.; SALGADO, C.; HIROOKA, Y.; ROSSMAN, A.Y.; SAMUELS,

G.J.Delimitation of Neonectria and Cylindrocarpon (Nectriaceae, Hypocreales,
Ascomycota) and related genera with Cylindrocarpon-like anamorp.Stud Mycol.
vol.68, p. 57–78, 2011.

CONTRERAS-CORNEJO, H.; MACÍAS-RODRÍGUEZ, L.; CORTÉS-PENAGOS, C.;

LÓPEZ-BUCIO, J.Trichoderma virens, a plant beneficial fungus, enhances biomass
production and promotes lateral root growth through an auxin-dependent mechanism in
Arabidopsis. Plant Physiol., vol. 149, p. 1579–1592, 2009.
GRUBER, S.; SEIDL-SEIBOTH, V.Self versus non-self: fungal cell wall degradation
in Trichoderma. Microbiology., vol. 158, p. 9–26,2012.

HARMAN, G.E.; HOWEL, C.R.; VITERBO, A.; CHET, I.; LORITO, M.Trichoderma
species- opportunistic, a virulent plant symbionts. Nature Reviews Microbiology vol.2,
p.43-56, 2004a.

HARMAN, G.E.; PETZOLDT, R.; COMIS, A.; CHEN, J. Interaction between

Trichoderma harzianum strain T-22 and maize inbred line Mo17 and effects of these
interactions on disease caused by Phytium ultimum and Colletotrichum graminicola.
Phytopathology vol. 94, p. 147–153, 2004b.

HARMAN, G.E.; HERRERA-ESTRELLA, A.H.; HORWITZ, B. A.; LORITO,

M.Special issue: Trichoderma – from Basic Biology to Biotechnology. Microbiology
vol. 158, p. 1–2, 2012

HERMOSA, R.; VITERBO, A.; CHET, I.; MONTE, E. Plant-beneficial effects of

Trichoderma and of its genes. Microbiology 158, 17-25, 2012.

HOWELL, C. R. Mechanisms Employed by Trichoderma Species in the Biological

Control of Plant Diseases: The History and Evolution of Current Concepts. Plant
Disease,vol.87,n.1,p.4-10,2003.
LÓPEZ-BUCIO, J., HERNÁNDEZ-ABREU, E.; SÁNCHEZ-CALDERÓN, L.,
PÉREZ-TORRES, A.; RAMPEY, R.A.; BARTEL, B.; HERRERA-ESTRELLA, L.An
auxin transport independent pathway is involved in phosphate stress-induced root
architectural alterations in Arabidopsis: identification of BIG as a mediator of auxin in
pericycle cell activation. Plant Physiol., vol.137, 681–691, 2005.

LORITO, M.; WOO, S.L.; HARMAN, G.E.; MONTE, E. Translational research on

Trichoderma: from 'omics to the field.Annu Rev Phytopathol., vol.48, p. 395-417, 2010.

MACHADO, D.F. M.; PARZIANELLO, F. R.; SILVA, A. C. F.; ANTONIOLLI, Z.

I.Trichoderma no Brasil: o fungo e o bioagente. Rev. de Ciências Agrárias, vol.35, n.1,
p. 274-288, 2012.

MASTOURI, F.;BJÖRKMAN, T.; HARMAN G. E. Seed treatment with Trichoderma

harzianum alleviates biotic, abiotic, and physiological stresses in germinating seeds and
seedlings. Phytopathology, vol. 100, p. 1213–1221,  2010.
MELO, I.S.; COSTA, F.G.Desenvolvimento de uma formulação granulada a base de
Trichoderma harzianum para o controle de fitopatógenos. Jaguariúna:
CNPDA/EMBRAPA, 2005, p. 1-4. (Comunicado técnico, 31).

MELO, I.S. Potencialidades de utilização de Trichoderma spp. no controle biológico de

doenças de plantas. In: BETTIOL, W., org. Controle biológico de doenças de plantas.
Jaguariúna: CNPDA/EMBRAPA, 1991. p.135-156. (Documentos, 15.).

MORANDI, M.A.B.; BETTIOL, W.; GHINI, R. Situação do controle biológico de

doenças de plantas no Brasil. In: VENZON, M.; PAULA JÚNIOR, T.J.; PALLINI, A.
Controle alternativo de pragas e doenças. Viçosa: EPAMIG/CTZM:UFV, 2006, p. 247-
268.

RUBIO, M. B.; DOMINGUEZ, S.; MONTE, E.; HERMOSA, R. Comparative study of

Trichoderma gene expression in interactions with tomato plants using high-density
oligonucleotide microarrays. Microbiology, vol. 158, 119–128, 2012.

RYDER, L. S.; HARRIS, B. D.; SOANES, D. M.; KERSHAW, M. J.; TALBOT, N. J.;
THORNTON, C. R. Saprotrophic competitiveness and biocontrol fitness of a
genetically modified strain of the plant growth- promoting fungus Trichoderma
hamatum GD12. Microbiology, vol. 158, 84–97, 2012.

BIBLIOGRAFÍA SUGERIDA

DRUZHININA, I.S.; KOPCHINSKIY,A.G.; KOMOJ, M., J.; BISSETT, J.; SZAKACS,

G.; KUBICEK, C.P. An oligonucleotide barcode for species identication in
Trichoderma and Hypocrea. Fungal Genetics and Biology 42 (2005) 813–828.

BETTIOL, W.; MORANDI, M.A.B.; PINTO, Z.V.; PAULA JÚNIOR, T.J.; CORREA,
E.B.; MOURA, A.B.; LUCON, C.M.M.; COSTA, J.C.B.; BEZERRA, J.L. Produtos
Comerciais à Base de Agentes de Biocontrole de Doenças de Plantas. Jaguariúna, SP,
Embrapa Meio Ambiente, 2012, 155 p. — (Documentos / Embrapa Meio Ambiente;
88). Acesso: http://ainfo.cnptia.embrapa.br/digital/bitstream/item/66628/1/Doc-88-1.pdf