NUEVA ISO 11133: 2014 PREPARACIÓN,

PRODUCCIÓN, CONSERVACIÓN Y
ENSAYOS DE RENDIMIENTO DE LOS
MEDIOS DE CULTIVO.

Pruebas seguras y confiables para los

consumidores de alimentos

Diana Sofía Ortíz G.

Field Marketing Manager BioMonitoring
VECO
Life Science
Introducción y revisión de la norma EN ISO 11133:2014

Por qué realizar control de calidad de Medios de Cultivo utilizando ISO

11133?

BAIRD-PARKER AGAR
2 Staphylococcus aureus ATCC 6538
Introducción y revisión de la norma EN ISO 11133:2014

Por qué realizar control de calidad de Medios de Cultivo utilizando ISO

11133?
o Los resultados de la prueba microbiana de Agua y alimentos están muy influenciados por la calidad de
los medios de cultivo usados
o La calidad de los medios está influenciada especialmente por la calidad de los componentes biológicos
(por ejemplo, peptonas, extracto de carne de vaca, extracto de levadura, agar, etc.)
o La calidad de los medios de cultivo puede variar de un cliente a otro y de un lote a otro
o Se necesita un procedimiento estandarizado para el control de calidad de los medios de cultivo
o ISO 11133 describe con precisión la preparación y control de calidad de los medios de cultivo para
pruebas de alimentos y agua
o Las normas ISO específica como se debe cumplir la norma ISO 11133 (y otras, ISO 9308-1: 2014)

BAIRD-PARKER AGAR
3 Staphylococcus aureus ATCC 6538
 Alta calidad frente a los medios de cultivo de bajo
presupuesto

Chromocult Listeria Selective Agar (ALOA)

Listeria monocytogenes ATCC 19111
• Agar transparente (buena visibilidad de la zona Halo)
Merck • Colonias azules con buen tamaño de colonia
• Formación eficiente de la zona Halo (según las
Especificaciones y la ISO 11290)

Listeria Selective Agar (ALOA)

Listeria monocytogenes ATCC 19111

Competidor -Agar transparente (lectura difícil de la zona Halo)

- Pequeñas colonias puntuales -> crecimiento deficiente
- No hay zona Halo

Page 4
 Contenido de la nueva versión EN ISO 11133: 2014

 Durante la revisión, la norma fue completamente reestructurada.

−Aclarar los procedimientos
−A establecer una línea clara entre las responsabilidades de los laboratorios y los fabricantes de
medios de cultivo en relación con la preparación de los medios de cultivo, producción,
almacenamiento y las pruebas de rendimiento.
 EN ISO 11133 reemplaza las especificaciones técnicas publicadas anteriormente de ISO 11133:
− ISO 11133-1: 2009 e ISO / TS 11133-2: 2003
− ISO 11133-2: 2003 s a full EN ISO, it is now a mandatory standard for all ISO 17025

−Para pruebas microbiológicas de alimentos (humanos/animales) o agua utilizando

medios de cultivo en laboratorios acreditados

5
Cepas
Cultivo de
Cepas de Stock De Cultivo de Trabajo
Referencia Referencia Reserva

• Subcultivo procedente
• Obtenida de una
• Serie de alícuotas de • Cultivo Primario de un lote de reserva
colección de
cultivos idénticas procedente de un lote de referencia o de un
referencia liofilizado
obtenidas en el de stock de cultivo de reserva o
al vacío, o un
laboratorio por un referencia. de un material de
organismo definido
simple sub-cultivo referencia (certificado
hasta género y
de la cepa de o no).
especie, altamente
caracterizado y de referencia.
origen conocido.
 Qué es la CRM

CRM “Materiales de Referencia Certificados”

Producidos bajo la guía ISO Guia 34 y certificados de acuerdo a / 17025 y
ISO 17043

Microorganismos de Referencia Certificados

CONTROLES!!!

American Type Culture Collection Coleccion Española de Cepas

7
ISO 34: Requerimientos Generales para materiales de referencia
ISO 17043 Evaluación de la conformidad — Requisitos generales para los ensayos de aptitud
 Qué Debe cumplir una cepa CRM?
Aplicaciones

- QC en agua, alimentos,
bebidas, pruebas
ambientales

- Pruebas de rendimiento
de los medios acc. ISO
11133

1 2 3 - Validación de nuevos
métodos

- Materiales para ensayos

Debe tener de aptitud
Tener
descripción
caracterización - Desarrollo de métodos
Debe ser precisa de
fenotípica y
homogéneo Estabilidad, - La formación del personal
genotípica por
y estable concentración,
métodos
viabilidad - Cultivos iniciales
validados

8 Company presentation
 3 Cuáles son los CRMs que comercializamos?

LENTICULE® discs Vitroids™

1. Contienen microorganismos viables en concentración
definida.

2. Consisten en bacterias u hongos en una matriz sólida

(pellet) soluble en agua.

3. Los microorganismos se encuentran en estado viable y son

estables por al menos 1 año.
Lenticule : http://www.sigmaaldrich.com/analytical-chromatography/microbiology/microbiology-
products.html?TablePage=119782880
9

Vitroids: http://www.sigmaaldrich.com/analytical-chromatography/microbiology/microbiology-
products.html?TablePage=108303480
10 Company presentation
Pasos para su uso CRMs
Remueva vial del freezer -20oC

Lleve a temperature ambiente 10-15 min

Coloque el disco en medios sólido o medio Líquido

Re-hidración ocurre en 10-15 min

Disco esta listo para su uso

 

Spread en Mueva en el medio

medio Sólido Dispense

Gestión de la Garantía de la Calidad de los Medios

Preparación de
Suministrada por el Instrucciones del
Medios en el Documentación
Fabricante/Proveedor Fabricante
Laboratorio

Conservación
Calidad de los Aceptación de la (Sellado, fecha de
Registros
componentes entrega de Productos recepción, fecha de
apertura)
 Tarjetas de Control para las Pruebas de Calidad Interna de los Medios de Cultivo
Medio de cultivo Volumen Preparado Datos Número de Lote Interno
Medio de Cultivo Proveedor Lote Cantidad Fecha / Firma
Deshidratado y Código

Suplementos Proveedor Lote Cantidad Fecha / Firma

Detalles del Proceso
Control de Calidad Físico
Apariencia esperada del Color Normal Calidad confirmada Defectos: Fecha / Firma
medio de cultivo Fluye libremente
deshidratado Si:

No:

Valor de pH esperado Medida de pH Calidad confirmada Defectos: Fecha / Firma

Si:

No:

Cantidad esperado de Observado: Calidad confirmada Defectos: Fecha / Firma

Llenado y/o espesor de la
capa Si:

No:

Color esperado Observado: Calidad confirmada Defectos: Fecha / Firma

Si:

No:

Claridad esperada/ Presencia Observado: Calidad confirmada Defectos: Fecha / Firma

de artefactos ópticos
Si:

No:

Estabilidad gel esperado / Observado: Calidad confirmada Defectos: Fecha / Firma

consistencia - Humedad
Si:

No:
Calidad de los Componentes

 Agua purificada: carga microbiana <102ufc/mL (ISO 6222: 22 ±1ºC/68 ±4h)

(Destilada, desmineralizada, desionizada o agua producida por ósmosis inversa)

 Conductividad< 5 μS/cm (máx. 25) (Tipo grado 2-1)

 Medida del peso y rehidratación: Error máximo de pesada 1% (ISO 7218 e ISO
8199). Los ingredientes se añaden sobre el volumen de agua(no enrasar)

 Medida y ajuste del pH (antes de autoclavar) Ajuste con NaOH (Hidróxido de Sodio)
1M ó HCl (Ac Clorhídrico) 1M . (Filtrado por membrana de 0.45 o 0.2 micras (filtro tipo
Jeringa Millex)

 Esterilización Calor húmedo (autoclavado)

 Filtración(0.22 μm) humedecer filtro para evitar retenciones

 SISTEMA DE PURIFICACION DE AGUA
Parámetro Valor Unidad
Resistividad >5 MΩ.cm @ 25°C
Agua purificada, Tipo 2, ideal para la preparación de Conductividad < 0.2 µS/cm
medios de cultivo. TOC < 30 ppb
Elimina sustancias inhibidoras/promotoras de
Bacteria < 0.1 cfu/ml*
crecimiento microbiano.
Partículas >
<1 partícula/ml*
0.22µm
Tecnología de
Electrodesionización - Elix
* Con filtro final de membrana Millipak™
Agua pura con calidad constante y
Express
confiable. Menores costos de
operación.
Millipak Express
Valores de resistividad y TOC
mejores que el agua producida por Filtración directa a 0.22µm,
doble destilación. asegurando el agua libre de
bacterias y partículas luego de
la dispensación.

Control
Equipado con tecnologías que
permiten una alta precisión en
la medición de los parámetros
del agua.
Lámpara UV 254 nm
Permite la inhibición de las
bacterias presentes en el agua.
Dispensador
Fácil y ergonómica dispensación
del agua en su laboratorio.
Permite optimizar tiempo y
espacio.
Dispensación volumétrica o
Manejo intuitivo
Sistema de fácil manejo, con
dispensadores que permiten
visualizar el estado de su
sistema.
Sencillo mantenimiento y
disponibilidad de Guías de
referencia rápidas para el
usuario.
 Almacenamiento y Vida Media de los Medios
Preparados

 Medios Comerciales: Instrucciones Fabricante

 Medios Preparados en el Laboratorio

Refrigerados (5+/- 3°C), protegidos de la Luz o desecación (bolsas celofán o

plástico).
Evaluación Vida Útil: rendimiento físico, químico y microbiológico. NO Riesgo sobre-
calentamiento!!!
Recomendación: 2 a 4 semanas placas y 3 a 6 meses tubos y botellas selladas. ***

Preparación para su Uso:

•Fusión medios en baño térmico y/o Autoclave a 47 a 50°C (max. 4 h)
•Vertida en placa 44-47°C
Microondas
Permitido
•Preparación de Medios para Inoculación: Secado de Placas a 25-50°C/ 60 a 30
Minutos
Preparación de medios sólidos en placas de Petri

 Vierta 18 - 20 ml de medio en una placa de Petri (espesor medio de> 3 mm).

 Puede requerirse más medio para incubación más larga (> 72 h) o mayor temperatura de incubación
(> 40 ° C)

Preparación de medios de cultivo para inoculación

 Para la inoculación superficial de medios de cultivo sólidos, se secan las placas poco antes de su uso
hasta que las gotas desaparezcan de la superficie del medio.
 Secado de Placas a 25-50°C/ 60 a 30 Minutos
Microorganismos de Ensayo para Pruebas de Rendimiento

Criterios de Selección
Cepas Positivas (Características típicas del microorganismos diana)  El anexo E contiene los microorganismos de prueba que se utilizarán en
Cepas débilmente Positivas. microbiología alimentaria.

Cepas negativas  El anexo F contiene los microorganismos de prueba que se utilizarán en

microbiología del agua.
Cepas completa o parcialmente inhibidas

WDCM:

Cepas de catálogo de identificadores en los compilados universales

por el Centro Mundial de Datos para Microorganismos (WDCM).

Selectividad Especificidad Productivodad

 Microorganismos para pruebas de rendimiento

Anexo E y F: Selección de organismos de prueba?

 Selección de microorganismos de ensayo para cada medio por proveedor comercial / no comercial:
− Necesidad de usar todas las cepas de QC listadas para un medio dado

 Selección de microorganismos de ensayo para cada medio:

− Necesidad de utilizar cepas mínimas como se indica por la letra "b" para un medio dado

Footnotes:
b – Cepas que se utilizarán como mínimo
D - cepa libre de elección; Se debe utilizar una cepa
19
H - E. coli WDCM 00013 es un productor de ß-D-glucuronidasa fuerte, WDCM 00012 es un productor débil
Microorganismos para pruebas de rendimiento

Microorganismos para pruebas de rendimiento - Inoculación e incubación

 Nivel del inóculo para pruebas de productividad - Pruebas cuantitativas:

 ~ 100 ufc es necesario para lograr una precisión suficiente; Esto puede requerir el uso de más de una réplica de placa.
 Se debe utilizar un rango práctico de 80 cfu - 120 cfu por placa con un número mínimo de 50 cfu / placa. Para los filtros, se
necesita el mismo número de cfu usando uno o más filtros.
 103 a 104 ufc para diluyentes y medios de transporte líquidos

Debe utilizarse
 Nivel del inóculo para pruebas de productividad - Pruebas cualitativas
 Tiempo de incubación
más corto
 103-104 cfu para pruebas cualitativas de medios de placa,
MCO. Objetivo
 ≤ 100 cfu para pruebas de productividad de medios de enriquecimiento previo y enriquecimiento,
 104 a 106 ufc para pruebas cualitativas de medios de transporte sólidos.
 Tiempo de incubación
más largo para
 Nivel del inóculo para la selectividad y para la prueba de especificidad
determinar la
− 104 to 106 del microorganismo no objetivo para pruebas de selectividad
selectividad.
− 103 a 104 ufc del microorganismo diana son necesarios para las pruebas de especificidad.
Métodos para pruebas de rendimiento de medios de cultivo sólido

Productividad:

Inoculo: Concentración conocida Medios Cultivo Prueba para Rto Medios Cultivo REFERENCIA no selectivo

PR: coeficiente de productividad

NS: recuento total de colonias obtenidas en o en el medio de cultivo sometido a
prueba
N0: recuento total de colonias obtenidas en el medio de cultivo definido de
referencia (Aprox 100 cfu)
Adicional en Merck de manera
voluntaria

ASEGURANDO CALIDAD

N0 NS
Métodos para la prueba de rendimiento de medios de cultivo
líquido
Cualitativas - Medios líquidos selectivos

M.O NO
M.O M.O NO Mezcla Diana
Diana Diana

Incubación a condiciones adecuadas del medio/M.O.

Tomar 10ul

Medios Cultivo ESPECIFICO Medios Cultivo NO especifico

Resultados

La productividad del caldo selectivo es satisfactoria si se obtiene al menos 50-

140% crecimiento de microorganismos diana sobre el medio especıfico para ese
organismo (por ejemplo, XLD)
 70-140% No selectivos
La selectividad del caldo de ensayo es satisfactoria si no se produce crecimiento
de microorganismos no diana en la placa de agar no selectiva (TSA)
 Nueva ISO 11133 (2014)
Nuevo Método de referencia ISO
9308-1 (2014)

Nueva ISO 11133 demandas cada prueba de Validación de Agar Chromocult

cada lote de filtro con cada lote de medio de Coliformes (CCA) en aguas
cultivo portables/piscinas/ bebidas

24
24
 Nuevo Método de referencia ISO 9308-1 (2014)
Influencia de la calidad del filtro de membrana en la recuperación de Coliformes

Brand 1 Brand 2 Brand 3 Brand 4 Millipore EZHAWG474

E. coli
ATCC 35270

C. koseri
ATCC 27156

S. marcencens
ATCC 14756

25
ISO 6579:2017
Microbiology of the food chain -- Horizontal
method for the detection, enumeration and
serotyping of Salmonella –
Part 1: Detection of Salmonella spp
Esterilidad de Medios de Cultivo

Determinar la efectividad de las esterilizaciones con vapor a 121 °C

por 15 minutos.

Sterikon® plus Bioindicador

• Ampollas de caldo nutritivo y esporas de un organismo no

patógeno, Geobacillus stearothermophilus ATCC 7953 .

• La resistencia térmica es tal que las esporas mueren totalmente

después de 15 min a una T:121 ° ± 0,5 °C (15 PSI/1 bar).

• Después de autoclavar, se procede a revisar el proceso de

esterilización por incubación a 60°C ± 2°C a 24h. de las
ampollas. Si no hay crecimiento de Geobacillus
stearothermophilus indica que la esterilización fue adecuada,
cuando se muestra crecimiento la esterilización fue inadecuada.
 STERIKON® PLUS

Especificaciones de esterilizacion por vapor T 121°C)

USP 34 Sterikon®

1.) Numero de esporas por unidad 5 x 105 to 5 x 106 5 x 105 to 1x107

antes de la esterilización
2.) D-valores en minutos 1.5 to max. 3.0 (min) 1.5 to 2.0 (min)
3.) F-valores en minutos 15.0 to max. 30 (min) 15.0 (min)

D = Tiempo de reducción decimal (Tiempo en minutos en la cual a una T definida reduce el

numero de microorganismos por un factor de 10)

F = Muerte térmica ( Menor tiempo en minutos para matar todas las esporas en una
suspensión especifica a una temperatura definida)
 Medios de Cultivo Merck
GranuCult™

• GranuCult tiene nuevos Certificados de Análisis

• Información importante para los clientes incluidos:

Promoción del crecimiento de acuerdo con las Versión de
DIN EN ISO 11133

• Todas las cepas de QC se enumeran en la nueva EN ISO

11133: 2014 y en normas ISO específicas (por ejemplo,
ISO 6579).

• Todas las cepas QC acorde a WDCM y ATCC (no es

necesario buscar la referencia cruzada)

• Dependiendo del medio, las cepas adicionales se

incluyen en las pruebas de control de calidad (incluyendo
cepas débilmente positivas)

• CoA actualizados: Acreditación ISO 17025 de Darmstadt

29 QC Lab
Nuevo GranuCult™ Plate
Count

Nuevo Certificado de Análisis

acorde a la acreditación 17025
Darmstadt

CoA pag 1
30
Nuevo GranuCult™ Plate Count

Todas las cepas de

QC listadas en la
nueva norma EN ISO
11133 y las normas
ISO específicas (por
ejemplo, ISO 4833,
ISO 17410)

Cepas para desafiar

el rendimiento de
PCA

CoA pag 3
CoA pag 2
31
 Agar Plate Count
Marca ?

 Cumplimiento de normas ISO? No mencionadas

 Se refiere a la anterior ISO11133-2 desactualizada para el

uso de cepas de control

 S. aureus no acorde a la ISO actualizada (WDCM00034 /

ATCC 25923)

 La indicación solo de cepas ATCC es inconveniente para los

clientes
Conclusiones:
 ISO 11133: 2014 se convirtió en el estándar regulador más importante para los medios
de cultivo de calidad asegurada en pruebas de alimentos y agua

 ISO 11133: 2014 mejorará la seguridad del consumidor.

 ISO 11133: 2014 se aplica no sólo en los EE.UU., sino también en muchos países fuera
de los EE.UU.

 Para los laboratorios acreditados ISO 17025, ISO 11133: 2014 es obligatorio.

 Merck como el proveedor líder de medios de cultivo de F&B ha actualizado

completamente el portafolio de medios de cultivo y la documentación de acuerdo con
las más recientes normas ISO y Cepas CRM

 Merck proporciona la documentación de cumplimiento más completa y herramientas

útiles de búsqueda de productos para servir a los clientes con la información de
cumplimiento requerida para los medios de cultivo.

33
 GRACIAS
•La seguridad es más compleja de lo que
parece
•Soluciones para evaluación microbiológica By
Merck.