Licenciatura en ciencia y tecnología de los alimentos

Microbiología General

Docentes: Lic. Martín Landriel

Lic. M. Eugenia Vignolo

Lic. M. Soledad Sarniguet

Microbiología de aire y superficie

Durante la elaboración de alimentos, la contaminación microbiana (tanto los microorganismo
alterantes y saprófitos como los patógenos), se encuentran en las superficies de los equipos y
áreas de trabajo (pisos, paredes, mesadas, y utensilios de trabajo), en las superficies expuestas
de los operarios (manos, rostro, pelo) y en las secreciones de la nariz y la boca.

Existe una relación directa entre la actividad que se realiza en el ámbito de trabajo y el número
y tipo de microorganismos q colonizan un ambiente y superficie. La contaminación microbiana
de las superficies de los equipos y áreas proviene del suelo, agua, materias primas y del
operario. En el aire, las partículas de polvo o los aerosoles son los que transportan la
contaminación.

Las empresas elaboradoras de alimentos tienen la responsabilidad de asegurar la inocuidad y

calidad de los productos que comercializan y por ello, los planes de Aseguramiento de la
Calidad, contienen los procedimientos de limpieza y desinfección conocidos como POES
(Procedimientos Operativos estandarizados de Saneamiento).

La limpieza y desinfección previenen la contaminación de los alimentos producida por las

superficies en contacto directo con los mismos. En algunos casos la higiene es una condición
extremadamente necesaria, y como tal debe tener asociado un sistema de monitoreo y
registro. Además cuanta más alta sea la concentración de microorganismos en un alimento,
más corta es la vida útil del mismo por lo que el control de los mismos ayuda a evitar grandes
pérdidas económicas en las líneas de producción.
Los controles de aire y superficie también son requeridos en los laboratorios microbiológicos de
control donde tienen particular importancia el monitoreo microbiológico ambiental como una
herramienta útil para el control de los laboratorios y el monitoreo de las operaciones que se
realizan durante un ensayo.

Se necesita disponer de ambientes controlados para procedimientos asépticos, que no deben

permitir una contaminación aérea microbiana más allá de ciertos límites bajos, a fin de
preservar la esterilidad del material con el cual se está trabajando. El control microbiológico por
tanto, es necesario para la evaluación de la calidad microbiológica. Para lograr el cumplimiento
de las buenas prácticas de laboratorio; el monitoreo ambiental microbiológico es un requisito
que debe ser cumplido y sus resultados deben quedar registrados.

Existe una estrecha relación entre la calidad y el monitoreo ambiental debido a que la calidad
conlleva al control, a la mejora de los resultados de un ensayo, de un producto o de un proceso
y el monitoreo ambiental controla el ambiente de las áreas de trabajo para asegurar la calidad.

De esta manera, facilita realizar actividades de procesamiento aséptico con las máximas
garantías de seguridad.

Los niveles de microorganismos en aire y superficies se establecen en base al riesgo de

contaminación del producto o proceso. Para esto es necesario determinar límites de acción, los
cuales son definidos como los niveles que al ser excedidos, indican que el proceso se ha
desviado de sus condiciones normales de operación. El rebasarlo implica tomar una acción
correctiva, para que el proceso regrese a sus condiciones normales de operación.

Técnicas Analíticas
Las técnicas analíticas que se deben utilizar para monitorear el aire y las superficies deben ser
rápidas y seguras para poder detectar errores de forma inmediata y aplicar las acciones
correctivas correspondientes antes de que se contamine el alimento a niveles inaceptables. De
esta forma se mantiene el proceso bajo control, se evita la aparición de productos rechazados
al final del proceso o el conflicto con consumidores que sufran los efectos de la contaminación.
Existen contadores de partículas que controlan el número de partículas totales (viables y no
viables) pero no diferencia a los microorganismos de las partículas inertes. A continuación se
describirán los métodos más habituales para controlar y evaluar la contaminación del Aire y las
Superficies.

Método de Sedimentación
Existen diferentes métodos que permiten evaluar la calidad microbiológica del aire. Uno de los
más utilizados es el método de sedimentación en placas de agar, que consiste en exponer
placas con un medio nutritivo sólido al ambiente durante un periodo determinado, incubar las
placas y hacer el recuento de las colonias obtenidas.

El tiempo de exposición depende del ambiente a evaluar: mientras mayor sea la contaminación
menor será el tiempo de exposición de las mismas. Con este método se detectan los
microorganismos que caen sobre la superficie de la placa, lo cual simula lo que ocurre
normalmente cuando estamos trabajando. Como las condiciones ambientales influyen en la
sedimentación de los microorganismos es necesario que, cuando se realiza este método, las
placas se expongan siempre en el mismo lugar y bajo las mismas condiciones para poder
comparar los resultados obtenidos. Este método requiere de la calibración según el área a
evaluar y sus condiciones ambientales: si dichas condiciones cambian se debe volver a calibrar
el método. Este método es muy utilizado para evaluar tanto áreas de laboratorio como zonas
de producción de alimentos así como validar el funcionamiento de flujos laminares y cabinas de
bioseguridad.

Método de Filtración
El aire, aspirado por una bomba de vacío que forma parte del muestreador, pasa a través de un
orificio y es dirigido a la superficie del medio de cultivo contenido en una placa adecuada.

Muchos muestreadores emplean este método, algunos recogen las partículas sobre una
superficie única mientras otros las recogen por diferentes fracciones de tamaño (diámetro
aerodinámico equivalente), en superficies sucesivas (impactación en cascada). Ejemplos de
estos muestreadores por impactación incluyen los de rendija, impactadores de etapa simple,
impactadores 2 y 6 etapas o placas (este último considerado como método de referencia),
impactador en cascada que recoge fracciones sobre portaobjetos.

La identificación específica del agente biológico supone habitualmente que se proceda a su

resiembra, en medio idóneo, y la posterior aplicación de reacciones de identificación o estudios
por morfología directa o tinciones específicas. La ventaja de este método por sobre el de
sedimentación es que la cuantificación se realiza por volumen de aire filtrado.

Método de Hisopado
El hisopado de superficies es el método más empleado para evaluar la higiene de las superficies
en las áreas de trabajo de los establecimientos donde se elaboran y procesan alimentos y de los
laboratorios, especialmente si las superficies son irregulares y de difícil acceso para análisis.
Además presenta la versatilidad de poder emplear el método de manera cuantitativa
(expresando los resultados como u.f.c./cm2) y/o cualitativa (en caso de investigaciones donde
interesa la presencia o ausencia del microorganismo en estudio).

Para realizar el estudio se requiere de un hisopo estéril el cual es embebido en solución salina.
El hisopo se frota sobre la superficie a evaluar, midiendo la superficie si es que el ensayo es
cuantitativo y teniendo la precaución de ir rotando el hisopo para mejorar la transferencia de
los microorganismo al hisopo. A continuación se sumerge en un tubo con solución salina estéril
para su posterior determinación.

En el caso de realizar el ensayo cuantitativo se debe desprender los microorganismos del hisopo
(por medio de vortex o similar) y realizar un recuento microbiano sobre la solución salina. Para
ello se pueden emplear dos métodos: o bien se filtra el contenido de la solución salina sobre un
filtro de 0.45 micrones y luego se llevara el filtro a un placa con medio de cultivo sólido
adecuado o se puede realizar una siembra directa de una alícuota conocida de la solución salina
sobre la superficie del medio sólido agarizado en la placa de Petri.

Luego se llevaran las placas a incubar a una temperatura y tiempo adecuados.

Método de Soporte o Placas de contacto

Los soportes o las Placas de Contacto son ideales para el control microbiológico de superficies
lisas, duras y no porosas. El medio de cultivo posee la superficie convexa, permite aplicar la
presión adecuada para capturar el mayor número de microorganismos posibles. Un método
rápido y eficaz, que permite realizar el control de superficies sin la necesidad de equipamientos
de laboratorio sofisticados ni formación específica en microbiología.

Disponibilidad de una amplia gama de medios de cultivo permite cubrir las necesidades del
control microbiológico de superficies.
Se coloca la placa sobre la superficie a muestrear de una forma directa, manteniéndola inmóvil
y presionando durante unos segundos. Se incuban en una estufa de cultivo a la temperatura y
tiempo requerido en cada caso.

Finalmente contar las colonias que han crecido y expresar el resultado en UFC/placa o
UFC/cm2.

Método por Bioluminiscencia

Los residuos de materia orgánica en las superficies se convierten en una fuente de nutrientes
para los microorganismos presentes y además los protegen frente a la acción de los
desinfectantes.

Una técnica rápida para el monitoreo de la higiene es la detección de ATP por Bioluminiscencia.

El ATP es una molécula que está presente en todos los organismos vivos y se encuentra
también en grandes cantidades en los alimentos en la forma de ATP-no microbiano (somático)
y puede estar presente también como ATP Libre. Es así como la presencia de ATP permite la
detección de estos dos tipos de contaminación en forma conjunta.

La técnica de determinación de higiene por ATP Bioluminiscencia puede ser utilizada en

cualquier tipo de industria de Alimentos y específicamente para monitoreo de higiene de
superficies de contacto directo.

Además de ser utilizada para el monitoreo de higiene, la técnica ha sido implementada en una
amplia gama de ensayos incluyendo el monitoreo de calidad microbiológica de muestras que
contienen cultivos iniciadores, barros activados y fermentaciones.

La ATP-Bioluminiscencia está basada en una reacción que ocurre en forma natural en las
luciérnagas (Photinus pyralis). La reacción bioluminiscente catalizada por la luciferasa utiliza la
energía química contenida en la molécula de ATP para producir la descarboxilización oxidativa
de la luciferina a oxiluciferina, dando como resultado la producción de luz.

La cantidad de luz emitida es proporcional a los niveles de microorganismos y/o materia

orgánica presente.

Existen distintas técnicas para la determinación de ATP por Bioluminiscencia. Las variaciones
están dadas por la integración o no de los reactivos y reactantes en un mismo dispositivo
utilizado, a su vez, para la toma de muestra. En este sentido se pueden encontrar hisopos,
cubetas o lapiceras.

Ventajas:

- Rapidez en la obtención de los resultados: lectura de resultados en segundos.

- Instrumental de fácil manejo: equipos portátiles.

- Técnica sencilla: hisopado de superficies.

- Resultados estimulantes: la implementación como monitoreo de las condiciones higiénicas

motiva al personal encargado de las tareas de limpieza y desinfección que tienen la posibilidad
de ver los resultados del análisis efectuado.

- Prevención de fallas mayores: permite llevar a cabo acciones correctivas ante fallas en las
condiciones higiénicas de las superficies de contacto directo sin que los alimentos lleguen a
contaminarse.

- Elevada Sensibilidad: Detección de muy bajos niveles de ATP.

Desventajas:

- Calibración y validación constante mediante inoculaciones de superficie y/o hisopados de

superficie.

- Los consumibles de este tipo de equipos tienen un costo elevado.

- Los resultados se presentan en una escala arbitraria que es difícil de aceptar por los
microbiólogos acostumbrados a obtener resultados exactos como unidades formadoras de
colonias (UFC).

- Actualmente la bioluminiscencia no puede indicar la presencia o ausencia de patógenos, sólo

informa el nivel total de contaminación como ATP que existe sobre una superficie.

- Los compuestos químicos tales como detergentes y desinfectantes pueden interferir en la

reacción de ATP

Bioluminiscencia por los siguientes caminos:

- Reacción de quimioluminiscencia que da falsos positivos

- Reducción de la respuesta bioluminiscente por interferencia con la enzima luciferasa que es
muy sensible a la acción de los compuestos químicos. No obstante ante esta desventaja, existen
modificaciones de la técnica que incluyen reactivos para reducir esta interferencia por
inactivación de los compuestos químicos y/o dilución.

Definitivamente, el éxito en el uso de estos equipos está en que consideremos las

características del lugar en el que los usaremos: tamaño, escala, ambiente, cantidad de
controles, número y capacidad del personal, tipo de producto elaborado, procedimiento de
limpieza y desinfección realizados, recursos económicos.

La puesta en práctica del monitoreo microbiológico ambiental es una herramienta que

permite caracterizar desde el punto de vista microbiológico en qué condiciones realizamos
las diferentes operaciones. La prescripción tanto del grado de contaminación del aire como
de la higiene de los equipos y del personal son necesarias para establecer un control de
inspección higiénico sanitario y llevar a cabo un programa de limpieza y desinfección. En
este sentido, la aplicación del diseño y sus resultados servirán para controlar y tomar las
acciones necesarias para mantener la calidad ambiental.