ELISA y PCR-RFLP

ELISA, PCR y PCR-RFLP
María Esmeralda Espinosa Vaca

Sofía Lizet Torres Moreno
José de Jesús García Regalado
Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzimas
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
Técnica bioquímica
E nzyme que nos permite
cuantificar e
identificar analitos de
L inked naturaleza proteica
en distintos tipos de
I nmuno Sorbent soluciones
A ssay
Premio de Análisis Bioquímico, Munich, abril de Método de prueba basado en anticuerpos
1976.
Aydin. (2015). A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA.
Peptides.
Alhaj & Farhana. Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2020 Jan)
PRINCIPIO
Se basa en la reacción de un Ac o de un Ag
acoplado de forma covalente a una enzima,
con un Ag o un Ac inmovilizado (fijado sobre
un soporte), para detectar finalmente la
actividad enzimática con ayuda de sustratos
específicos
Peptides.(2015). Enzyme‐Linked Immunosorbent Assays. Current protocols in inmunology.
V. Hornbeck.
REACTIVOS Y MATERIALES
Soporte Sustrato
Un antígeno o un Enzima
anticuerpo
V. Hornbeck. (2015). Enzyme‐Linked Immunosorbent Assays. Current protocols in inmunology.

Peptides.
PASOS GENERALES
2 4
Tapizado con Unión del antígeno o
gelatina o albúmina anticuerpo específico
1 sérica bovina 3 5
5.-Lavado del
Tapizado del pocillo Adición de la muestra
con el antígeno o 7 problema 9 pocillo
anticuerpo
Unión del Adición del
anticuerpo sustrato
6 secundario 8 10
Adición del anticuerpo secundario Lavado del

Unión del sustrato a la
marcado con la enzima pocillo
enzima
TIPOS DE ELISA
ELISA DIRECTO
VENTAJAS DESVENTAJAS
• Muy simple • Marcaje directo de los anticuerpos
• Más rápido primarios requiere mucho tiempo Adecuado para
• Elimina la posibilidad de • Costoso determinar la
reactividad cruzada del • Puede afectar negativamente a la cantidad de
anticuerpo secundario inmunorreactividad del anticuerpo antígenos de alto
peso molecular

ELISA INDIRECTO
Se emplean dos
VENTAJAS DESVENTAJAS anticuerpos: uno
primario contra el
• Alta sensibilidad • Protocolo más complejo
• Alta flexibilidad • Reactividad cruzada
antígeno y uno
• El anticuerpo primario mantiene secundario
intacta su inmunoreactividad marcado contra el
primario.
ELISA SÁNDWICH
Ensayo de captura de
antígeno y detección
mediante
inmunocomplejos VENTAJAS DESVENTAJAS
• Alta flexibilidad • El antígeno

debe de ser lo
• Alta sensibilidad suficientemente
grande
• Puede ser más
costoso
V. Hornbeck. (2015). Enzyme‐Linked Immunosorbent Assays.

Current protocols in inmunology.
ELISA COMPETITIVO
Se utiliza un antígeno de
referencia que competirá con
el antígeno de la muestra por
la unión al anticuerpo
VENTAJAS DESVENTAJAS
● No se ● Menor
requiere especificidad
procesamie ● Proceso muy
nto de la complejo
muestra
● Menor
variabilidad
● Máxima V. Hornbeck. (2015). Enzyme‐Linked Immunosorbent Assays.
flexibilidad Current protocols in inmunology.
APLICACIONES
Detectar y medir la Detectar y estimar

Detectar y estimar
presencia de los niveles de
los niveles
anticuerpos en la marcadores
hormonales.
sangre. tumorales.
Examen de sangre
Detectar donada en busca de Detectar el abuso de
exposiciones posibles drogas.
pasadas. contaminantes
virales.
Reacción en Cadena de la Polimerasa
Polymerase Chain Reaction
Técnica que busca amplificar fragmentos
específicos de DNA mediante el uso de la enzima
DNA polimerasa
Dr. Kary B. Mullis, creador

de la PCR en 1985 y
ganador del premio Nobel
a química en 1993
-. (2019). PCR Y RFLP EN LA CLÍNICA Y MEDICINA FORENSE. 29 de septiembre de 2020, de Universidad del Norte Colombia Sitio web:
https://www.studocu.com/co/document/universidad-del-norte-colombia/biologia-molecular/ejercicios-obligatorios/pcr-y-rflp-en-la-clinica-y-medicina-forense/527533
1/view
Secuencia blanco
de DNA
Buffer y H₂O estéril Reactivos y
Materiales
Desoxinucleótidos
Cloruro de
trifosfato Micropipeta
magnesio
(dNTPs)
DNA polimerasa Primers o

Tubo de 1.5 ml
(taq pol) cebadores
1/view
Termociclador
Procedimiento
1 ciclo
Extensión:
Desnaturalización:
±72ºC/30-60 seg
94ºC/30-60 seg
Emparejamiento de
Separación de las
los dNTPs a la cadena
cadenas de DNA
molde por la DNA pol
Desnaturalización Alineación: Repetición del

inicial: ±62ºC/30-60 seg ciclo:
94ºC/1-5 min Formación de enlaces
Separación del hidrógeno de los Para poder generar
antígeno acoplado a la primers con las cantidades enormes
DNA pol muestras de DNA de amplicones
1/view
Técnica usada para separar
biomoléculas en un gel de Electroforesis
acuerdo a su tamaño,
sometiendolas a un campo
eléctrico.
El gel puede ser de agarosa o

poliacrilamida y sirve como una
red o coladera. Entre más
pequeña sea la molécula más
avanzará
El DNA se coloca en los pozos

El DNA se tiñe con bromuro de
que se encuentran del lado
etidio, el cual se intercala entre
negativo y, gracias a su carga
las secuencias y fluoresce en
negativa, éste se desplaza al lado
presencia de luz UV
positivo
Aplicaciones
Laboratorios de Medicina Biología

inmunología forense molecular
Diagnóstico de Investigación:
Identificación del “perfil
enfermedades:
genético”:
● Clonación y estudio
● Infecciosas: Tb, de la expresión
Patrones de fragmentos
Hepatitis B y C, VIH y genética
cortos de DNA a los que se les
VPH ● Busqueda de
dá un código fácil de
● Neoplásicas polimorfismos
almacenar y comparar.
● Genéticas genéticos
Ventajas y Desventajas
● Rapidez y sensibilidad ● Debemos conocer por lo

● Obtención de cantidades menos una parte de la
enormes de DNA a partir de secuencia (20-40 bp) para
una muestra pequeña amplificar
● Se puede utilizar para clonar, ● Se necesitan primers
secuenciar y analizar específicos para el fragmento
● Se puede amplificar DNA de que se quiere sintetizar
cualquier organismo vivo o ● Puede contaminarse con otro
muerto DNA
PCR- Fragmentos de Restricción de Longitud Polimórfica
PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism
Huella genética
Número Variable de Repeticiones en Tándem (VNTR)
Alec Jeffreys Enzimas de restricción que cortan el ADN en una secuencia

específica, o en un sitio cercano a este.
https://www.studocu.com/co/document/universidad-del-norte-colombia/biologia-molecular/ejercicios-obligatorios/pcr-y-rflp-en-la-clinica-y-medicina-forense/5275331/view
Materiales
Agua MilliQ Tampón de digestión Enzima restrictiva ADN Incubadora
Tampón de carga de Micropipetas Puntas para Tubos Eppendorf

electroforesis para micropipetas
ácidos nucleicos
Extracción y Llevar a incubadora
Procedimiento 1 purificación del

ADN
5 a 37°C
Amplificación Aplicar el tampón de

2 del ADN (PCR) 6 carga de electroforesis
Agregar el agua, Los fragmentos

el tampón y el resultantes se separan
3 DNA al tubo 7 por electroforesis en
eppendorff poliacrilamida
Agregar las
4 endonucleasas 8 Análisis de resultados
Aplicaciones clínicas
Recibir un diagnóstico Diagnóstico en el Permite conocer Diagnóstico de

acertado y específico cambio de una el genotipo del deleciones o
a un bajo costo base nitrogenada individuo inserciones
Enfermedad Von Hippel-Lindau Enfermedad autosómica dominante que
produce tumores
Angioma retinal Hemangioblastoma

de cerebelo
Hemangioma Mutación en el gen VHL

hepático
Brazo corto del
Hemangioma
cromosoma 3
pulmonar
Feocromocitoma
Tumor neuroendocrino
Hemangioblastoma
de páncreas
de médula espinal
Ventajas y Desventajas
● Bajo costo ● Es una técnica tardada

● Diagnósticos más precisos ● Necesita de los
● Puede estudiarse el DNA conocimientos sobre otras
degradado técnicas para llevarse a
● Limita regiones específicas cabo
de un cromosoma ● No está disponible para
toda la población
Referencias:
● Morena, J. (2009). Estandarización de una PCR-RFLP para la determinación genética de tres polimorfismos de la enzima
paraoxonasa 1. 29 de septiembre de 2020, de Instituto Tecnológico de Costa Rica Sitio web:
https://repositoriotec.tec.ac.cr/bitstream/handle/2238/558/TFG%20Morera%20Rojas%20Juan%20Pablo.pdf?sequence=1&
isAllowed=y
● -. (2019). PCR Y RFLP EN LA CLÍNICA Y MEDICINA FORENSE. 29 de septiembre de 2020, de Universidad del Norte
Colombia Sitio web:
https://www.studocu.com/co/document/universidad-del-norte-colombia/biología-molecular/ejercicios-obligatorios/pcr-y-rflp-
en-la-clínica-y-medicina-forense/5275331/view
● Gail, M. (2020). ¿Cómo funcionan y en qué se diferencian las PCR y los test rápidos de coronavirus?. 29 de septiembre de
2020, de Gaceta Médica Sitio web:
https://gacetamedica.com/investigacion/como-funcionan-y-en-que-se-diferencian-las-pcr-y-los-test-rapidos-de-coronavir
us/
● Alhaj & Farhana. Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2020 Jan)
RECUPERADO DE: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK555922/
● V. Hornbeck. (2015). Enzyme‐Linked Immunosorbent Assays. Current protocols in inmunology. Recuperado de:
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25908411/
● Aydin. (2015). A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein
analyses using ELISA. Peptides. Elsevier. Recuperado de:
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S019697811500131X?via%3Dihub

ELISA y PCR-RFLP

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María Esmeralda Espinosa Vaca

V. Hornbeck. (2015). Enzyme‐Linked Immunosorbent Assays. Current protocols in inmunology.

Adición del anticuerpo secundario Lavado del

V. Hornbeck. (2015). Enzyme‐Linked Immunosorbent Assays. Current protocols in inmunology.

• Alta flexibilidad • El antígeno

V. Hornbeck. (2015). Enzyme‐Linked Immunosorbent Assays.

Detectar y medir la Detectar y estimar

Dr. Kary B. Mullis, creador

DNA polimerasa Primers o

Desnaturalización Alineación: Repetición del

El gel puede ser de agarosa o

El DNA se coloca en los pozos

Laboratorios de Medicina Biología

● Rapidez y sensibilidad ● Debemos conocer por lo

Número Variable de Repeticiones en Tándem (VNTR)

Alec Jeffreys Enzimas de restricción que cortan el ADN en una secuencia

Agua MilliQ Tampón de digestión Enzima restrictiva ADN Incubadora

Tampón de carga de Micropipetas Puntas para Tubos Eppendorf

Procedimiento 1 purificación del

Amplificación Aplicar el tampón de

Agregar el agua, Los fragmentos

Recibir un diagnóstico Diagnóstico en el Permite conocer Diagnóstico de

Angioma retinal Hemangioblastoma

Hemangioma Mutación en el gen VHL

● Bajo costo ● Es una técnica tardada

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