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Extracción en fase sólida (SPE) para tratamiento de muestras de alimentos

para análisis por cromatografía.

Presentation · January 2004

DOI: 10.13140/RG.2.2.16345.52325

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Jaime Valls Puig

Central University of Venezuela
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Coordinador del Proyecto Individual CDCH PI- 03-00-5827-2005. “Optimización y Validación de una Metodología por Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC)
para la Determinación de Ácido Láctico en Productos Pesqueros. 2008 View project

Coordinador del Proyecto Individual CDCH PI-03.32.3986.2001: Estudio de la Estabilidad de Sardinas (Sardinella aurita) en Condiciones de Refrigeración y Congelación.
2005. View project

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 UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZUELA
FACULTAD DE CIENCIAS
POSTGRADO INTERFACULTADES EN CIENCIA Y
TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS

EXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA (SPE) PARA TRATAMIENTO DE

MUESTRAS DE ALIMENTOS PARA ANÁLISIS POR
CROMATOGRAFÍA.

Tutor: Seminario II de Doctorado

Dr. Andrés Escalona MSc. Jaime E. Valls P.

CARACAS-VENEZUELA
2004
GLOSARIO

ASE Extracción acelerada con solventes (Accelerated Solvent Extractor)

C8 Fase estacionaria de octilsilano

C18 Fase estacionaria de octadecilsilano

CG Cromatografía Gaseosa (Gas Chromatography)

CV Coeficiente de variación

CN Fase estacionaria de ciano

DE Desviación estándar

DSR% Porcentaje de desviación estándar relativa

DVB Divinilbenceno

EC Electroforesis Capilar

EM Espectroscopia de Masas

FID Detector de ionización de llama (Flame ionization detection)

HPLC Cromatografía Líquida de Alta Resolución (High Performance Liquid

Chromatography

HS Espacio de cabeza (Headspace)

IPC Apareamiento iónico (par-iónico)

k Factor de capacidad. Parámetro empleado en cromatografía. Cociente

entre el número de moles de soluto en la fase estacionaria y número
de moles de soluto en la fase móvil.

LLE Extracción líquido-líquido (Liquid-Liquid Extraction)

MS Espectroscopia de masas (Mass Spectrometry)

MSPD Dispersión de matriz en fase sólida (Matriz Solid Phase Dispersion)

M-SPE Extracción en fase sólida en miniatura (Miniaturizad Solid Phase

Extraction)

µ micro

PA Poliacrilato

PDMS Polimetilsiloxano
ppb Partes por billón

ppm Partes por millón

SBSE Extracción con barra magnética (Stir Bar Sorptive Extraction)

SPE Extracción en fase sólida (Solid Phase Extraction)

SPME Micro extracción en fase sólida (Solid phase Microextraction)

TLC Cromatografía en Capa Fina (Thin Layer Chromatography)

UV Ultravioleta

Vis Visible
INDICE
Página
Indice I

Tablas II

Figuras III

Esquemas IV

Resumen V

Introducción 1

1.- Desarrollo de la extracción en fase sólida (SPE) 2

2.- Extracción en fase sólida 3

2.1.-Aspectos básicos de la SPE 3

2.2.- Usos de la SPE 7

2.3.- Procesos de extracción en la SPE 13

2.4.- Dispositivos usados para la SPE 18

2.5.- Equipos para la SPE 28

2.6.- Metodología para la extracción con SPE 31

3.- Micro extracción en fase sólida (SPME)

42
3.1.- Aspectos generales de micro extracción en fase sólida (SPME) 42

3.2.- Fases estacionarias en la SPME 49

3.3.- Parámetros que influyen en la SPME 50

3.4.- Derivación y calibración en la SPME 58

3.5.- Variantes de la SPME 61

3.6.- Aplicaciones de la SPME en alimentos 62

Conclusiones y recomendaciones. 65

Referencias bibliográficas. 66
 Tablas Página

1 Propiedades de las principales fases estacionarias empleadas 15

en la SPE.

2 Aplicaciones de par-iónico (IPC) con extracción en fase sólida 17

(SPE) en alimentos

3 Aplicaciones de MSPD en el análisis de residuos y vitaminas 27

en alimentos.

4 Porcentaje de recuperación, desviación estándar (DE), 39

porcentaje de desviación estándar relativa (DER%) y
reproducibilidad a partir de pulpa de manzana, a la cual se le
ha añadido diferentes cantidades de daminozida.

5 Aplicaciones de la SPE en muestras de alimentos. 41

6 Comparación entre SPE y la SPME. 44

7 Ventajas y desventajas de la SPME. 49

8 Principales fases estacionarias empleadas en la SPME. 51

9 Parámetros experimentales optimizados para la SPME. 55

10 Estudios por SPME, desarrollados en alimentos. 64

Figuras Página

1 Cromatogramas de (a) muestra de cacao antes del tratamiento 9

con cartucho "Sep-pak C18" y (b) muestra de cacao después
del tratamiento con cartucho.

2 Cromatogramas por HPLC, de (A) néctar de una muestra 10

tratada por SPE, (B) a una muestra con analito añadido y
también tratada con SPE y (C), es una muestra con añadido
de ácido fólico, pero sin tratamiento por la SPE.

3 Preconcentración en línea de 20 pesticidas, con posterior 12

determinación por cromatografía de gases. (A) Paso de
preconcentración y (B) paso de extracción. Siglas: IV1 válvula
de inyección; W: desechos.

4 Guía para la selección de las diferentes modalidades de SPE. 18

SAX Intercambiador aniónico fuerte, SCX: intercambiador
catiónico fuerte, WCX: intercambiador catiónico débil, RP: fase
reversa, NP: fase normal, IE: intercambiador ionico.

5 Diseño de las principales variantes de SPE (a) Cartuchos (b) 19

Disco y (c) Fibra (SPME).

6 Dispositivo de M-SPE dentro de jeringa "Hamilton". 23

7 Representación esquemática del proceso de la MSPD. 26

8 Dispositivos de la SPE (a) cartucho a presión, (b) cartucho con 28

aplicación de vacío y (c) sistema de muticartuchos con
aplicación de vacío.

9 Cromatogramas de cachaca extraida por LLE y SPME. 43

10 Configuraciones de la SPME. 45

11 Modalidades de la SPME, (a): extracción directa, (b): espacio 45

de cabeza, (c): membrana protegida o recubierta.

12 Diagrama de extracción directa (SPME-DED) y su 46

comparación con SPME mediante espacio de cabeza (HS-
SPME)

13 Diagrama de dispositivo clásico de la SPME 47

14 Optimización del proceso de extracción con SPME 56

Esquemas Página

1 Principales variantes desarrolladas de la SPE. 3

2 Principales objetivos del uso de la SPE. 7

3 Procedimiento para la determinación de funguicidas en jugo 35

de manzana empleando cartuchos "OASIS MCX".
 Resumen

La ejecución de un método analítico, incluye una secuencia de

procedimientos que se inicia con la recolección de la muestra, pasos intermedios y
culmina con el reporte final de los resultados. Los pasos intermedios pueden
involucrar el almacenamiento de la muestra, acondicionamiento o preparación,
aislamiento de los analitos, identificación y cuantificación. Sin embargo la
preparación es usualmente el paso mas laborioso y tedioso, ya que
aproximadamente más del 60% del tiempo de un análisis, es empleado en la
preparación de la muestra (Fritz y Macka, 2000). El principal objetivo en la
preparación de muestras, es extraer los compuestos de interés, de manera de
separarlos de otros componentes que pueden causar interferencias (Huck y Bonn,
2000).

Majors, (2003a) señala que la tendencia actual es a la ejecución de

procedimientos, en los cuales se maneje una menor cantidad de solventes, en
menor tiempo y que permitan procesar un mayor número de muestras. Esto ha
conducido al diseño de equipos o sistemas, en los cuales se han incorporado: la
miniaturización, automatización e inclusive la robotización. Estos equipos, módulos o
periféricos emplean para el procesamiento de muestras técnicas tales como:
extracción en fase sólida, extracción con fluidos supercríticos, extracción asistida
con microondas, extracción acelerada con solventes etc.

Acoplado a los equipos o módulos, anteriormente señalados se han diseñado

a su vez, interfaces que permiten la unión con equipos de detección, como:
cromatografía de gases, cromatografía líquida de alta resolución, espectrofotómetros
de absorción atómica, emisión atómica, infrarrojos, electroforesis capilar etc. Toda
esta gama de posibilidades e interconexiones aumentan considerablemente la
capacidad que se dispone para el análisis en laboratorios. Actualmente se han
superado muchas de las barreras en cuanto a análisis que hace unos años eran
difíciles o imposibles de realizar. Es frecuente hoy en día, el reporte de
procedimientos que involucren diferentes sistemas de extracción de muestras, así
como también el uso de métodos acoplados de cuantificación.

De entre todas las técnicas ya mencionadas, es la extracción en fase sólida

(SPE), una de las más atractivas e interesantes para el aislamiento y la
concentración de analitos en alimentos, ya que según Majors, (2002ab) es la más
empleada para el tratamiento de muestras especialmente para cromatografía de
gases (CG) y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Básicamente la SPE
consiste en pasar una muestra diluida a través de un cartucho, que contiene un
relleno de un material que extrae selectivamente el analito de interés, desechando
así los compuestos que pueden producir interferencias en el análisis. Este
procedimiento, puede adicionalmente provocar una concentración, o enriquecimiento
del compuesto que se desea evaluar, introduciendo volúmenes continuos de la
muestra diluida. Se emplea principalmente en tres modalidades o dispositivos:
cartuchos, filtros y con fibra o mejor conocida esta última como la SPME (Micro
extracción en fase sólida). La SPE, puede ser utilizada para disminuir los tiempos de
trabajo, al sustituir técnicas tradicionales, con la ventaja adicional que se obtiene un
ahorro sustancial de solventes.

Una variante de la SPE, que ha tenido un gran desarrollo y aplicabilidad, que

prácticamente se ha convertido en un técnica independiente, es la micro extracción
en fase sólida (SPME). Según Ulrich, (2000) una de sus grandes ventajas, es que
agrupa los pasos de extracción, concentración e inyección, en un solo dispositivo, lo
cual reduce significativamente la manipulación y el tiempo de trabajo. Fritz y Macka,
(2000) señalan que entre las ventajas de la SPME, además de su simplicidad,
destaca que puede emplearse con poco volumen de muestra (inclusive solo varios
µL), disminuye considerablemente el tiempo y pasos de procesamiento, se pueden
alcanzar límites de detección de hasta partes por trillón y no se produce un consumo
significativo de solventes ya que prácticamente no requiere de estos.

Según Fritz y Macka, (2000) señalan que la forma de realizar la SPE, permite
acoplar está técnica a equipos automáticos, que incluyen estaciones de trabajo,
periféricos y módulos, que realizan múltiples funciones, controlados todos por un
sistema central de procesamiento de funciones y datos. Se acoplan en línea
módulos de SPE con cromatógrafos de HPLC, CG, los cuales a su vez pueden tener
uno o más detectores como: masas, ultravioleta, diodos etc. El gran potencial de la
SPE y sus variantes, consiste en que pueden ser automatizados. Estos pueden ser
en serie o en paralelo; en los primeros se tiene una línea, en la cual una muestra, no
es tratada, hasta que la anterior es procesada, lo cual da una velocidad de
procesamiento entre 25-50 muestras/h. Por otra parte en paralelo, se tienen varias
líneas o módulos (en algunos casos hasta 10) de SPE, que permiten la extracción
simultánea de hasta 400 muestras/h. Ambos sistemas tienen la ventajas que pueden
procesar durante largos períodos, como la noche, fines de semana etc.

Es la tendencia actual, en el inicio de este nuevo milenio, el desarrollo de

procedimientos, técnicas y métodos, que sean más sensibles, rápidos y que
especialmente involucren un menor consumo de solventes. La extracción en fase
sólida con todas sus variantes, es hoy por hoy una de la técnicas que presenta
mayor potencialidad, para el tratamiento de muestras en diferentes áreas, (farmacia,
ambiente, forense, toxicología, química analítica etc) pero especialmente en
alimentos. Las aplicaciones reportadas por investigadores, muestran la gran
versatilidad y aplicabilidad de está técnica que existe actualmente y que pueden ser
desarrollada. La forma e insumos que utiliza la SPE, la hacen idónea para el diseño
de equipos automatizados, en miniatura e inclusive robotizados.

Referencias:

Fritz, J., and Macka, M. 2000. Review. Solid-phase trapping of solutes for further
chromatographic or electrophoretic analysis. J. Chromatogr. A. 902: 137-166.
Huck, C., and Bonn, G. 2000. Review. Recent developments in polymer-based
sorbents for solid-phase extraction. J. Chromat. A. 885. 51-72.

Majors, R. 2002a. Highlights of HPLC 2002. LCGC North America. 20 (9): 830-841.

Majors, R. 2002b. Trends in sample preparation. LCGC North America. 20 (12):

1098-1113.

Majors, R. 2003. Stir-bar sorptive extraction of trace organic compounds form

aqueous matrices. LCGC North America. 21 (2): 108-118.

Ulrich, S. Review. Solid-phase microextraction in biomedical analysis. J. Chromatogr.

A. 902: 167-194.
 Extracción en fase sólida (SPE) para tratamiento de muestras de alimentos
para análisis por cromatografía.

Introducción.

La extracción en fase sólida, mejor conocida por sus siglas en inglés: SPE,
"Solid Phase Extraction", tal como se denominará en lo sucesivo en este seminario,
es una técnica utilizada para la preparación de muestras que comenzó a ser
empleada a finales de 1970. Básicamente consiste en la extracción de un analito de
interés mediante sistemas sólido-líquido, empleando principalmente cartuchos,
discos o fibras. La SPE permite desarrollar sistemas en miniatura, que son
actualmente la tendencia dominante en campos como: química analítica, estudios
ambientales, forenses, toxicológicos, clínicos, farmacéuticos, alimentos etc. El
diseño de equipos en miniatura conduce a su vez a la automatización y
acoplamiento en línea para análisis, obteniendo entre otras ventajas: mayor
sensitividad, menor riesgo de pérdida del analito, ahorro de reactivos, disminución
del tiempo de trabajo y menor cantidad y tratamiento de desechos de laboratorio
(Majors, 2003 a,b).

Fritz y Macka, (2000) señalan que el origen de la SPE, se remonta a

principios de 1970 cuando fue utilizada por Burnham en estudios de contaminantes
orgánicos en agua. En esa oportunidad se trabajó con 150 L. de agua, que fueron
pasados a través de una columna de poliestireno modificado, posteriormente los
compuestos orgánicos fueron extraídos con 15 ml de éter etílico, el cual fue
evaporado hasta obtener 1 ml, volumen que fue empleado para la determinación por
cromatografía de gases. A partir de este momento se continuaron desarrollando más
aplicaciones surgiendo en el transcurso de los años posteriores mejores diseños de
dispositivos, así como también de los rellenos que contenían.

Se han desarrollado varias modificaciones de la SPE destacándose: SPE en

disco, extracción en fase sólida miniaturizada (M-SPE), micro dispositivos en línea,
SPE en puntas de pipeta, dispersión de matriz en fase sólida (matriz solid phase
dispersion: MSPD) y micro extracción en fase sólida (SPME), teniendo está última
un desarrollo muy extenso y particular, como se discutirá más detalladamente en
una sección de este seminario. Actualmente la SPE y sus variantes constituyen una
de las técnicas más empleadas para el tratamiento de muestras antes de su
determinación por métodos cromatográficos.

El objetivo del presente seminario es realizar una revisión bibliográfica de la

extracción en fase sólida (SPE) aplicada a muestras de alimentos, previo al análisis
por métodos cromatográficos. Se discutirán y evaluarán los procedimientos
principales de esta técnica, así como también sus variantes con respecto a sus
aplicaciones y limitaciones en el campo de alimentos.

1.- Desarrollo de la extracción en fase sólida (SPE).

Desde que la SPE fue aplicada en 1970 se han desarrollado numerosas

variantes. Las principales se muestran en el ESQUEMA 1., se podría hablar de dos
grandes etapas en la SPE: la primera fue en sus inicios con el empleo básicamente
de cartuchos, posteriormente la necesidad de emplear grandes volúmenes de
muestras originó insumos en forma de discos, constituyendo estas dos (cartuchos y
discos) los tipos de SPE más empleados inclusive hasta la época actual. En la
segunda etapa, a partir de 1990, Janusz Pawliszyn y sus colaboradores de la
universidad de Waterloo en Canadá, desarrollaron la micro extracción en fase sólida
(SPME), la cual se ha destacado y resaltado desde su origen, llegando a ocupar un
"puesto" o nombre propio dentro del tratamiento de muestras, adicionalmente la
SPME ha permitido a su vez nuevas variantes (Kataoka et al. 2000).

Se desea resaltar que para el desarrollo de este seminario se tratará la

extracción en fase sólida (SPE) en una parte o sección, mientras que la micro
extracción en fase sólida (SPME), la cual ha tenido un gran auge e inclusive se ha
considerado como una técnica independiente, será tratada por separado en otra
sección.
Extracción en fase sólida (SPE). 1970.
1.- Cartucho. 1970.
2.- Disco. 1980.
3.- Micro dispositivos en línea de SPE. 1980.
4.- Dispersión de matriz en fase sólida (MSPD). 1989.
5.- Extracción en fase sólida miniaturizada (M-SPE). 1997.
6.- Micro extracción en fase sólida (SPME).1990.
6.1.- Extracción con barra magnética (SBSE). 2000.
6.2.- Micro extracción en fase sólida capilar. 2001.

ESQUEMA 1. Principales variantes desarrolladas de SPE.

Referencias: Barker, (2000a,b); Kataoka et al. (2000); Poole et al. (2000); Ruiz-Gutiérrez y
Pérez-Camino, (2000); Majors, (2003 ab).

2.-Extracción en fase sólida (SPE).

2.1- Aspectos básicos de SPE.

Esencialmente la SPE es considerada como una cromatografía, en la cual se

tiene como objetivo realizar la separación de ciertos componentes de una muestra
mediante su distribución en dos fases: una estacionaria y otra móvil. La estacionaria
es principalmente un sólido o un sólido con características gomosas retenido sobre
un soporte, mientras que la fase móvil es líquida (Quattrocchi et al. 1992).

En la SPE la mayoría de la aplicaciones emplean cartuchos que son

pequeñas columnas, generalmente de plástico (usualmente polipropileno), que
contienen un relleno con cantidades variables (100-500 mg) de materiales similares
a los usados como fase estacionaria en cromatografía líquida de alta resolución
(HPLC)., Sin embargo, la principal diferencia radica en el tamaño de la partícula, que
puede ser de 40 µm, en lugar de 5 µm, que es la usualmente empleada en HPLC.
Se puede considerar que la SPE es realmente una adaptación de HPLC, pero de
una menor eficiencia, ya que los principios básicos son similares. Los rellenos
utilizados en SPE son de "menor calidad", en el sentido de que tienen un mayor
tamaño de partícula y su superficie es menos selectiva, adicionalmente su costo es
menor en relación a los empleados en HPLC, esto es debido a que la SPE es
utilizada como una parte del procedimiento del análisis, que permitirá o bien eliminar
interferencias o concentrar el analito de interés, para posteriormente realizar la
determinación final y cuantitativa por medio de métodos como cromatografía de
gases (GC) o HPLC.

Las fases estacionarias empleadas pueden ser clasificadas según León-

González y Pérez-Arribas (2000) en no polares, polares y de intercambio iónico. Las
no polares son aquellas que tienen grupos metilo, octilo (C8) u octadecilo (C18),
unidas a una superficie de sílica, se les conoce también como de fase reversa o fase
inversa (RP), mientras que las polares son sílica sin modificación, o unida a grupos
ciano, amino o diol. Finalmente los rellenos de intercambio iónico están constituidos
por grupos funcionales catiónicos o aniónicos e inclusive resinas "Amberlite" y
"Porapaq Q", así como también fases estacionarias de carbón activado (Hennion,
2000; Rodríguez, et al. 2000). La capacidad de retención de solutos dentro de una
columna SPE depende del tipo de material de relleno, tamaño de la columna, tipo de
analito y condiciones de extracción. Según Majors, (2002 a,b) se usan en un 90%
con rellenos en fase reversa (sílica modificada), de los cuales un 55% corresponde a
sílica unida a grupos C18, mientras que el uso de fases normales (sílica sin
modificar) es de solamente un 10%.

León-González y Pérez-Arriba, (2000) señalan que se han desarrollado

también fases estacionarias para substancias específicas: fenoles, herbicidas,
carbamatos, pesticidas y compuestos orgánicos polares. Estas fases son formuladas
a base de poliestireno-divinilbenceno, o bien por modificaciones químicas
empleando acetilo, hidroximetilo, benzoilo, 2-4 dicarboxibenzoilo etc. La modificación
permite obtener rellenos, con mayor capacidad de retención para analitos
específicos. Inclusive se han elaborado micro cartuchos con estos rellenos que son
acoplados a cromatógrafos para lograr separaciones en línea con un mínimo de
manipulación.

Fritz y Macka, (2000) señalan las principales propiedades de las fases

estacionarias:

1.- Elevada área superficial. La retención del analito es un equilibrio entre la

muestra en solución y la fase estacionaria. Este equilibrio es incrementado si el
sorbente tiene una gran área de exposición. Las partículas empleadas en la SPE
tienen superficies entre 400-1000 m2 /g e inclusive algunas tienen hasta 1200 m2/g.

2.- Adsorción reversible. Si bien es deseable que el analito se retenga en la

fase estacionaria, es también importante que pueda ser extraído fácil y
completamente con la menor cantidad posible de solvente.

3.- Baja lixiviación de partículas o impurezas que puedan interferir en el

análisis. Los materiales de relleno usualmente contienen una baja carga de
impurezas, pero puede aumentar si es mal manipulado, e inclusive pueden adsorber
componentes del medio ambiente del laboratorio.

4.-Eficiente superficie de contacto con la muestra. En el caso de fases

reversas que tienen grupos hidrofóbicos se hace necesaria la activación de la
superficie, mediante el uso de metanol o acetonitrilo, que actúan como solventes de
enlace entre la fase acuosa de la muestra y la superficie hidrofóbica del relleno.

El empleo de la SPE permite economizar solventes ya que realiza la

concentración del analito empleando una menor cantidad de solvente en relación a
los procesos tradicionales, tales como extracción sólido-líquido y líquido-líquido. Así
por ejemplo Mateos et al. (2001) proponen un método para determinar fenoles,
flavonoides y compuestos derivados de la lignina en aceite de oliva por HPLC,
empleando extracción previa en SPE (cartuchos fase reversa con grupos diol), con
lo cual se pueden cuantificar 17 compuestos. Sus resultados indican que no existen
diferencias significativas entre las muestras extraídas por el método tradicional de
líquido-líquido (mezclas de tetrahidrofurano-agua) y la SPE.

La SPE es una técnica alternativa para procesos de extracción sólido-líquido,

o líquido-líquido, así por ejemplo Ruiz-Gutiérrez y Pérez-Camino, (2000) señalan
que para la determinación de lípidos, los procesos tradicionales de extracción,
además de consumir más solventes y de ser menos rápidos, usualmente conducen
a la formación de emulsiones, lo cual disminuye la eficiencia para la extracción de
los compuestos de interés. Por otra parte algunas sustancias como glicolípidos y
prostaglandinas presentan un bajo porcentaje de recuperación, ya que son retenidas
casi en su totalidad por la fase acuosa. El empleo de la SPE evita todos estos
inconvenientes, además que permite procesar simultáneamente un mayor número
de muestras. Otro aspecto comentado por estos autores, es que en numerosos
trabajos para la separación de lípidos se utiliza cromatografía en capa fina (TLC), en
la cual se corren muestras y posteriormente se realiza un raspado de la zona, donde
se encuentra el lípido que se desea analizar, para posteriormente cuantificarlo. Este
procedimiento presenta inconvenientes para la determinación de ácidos grasos
poliinsaturados, que son susceptibles a la oxidación durante el desarrollo de la
placa, de igual manera la alternativa del uso de la SPE, evita o disminuye
considerablemente estos problemas.

La SPE puede ser utilizada para disminuir los tiempos de trabajo, al sustituir
otra técnica. Así por ejemplo Ham et al. (2000) señalan el uso de SPE para la
determinación de esteroles en aceites. El procedimiento tradicional involucra un
desarrollo en cromatografía en capa fina (TLC), con posterior remoción de las
bandas obtenidas y extracción con solventes, lo cual puede llevar a un tiempo de
trabajo por muestra entre 2-3 h. Mientras que con la SPE, se realiza en 30 min. y
adicionalmente se obtiene un ahorro de solventes. Los autores reportan resultados
iguales tanto para TLC y SPE.

Existen desarrollos simples como los reseñados por Bruno et al. (2001) para
la determinación a nivel de trazas de 10 antibióticos del tipo beta-lactama en leche
bovina. Los autores emplean cartuchos de "Carbograph 4", que corresponden a un
relleno de carbón grafitizado, a través del cual se puede introducir hasta 10 ml de
leche, tanto cruda o pasteurizada, sin necesidad de tratamiento previo. De esta
manera el método propuesto permite disminuir el tiempo de trabajo ya que no
requiere de una eliminación del material proteico de la leche con solventes
(acetonitrilo). Los autores señalan porcentajes de recuperación (leche cruda)
superiores al 80%, con la excepción de dos antibióticos, nafcillina y ceftiofur, que
presentaron valores de 65-66% respectivamente. Estos resultados indican que en
determinaciones múltiples no siempre se puede "armonizar" las condiciones de
extracción por SPE, en las cuales se obtengan máximos rendimientos para todos los
compuestos de interés, y más aún cuando estos presentan diferencias estructurales
significativas en su fórmula.

2.2.- Usos de la SPE.

Según Majors, (2002 a,b) SPE, es la técnica más empleada para el

tratamiento de muestras previo a HPLC. En una encuesta llevada a cabo por este
investigador entre 152 laboratorios, (farmacéuticos; 28%, ambientales; 25% y 8% de
alimentos y productos agrícolas) un 38%, empleo la SPE en sus protocolos de
trabajo para los usos señalados en el Esquema 2:

1.- Eliminación de interferencias de muestras

2.- Concentración de muestras
3.- Fraccionamiento de una mezcla compleja, en grupos o compuestos.
4.-Almacenamiento de analitos inestables.
5.- Como base para la realización de reacciones de formación de derivados.

ESQUEMA 2. Principales objetivos del uso de la SPE

Adaptado de: Huck y Bonn, (2000).
 Fritz y Macka, (2000) reportan cómo ha sido el auge de esta técnica en
diferentes áreas de investigación, destacándose: fluidos biológicos, ambiente y
alimentos. Señalan que en 1990 en estas áreas se publicaron 100 trabajos en los
cuales se empleó la SPE, está cifra aumentó hasta 350 en 1999, (tomando como
referencia la base del "Analytical Abstracts"). Por otra parte entre 1995 y 1999, en el
área de alimentos se publicaron aproximadamente 80 trabajos que emplearon la
SPE.

Los usos de la SPE se basan principalmente en:

1.- Eliminación de interferencias y substancias que bloquean o inactivan la

columna. Las interferencias pueden producir solapamiento de bandas en un
cromatograma, complicando la resolución e interpretación de los resultados. El
empleo de la SPE permite eliminar estas interferencias, ya que pueden ser retenidas
previamente.

Por otra parte, substancias lipofílicas (grasas, aceites etc), que en columnas
de fase reversa se adhieren fuertemente de manera irreversible, pueden producir
una obstrucción al paso del caudal (Majors y Slack, 1997): El uso de la SPE permite
retener estos componentes e inclusive, en el caso de partículas suspendidas que de
ser inyectadas directamente en el equipo pueden llegar a bloquear los conductos
internos de las tuberías o ser retenidas en la cabeza de la columna, son eliminadas
con la SPE. Yuritas et al. (2000) emplean cartuchos de fase reversa (C18), para la
purificación de compuestos antioxidantes fenólicos en almendras y el uso de la SPE
es reseñado por estos autores para obtener una eliminación de compuestos no
polares, tales como grasas y tocoferoles, que interfieren en el análisis.

Para la determinación de los alcaloides teobromina y cafeína en chocolate y

sus productos, Naik, (2001) emplea cartuchos de fase reversa C18 para eliminar
pigmentos que producen interferencias en los cromatogramas, como se puede ver
en la FIGURA 1. De esta manera el autor señala que se prolonga la vida útil de las
columnas y se mejora la resolución de los picos, además indica que un solo cartucho
permite el tratamiento de hasta 25 muestras, empleando el correspondiente proceso
de lavado entre muestras.

FIGURA 1. Cromatogramas de (a) muestra de cacao antes del tratamiento con cartucho
"Sep-pak C18" y (b) muestra de cacao después del tratamiento con cartucho. Referencia:
Naik, (2001).

En la determinación de ácido fólico en néctar de frutas Breithaupt, (2001)

emplea cartuchos de intercambio iónico, con posterior cuantificación por HPLC con
detector de diodos. Los autores señalan que la SPE es una técnica muy útil para
este tipo de determinación, ya que estos alimentos contienen numerosas sustancias
que absorben en el UV, mostrando un fuerte efecto de fondo en los cromatogramas,
como se muestra en la FIGURA 2. en la cual la (A) corresponde a una muestra
tratada por SPE, mientras que (B) es una muestra con analito añadido y finalmente
la (C), es muestra con añadido de ácido fólico, pero sin tratamiento por SPE. Se
puede observar en esta última una fuerte inestabilidad de la línea base,
representada por desviaciones del nivel cero. Estos cromatogramas resaltan la
importancia que tiene la SPE como medio para eliminación de interferencias.
FIGURA 2. Cromatogramas por HPLC, de (A) néctar de una muestra tratada por SPE. (B)
muestra con analito añadido y también tratada con SPE. (C), muestra con añadido de ácido
fólico, pero sin tratamiento por SPE. Referencia: Breithaupt, (2001).

Para la determinación de fungicidas y plaguicidas en alimentos el empleo de

SPE tiene particular importancia, especialmente cuando estos compuestos van a ser
cuantificados mediante un detector de masas, las muestras obtenidas presentan una
disminución significativa de interferencias por compuestos intrínsecos de la matriz
(Young, et al. 2001). En un trabajo reportado por Kontou, et al. (2001) en el cual
determinan en tomate y sus productos el compuesto etilentiourea, principal producto
de degradación de fungicidas orgánicos, los autores evalúan la extracción tradicional
con solventes y embudos de separación, la cual es comparada con la SPE en
cartuchos "Extrelut". El empleo de estos últimos mejora la precisión, porcentaje de
recuperación e inclusive la selectividad del método, con lo cual los autores proponen
la SPE para monitoreo de este analito en tomate y sus productos.

Algunos investigadores, como Riet, et al. (2001) prefieren el desarrollo de

procedimientos por SPE para la determinación de drogas, como emamectina e
ivermectina, en músculo de pescado. La SPE les permite trabajar con insumos
como cartuchos o filtros constituidos por materiales plásticos (polipropileno), con lo
cual se evita el uso de material de vidrio, que en algunos casos puede absorber
sobre su superficie el analito que se está evaluando, de esta manera se evita un
trabajo de silanización del vidrio o su acondicionamiento.

2.- Concentración o enriquecimiento de trazas de un analito. Si se puede

seleccionar un procedimiento en el cual se obtenga un factor de capacidad de k >>
1, para un analito, es factible la introducción de una gran cantidad de volumen de
muestra a través del cartucho, antes de que el mismo se sature y comience la
elución del compuesto de interés, esto provoca un alto incremento de su
concentración, que puede ser extraída posteriormente con un solvente con k > 1, lo
cual ocasiona la elución del analito, aumentando por lo tanto la sensitividad ya que
se pueden obtener factores de concentraciones superiores a 1000 (Fritz y Macka,
2000).

Nascimento et al. (2000) evalúan 17 ácidos orgánicos en muestras de licores

típicos del Brasil, emplearon cartuchos C18 para concentrar estos compuestos,
obteniendo porcentajes de recuperación del 95%. Los autores indican que el método
propuesto permite la cuantificación de succínico, láctico, oxálico, málico y fórmico
que usualmente presentan dificultades para su determinación por cromatografía de
gases.

Columé et al. (2001) emplean la SPE para cuantificar 20 pesticidas

(Organoclorados y piretroides) en frutas, por cromatografía de gases, empleando un
detector de captura de electrones. En la FIGURA 3. se puede observar un esquema
del diseño. Para el análisis se realiza una preconcentración en línea de los
pesticidas en un cartucho de sílica (2 cm x 4 mm id. Relleno de 50 mg),
posteriormente, por medio de un sistema de válvulas, se introducen 175 µL de
acetato de etilo, que provoca una extracción de los pesticidas del cartucho de sílica
con la posterior determinación por gases. Los autores reportan límites de detección
entre 0,05- 2,0 ppb, con factores de concentración entre 30-120, además señalan
que el cartucho fue utilizado por un período de 3 meses diariamente, sin pérdida de
su eficiencia.
 El sistema fue optimizado para variables como: cantidad de muestra (máximo
20 mL), cantidad del relleno de sílica (25-100 mg), flujo de eluyente durante la
preconcentración (1-2 mL/min), flujo de aire (0,1- 0,5 mL/min) y volumen del acetato
de etilo (máximo 175 µL).

FIGURA 3. Preconcentración en línea de 20 pesticidas, con posterior determinación por

cromatografía de gases. (A) paso de preconcentración y (B) paso de extracción. Siglas: IV1
válvula de inyección; W: desechos. Referencia: Columé et al. (2001).

3.- Otros usos son la eliminación de sales de una matriz. La SPE en fase
reversa puede ser empleada para eliminar sales, especialmente antes de realizar
una cromatografía por HPLC de intercambio iónico. En este procedimiento se
seleccionan condiciones de pH y composición de fase orgánica de manera que se
retenga el analito en el cartucho, con lo cual se eliminan las sales inorgánicas,
usualmente con agua grado HPLC, posteriormente el analito se eluye con una fase
orgánica.

La SPE también se emplea para cambio de solvente, derivación "in situ"

(Huck y Bonn, 2000) y para almacenamiento de muestras o su transporte. Liska,
(2000) señala la utilidad que tiene la SPE para el almacenaje de muestras que en
otras condiciones, presentan alta inestabilidad, como es el caso de pesticidas. Estos
fueron extraídos en cartuchos y pudieron ser almacenados sin cambios
significativos, por 7 semanas en refrigeración y hasta 8 meses a -20° C. Fritz y
Macka, (2000) señalan que pueden preservarse los pesticidas extraídos en discos,
los cuales muestran mayor estabilidad en relación a las muestras originales,
recomiendan el almacenaje de estos discos en refrigeración.

2.3.- Procesos de extracción en SPE

Los fenómenos que rigen los procesos en SPE son mecanismos de sorción-
desorción de los analitos en la superficie del material activo del relleno. La retención
y extracción son por partición tanto para fase normal, reversa e intercambio iónico.
León-Gonzalez y Pérez-Arribas, (2000) señalan que los mecanismos de retención
son principalmente por interacciones hidrofóbicas entre los solutos y la fase
estacionaria (fuerzas de Vander Waals), puentes de hidrógeno y fuerzas dipolo-
dipolo (hidrofílicas o polares).

Según Huck y Bonn (2000) la SPE puede considerarse como una extracción
líquido-sólido, en la cual existe un equilibrio entre la concentración del analito en la
fase estacionaria (A) s y la fase móvil (A) m, es decir:

(A) s = (A) m
 Cuando el analito se retiene en la columna, el equilibrio se encuentra
desplazado hacia la izquierda, mientras que para conseguir la extracción, se debe
desplazar a la derecha.

En algunas aplicaciones de SPE, con relleno de tierra de diatomeas se

produce, una partición entre el agua empleada como vehículo de disolución del
analito y el solvente orgánico empleado para extracción del analito, con lo cual se
tiene una partición líquido-líquido.

Un resumen de los principales sistemas de preparación de muestras en SPE

se señala en la TABLA 1. Las substancias neutras no polares, se retienen a partir
de solventes polares en columnas no polares del tipo C8 o C18, estas columnas se
lavan con mezclas de agua:solvente orgánico y los analitos se extraen con algún
solvente orgánico como metanol o acetonitrilo puro o mezclado con agua.

La retención de substancias iónicas está regulada por el pH del medio. Los

compuestos con carácter ácido pueden retenerse en columnas intercambiadoras de
aniones si se encuentran en su forma cargada, es decir si el pH del medio es dos
unidades mayor que el valor del pKa del ácido. La extracción se consigue bajando el
valor del pH del medio por debajo del pKa, incrementando la fuerza iónica utilizando
un solvente orgánico o combinando estas últimas tres condiciones.

Estas substancias pueden retenerse en columnas no polares si el valor del pH

del medio es dos unidades menor que el pKa del ácido. En este caso la extracción
se consigue o bien aumentando el valor del pH, agregando solventes orgánicos
(metanol o acetonitrilo) o empleando mezclas de solventes orgánicos con agua.

Por otra parte las substancias iónicas básicas pueden retenerse en columnas
intercambiadoras de cationes, si se encuentran en su forma cargada, es decir el pH
del medio es dos unidades menor que el valor de pKa de la base. La extracción se
consigue incrementando el valor del pH del medio por encima del pKa, aumentando
la fuerza iónica, utilizando un solvente orgánico o combinando estas tres
alternativas. Estos compuestos también pueden retenerse en columnas no polares si
el valor del pH del medio es dos unidades superior al valor del pKa de la base, en
este caso la extracción se consigue disminuyendo el valor del pH, agregando
solventes orgánicos (metanol o acetonitrilo) o mezclas de estos con agua.

TABLA 1. Propiedades de los principales fases estacionarias empleadas en SPE.

Modo de separación Fase Propiedades

Sílica normal Fase normal Sílica Polar
sin
modificación
Sílica Fase normal Aminopropilo Menos polar, que la anterior.
modificada Cianopropilo
Diol
Sílica Fase reversa Octadecilo (C18) Hidrofóbica, se usa para
modificada retener analitos diluidos en
solventes polares
Octilo Menos hidrofóbica que C18
Etilo Baja funcionabilidad hidrofóbica
Intercambio Intercambio iónico Aminas Intercambiador aniónico, para
iónico cuaternarias retener compuestos con carga
negativa
Propilbenceno Intercambiador catiónico usado
sulfonato para extraer compuestos
Propilsulfonato básicos con carga positiva
Adaptado de: Ruiz-Gutiérrez y Pérez-Camino, (2000).

Las substancias iónicas presentan dificultad para ser retenidas con rellenos
de fase reversa, pero son fácilmente retenidas con materiales de intercambio iónico.
En este caso la extracción se consigue modificando la fuerza iónica y el contenido
del solvente orgánico del medio. Si se emplean columnas de fase reversa, es factible
eliminar las interferencias de los grupos silanoles del material de relleno, o bien
disminuyendo el valor del pH del medio o por el agregado de aminas (ditetilamina,
trietilamina, etc).
 Otra variante del SPE se logra mediante el uso de reactivos de par-iónico
para el control de la ionización de un compuesto. Usualmente se debe trabajar con
substancias altamente hidrofílicas, bases o ácidos orgánicos, que se mantienen en
forma iónica dentro de los rangos habituales o recomendados para preservar la
integridad de la fase estacionaria de un relleno. Estos casos pueden ser resueltos
por control de la ionización, ya que llegar a la forma no iónica puede implicar un pH
demasiado ácido como para evitar la hidrólisis de la fase ligada, o demasiado
alcalino como para evitar la disolución de la sílicagel. En estos casos es preferible
mantener el estado iónico del analito, aplicando la cromatografía de apareamiento
iónico o par-iónico (IPC): a la fase móvil se le añade un contraión, es decir una
especie química de carga opuesta a la del analito, de esta forma el analito y el
contraión forman un complejo "neutro" que se transporta como tal dentro de la
columna. El tipo de contraión dependerá del analito, para bases formadoras de
cationes se emplean contaiones aniónicos, en especial alquilo sulfonatos y para los
ácidos (formadores de aniones), compuestos de alquilo amonio (tetrabutilo,
tetraetilo, tetrametilamonio, o trimetil alquilo amonio). La principal virtud del uso de
esta modalidad, consiste en que permite separar solutos iónicos y no iónicos en un
mismo cromatograma con una única fase móvil (Quattrocchi et al. 1992).

Carson, (2000) señala algunas ventajas y desventajas de usar par-iónico,

entre las ventajas se encuentran que: 1.- puede emplearse tanto en cartuchos de
SPE, intercambio iónico o de fase reversa, sin embargo son más empleados en este
último. 2.- es compatible con soluciones acuosas y generalmente no requiere de
disoluciones previas o extracciones con solventes no polares. 3.- no es
absolutamente necesario el empleo de buffers, como es el caso de SPE de
intercambio iónico. Entre las desventajas se mencionan: 1.- tiene limitada aplicación
en HPLC, acoplado a masas, o GC, ya que el contranión que se forma no es volátil,
a excepción del contranión ácido perfluropropiónico que es utilizado en IPC RP
HPLC-MS. 2.-el método tiene que ser optimizado tomando en cuanta variables
como: concentración de contraión, pH, solvente orgánico y tipo de fase estacionaria.
En la TABLA 2. se señalan algunas de las aplicaciones de está variante de SPE, en
alimentos.

TABLA 2. Aplicaciones de par-iónico (IPC) con extracción en fase sólida (SPE) en

alimentos.

Alimento Analito IPC Análisis Rango

(ppm)
vino aminas Octano, decano y dodecano RP-HPLC 0,1-8,0
biógenas sulfonato
(15)
Salsa aminas ácido dodecilbenzenosulfónico MEKC-LIF > 0,1
soya biógenas
Leche antibióticos ácido heptanosulfónico RP-HPLC 0,025-0,400
Leche antibióticos ácido heptaflurobutírico RP-HPLC- 0,05-2,00
MS
Miel antibióticos heptanosulfonato RP-HPLC 0,01-0,4
Jugos alcaloides sodio octil sulfonato RP-HPLC- 40-200
UV

RP: Fase reversa o invertida. MEKC-LIF: cromatografía electrocinética capilar con detección
de fluorescencia inducida por láser. Observación: en todos los casos se emplearon
cartuchos C18. Adaptado de: Carson, (2000)

Una guía para seleccionar el tipo de cartucho en función de las características

del analito, es reseñada por Poole et al. (2000), como se puede ver en la FIGURA 4.
Para esta selección se debe partir de la solubilidad de la muestra, posteriormente se
evaluarán características como polaridad y su capacidad de ionización.

Rossi y Zhang, (2000) señalan que también aspectos tales como el tipo de
absorbente seleccionado tiene gran importancia, ya que dependiendo de sus
características se obtendrán diferentes porcentajes de recuperación del analito.
Otros aspectos tales como concentración del solvente empleado para la extracción
deben ser determinados, para así obtener la optimización del proceso de la SPE.
FIGURA 4. Guía para la selección de las diferentes modalidades de SPE. SAX:
intercambiador aniónico fuerte, SCX: intercambiador catiónico fuerte, WCX: intercambiador
catiónico débil, RP: fase reversa, NP: fase normal, IE: intercambiador ionico. Referencia:
Poole et al. (2000)

2.4.- Dispositivos usados para la SPE.

Majors y Slack., (2003) señalan que los implementos más usuales para SPE
son: cartuchos, discos y fibra cubierta (sin embargo esta última es considerada como
SPME). El más usado lo constituyen los cartuchos, con aproximadamente un 62%
de utilización (Majors, 2002b). En la FIGURA 5, se muestran las diferentes partes,
constituidas por el cuerpo, generalmente de polipropileno grado medico
seleccionado por su alta pureza, de manera de evitar que posibles aditivos
empleados normalmente en plásticos, tales como plastificantes, estabilizantes o
antimicóticos, puedan ser extraídos durante el uso e interferir en los resultados o
contaminar la columna. La salida o punta del cartucho es normalmente del tipo
"Luer", de manera que se pueda incorporar una aguja para manipular el eluyente.
Dentro del cartucho se encuentran dos membranas porosas o "frits" que pueden ser
de polietileno, PTFE o acero inoxidable, con una porosidad de 10-20 µm, para
ofrecer una baja resistencia al paso del caudal.

FIGURA 5. Diseño de las principales variantes de SPE (a) Cartuchos (b) Disco y (c) Fibra
(SPME). Referencia: Majors, 2002b.

Contenido en el espacio entre ambas membranas se encuentra el relleno. El

volumen de este lecho puede ser entre 0,5 a 10 mL., con una masa entre 35 mg a 2
g. Se consiguen inclusive cartuchos con más de 10 g y 60 mL de lecho, para
grandes cantidades de muestras o si éstas tienen gran cantidad de interferencias
(Majors, 2000). Los cartuchos de 500 mg con volumen de 3 y 5 mL, así como
también los de 100 mg con volumen de 1 mL, son los más empleados y el diámetro
de partícula es usualmente de 40 µm (Sabik et al. 2000). La tendencia es emplear
menor volumen debido a: aumento de la sensibilidad de los equipos de detección,
interés en emplear una menor cantidad de solventes para los procesos de lavado,
acondicionamiento, extracción e inclusive para disminuir los tiempos y gastos por
procesos posteriores de evaporación en caso de concentración (Majors, 2001).
 Los cartuchos de SPE pueden variar en su diseño algunos son construidos
para acoplarse a equipos automáticos. En el caso de análisis de trazas existen
cartuchos con cuerpo de vidrio, para eliminar así cualquier posible interferencia que
pueda presentarse por el uso de polipropileno grado médico. Es recomendable la
realización de blancos, de manera de evaluar si existe un riesgo potencial de
contaminación por extracción de compuestos del cuerpo, membranas o relleno, que
puedan interferir con el compuesto de interés. En caso de una contaminación el
dispositivo puede ser lavado con metanol, acetonitrilo o ácido diluido antes de su
uso. Algunos contienen pequeños filtros, constituidos por tierra de diatomeas o
lechos de vidrio, con el objeto de evitar que se obstruya el cartucho por la presencia
de pequeñas partículas suspendidas en la muestra (Fritz y Macka, 2000)

El segundo diseño más utilizado es el disco, que según Majors, (2002 b) es

empleado en aproximadamente un 24%. El disco combina las ventajas del uso de
membranas y SPE, (FIGURA 5b).Tiene usualmente un espesor de 1 mm o menos,
con diámetros entre 4 a 96 mm, mientras que el diámetro de las partículas de la fase
estacionaria es de 8 µm y su peso es de un 90% en relación al peso del disco
(Sabik et al. 2000). Los discos de 4 mm son acoplados "en línea" con equipos para
análisis. La diferencias entre cartuchos y discos consiste principalmente en la
relación largo/diámetro: siendo mayor o igual a 1, para el primero y menor o igual a
uno para el segundo. Esta características del disco permite emplear caudales o
flujos mayores para extracciones más rápidas. Por ejemplo 1 L de agua
relativamente limpia, puede pasar a través de un disco de 45 mm de diámetro en
aproximadamente 15- 20 min, mientras que el mismo volumen en un lecho de
cartucho de 15 x 8 mm, emplearía 2 h, es factible el uso de flujos de hasta 200
ml/min a través de estos dispositivos (Fritz y Macka, 2000).

Poole et al. (2000) clasifica a los discos para SPE en:

1.- Discos con partículas cargadas, que consisten en una base de

microfibrillas de PTFE expandible que contienen un relleno de fase estacionaria
(sílica con o sin modificación, resinas etc, de 8-10 µm). Pueden tener estos discos
un diámetro entre 4 a 96 mm, y un espesor de 0,5 mm.

2.- Discos con membranas de fibra de vidrio, dentro del cual está contenido el
relleno (10-30 µm). En este caso la ausencia de membrana de PTFE, elimina
posibles interferencias por lixiviación de compuestos plastificantes.

3.- Empaquetamiento impregnado de polivinil cloruro (PVC). Permiten una

separación más rápida, especialmente para purificación de proteínas.

4.- Membranas para derivación. Conformadas por celulosa derivatizada con

grupos como dietilaminoetilo, amonio cuaternario o sulfonilpropilo, empleadas
particularmente en cromatografía de intercambio iónico.

Ruberu et al. (2000) utilizan discos de C18, para la determinación de

herbicidas del tipo fenil urea en agua. Con el método propuesto los autores emplean
muestras acondicionadas de 20 mL de agua en la cual preconcentran los analitos en
discos, con un sistema automatizado que permite obtener mayores porcentajes de
recuperación, atribuido por estos autores a la disminución de la manipulación.
También Thorstensen et al. (2000) cuantifican ácidos fenoxi y bentazona en agua,
usando discos, que les permiten emplear hasta 2000 mL de agua sin pérdida de
analitos. El trabajo es comparado con un sistema tradicional de extracción líquido-
líquido y en relación a este último, el uso de discos permite disminuir el tiempo de
trabajo, evita la formación de emulsiones, reduce el uso de solventes orgánicos y
como emplea material que es desechable, no es necesario procesos meticulosos de
lavado de vidrio, como es el caso del método tradicional.

Otra aplicación para los discos es señalada por Ringo et al. (2003) que
indican que pueden ser empleados para la purificación de fases móviles,
especialmente en separaciones por gradiente, obteniendo una eliminación de
impurezas de hasta un 95%. Ya que al emplear un gradiente con dos fases, primero
una débil que contenga contaminantes, estos se pueden acumular en la cabeza de
la columna y posteriormente al emplear la fase más fuerte, aparecen picos de estos
contaminantes. Si son eliminados previamente, se obtienen mejor exactitud y
precisión.

Algunos autores emplean sistemas mixtos (denominados 2D) de cartucho y

filtro por ejemplo Hubert et al. (2001) para la determinación de pesticidas en filetes
de trucha arcoiris (Oncorhynchus mykiss) y bagre (Ictalurus punctatis). Usan
inicialmente una columna de C18, (1.000 mg) y a continuación un sistema de disco,
también de C18, para eliminar substancias lipofílicas y luego concentrar los analitos
de interés.

Ng et al. (2000) cuantifican un total de 19 ácidos y fenoles en bebidas

alcohólicas destiladas, empleando discos de intercambio iónico para la extracción de
los compuestos, los cuales son evaluados posteriormente por GC, con detector de
masas. En este trabajo el empleo del disco tiene un doble propósito, en primer lugar
para la extracción de los compuestos y después de extraerlos con el disco, este es
secado, removido y colocado en otro dispositivo en el cual se realiza la formación de
los derivados con trimetilsilitrifluoroacetamida, para finalmente extraerlos y
cuantificarlos por GC. Este segundo paso de formación de los derivados en el disco,
muestra la versatilidad que tienen estos insumos, para el tratamiento de muestras y
la reducción del tiempo de análisis.

Otra variante de la SPE reportada por Fritz y Masso, (2001) lo constituye la

extracción en fase sólida miniaturizada (M-SPE), la cual emplea discos
miniaturizados que pueden tener 1,2 mm de altura y 0,7 mm de diámetro, que son
colocados en una jeringa de 50 µL del tipo " Hamilton", empleada en GC. El diseño
se puede observar en la FIGURA 6. Para la preparación de la jeringa se realiza un
cono de 0,25 mm de profundidad en la sección de unión entre el cuerpo de vidrio y la
aguja, encima del cono se localiza un filtro de acero inoxidable de 55 µm y se coloca
el filtro de las dimensiones previamente señaladas. Todos estos componentes son
sujetos por una férula estándar de PTFE y para los análisis, inicialmente se acopla
otra jeringa de mayor capacidad por medio de un sistema de clip y se hace pasar 5
ml de muestra por medio de una bomba automatizada, para asegurar flujos entre
100 a 200 µL/min, después de pasado este volumen, se desacopla la jeringa y se
coloca la "Hamilton". Posteriormente se introducen 5 µL de solvente, el cual se deja
por un período entre 2-5 min, para permitir la mejor extracción de los analitos
retenidos en la membrana y finalmente se procede a la inyección de los 5 µL en el
equipo de GC.

FIGURA 6. Dispositivo de la M-SPE dentro de jeringa "Hamilton". Referencia: Fritz y Masso,

(2001)

Está técnica emplea las ventajas de los discos, como son pequeño tamaño de
partículas (5-10 µm), alta carga de fase estacionaria (90% en peso, en relación al
peso del disco) y relación diámetro/altura que permiten el paso de altos volúmenes
de líquidos. Los investigadores emplearon soluciones acuosas con 10 ppb, de 7
derivados de benceno y obtuvieron porcentajes de recuperación mínimos de 92%,
con niveles de enriquecimiento de hasta 500 veces. Si bien estos estudios, están
enfocados en soluciones diluidas y obtenidas a partir de estándares puros, este
técnica abre un nuevo campo de posibilidades y de estudios para su empleo en
muestras más complejas, el uso de volúmenes pequeños (5 -10 µL) y los factores de
concentración (500 veces) muestran sus ventajas.
 El tercer implemento de fibra cubierta, es empleado en micro extracción en
fase sólida (SPME), ver FIGURA 5c. En este diseño, una fibra sólida de sílica
cubierta con una fase estacionaria polimérica como polidimetilsiloxano o poliacrilato.
Esta fibra es sumergida en la solución a analizar y los compuestos difunden por
partición hacia ésta, en función de sus coeficientes de partición. Luego, el dispositivo
es removido de la solución y colocado en el puerto de inyección del equipo HPLC,
en el cual los analitos son desplazados de la fibra por un solvente (fase móvil),
análogo al proceso de extracción con cartuchos o discos. Este tipo de diseño, como
se señaló anteriormente, se discutirá en una sección aparte de este seminario.

Otros implementos que se han desarrollado para SPE son puntas de pipetas,
en las cuales se les ha adicionado dos membranas que retienen una fase
estacionaria, de esta manera se pueden realizar los procesos de extracción
empleando pipetas, inclusive del tipo multicanal, el flujo para la extracción puede ser
bidireccional, tanto si el líquido es absorbido por la pipeta, como si es dispensado
(Majors, 2001).

Por otra parte Waters, (2003ab) señalan otro tipo de formato de SPE especial
para pequeños volúmenes de muestra, denominada micro elución, que consiste
básicamente en cartuchos de SPE, pero semejantes a puntas de pipetas, en los
cuales la fase estacionaria es colocada en el extremo de la punta dentro de un canal
muy fino, con lo cual se obtiene un diseño semejante a una micro columna de
cromatografía, que se caracteriza por ser bastante larga, pero con un diámetro
pequeño. La cantidad de relleno de la fase estacionaria es de solamente 2 mg. Este
diseño tienen una relación de altura del relleno de la fase estacionaria con respecto
al diámetro del relleno fase estacionaria de 1,15 el cual es superior a otros formatos
más convencionales de cartuchos donde esta relación es de 0,13. Estas
características permiten trabajar con volúmenes pequeños de muestra entre 25-50
µL e inclusive 15 µL, con factores de concentración superiores a 5.

Una técnica de extracción, denominada dispersión de matriz en fase sólida

(Matrix solid-phase dispersión: MSPD), consiste en emplear los rellenos activos y
mezclarlos directamente con las muestras a analizar, posteriormente en algunos
casos es separado el relleno, al cual se ha fijado el analito y se procede a su
extracción con un sistema de solventes (Curren y King, 2001).

Barker (2000ab) realizó una revisión sobre MSPD, este investigador fue el
que desarrolló este proceso por primera vez en 1989 y señala que de esta manera la
fase estacionaria tiene un doble propósito, en primer lugar actúa como agente para
la ruptura y desintegración de la muestra rompiéndola en partes pequeñas, por otra
parte la presencia de la fase estacionaria permite la disolución y dispersión de los
analitos.

Se puede emplear en muestras viscosas, semi-sólidos, sólidos y líquidos. El

proceso se muestra en las FIGURAS 7ab, usualmente se emplea 0,5 g de muestra,
la cual es mezclada en un mortero, con aproximadamente 4 g de fase estacionaria
(40-100 µm), el mortero y el mazo para la mezcla deben ser de vidrio o de piedra de
ágata, ya que la porcelana u otros materiales porosos pueden originar pérdidas de
analitos. Después la mezcla se transfiere a una columna o cartucho, se comprime
evitando la formación de posibles canales, así como también de no compactar
demasiado la muestra. Se añade el solvente para la extracción, usualmente entre 4-
8 mL, de manera de extraer los analitos para su posterior cuantificación. MSPD ha
sido aplicada para el aislamiento de drogas, pesticidas, herbicidas en productos
cárnicos, frutas y vegetales, como se puede ver en la TABLA 3.

Chase y Thompson, (2000) emplean una mezcla de 2 g de relleno C18, con

isopropil palmitato, a la cual se le añade una muestra de alimento para regímenes
especiales, que se le desea determinar su contenido de vitamina K. La mezcla es
colocada en un sistema de extracción acelerada con solventes (Accelerated solvent
extractor: ASE), en una celda que puede emplear temperaturas de 50° C y presiones
de 1500 psi, para un tiempo total de extracción de 14 min. Los solventes son luego
recolectados y analizados por HPLC para la cuantificación de la vitamina. Los
autores señalan que el método propuesto tiene como ventajas: ahorro de solventes,
simplificación de los pasos de extracción en relación a los método tradicionales y
permite el procesamiento de mas de 24 muestras en forma automatizada.

FIGURA 7. Representación esquemática del proceso de la MSPD. Referencia: Baker,

(2000a)
TABLA 3. Aplicaciones de la MSPD en el análisis de residuos y vitaminas en alimentos.

Analito Alimento

Benzimidazol Cárnicos
PCBs, oxitetraciclina Pescado
Penicilina Cerdo
Pesticidas Bagre, frutas, vegetales, leche, naranjas, ostras y cítricos
Drogas sulfa Pollo
Sulfadimetoxina Bagre
Sulfonamidas Fórmulas infantiles, carne, leche, salmón y huevos
Tetraciclinas Leche, carne y queso
Vitaminas Alimentos especiales y fórmulas infantiles

Adaptado de: Barker, (2000ab)

Liska, (2000) explica el uso de la SPE, en micro dispositivos, en línea con un

equipo HPLC. De esta manera, se pueden pasar hasta flujos de 10 mL/min, de una
dilución de la muestra, la cual es concentrada en un micro cartucho con un diámetro
interno entre 2- 4,6 mm y un largo de 2- 10 mm. Una vez pasado el volumen
deseado por medio de un sistema de válvulas, se circula una fase móvil que extrae
el analito del lecho de la fase estacionaria, procediendo a su posterior cuantificación.
En el caso del empleo de estos dispositivos en GC, el procedimiento consiste en
que, una vez es retenido el analito en el micro dispositivo por medio de un sistema
de válvulas, se cierra la introducción de fase líquida, procediendo al secado con
helio de manera de eliminar los solventes empleados, posteriormente con un
solvente (hexano) que es inyectado, se procede a la disolución y arrastre de los
analitos hacia el detector del equipo GC.
 2.5.- Equipos para la SPE.

Los equipos empleados para la SPE, se muestran en la FIGURA 8. Estos

pueden emplear la fuerza de gravedad para el paso de la muestra, sin embargo este
flujo es generalmente muy bajo, razón por la cual se puede utilizar una jeringa para
forzar el líquido a través del cartucho o disco. Este procedimiento puede ser
dificultoso en muestras viscosas o que contienen partículas en suspensión. Otra
alternativa consiste en aplicar vacío con embudo de filtración o bombas.

FIGURA 8. Dispositivos de la SPE (a) cartucho a presión, (b) cartucho con aplicación
de vacío y (c) sistema de multicartuchos con aplicación de vacío. Referencia: Majors y
Slack, (1997).

Cuando se procesan varias muestras se puede emplear un sistema de vacío,

en el cual una bandeja removible con varios puestos para tubos de recolección se
encuentra en el interior del equipo, una vez completada la extracción, se puede
remover la bandeja con las muestras extraídas. Generalmente estos dispositivos
poseen válvulas y medidores que controlan el vacío aplicado, en unidades más
sofisticadas puede haber controles individuales de vacío para cada uno de los
cartuchos.
 Un equipo de los más populares lo constituye la estación de trabajo de 96
(8x12), puestos, o sistema SPE-96, con un espaciado de 9 mm entre cada puesto,
que permite procesar numerosas muestras en paralelo y acoplar, por medio de
interfaces, a un equipo de HPLC, inclusive se han diseñado estaciones de hasta 384
puestos (16x24) con espaciado entre ellos de 4,5 mm, para extracción por SPE. Sin
embargo de este último se ha señalado que se debe tener precaución, ya que la
gran cantidad de muestras, requiere de una manipulación muy precisa, que de otra
manera, puede generar problemas tales como: secado en algunos cartuchos,
variabilidad en los flujos de solventes, e inclusive formación de nebulización con
posible contaminación cruzada de muestras (Majors, 2000). El empleo de la estación
de 96 puestos ha permitido la automatización en equipos de análisis, según Rossi y
Zhang, (2000) de un total de 10 equipos comerciales, seis de ellos con las mayores
velocidades de procesamiento, emplean los módulos de 96 puestos.

Según Fritz y Macka, (2000) la forma de realizar la SPE permite acoplar esta
técnica a equipos automáticos que incluyen estaciones de trabajo, periféricos y
módulos, que realizan funciones múltiples controladas por un sistema central de
procesamiento de funciones y datos, algunos emplean condiciones de trabajo que
emplean robótica para su desempeño. Se acoplan en línea SPE con HPLC, GC y
diferentes detectores como MS, UV, diodos, etc. El desarrollo de prefiltros o
membranas aseguran que no entren a los detectores partículas que puedan interferir
en el desempeño de estos últimos, así como también el empleo de sistemas de
válvulas con más de 6 posiciones permiten introducir, seccionar o descartar
determinados flujos, que facilitan el trabajo de estos sistemas automatizados.

En este punto se debe hacer la observación de tener la precaución de no

trabajar con flujos altos, ya que se disminuiría la probabilidad de interactuar el analito
con el relleno de la fase estacionaria. Para aplicaciones típicas en cartuchos se
emplean flujos de 10 mL/min, mientras que en discos son mayores de 50 mL/min.

El volumen de muestra a aplicar dependerá del tamaño y tipo del dispositivo,

retención del analito e inclusive de su concentración, así como también de la
cantidad de posibles interferencias. Usualmente es deseable trabajar con el máximo
volumen posible que permita el diseño experimental, así como también la
sensibilidad que requiere el método analítico. En caso de solo disponer de
volúmenes pequeños de muestras, es absolutamente necesario el emplear
dispositivos proporcionales con poco relleno. Huck y Bonn (2000) señalan que
existen micro aplicaciones en la SPE, que pueden ser realizadas con volúmenes de
muestras de solamente 50-100 µL. Se han desarrollado inclusive dispositivos en
línea de SPE a nivel de nano escala que emplean tamaños de 1 mm x 50-75 µm
(Fritz y Macka, 2000).

Un procedimiento usual para determinar el máximo volumen a aplicar de

muestra, consiste en recolectar pequeñas fracciones que luego son evaluadas por
cromatografía de manera de determinar la presencia o no del analito, estableciendo
por lo tanto a qué carga de muestra o de solvente para extracción se obtienen los
resultados deseados. Este procedimiento debe ser tomado con precaución, en
especial cuando la matriz de la muestra cambie por variaciones en su composición.

Cuando el número de muestras es alto se debe considerar la automatización

de todo el proceso, de ser posible mediante estaciones de trabajo. Estas son más
versátiles si tienen acopladas interfaces que puedan ejecutar todas las fases de
SPE, desde la pesada de la muestra, mezcla, diluciones, auto muestreo etc. Dilkin et
al. (2001) para el estudio de micotoxinas (fumonisinas B1 y B2) en maíz y alimentos
derivados de este cereal, diseñaron una estación que permite el análisis de 40
muestras realizando la SPE en forma automatizada, e inclusive con la posterior
formación del derivado, inyección, detección fluorescente y cuantificación en 15 h.

Una de las principales ventajas de la SPE consiste en que puede ser

automatizada. Al respecto Rossi y Zhang, (2000) señalan que el número de
publicaciones que emplean sistemas automatizados en los campos de: ambiente,
alimentos, bioanálisis desarrolladas entre 1984 hasta 1999, se ha incrementado
notablemente. Los sistemas de automatización de la SPE pueden ser en serie o en
paralelo, en los primeros se tiene una línea de trabajo de SPE en la cual una
muestra no es tratada, hasta que la precedente es procesada, lo cual da una
velocidad de procesamiento entre 25-50 muestras/h. Por otra parte, en paralelo se
tienen varias líneas o módulos (en algunos casos hasta 10) de SPE, lo cual permite
la extracción simultánea de hasta 400 muestras/h. Ambos sistemas tienen la ventaja
de que pueden procesar durante períodos como la noche, fines de semana etc.

2.6.- Metodología para la extracción por SPE

Para la preparación de las muestras, se sigue básicamente el siguiente

procedimiento:

1.- Lavado y activación de la columna, esta operación se realiza con el objeto

de solvatar los grupos funcionales del material de relleno de la columna. Esta paso
es necesario para activar su superficie, especialmente en el caso de emplear fase
reversa, la cual debe "estirarse" para lograr la interacción. Para C8, C18 o fenil, que
se han dejado secar, estas pueden tener una menor capacidad de retención, por
esto es necesario una fase de lavado que permita la completa solvatación. Por otra
parte este lavado permite eliminar impurezas, que pueden estar presentes en el
dispositivo o que fueron recolectadas del ambiente del laboratorio durante el
almacenamiento hasta su uso (Quattrocchi et al. 1992; Fritz y Macka,.2000).

En fase reversa, la activación se realiza pasando aproximadamente dos

volúmenes equivalentes a la columna con un solvente orgánico y luego dos
volúmenes con agua o buffers. El primer paso se emplea además para eliminar las
substancias provenientes de muestras anteriores, que puedan estar retenidas en la
columna, y se realiza con metanol u otros solventes menos polares como acetonitrilo
o tetrahidrofurano. El segundo paso se utiliza para equilibrar la columna con un
solvente igual o similar al empleado, para disolución de las muestras.
Majors y Slack, (2003) señalan que el metanol es frecuentemente empleado
para acondicionar SPE en fase reversa o rellenos con fases estacionarias polares
tales como ciano, amino y diol. En el caso de SPE en fase normal, el metanol puede
desactivar la superficie activa de sílica, razón por la cual se emplea cloruro de
metileno, para este proceso de acondicionamiento y lavado.

Después que el lecho de relleno es acondicionado, el exceso de solvente

puede ser eliminado por una corriente de aire a través del dispositivo, hasta que no
se produzca goteo del solvente, tomando la precaución de no llegar a producir un
secado. En el caso de SPE en fase reversa se prefiere remover el exceso de
solvente empleado para el lavado y activación, mediante la incorporación de otro
solvente miscible con el primero (soluciones acuosas o buffers), preferiblemente si
éste es el que se empleará en la fase de extracción del analito o es de la misma
composición de la fase en la cual se encuentra disuelta la muestra.

2.- Aplicación de la muestra, se emplea un caudal generalmente entre 1 a 10

mL/min, este paso debe efectuarse lentamente, ya que flujos rápidos pueden
producir efectos cinéticos en el relleno que conducen a bajas recuperaciones del
analito. Quattrocchi et al. (1992) señala que se pueden aplicar las siguientes
modalidades:

2.1.- Aplicación directa de la solución a inyectar para lograr la extracción

rápida del analito, pero provocando la retención de impurezas, que posean una
mayor afinidad por el relleno de la fase estacionaria del dispositivo. En este caso lo
que se desea es retener la impurezas y dejar que el compuesto de interés pase
libremente. Esta opción no produce concentración, sino soluciones más limpias con
menor número de interferencias o substancias que produzcan daño a la columna
cromatográfica.

2.2.- Retención del analito en la columna, utilizando un solvente débil, en

general seguido de un lavado con un solvente particular que no extraiga el analito,
para posteriormente realizar la extracción con otro solvente más fuerte. Este método
es el más habitual y puede utilizarse para preconcentrar muestras, pasando grandes
volúmenes a través de la columna.
 En la SPE en fase reversa, en la cual la muestra está disuelta en un solvente
que muestra una baja afinidad por el analito, es de esperar que éste se retenga en el
dispositivo. En general se recomienda emplear soluciones con un bajo porcentaje de
componente orgánico (< 10%), de manera de facilitar la retención. El paso de la
solución es usualmente realizado, con la aplicación de vacío (en el extremo terminal
del cartucho, o aplicando presión en la cabeza del dispositivo (Fritz y Macka, 2000)

3.- Lavado de la columna, se refiere a la eliminación de las impurezas

retenidas en el paso anterior, utilizando un solvente relativamente débil con el cual el
analito no es extraído. El lavado de la columna no es indispensable, pero en general
es recomendable ya que produce muestras con menos interferencias.

Para la eliminación de interferencias, se emplea un solvente con una fuerza

intermedia, de tal manera que no extraiga el analito de interés. En teoría, el punto
óptimo constituye aquel en el cual se tiene una condición en que el analito está casi
justo por empezar a salir del dispositivo, obteniéndose que compuestos que son más
débilmente retenidos por el relleno de la columna son eliminados.

Sin embargo esta condición de idealidad según Majors y Slack, (2003) no

siempre puede ser obtenida y debe por lo tanto evaluarse un procedimiento para
determinar el porcentaje de recuperación que se puede obtener con la SPE. Por otra
parte se ha señalado que existe variabilidad en la capacidad de separación entre
cartuchos, con lo cual se debe disponer de un volumen o margen de "seguridad", en
las cantidades empleadas para la remoción de interferencias.

4.- Extracción del analito, finalmente el analito se extrae con un solvente, que
posea la fuerza necesaria, empleando entre 5 a 20 volúmenes de columna.

Si el propósito consiste en detectar trazas, el analito debe ser recuperado

preferiblemente en la menor cantidad posible de solvente, esto puede lograrse
mediante la extracción con un solvente fuerte, de tal manera que el factor de
capacidad sea igual a cero (k = 0 ). Es factible también en el caso de necesitar un
mayor volumen para recobrar el analito, el empleo posterior de un proceso de
evaporación de solvente, tomando las precauciones o consideraciones del grado de
susceptibilidad térmica del analito. Esta evaporación puede ser por tratamiento
térmico o por corriente de un gas inerte (nitrógeno), con o sin aplicación de vacío
etc. El residuo o la fracción reducida de volumen puede ser disuelta o retomada
preferiblemente en la fase móvil en la cual se va a emplear para la determinación por
HPLC. En este punto se debe tener la precaución de no emplear para la extracción
del analito por medio de la SPE, de solventes que tengan una gran afinidad por el
compuesto de interés, en relación a la fase móvil que se empleará para la
determinación por HPLC, ya que, la introducción al equipo de estos solventes junto
al analito, puede llegar a comprometer la eficiencia para la resolución que pueda
tener la fase estacionaria de la columna.

En caso de muestras que posteriormente serán analizadas por GC puede

aplicarse aire o nitrógeno a través del cartucho de manera de eliminar al máximo los
solventes en los cuales estaba disuelta la muestra, a continuación se extrae con un
solvente orgánico de bajo punto de ebullición, de manera que este no produzca una
interferencia en el cromatograma (Fritz y Macka, 2000)

Dependiendo del diseño de las columnas y de las necesidades del analista, el

solvente puede pasarse por medio de una jeringa o aplicando vacío. Durante toda la
metodología de extracción las columnas deben mantenerse húmedas y no se
pueden secar, lo cual conduciría a bajas recuperaciones y a la formación de canales
por los cuales no se produciría la extracción.

Un ejemplo de un método de la SPE es reportado por Young et al. (2001)

para la determinación de funguicidas (thiabendazol y carbendazima) en jugo de
manzana, como se muestra en el ESQUEMA 3. Se emplearon cartuchos "Oasis
MCX", de fase reversa e intercambiador catiónico fuerte, relleno de 150 mg y de 30
µm. Brevemente, el procedimiento comienza con un acondicionamiento de la
columna empleando 2 mL de metanol y 3 mL de solución de hidróxido de amonio
(0,15M), de manera de activar la superficie iónica del relleno, se introduce la
muestra, y se procede a realizar dos lavados para eliminar substancias interferentes,
a continuación se añade 2 mL de solución de ácido clorhídrico (0,1 M), para cambiar
a su forma cationica el analito, se vuelve a lavar con 2 mL de metanol, para
finalmente extraer con 3mL de metanol e hidróxido de amonio (0,3 M).

1.- Preparación de la muestra .Ajustar pH

2.- Acondicionamiento de la columna: 2 mL de metanol / 3 mL de NH4OH 0,15M
3.- Introducción de la muestra
4.- Primer lavado: 2 mL NH4OH 0,15M
5.- Segundo lavado: 2 mL de metanol 30% / NH4OH 0,15M
6.- Cambio del analito a su forma iónica: 2 mL de HCl 0,1 N
7.- Tercer lavado: 2 mL de metanol
8.- Extracción: 3 mL metanol / NH4OH 0,3 M
9.- Evaporación y añadido de solvente

ESQUEMA 3. Procedimiento para la determinación de funguicidas en jugo de manzana

empleando cartuchos "OASIS MCX". Adaptado de: Young et al. (2001).

Al desarrollar un procedimiento por SPE se debe tener la certeza de que el

mismo sea exacto y reproducible, dentro de un rango de interés, en el cual se va a
analizar un analito o varios. La generación de esta información permite tener más
confianza en que la misma pueda ser transferida a otros laboratorios de análisis,
para su aplicación.

La precisión, es un parámetro importante que debe ser evaluado en la SPE.

Este estadístico determina la dispersión de las medidas alrededor de su valor
promedio, cuando es valorada a partir de una muestra homogénea. Se expresa
como la desviación estándar (DE), o también como porcentaje de desviación
estándar relativa (DSR%) o coeficiente de variación (Smith, 1998). Con estos
estadísticos se determina la incertidumbre de la medida, ocasionada por errores
sistemáticos y aleatorios, los cuales producen una dispersión alrededor del
promedio. El número de determinaciones tiene una gran importancia para este
parámetro ya que al aumentar estas la probabilidad de error, tiende a disminuir
debido a que el promedio de la muestra, se acerca cada vez más al que debería ser
el valor promedio de la población (Fabre y Altria, 2001).

Según Quattrocchi et al. (1992) la precisión puede ser considerada en tres

niveles:

.- Precisión repetitiva: es la variabilidad cuando el ensayo es realizado por el

mismo analista y equipo en un intervalo corto de tiempo, usualmente el mismo día.

.-Precisión intermedia: corresponde cuando a la variación de uno o varios

factores (analista, día de operación, otro cartucho de SPE pero de la misma marca y
características o diferente lote).

.- Reproducibilidad: se refiere a estudios en los cuales una misma muestra es

analizada en diferentes laboratorios para fines comparativos, con lo cual se tienen
condiciones diferentes de analistas, día de análisis y casi siempre diferentes
columnas, equipos de extracción para la SPE etc.

Una evaluación de la precisión en la SPE puede ser realizada introduciendo

una misma muestra o un estándar, en varios cartuchos y determinando así el
promedio y la DER%, de los resultados obtenidos. Este ensayo puede ser ejecutado
por diferentes analistas, días de trabajo, cartuchos o filtros de un mismo tipo, marca
pero diferente lote, equipos de extracción etc. A los resultados obtenidos se les
puede determinar su intervalo de confianza, a un nivel de probabilidad, e inclusive
cuantificar si existen diferencias significativas (Montgomery, 2002), al realizar
diferentes variaciones (analista, día de análisis, misma marca pero diferente lote,
diferente marca etc).

Otro parámetro a evaluar es la exactitud, la cual es también conocida como

error sistemático o tendencia, y corresponde a la diferencia entre el valor obtenido y
el valor verdadero. Este parámetro mide para el caso de la SPE, las pérdidas
causadas por la unión del analito a compuestos contenidos en la matriz del alimento,
así como también puede reflejar problemas en las condiciones del proceso de
lavado, acondicionamiento y extracción de las muestras en el sistema SPE. Por otra
parte se pueden manifestar efectos de diferencia de solubilidad de un compuesto a
diferentes concentraciones o por la presencia de otros compuestos de la matriz
(Fabre y Altria, 2001). La exactitud puede ser afectada cuando una interferencia, se
encuentran en niveles variables en muestras diferentes, con lo cual un
procedimiento de extracción se diseña para ciertas condiciones, que después no
necesariamente se cumple para todas las muestras (Pomeranz y Meloan, 1994).
Este parámetro puede evaluarse de dos maneras:

1.- Método absoluto, cuando se dispone de una muestra con una cantidad
conocida de un compuesto y ésta es comparada con el resultado obtenidos por el
método que se desea evaluar. Ya que es difícil el disponer de una muestra con una
valor verdadero es factible emplear otro sistema de determinación, que sea más
exacto que el que se desea evaluar y emplear el primero como "valor verdadero".

2.-Se emplea con más frecuencia el porcentaje de recuperación, que consiste

en determinar cuanto se está recuperando del analito de interés, al someter a éste a
uno o varios pasos de manipulación (Pomeranz y Meloan, 1994).

En el caso de la SPE se determina el porcentaje de recuperación del analito y

es deseable valores lo más cercanos a 100%, lo cual indicaría que la presencia de
errores probablemente es mínima. Columé et al. (2001) para evaluar la exactitud de
un sistema de SPE, propuesto por estos autores para la determinación de 20
pesticidas en frutas, determinan el porcentaje de recuperación en una muestra (7
frutas diferentes) por triplicado, a tres niveles de concentración, de manera de
determinar si existe algún efecto de la concentración sobre el porcentaje de
recuperación. Sus resultados indican solamente valores bajos para bifenthrina
(70%), deltamethrina, bifenthrina y captano (aproximadamente 85%), mientras que
para el resto de los pesticidas son superiores al 92%, independientemente de la
matriz de la muestra.
 Ng et al. (2000) cuantifican en bebidas alcohólicas destiladas un total de 19
ácidos y fenoles. La extracción es realizada con discos de intercambio iónico y la
cuantificación por GC, con detector de masas. Los autores en su estudio, para tener
seguridad y confianza en su procedimiento de SPE, determinan: porcentaje de
recuperación, reproducibilidad (interdiaria), linealidad y adicionalmente, ya que
realizan la formación de un derivado (sililado) "in situ" en el disco, evalúan la
estabilidad de la respuesta en función del tiempo de espera, que puede ocurrir en un
dispositivo automático, realizando determinaciones a: 0, 5, 20, 28 y 48 h.

La Croix y Wolf, (2001) proponen un método para la determinación de la

vitamina niacina en alimentos para niños, empleando para la extracción un sistema
de SPE, de columnas de intercambio iónico. Para verificar el procedimiento en base
a precisión y exactitud, emplean estándares de niacina, en un rango entre 25 a 100
ppm, así como también una muestra certificada de alimento infantil con una cantidad
conocida de esta vitamina (63,3 ppm), obteniendo porcentajes de recuperación entre
91,7- 96,8% para esta última.

Bicchi et al. (2001) determinan residuos de daminozida en pulpa de manzana

empleada para alimentos infantiles, el método propuesto por estos autores, emplea
cartuchos (Extralut 20 NT de polipropileno) y determinación por HPLC, con detector
ultravioleta de diodos. Los investigadores como parte de su trabajo de validación del
método realizan un estudio donde determinan: porcentaje de recuperación,
desviación estándar relativa, coeficiente de variación y reproducibilidad. Sus
resultados se muestran en la TABLA 4. Emplearon 6 niveles de incorporación, para
determinar si existen variaciones en función de la concentración del analito,
efectuando las determinaciones por sextuplicado. Este diseño puede constituir un
ejemplo de cómo puede llevarse a cabo un estudio de recuperación para la SPE.
 TABLA 4. Porcentaje de recuperación, desviación estándar (DE), porcentaje de desviación
estándar relativa (DER%) y reproducibilidad a partir de pulpa de manzana, a la cual se le ha
añadido diferentes cantidades de daminozida.

Porcentaje de recuperación
Cantidad añadida ppm. %recuperación DE DER%
0,05 83,3 10,1 5,1
0,04 79,4 4,9 3,4
0,03 90,1 8,2 7,8
0,02 82,9 4,4
6,6
0,01 84,2 3,5
3,2
0,005 71,2 7,8
5,5

reproducibilidad
0,1 86,6 7,8 6,7
0,5 83,4 5,9 5,6

Para todas las determinaciones n = 6.

Referencia: Bicchi et al. (2001)

Russell et al. (2002) desarrollan un método para la cuantificación de fenoles

como substratos para el obscurecimiento en manzanas. Los autores comparan un
sistema tradicional de extracción con solventes líquido-líquido (LLE) en relación a la
SPE y sus resultados muestran mayores porcentajes para SPE entre 87-108%,
mientras que para LLE fueron de 41-95%, por otra parte la repetibilidad de ambos
métodos no mostró diferencias significativas (P= 0,05). Los investigadores también
señalan la conveniencia de SPE en relación a LLE, ya que reduce a la mitad el
tiempo de trabajo.

Kim-Kang et al. (2001) proponen un método para la detección de emamectina

en músculo de salmón, empleando dos cartuchos diferentes de SPE: PRS-SPE y
LC-SCX Supelco, no encontrando diferencias significativas en los porcentajes de
recuperación. Este tipo de determinación en el cual se comprueba si pueden darse
cambios significativos, cuando se cambian una variable (en este caso tipo de
columna) se denomina robustez del método, que permite evaluar que parámetros
pueden tener un efecto significativo o no sobre el resultado que se desea. Es
deseable que el método sea robusto frente a diferencias en los equipos o
procedimientos (USP, 2002), sin embargo no debe serlo frente a todos los cambios
(Quattrocchi et al. 1992) así por ejemplo un cambio de pH en un buffer para extraer
el analito de un sistema SPE puede producir cambios drásticos al momento de la
extracción, alterando por lo tanto el porcentaje de recuperación. En este caso se
debe evaluar el rango de pH en el cual, no genera diferencias significativas en el
resultado del análisis para obtener una mayor confianza para la variable pH.

En la TABLA 5. se puede observar otras aplicaciones de la SPE en muestras

de alimentos. Una gran mayoría está enfocada a la determinación de pesticidas,
plaguicidas en alimentos y la mayoría se aplica HPLC, para la cuantificación final. En
general se puede señalar que la SPE en alimentos es utilizada empleando
básicamente con cartuchos, en la mayoría de los casos del tipo de fase reversa y
que la metodología final de cuantificación es casi siempre HPLC.
TABLA 5. Aplicaciones de SPE en muestras de alimentos

Referencia Alimento Analito Dispositivo de Técnica de

SPE cromatografía
Tsatsakis et al. Aceite de oliva Fenthion y C18 GC-MS
(2003) dimethoate
Verzegnassi et Miel Cloramfenicol OASIS HLB HPLC-MS
al. (2003)
Winrow et al. Trigo, maíz, Isoproturom Amino propilo HPLC-Diodos-
(2003) avena y pastas Sílica MS
Russell et al. Manzanas Fenoles Polímero HPLC-UV
(2002) Bond Elut PPL
Cabras et al. Frutas Rianodina Aminopropilo HPLC-Diodos
(2001) Dehidrorianodina
Columé et al. Frutas Pesticidas Sílica GC-ECD
(2001)
Dreassi et al. Cárnicos Levamisol Sílica HPLC-UV
(2001)
Guyot et al. Manzanas Procianidinas C18 HPLC-Diodos
(2001) SepPak
Hoenicke et al. Vino y mosto Triptófano y sus Iónico HPLC-
(2001) metabolitos LiChrolut SAX fluorescencia
Ham et al. Aceites Esteroles C18 GC-MS
(2000) refinados y
crudos
Nascimento et Licores Ácidos orgánicos C18 HPLC-
al. (2000) Supelclean Fluorescencia
ENVI-18

C18: columna de octadecilo

Marcas comerciales: OASIS HLB; Bond Elut PPL; LiChrolut SAX; SepPak; Supelclean y
ENVI-18
Detectores. MS: espectroscopia de masas, UV: ultravioleta, ECD: captura de electrón
3.- Micro extracción en fase sólida (SPME)

3.1- Aspectos generales de micro extracción en fase sólida (SPME)

En 1990, Arthur y Pawliszyn, desarrollaron un sistema de microextracción

basado en la adsorción con fases estacionarias como polidimetilsiloxano (PDMS)
que se encuentran sobre un soporte o fibra (Kataoka et al. 2000). A esta técnica se
le conoce como micro extracción en fase sólida (SPME: Solid Phase Microextraction)
(Majors, 2003 b), entre sus ventajas están que no requiere del uso de gran cantidad
de solventes, ni de equipos complicados y puede usarse para concentrar
fundamentalmente componentes volátiles y no volátiles en muestras líquidas y
gaseosas. Básicamente se puede señalar que los analitos se adsorben mediante la
inmersión de la fibra sobre el espacio libre, que está presente sobre muestras
líquidas e inclusive sólidas, dentro de un recipiente cerrado. Este espacio también es
conocido como "espacio de cabeza" (HS: Head Space). Al optimizarse la manera de
tomar la muestra y el tipo de fibra, se pueden eliminar interferencias selectivamente
y concentrar los analitos deseados. Estos pueden ser posteriormente extraídos de la
fibra mediante exposición directa en un puerto de inyección GC o una interfase para
HPLC (Supelco, 1998).

La SPME al igual que la SPE muestran una serie de ventajas en comparación

a los métodos tradicionales, especialmente la extracción líquido-líquido (LLE),
Nonato et al. (2001) realizan un estudio en bebidas alcohólicas típicas de Brasil
(cachaςa), evaluando alcoholes secundarios y ésteres, comparando un
procedimiento desarrollado por estos autores con SPME y el usual de LLE.
Determinaron que la SPME, permitía extraer un mayor número de compuestos en
relación a LLE, como se puede observar en la FIGURA 9. Adicionalmente la
concentración de analitos con SPME, en 12 muestras de bebidas, era mayor que los
obtenidos por LLE y la repetibilidad era mejor en la SPME (1,8-3,9%) en relación a
LLE (10,3-11,7%).
FIGURA 9. Cromatogramas de cachaςa extraída por LLE y SPME.
Referencia: Nonato et al. (2001).

Lord y Pawliszyn, (2000ab) reseñan la principales diferencias entre SPE y

SPME, como se muestra en la TABLA 6. Una de las principales consiste en que la
micro extracción es una técnica en la cual la fase que se emplea para extraer, es
muy pequeña en relación al volumen de la muestra, además que la extracción de los
analitos, no debe ser exhaustiva, ya que en la mayoría de los casos solo una
fracción (< 1%) del analito es extraído para la determinación. Este aspecto marca
una diferencia notable con respecto a la SPE, ya que en está última se desean
porcentajes de recuperación del 100%, mientras que en la SPME, generalmente solo
se va a extraer una pequeña fracción del analito.
 TABLA 6. Comparación entre la SPE y la SPME

SPE SPME

Extracción Ideal 100% Usual < 1%

Pasos básicos 1.-Pase de muestra 1.- Extracción

2.- Lavado impurezas 2.- Desorción en equipo
3.- Extracción del
analito

Concentración después de la Es usual No procede

extracción

Volumen de fase estacionaria Alta 1-60 mL Baja 0,5 µL

Retención en compuestos en el Es factible Poco probable

volumen muerto

Volumen de muestra Mayor Menor

Análisis de superficie No es probable Es factible el análisis por

medios de espectroscopia
de los compuestos retenidos
en la superficie.

Adaptado de: Lord y Pawliszyn, (2000ab)

Algunas de las configuraciones más empleadas para la SPME, reseñadas por

Lord y Pawszyn, (2000a) se muestran en la FIGURA 10. que incluyen fibras
cubiertas (más frecuente), recipientes, mecanismos de agitación, discos, en tubo etc.
Por otra parte los tres métodos básicos son los mostrados en la FIGURA 11. que
son: extracción directa, espacio de cabeza y con protección de membrana. En el
primero, la fibra es insertada en la muestra y los analitos se transfieren a la fase
estacionaria, para facilitar la extracción se realiza agitación. En el método de espacio
de cabeza se realiza sobre el espacio superior al nivel de la muestra, de esta
manera se protege a la fibra de compuestos de alto peso molecular, que puedan
dañar a la fibra. Se determinan compuestos volátiles y semivolátiles, el proceso
puede ser optimizado para temperatura y grado de agitación (mediante ultrasonido,
barra magnética etc). En el tercer método, se emplea una membrana para proteger a
la fibra, de sustancias de determinado peso molecular. De esta manera la
membrana, evita el paso hacia la fibra de compuestos que puedan interferir o dañar
la fase estacionaria.

FIGURA 10. Configuraciones de la SPME

Referencia: Lord y Pawszyn, (2000a)

FIGURA 11. Modalidades de la SPME, (a): extracción directa, (b): espacio de cabeza, (c):
membrana protegida o recubierta.
Referencia: Lord y Pawszyn, (2000a)
 Ruiz et al. (2001) diseñaron un dispositivo nuevo, que permite introducir la
fibra directamente en muestras sólidas. Este tiene una cubierta externa de metal,
con finos agujeros que permiten la difusión de las substancias volátiles hacia la fase
estacionaria de la fibra, como se muestra en la FIGURA 12. Los investigadores con
este diseño estudiaron hasta 63 compuestos responsables del aroma y sabor en
jamón curado y 78 en pasta de hígado.

FIGURA 12. Diagrama de extracción directa (SPME-DED) y con espacio de cabeza (HS-
SPME).
Referencia: Ruiz et al. (2001).

El dispositivo más usual consiste en una jeringa adaptada para este propósito,
como se muestra en la FIGURA 13. la cual consta de una agua de acero inoxidable,
que es un microtubo, que contiene una fibra (por ejemplo sílice), que a su vez, tiene
sobre su superficie una cubierta de fase estacionaria (PDMS, PA etc). Para una
muestra que se desea analizar, esta puede colocarse dentro de un recipiente o vial,
que tiene un septum en la tapa a través del cual se pasa la jeringa, en este momento
la fibra y la fase estacionaria se encuentra retraídas dentro del microtubo. Para HS-
SPME, se oprime el embolo, que hace descender la fibra (aproximadamente 1 cm) y
puede sumergirse en la muestra líquida o permanecer en el espacio inmediatamente
superior a está (fase de vapor en equilibrio), los analitos se adsorben en la fase
estacionaria en la fibra en un período que usualmente puede variar entre 2-15 min,
pero que inclusive puede tardar varias horas (Mills y Walker, 2000). A continuación
se retrae la fibra y se saca la jeringa del recipiente de la muestra. Con este mismo
dispositivo se inyecta en equipos de GC (por ejemplo a 260° C por 1 min) y también
existen dispositivos para HPLC (con una fase móvil, que tenga mayor afinidad), en
los cuales ocurre la desorción de los analitos (Supelco, 1998; Lord y Pawliszyn,
2000a). Según Ulrich, (2000) una de las grandes ventajas de la SPME, es que
agrupa los pasos de extracción, concentración e inyección, en un solo dispositivo lo
cual reduce la manipulación y el tiempo de trabajo. Por otra parte es factible después
de realizar la extracción, secar la fibra con lo cual se eliminan los solventes en los
cuales estaba disuelta la muestra y solo quedan retenidos los compuestos de interés
sobre la fase estacionaria. A continuación se introduce en el puerto de inyección,
con lo que se obtiene mejoras en los cromatogramas ya que no se manifiesta la
presencia del pico del solvente. Se mejora por lo tanto la resolución, en especial con
picos que tienen tiempos de retención bajos o cercanos al solvente (González-
Córdoba y Vallejo-Cordoba, 2001).

FIGURA 13. Diagrama de dispositivo clásico de la SPME.

Referencia: Lord y Pawliszyn, (2000).
 Existen dispositivos que una vez tomada la muestra puede sellarse el extremo
de la jeringa y desacoplarse de ésta, para así almacenar y transportar la muestra
hasta el laboratorio. Inclusive se han diseñado equipos pequeños y portátiles de GC,
para realizar el análisis en el lugar que se tomo la muestra (Mills y Walker, 2000). En
algunos diseños portátiles se pueden procesar hasta 15 muestras simultáneamente,
mediante planchas de agitación de mutipunto, (varios centros magnéticos de
agitación), las fibras con los analitos son protegidas mediante un septo y pueden ser
transportadas al laboratorio. En el caso de muestras líquidas este sistema
representa una gran ventaja, en cuanto al volumen ya que al comparar la masa de
una fibra que es < 1 g, ésta es significativamente menor en relación a una muestra
líquida 100-1000 g (Eisert et al. 2001).

Según Fritz y Macka, (2000) entre las ventajas de la SPME, además de su

simplicidad, se destaca que puede emplearse con poco volumen de muestra, lo cual
disminuye considerablemente el tiempo y pasos de procesamiento, además se
pueden alcanzar límites de detección de partes por trillón, con detectores en GC
como captura de electrones y no produce consumo significativo de solventes. Por
otra parte las desventajas, son: es una técnica que debe alcanzar un equilibrio,
frecuentemente solo una pequeña fracción de los analitos de la muestra son
extraídos. La cuantificación es dependiente de la fracción de extracción de cada
analito, lo cual significa que cambios en la matriz de la muestra, o cualquier otra
variable pueden afectar el equilibrio y por lo tanto los resultados. En contraste a la
extracción por SPE, la cual está dirigida a la obtención, en lo posible del cien por
ciento del analito. Existen diseños de microfibras empleadas para mediciones en
células, con la ventaja adicional de que no dañan al sistema vivo, ya que se remueve
solamente una pequeña cantidad del analito del sistema que se desea evaluar (Lord
y Pawszyn, 2000a).

Por otra parte autores como Ulrich, (2000) y Yang et al. (2003) han señalado
tanto las ventajas como las desventajas de la SPME, como se muestra en la TABLA
7. En general se puede apreciar que las ventajas tienen un peso más "significativo"
que sus posibles desventajas.
 TABLA 7. Ventajas y desventajas de la SPME.

Ventajas Desventajas

1.- No usa solventes 1.- Difícil para matrices complejas

2.- Manipulación sencilla
3.- Requiere de poco equipo
4.- Método rápido
5.- Adaptable para automatización y
miniaturización
6.- Buena linealidad y alta sensibilidad
2.- Baja recuperación
3.- En algunos casos la extracción es lenta
4.- En algunos casos baja precisión (%DER
10%)
5.- Debido al bajo porcentaje de
recuperación cualquier irregularidad en la
fase estacionaria, tiene efectos significativos
sobre la extracción.

Adaptado: Ulrich, (2000) y Yang et al. (2003).

3.2- Fases estacionarias en la SPME

Las partes esenciales en la SPME, consisten: fase de soporte y la fase

estacionaria o también llamada recubrimiento. La fases de soporte, puede ser de:
sílice, poliimida, cristal líquido de poliacrilato, carbowax, acero inoxidable, tungsteno
etc. En la TABLA 8. se muestran las fases estacionarias más empleadas en esta
técnica. El volumen de fase estacionaria para una fibra típica de 100 µm (PDMS),
está entre 0,5-0,6 µL, sin embargo la forma característica para describir a la fibra, no
se basa en el volumen sino en cuanto al tipo de fase estacionaria y su espesor. En el
caso de la fibra de DVB-PDMS-Carboxen, la base es una capa interna de 30 µm de
carboxen mezclado con PDMS, con una capa externa de DVB de 50 µm, para un
total de 80 µm o 50/30 como se señala en la misma tabla (Page et al. 2000).

Fritz y Macka, (2000) señalan las dos principales tecnologías empleadas para
el recubrimiento de la fase estacionaria, sobre el soporte. La primera consiste en un
sumergido de la fibra en una solución concentrada de la fase estacionaria, a
continuación se remueve y el solvente es evaporado, en la segunda una pieza en
forma de microtubo de la fase estacionaria, es hinchada mediante un solvente
orgánico volátil, a continuación se coloca sobre la fibra y el solvente es evaporado,
retomando así su diámetro original.

Las fibras nuevas y usadas deben acondicionarse antes de su uso. Para GC

se recomienda colocarla en el puerto de inyección del equipo, con corriente de gas
inerte altamente purificado, sin oxígeno ya que trazas de éste pueden dañar la fase
estacionaria. Se expone en estas condiciones por un tiempo determinado que
dependerá del tipo de fibra. Como ejemplos se tiene que González-Cordoba y
Vallejo-Cordoba, (2001) acondicionan PDMS a 250°C por 1 h., PA a 300° C por 2h y
Carbowax-DVB a 250° C por media hora. Por otra parte Falqui-Cao et al. (2001) que
emplean un equipo de HPLC acondicionan la fibra en el puerto de inyección, con la
fase móvil que se empleará en el análisis, manteniéndola por 20 min. y realizando un
posterior secado a temperatura ambiente. Mills y Walker, (2000) indican que
realizando buena manipulación y cuidado, las fibras pueden ser reutilizadas hasta
más de 50 veces, después de este uso deben descartarse, ya que pierden su
eficiencia principalmente por contaminación de la fase estacionaria.

Wu y Pawliszyn, (2001) señalan que los campos de investigación en el área

de desarrollo de fibras, están orientados hacia fases estacionarias intercambiadoras
de iones, aumento de la resistencia y durabilidad, fases catalíticas, mejor
selectividad, mayor variedad y calidad de fases para su uso en HPLC etc.

3.3- Parámetros que influyen en la SPME

Lord y Pawliszyn, (2000b) explican que el proceso de extracción en la SPME

está influido por la convección (que se logra por agitación) y la difusión, la cual se
incrementa notablemente con la temperatura. En el caso particular de fases
estacionarias como PDMS y PA, estás son substancias amorfas, con características
gomosas, y por lo tanto no son completamente rígidas, razón por la cual tienden a
comportarse como líquidos, permitiendo esta condición una mayor difusión hacia el
interior. Mientras que otras fases estacionarias son sólidas (Carbowax-DVB, PDMS-
DVB) y por lo tanto en la extracción, la adsorción sobre la superficie es el fenómeno
principal (Ulrich, 2000).

TABLA 8. Principales fases estacionarias empleadas en la SPME.

Recubrimiento Espesor Polaridad Estabilidad Máxima Equipos Aplicación

µm temperatura
°C
Polidimetilsiloxano 100 NP NB 280 GC/HPLC Volátiles
(PDMS) 30 NP NB 280 GC/HPLC Polar no
7 NP NB 340 GC/HPLC volátiles

PDMS- 65 Bi-P CL 270 GC Volátiles

divnilbenceno 60 Bi-P CL 270 HPLC polares
(PDMS-DVB) Bi-P CL

Poliacrilato 85 P CL 320 GC/HPLC Semivolátiles

(PA) polares

Carboxen-PDMS 75 Bi-P CL 320 GC Gases y

85 volátiles

Carbowax-DVB 65 P CL 320 GC Polar

70

Carbowax-resina 50 P CL 240 HPLC Surfactantes

templada

DVB-PDMS- 50/30 Bi-P CL 270 GC Volátiles

Carboxen

NP: no polar., P: polar., Bi-P: bi-polar., NB: fase no-enlazada., CL: fase enlazada.
Adaptado de: Supelco, (1998); Huck y Bonn, 2000; Sabik et al. (2000); Lord y Pawliszyn,
2000a; Mills y Walker, (2000).

Los parámetros experimentales que afectan el desempeño de la SPE son

según Fritz y Macka, (2000), Ulrich (2000) y Lord y Pawliszyn, (2000ab) :

1.- Tipo de fase estacionaria. La selectividad de la cubierta, puede ser

mejorada, escogiendo una que tenga una estructura química similar a la del analito
que se desea analizar. Para la selección se evalúa principalmente, la cantidad del
analito extraído y la precisión de los resultados obtenidos. También pueden ser
considerados, aspectos de estabilidad de la fibra en relación a: como es afectada
por la matriz, estabilidad térmica, respuesta a los pasos de limpieza etc (Steenson et
al. 2002).

Algunos autores emplean varias fibras para complementar la información

obtenida, así por ejemplo, Augusto et al. (2000) determinan hasta 31 compuestos
relacionados con el aroma de frutas típicas de Brasil, empleando tres tipos de fibra,
Carbowax-PDMS, PDMS y PA. Recomiendan la primera para la extracción de
compuestos livianos, mientras que la dos siguientes, según estos autores son
preferibles para compuestos de mayor peso molecular, señalando que la
combinación de la información obtenida con estas tres fibras, es la que permite
establecer definitivamente la cantidad y proporción del aroma en estas frutas.

2.-Espesor de la fase estacionaria. Un recubrimiento delgado permite alcanzar

el equilibrio más rápido, sin embargo retiene menos, por otra parte uno más grueso,
permite extraer más compuestos pero en un tiempo mayor.

3.- Método de agitación. La agitación favorece los fenómenos de convección,

el cual es un aspecto esencial ya que, sin agitación, la velocidad de transferencia de
los analitos a la fibra es muy baja. La agitación magnética es la más frecuentemente
empleada, para muestras líquidas. También se emplea ultrasonido y mezclado con
"Vortex".

4.- Efecto de las sales. La adición de sales inorgánicas a muestras acuosas,

favorecen la retención de analitos por parte de la fase estacionaria. La adición de
cloruro de sodio es frecuentemente utilizada, para mejorar la extracción, sin
embargo se suele observar un aumento, hasta cierta concentración de la sal y luego
decrece. Se puede explicar este comportamiento ya que ocurren dos eventos
simultáneos, inicialmente aumenta la extracción del analito, debido a que el agua
forma esferas de hidratación, alrededor de las moléculas iónicas de sal y se
encuentra por lo tanto menos disponible para hidratar al analito. Al aumentar la
concentración de sal está empieza a interactuar con el analito, disminuyendo por lo
tanto su extracción.
 5.- pH. El recubrimiento generalmente solo extrae compuestos neutros. Por lo
tanto se debe controlar el pH del medio al cual se realiza la extracción. El empleo de
buffer es sumamente importante ya que la forma sin disociar del analito, es extraída
en la fibra y el buffer desplaza el equilibrio, formando más especie sin disociar que
está disponible para incrementar así la cantidad que se puede extraer.

El efecto combinado de adición de sal y del pH, se pueden observar en el

trabajo de González-Córdoba y Vallejo-Cordoba, (2001) en el cual evalúan ácidos
grasos de cadena corta (C2 - C12), en leche y emplean PA (85 µm). Estos autores
optimizan las condiciones de extracción, obteniendo mejores resultados con pH de
1,5 y añadido de 28% de cloruro de sodio en la muestra, con lo cual se incrementa
notablemente la extracción de los ácidos grasos C4 hasta C10. En el caso del pH es
debido a que a 1,5 los ácidos grasos evaluados, se encuentran en su forma no
ionizada, este efecto del pH unido a la alta concentración de sal, producen este
aumento de la extracción.

6.- Temperatura. El calentamiento de muestras líquidas produce una mayor

difusión de los analitos hacia el recubrimiento de la fibra, lo cual reduce el tiempo de
extracción necesario para el equilibrio. Sin embargo, al exceder ciertos rangos de
temperaturas se obtiene menor cantidad de analito extraído ya que el incremento de
la temperatura, facilita la extracción de los analitos de la fibra.

7.-Tiempo de extracción. El objetivo de la SPME, es en principio alcanzar el

equilibrio del sistema, en el cual una variación de la transferencia de masa no afecta
los resultados finales. Sin embargo, cuando los tiempos para alcanzar el equilibrio
son largos, es factible el empleo de menores tiempos para cuantificación, pero en
este caso debe controlarse cuidadosamente el tiempo de exposición (González-
Cordoba y Vallejo-Cordoba, 2001). En general se trabaja con tiempos en los cuales
se obtiene un equilibrio, en el cual la cantidad de analito extraído por la fibra es
proporcional a la concentración inicial de la muestra (Zambonin et al. 2001).
 8.- Otros factores que pueden tener influencia son: humedad de la jeringa,
composición de la matriz de la muestra, volumen del espacio de cabeza, posición de
la fibra en el recipiente y condiciones de inyección. Se recomienda la silanización del
material de vidrio para evitar pérdidas por reacciones sobre su superficie (Mills y
Walker, 2000).

En la TABLA 9. se muestran algunas parámetros escogidos por tres

diferentes grupos de investigación, para optimizar la extracción por SPME en el
primero Sales y Cardeal, (2003) evalúan trazas de metanol en aspartame, mientras
que en el segundo Steenson et al. (2002) determinan compuestos volátiles
(aldehídos y cetonas) en aceites de soya y maíz, mientras que en el tercero Rocha
et al. (2001) evalúan 9 compuestos volátiles responsables del aroma y sabor en
vinos. Estos trabajos pueden ser considerados como un ejemplo o guía de
referencia para optimización de la SPME. Sin embargo se debe señalar que en la
revisión realizada no se encontró trabajos, en los cuales se efectuará un diseño
estadístico del tipo factorial, empleando Plackett y Burman (Quattrocchi et al. 1992)
o Metodología de Respuesta de Superficie (Montgomery, 2002).

En caso de emplearse estos procedimientos se podría identificar los factores

críticos que tienen mayor peso o influencia sobre el método, además de disminuir la
cantidad de experiencias a realizar. En los trabajos revisados se escoge una variable
y se fijan las otras, procediendo al estudio de una variable por vez, al tener el óptimo
para este parámetro, esta última es fijada y se procede a la variación de los otras.
Ejemplo de este procedimiento se puede observar en las FIGURA 14. que
corresponde a la optimización realizada por Rocha et al. (2001).
 TABLA 9. Parámetros experimentales optimizados para la SPME.

Parámetros Sales y Cardeal, (2003) Steenson et al. (2002) Rocha et al.

(2001)

1.- Tipo de fibra PA 85 PDMS 100, carboxen- NE

(µm) PDMS 100 PDMS 75 µm.,
DVB/Carbowax/PDMS Carbowax-DVB 64, y
50/30 PA 85.

2.- Agitación (rpm) Con agitación NE Sin agitación y

1000

3.- Tiempo de 3, 5, 10, 15 y 20. 30, 60, 90 y 120. 15, 30, 45 y 60.
extracción (min)

4.- Temperatura de 30, 50, 60 y 70 35, 45 y 60 25, 30 y 40

extracción (° C)

5.- Tamaño de la 100, 200, 400 y 800 µL. 5, 10, 15, 20 y 25 mL 20, 30 y 40 mL
muestra en el
recipiente de
extracción

6.- Efecto de 0, 10, 20 y 30 NE 0, 4, 8 y 12

añadido de cloruro
de sodio (%)

7.- Posición interna NE 0,75., 1,50 y 2,00 NE

de la fibra en el
puerto de inyección
(mm)

8.- Temperatura NE 190, 210, 230 y 250 NE

del puerto de
inyección (° C)

9.- Tiempo de 1, 2, 3 y 4 NE NE
desorción en el
puerto de inyección
(min).

NE: No evaluado
Adaptado de: Sales y Cardeal (2003); Steenson et al. (2002) y Rocha et al. (2001)
 FIGURA 14. Optimización del proceso de extracción con SPME. Referencia: Rocha
et al. (2001).
 En el caso de HPLC, la extracción del analito en el puerto de inyección puede
ser realizada de dos maneras: mediante un flujo determinado de la fase móvil
(desorción dinámica), con lo cual la fibra se expone al solvente y los analitos son
extraídos de la fibra, incorporados al caudal para así entrar a la columna y
posteriormente al detector. En la segunda manera o desorción estática, usada
principalmente cuando los analitos están fuertemente unidos a la fibra. Se introduce
ésta, en el puerto de inyección y es mantenida o "remojada" con una fracción de la
fase móvil (60 µL) por un período de tiempo (por ejemplo 5 min) y luego por medio
de un sistema de válvulas, se procede a la incorporación de esta fracción a la fase
móvil, exponiendo este contenido por no más de 20 s a la corriente de la fase móvil,
para nuevamente su paso por columna y detector. Estos parámetros son críticos
para optimizar la eficiencia de la separación. En general una fibra que retiene
fuertemente compuestos, si es expuesta por más de 20 s al caudal de la fase móvil,
se produce un fuerte ensanchamiento de la base del pico (Zambonin et al. 2001).

Para casos de desorción lenta en GC, se emplea un dispositivo después del

módulo donde esta colocada la fibra, el cual está a bajas temperaturas, con lo cual
se van reteniendo o acumulando los compuestos extraídos en este punto. Al cabo de
un período se aumenta la temperatura para proceder a su análisis (Page et al.
2000).

La cuantificación de la SPME está basada en la extracción de una fracción del

analito y no en la extracción total como es el caso de la SPE, la fracción del analito
extraída en el recubrimiento de la fibra viene dada por la formula:

fex = Kd V2 / Kd V2 + V1
donde:
fex = fracción de analito en la fase estacionaria
Kd = Constante de distribución del analito
V1 = Volumen de la muestra
V2 = Volumen de la fase estacionaria
 En la práctica, según Lord y Pawliszyn, (2000a) una vez se ha alcanzado el
equilibrio entre el analito disuelto en la solución y el extraído en la fase estacionaria
se obtiene una cantidad constante, dentro de los límites del error experimental que
es independiente del tiempo de extracción. La relación antes señalada no puede ser
empleada cuando la concentración del analito es muy alta, ya que puede ocurrir una
saturación sobre la superficie de la fase estacionaria, resultando en relaciones no
lineales. De igual manera, una alta cantidad de otro compuesto que compita con el
analito, puede producir graves errores en la medición. En una gráfica del tiempo de
extracción versus cantidad extraída de varios analitos, si se observa en uno de los
analitos que tiene un máximo y luego comienza a disminuir, esto es ocasionado a
una unión reversible con la fase estacionaria y que otro de los analitos presente en
la muestra, desplaza al primero de los sitios activos. Este fenómeno suele ocurrir
con compuestos de bajo peso molecular, que son sustituidos en los sitios activos por
otros de mayor peso molecular, observándose por lo tanto, un nivel máximo que
disminuye con el tiempo (Semenov et al. 2000).

Existen diferencias en la eficiencia de extracción de fases estacionarias si

éstas son líquidas o sólidas. En el primer caso con los analitos, ocurre una absorción
en la cual difunden hacia el interior del líquido los compuestos extraídos, penetrando
en la totalidad del volumen de la fase estacionaria, especialmente si el espesor en
pequeño y esto ocasiona que aumente por lo tanto, el porcentaje de extracción. En
el caso de fases sólidas, ocurre solo una adsorción sobre la superficie y los poros
del analito sobre la fase estacionaria.

3.4- Derivación y calibración en SPME

Una de las ventajas de la SPME, es que ha permitido el desarrollo de

procedimientos para la obtención de derivados de los analitos de interés, sobre la
misma fibra. Al respecto Lord y Pawliszyn, (2000ab) reseñan que debido a que la
gran mayoría de las aplicaciones desarrolladas con esta técnica, se basan en la
posterior cuantificación con GC, en algunos casos se hace indispensable derivatizar
al analito para obtener un compuesto volátil. Básicamente se pueden realizar
derivados con cuatro procedimientos distintos:

1.- Derivación directa de la muestra. En este procedimiento se añade

directamente el compuesto químico que formará el derivado (QD) en el vial o
recipiente que contiene la muestra y se procede a realizar la reacción. Luego los
derivados obtenidos son extraídos por la SPME.

2.- Derivación en la fibra, después de la extracción: Se extraen primero los

analitos que se encuentran en la fase estacionaria de la fibra y está se expone al
QD. En la mayoría de los casos se coloca la fibra por encima de la solución líquida
del QD (con baja presión de vapor) y se calienta. Los gases formados reaccionan
con los analitos en la fibra formando el derivado. La exposición directa de la fibra en
el seno del líquido del QD debe evaluarse ya que puede afectar la fase estacionaria.

3.- Derivación en el puerto de inyección del GC. Se emplea usualmente en

puertos de inyección a altas temperaturas. Por ejemplo, para la determinación de
ácidos grasos de larga cadena, éstos son extraídos en la fase estacionaria en forma
de par-iónico con tetrametilamonio hidrógeno sulfito. Posteriormente, en el puerto de
inyección, el analito y el par-iónico forman los correspondientes ésteres metílicos
volátiles.

4.- Extracción y derivación simultánea. El procedimiento se basa en una

exposición inicial de la fase estacionaria de la fibra al QD. Luego a continuación se
expone a la muestra, con lo cual los analitos son extraídos y simultáneamente se
forman sus derivados. La forma de introducir el QD puede ser por sumergido de la
fibra en una solución del agente disuelta en un solvente volátil, la fibra se hincha y
retiene al reactivo, se retira y se seca, quedando así sobre la fase estacionaria, listo
para cuando se proceda a la extracción de los analitos, para que ocurra
simultáneamente la extracción y formación de derivados.
 Para los procesos de cuantificación por la SPME se debe correlacionar
linealmente la cantidad extraída con la concentración de la muestra. Ya que en esta
técnica se desea que se extraiga la misma proporción, en relación al contenido de la
muestra, es importante calibrar estos parámetros. Según Lord y Pawliszyn, (2000ab)
se emplean los siguientes procedimientos:

1.- Calibración externa. Es la más usada y se basa en que varias muestras

son preparadas con diferentes concentraciones del analito, usualmente por
triplicado. Mediante ajuste por regresión lineal se determina la concentración. Este
método se práctica en SPME principalmente en matrices poco complejas o con poca
variación entre muestras. En el caso de matrices complejas, no se puede emplear
este procedimiento.

2.- Adición de estándar. Para matrices complejas y muestras con mucha

variabilidad, se emplea la adición de estándar. Una misma muestra es tratada sin
estándar y otra con el añadido de un estándar, la cantidad desconocida en la
primera, es calculada basada en la cantidad conocida añadida en la segunda. En
caso de mayor precisión se debe analizar la adición de tres niveles del estándar por
triplicado.

3.- Estándar interno: Puede emplearse un estándar interno, el cual debe tener
características lo más posible similares o casi idénticas, al analito, especialmente en
cuanto a su afinidad por la fase estacionaria de la fibra. Este procedimiento debe
tomarse con precaución en muestras, en las cuales existan otro compuesto que se
encuentre en cantidades variables entre muestras y compita, con el estándar interno
en los sitios activos de la fase estacionaria, en estas condiciones se obtendrían
resultados con errores.
 3.5- Variantes de la SPME

La aplicabilidad y funcionabilidad de la SPME ha generado otros tipos de

variantes de esta técnica, uno que tiene bastante potencial es el empleo de
microtubos y columnas capilares, las cuales tienen en su parte interna las fases
estacionarias típicas de la SPME. Estos dispositivos son colocados usualmente
dentro de los equipos cromatográficos, lo cual permite la extracción de muestras
dentro del mismo equipo, posteriormente mediante un sistema de válvulas se
procede a la extracción de los analitos de la superficie de la fase estacionaria,
generalmente se emplea una trampa a bajas temperaturas (30° C o menos ) para
producir una concentración, elevando después la temperatura para proceder a la
cuantificación (Hinshaw, 2003). Recientemente Wang et al. (2004) reportan el uso de
una columna capilar de 5 m de largo por 0,53 mm de diámetro, con un espesor de
capa de fase estacionaria de 1,2 µm de PDMS, para la determinación de 16
hidrocarburos aromáticos en agua. Las dimensiones del capilar permiten obtener un
área de extracción de 8321 mm2 la cual es significativamente superior al área de una
fibra típica de 100 µm, que es de 9,7 mm2. Con este diseño el volumen de fase
estacionaria es de 10 µL, que es de 10 a 50 veces mayor que los empleados en
fibra. Los autores trataron un volumen de muestra de 15 mL para proceder a la
extracción, la cual fue llevada a cabo entre 3 a 40 min, estos tiempo permitían
obtener concentraciones entre 30 a 50 veces respectivamente.

Otra variante de la SPME que es evaluada por Majors, (2003 b) consiste en la

extracción con barra magnética (SBSE) (Stir-Bar Sorptive Extraction), la cual emplea
una barra magnética cubierta con vidrio y sobre este, se encuentra una capa que
puede ser de PDMS. La cubierta de vidrio en estos magnetos es para evitar la
descomposición de la fase estacionaria por posibles efectos del metal o plástico.

La potencialidad de este dispositivo esta basado en que el área superficial de

la barra es significativamente mayor en relación a la de una fibra. Por lo tanto la fase
estacionaria que puede ser depositada sobre la barra en cantidades mayores entre
50 a 250 en relación a SPME, con lo cual la capacidad de recuperación de analitos
es superior. Esta técnica tiene una mayor aplicación especialmente en análisis de
solutos parcialmente solubles en agua, debido a que permite mayor interacción del
analito con la fase estacionaria. El volumen de PDMS en una fibra típica de 100 µm
empleada para SPME es de 0,5 µL, mientras que en barras es entre 25-125 µL, lo
cual aumenta la capacidad de adsorción de analitos.

Para su utilización se coloca en un recipiente la barra junto con la muestra

(20-50 mL) y se procede a su agitación por 30-240 min. Se debe optimizar el
proceso en base al rendimiento en función del tiempo, para las variables: 1.-
Volumen de muestra, 2.- Velocidad de agitación, 3.- Dimensión de la barra y 4.-
Propiedades de la fase estacionaria. Posteriormente se retira la barra, se seca
cuidadosamente con papel absorbente o se lava suavemente con agua destilada,
con lo cual se pueden remover: azucares, proteínas etc., llevando a cabo estos
procesos meticulosamente no ocurren pérdidas del analito. La barra se introduce en
un tubo de vidrio resistente al calor, para su determinación por CG. El sistema de
vidrio es llevado hasta 150-300° C por 5-15 min. y con un flujo de helio entre 10-50
mL/min. En casos de extracción lenta se combina el dispositivo con una trampa a
bajas temperaturas (-150° C) para concentrar el analito, el cual finalmente es
introducida en la columna de CG para su cuantificación. Es factible también la
extracción del analito de la barra mediante empleo de solventes, con posterior
evaporación de estos, en caso de ser necesario, adicionalmente todos estos
procesos pueden ser automatizados.

3.6- Aplicaciones de la SPME en alimentos

La SPME ha sido ampliamente utilizada para la determinación de analitos en

muestras de alimentos, la gran mayoría de los trabajos enfocan la cuantificación
especialmente de compuestos volátiles, lo cual la hace una herramienta, sumamente
útil, para estudios de aroma y sabor. Ya que la SPME fue desarrollada inicialmente
para ser empleada con GC, se puede observar en la literatura relacionada con el
área de alimentos, que casi la totalidad de los trabajos emplean este tipo de
cromatografía, es a partir del 2000 cuando, comienza a ejecutarse desarrollo de
algunos métodos en los cuales se emplea HPLC. Recientemente se han reportado
trabajos en los cuales se ha empleado SPME para determinar metales y sus
compuestos orgánicos, como metilmercurio en pescado usando fibra de PDMS 100
µm (Yang et al. 2003), así como también dibutilestaño, tributilestaño, metilmercurio y
mercurio en muestras de agua (Botana et al. 2002), estas aplicaciones reflejan el
potencial y la versatilidad que tiene esta técnica para la evaluación de diferentes
analitos.

Para una revisión sobre los trabajos realizados en alimentos con la SPME,
anteriores al año 2000 se sugiere la referencia de Kataoka, et al. (2000) la cual
reporta un total de 77 trabajos en vegetales, frutas, jugos, bebidas alcohólicas,
lácteos, aditivos, pesqueros, miel, cárnicos etc. Además señala tipo de fibra, forma
de extracción, temperatura, tiempo, etc de extracción. Es notorio también que en
todos estos trabajos anteriores al año 2000, la determinación final es realizada por
CG y solamente uno de los 77 por HPLC.

En la TABLA 10. se muestran algunos de los trabajos en SPME aplicados a

alimentos a partir del 2000. Se puede observar la misma tendencia, en la cual la
mayoría la técnica de cromatografía es en casi todas la CG, también es notorio el
reporte de trabajos en los cuales se emplean varios detectores.
 TABLA 10. Estudios por SPME, desarrollados en alimentos.
Referencia Alimento Analito Fibra- µm Observaciones
Dietzi et al. (2003) Ajo Volátiles de PDMS 100 DI-GC-MS
selenio PA 85 HS-GC-MS
Jelen, (2003) Hongo: 37 compuestos PDMS 100 HS-GC-MS
Penicillum PA 85
roqueforti Carboxen/PDMS 75
Jirovetz et al. Mango y 100 DVB/Carboxen 50/30 HS-GC-MS
(2003) lechosa compuestos en HS-GC-FID
cada uno
Mansur et al. 6 especies 17 compuestos Carboxen-PDMS 75 HS-GC-MS
(2003) de pescado volátiles
Sales y Cardeal, Jugos con Metanol PA 85 HS-GC-FID
(2003) aspartame PDMS 100
Yang et al. (2003) Pescado Metil mercurio PDMS 100 HS-GC-ICP-MS
Zhou et al. (2002) Soya 2-pentil piridina PDMS NR HS-GC-MS
Steenson et al. Aceites 10 compuestos PDMS 100 HS-GC-MS
(2002) volátiles
González- Leche Ácidos grasos Carbowax-DVB 65 HS-GC-FID
Córdoba y de PDMS 100
Vallejo-Cordoba, C2- C12 PA 85
(2001)
Curren y King, Cárnicos Triazina Carbowax-DVB 65 MSPD-ASE-DI-GC-MS
(2001)
Falqui-Cao et al. Fresas Pesticidas PDMS-DVB 60 FMAE-DI-HPLC-DAD
(2001)
Nonato et al. Bebidas Alcoholes PA 85 HS-GC-FID y MS
(2001) alcohólicas secundarios y
esteres
Rocha et al. Vinos 9 compuestos PA 85 HS-GC-FID
(2001) del aroma y
sabor
Ruiz et al. (2001) Cárnicos 63-78 Carboxen-PDMS 75 DED-GC-MS
compuestos de
sabor
Tomaino et al. Suero de Ácidos grasos PDMS 30 HS-GC-FID
(2001) leche C6- C18
Zambonin et al. Queso Micotoxina Carbowax-resina DI-HPLC-UV-DAD
(2001) Ácido templada 50
ciclopiazonico
Augusto et al. Frutas Hasta 31 Carboxen-PDMS 75 HS- GC-MS
(2000) compuestos de PDMS 100
aroma PA 85
Page et al. (2000) Aceites 37 compuestos Carboxen-PDMS 75 HS-GC-MS
volátiles Carboxen-DVB-PDMS
80

Tipo de SPME: HS: Espacio de cabeza., DI: Inmersión directa., DED: Extracción directa
Métodos de análisis: GC: Cromatografía de gases., HPLC: Cromatografía líquida de alta resolución.
ICP: Plasma acoplada inducida.
Detector: FID: Detector de ionización de llama., MS: detector de masas., , UV: Detector ultravioleta.,
DAD: Detector de diodos
Otros: NR: No reporta., ASE: Extracción acelerada con solventes., MSPD: Dispersión de matriz en
fase sólida., FMAE: Extracción enfocada asistida por microondas.
 Conclusiones y recomendaciones

.- La tendencia actual en el tratamiento de muestras es hacia el desarrollo de

técnicas y métodos que sean más sensibles, rápidos y que involucren un menor
consumo de solventes.

.- La extracción en fase sólida con todas sus variantes, es hoy por hoy una de
las técnicas que presenta mayor potencial, para tratamiento de muestras en
diferentes áreas, entre ellas la de alimentos.

.- Las aplicaciones reportadas por investigadores muestran una gran

versatilidad y aplicabilidad de SPE en diferentes matrices de alimentos, las cuales
permiten simplificar los procesos de análisis de analitos.

.- La forma e insumos que emplea SPE facilitan su transferencia para el

diseño de equipos automatizados, miniaturizados e inclusive robotizados. En la
bibliografía reportada se puede observar un incremento en el número de trabajos en
los cuales se acoplan directamente dispositivos de SPE en equipos de
cromatografía, lo cual reduce la manipulación de las muestras.

.- La micro extracción en fase sólida (SPME) que es una variante de SPE,

tiene un gran potencial para su aplicación, especialmente en evaluación de los
compuestos involucrados en el aroma y sabor de los alimentos.

.- Dado la gran versatilidad de la SPE y SPME, se recomienda el estudio de

su factibilidad de aplicabilidad en el desarrollo de metodologías alternativas de
análisis de alimentos para la elaboración de normas de calidad.
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