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A la memoria de mis padres
Victoria y Telésforo, que siempre
los llevo conmigo.
A Dora Amalia, por su constante

preocupación y poyo en la consecución
de mis objetivos, con cariño mi eterno
agradecimiento.
A Luis Fernando, por animarme a

seguir bregando en la vida
2
Al Dr. Gerardo Gamarra, por su asesoramiento
profesional y preocupación constante en la
culminación del presente trabajo.
A la Mg. Mirtha Roque Alcarraz, por su

brillantez profesional y amistad sincera
que me permitió culminar el presente,
mi eterna gratitud y agradecimiento.
A los señores profesores de la Facultad

de Farmacia y Bioquímica de la
UNMSM por impartirme sus
conocimientos, mi sincero
agradecimiento.
3
Mi profundo agradecimiento a los Señores miembros del Jurado
Presidenta: Dra. Elizabeth Gonzales Loayza

Miembros: Dr. Gerardo Gamarra Ballena
Dra. Amparo Zavaleta Pezantes
Mg. Mirtha Roque Alcarraz
Mg. Angel Narváez Villavicencio
4
SUMMARY
Of the 120 isolated microorganisms of floors of citric of the town of Huaral,

46 stumps were identified with hidrólisis capacity on the starch that they represent
38.33%, existing a prevalence of B. circulans, with 28.33%; B. Firmus, 23.91%;
Faenibacillus spp. 17.39%; B. coagulns, 15.22%,; B. megaterium, 8.70%; B. alvei,
4.35%; B. Lentus, 2.17%. In the fermentation driven in upset flask with broth starch
modified according to Achi, (1992) B. megaterium MFFB-UNMSM-39 reaches the
biggest amylase activity with 16.55 U/mL., at 45ºC, pH 7.5, and 150 rpm; while in
biorreactor of upset tank it registers a production of amylase with 25.38 U/mL., at
45ºC, pH 7.5, and 150 rpm; that represents an increment of 57.82% for effect of the
aereación and agitation. In the screening when evaluating the ingredients of the
substrates cassaava starch to 45ºC; pH 7.5; 75 rpm and 1.5 vvm, It meets statistical
significance with a = 0.05, for cassava starch; yeast extract; sodium of citrate and
chloride of calcium. In the stage of upward optimization, when the chloride of calcium
is increased in 0.3 g/L, the amylase production is increased in 1% and shortens the
period of latency. In the stage of final optimization has been the good values of those
factors; yucca starch (X1 = 25.41 g) and chloride of calcium (X2 = 2.87 g), these
values correspond to the summit of the surface answer described by the dear
mathematical pattern. The enzyme amylase in biorreactor upset tank with broth starch
so much of the screening, upward optimization, and final optimization, the maximum
productions of the amylase enzyme were of 27.40 U/mL; 32.84 U/mL; 33.22 U/mL
respectively, and the appearance of the amylase production was observed at the 20
hours toward final of the logarithmic phase, increased fasted at the 28 at 40 hours and
28 at 36 hours reaching the maximum production at the 60 hours in the stationary
phase for screening and upward optimization; however in the final optimization the
enzyme appears at the 16 hours toward final of the logarithmic phase, increased fasted
at the 24 at 36 hours for to reach the maximum production at the 60 hours in the
stationary phase.
Key word: Isolation of bacteria, cassava starch, amylase production
6
RESUMEN
De los 120 microorganismos aislados de suelos de cítricos de la localidad de

Huaral, se identificaron 46 cepas con capacidad de hidrólisis sobre el almidón que
representan el 38.33%, existiendo un predominio de B. circulans, con 28.33%; B.
Firmus, 23.91%; Faenibacillus spp. 17.39%; B. coagulns, 15.22%,; B. megaterium,
8.70%; B. alvei, 4.35%; B. Lentus, 2.17%. En la fermentación conducida en matraz
agitado con caldo almidón modificado según Achi, (1992) B. megaterium MFFB-
UNMSM-39 alcanza la mayor actividad de amilasa con 16.10 U/mL., a 45ºC, pH 7.5,
y 150 rpm; mientras que en biorreactor de tanque agitado registra una producción de
25.38 U/mL. a 45ºC, pH 7.5, 150 rpm, y 1.5 vvm, que representa un incremento de
9.28 U/mL. (57.63%) por efecto de la aereación y agitación. En el screening al
evaluar los ingredientes del sustratos almidón de yuca a 45ºC; pH 7.5; 75 rpm y 1.5
vvm, se encuentra significancia estadística con un α = 0.05, para almidón de yuca;
extracto de levadura; citrato de sodio y cloruro de calcio. En la etapa de optimización
ascendente, cuando los factores se incrementa en base al cloruro de calcio en 0.3 g/L,
se logra incrementar la producción de amilasa y se acorta el periodo de latencia. En la
etapa de optimización final se ha encontrado los valores óptimos de los factores;
almidón de yuca (X1 = 25.41 g) y cloruro de calcio (X2 = 2.87 g), estos valores
corresponden a la cima de la superficie respuesta descrita por el modelo matemático
estimado. La enzima amilasa en biorreactor de tanque agitado con caldo almidón
almidón de yuca tanto en la fase del screening, optimización ascendente, y
optimización final, fueron de 27.40 U/mL; 32.84 U/mL; 33.22 U/mL respectivamente,
y la aparición de la producción de amilasa se observó a las 20 horas hacia finales de la
fase logarítmica, incrementándose rápidamente de las 28 a las 40 horas y de las 28 a
las 36 horas en la fase estacionaria, alcanzando la máxima producción a las 60 horas,
para el Screening y optimización ascendente; sin embargo en la optimización final, la
enzima hace su aparición a las 16 horas hacia finales de la fase logarítmica,
incrementándose aceleradamente de las 24 a las 36 horas para alcanzar su máxima
producción a las 60 horas en la fase estacionaria.
Palabra clave: Aislamiento de bacterias, almidón de yuca, producción de amilasa
7
INTRODUCCIÓN
Las amilasas son enzimas extracelulares que hidrolizan el almidón, y que

pueden ser producidos por diferentes microorganismos, entre ellos las bacterias y
hongos. Estas enzimas tienen diferentes aplicaciones en la industria, se utilizan para
modificar las características de almidones naturales, es así, que en panadería y
molinería se usa para la reducción de la viscosidad de las pastas, aceleración del
proceso de fermentación, incremento del volumen de pan, mejoramiento de la miga y
textura, mantenimiento de frescura y suavidad, mejoramiento de la textura de las
pastas, reducción del tiempo de mezclado, incremento del volumen de masa; en
cervecería, para el proceso del malteado; cereales, alimentación con precocidos para
infantes, alimentos instantáneos; Chocolate y cocoa, para la manufactura de jarabes;
en industria alimentaría para la producción de edulcolorantes, jarabe de maíz, para la
manufactura de jarabes de alto contenido de maltosa, producción de jarabe de bajo
índice de dextrosa; bebidas destiladas; en fundición, confieren mayor solidez; en
textilería, para el proceso de engomado y desengomado; en saborizantes, como
clarificantes; en alimentos vegetales, para liquefacción de purés y sopas. En la
industria del papel; piensos y detergentes.
Actualmente en nuestro medio, no se han profundizado estudios de producción

de amilasa, utilizando bacterias silvestres y sustratos de origen agrícola con alto
contenido de almidón, este polisacárido es ideal para la inducción de las permeasas
que hidrolizan el almidón en productos como dextrinas, maltosa y glucosa, que luego
de hidrolizarlos hasta monosacáridos, son aprovechados por las bacterias para su
metabolismo, la expresión de la enzima amilasa excedente, queda en el medio
fermentado que puede ser recuperada posteriormente.
En el presente trabajo de investigación hemos realizado el aislamiento y luego

seleccionado las bacterias silvestres del Género Bacillus, procedentes de suelos de
cultivos de cítricos de la localidad de Huaral, Distrito de Huando, del Departamento
de Lima; además hemos evaluado la producción de amilasa a partir de las mismas
8
bacterias. utilizando almidón de yuca suplementado con sales mediante un proceso
fermentativo discontinuo.
Para llevar adelante el presente estudio, se evaluó la producción de amilasa de

las bacterias seleccionadas, empleando para ello un sustrato en base a almidón de yuca
suplementado con sales, y se establecieron los siguientes objetivos.
i.- Aislar e identificar bacterias del Género Bacillus por medio de caracteres
morfológicos, examen microscópico y pruebas bioquímicas.
ii.- Seleccionar y evaluar bacterias del Género Bacillus en función de la
temperatura y pH para determinar la cepa con mayor producción de amilasa.
iii.- Determinar el sustrato óptimo, para encontrar la máxima producción de
amilasa
La hipótesis planteada fue:

Es posible optimizar la producción de amilasa que se obtiene de una especie
silvestre del género Bacillus con capacidad hidrolítica sobre el almidón de
yuca mediante el manejo de los parámetros fermentativos, bajo las condiciones
de estudio.
9
II. - ANTECEDENTES Y FUNDAMENTACION CIENTÍFICA
2.1. GENERALIDADES.-
Las amilasas son enzimas que degradan el almidón y tienen numerosas
aplicaciones biotecnológicas, un ejemplo de ello es la producción de jarabes, que
contienen oligosacáridos como maltosa y glucosa, la composición precisa de los
productos finales pueden ser controlados en los procesos fermentativos (Palmer,
1975). La degradación enzimática del almidón por acción de la amilasa a escala
industrial, ha sido practicada por muchos años y ha reemplazado considerablemente
los procesos tradicionales de catálisis ácida (Barfoed, 1976. Underkofler, y col. 1965).
En USA, cerca del 75% de los jarabes y dextrosa sólida son ahora producidos por
procesos enzimáticos, es decir una nueva tecnología se ha acentuado en el área de la
degradación del almidón por efecto de las amilasas, y entre ellas se tiene ha α-
amilasa, β-amilasa, amiloglucosidasa y pulunanasa principalmente, que son
producidas por bacterias y hongos. Estas enzimas actúan sobre el almidón
hidrolizando enlaces glicosídicos α-(1,4) y/o α-(1,6). Si bien un producto comercial
está integrado por una mezcla de enzimas diferentes, los dos grupos de enzimas
amilolíticas más importantes están representados por la α-amilasa y β-amilasa.
2.2. DISTRIBUCIÓN Y MODO DE ACCIÓN DE LA α-AMILASA. -
La α-amilasa (α-1,4-D-glucan glucanohidrolasa EC 3.2.1.1, endoamilasa), esta

distribuido ampliamente en los microorganismos (B. acidocaldarius, B.
amyloliquefaciens, B. caldolyticus, B. coagulanas, B. licheniformis, B.
stearothermophilus, B. subtilis, B. subtilis var.amilosachariticus, Bacillus. sp.,
Bacillus ssp.(alkalophilico), Bacteroides amylophilus, Clostridium acetobulicum,
Lactobacillus amylophilus, Micrococcus halobtus), que hidrolizan enlaces α-1,4 –
glicosídicos de la amilosa, amilopectina y glicógeno, pero los enlaces α-1,6
glicosídicos de la cadena ramificada de los polímeros del almidón no son atacados.
Las propiedades y mecanismos de acción de las α-amilasas dependen del origen de las
enzimas, todas ellas son endo enzimas. La hidrólisis de la amilosa por α-amilasa
10
causa una conversión en glucosa, maltosa, maltotriosa y sobre todo α-dextrinas
inicialmente, seguido de una segunda reacción de la maltotriosa que es un sustrato
pobre. (Walker y Whelan. 1960). La hidrólisis de los enlaces glicosídicos α-(1,4)

entre las ramificaciones α-(1,6) de la amilopectina por la α-amilasa, también rinde
glucosa y maltosa además de una serie de α-dextrina limite (que es un núcleo grande y
muy ramificado como producto final de la acción exhaustiva de la amilasa), lo que
conduce a una licuefacción del almidón después de una rápida gelatinización, por lo
que a la α-amilasa se le conoce como enzima “licuante”; éstas dextrinas de cuatro o
mas residuos de glucosa contienen todas enlaces α-(1,6) glicosídicos de la estructura
original. Con la amilopectina o glucógeno, en la segunda etapa de la degradación del
almidón por la α-amilasa, involucra baja hidrólisis de maltotriosa, así como baja
hidrólisis de enlaces específicos cerca de los puntos de ramificación de las α-dextrina
límite. Diferentes α-amilasas producen diferentes α-dextrina límite (Whelan, 1960;
Umeki y Yamamoto 1975; Richard, 1989). Además de una sola ramificación de α-
dextrina límite, es altamente probable que algunas α-amilasas produce multiples
ramificaciones de α-dextrina limite (French 1960; Roberts y Whelan 1960). La
isomaltosa no es formado en estas reacciones porque los enlaces α-(1,6) son
resistentes a la α-amilasas y ellas les confieren alguna estabilidad a los enlaces α-(1,4)
cerca de los puntos de ramificación, la formación del complejo enzima-sustrato parece
ser restringidas por la presencia de éstos enlaces α-(1,6). (Manners y Marshall, 1971).
2.3. DISTRIBUCIÓN Y OCURRENCIA DE LA β-AMILASA. -

Otra de las enzimas importante del complejo enzimático de las amilasas es la
β-amilasa. Según Meyer, y col. (1953); Rowe y Weill, (1962). La enzima la β-amilasa
(EC 3.2.1.2, α-1,4-D-glucan maltohidrolasa, amilasa sacarogénica), esta presente
ampliamente en plantas y microorganismos tales como bacterias y levaduras, ésta
enzima actúa sobre los extremos no reductores de la amilosa, amilopectina o
glicógeno; hidrolizando enlaces glicosídicos alternantes, produciendo las formas β-
anoméricas de maltosa. La producción de las formas β-anoméricas de maltosa se da
por la inversión de la configuración alrededor de la posición del C1 de α a β, este
cambio configuracional es la razón por la que a ésta enzima se le denomina β, (Reed,
11
1975). La β-amilasa, es incapaz de pasar los enlaces α-1,6 glicosídicos de la
amilopectina y el glicógeno. La degradación de estos polímeros ramificados es sin
embargo incompleta. La acción de la β-amilasa sobre la amilopectina resulta en la

conversión de 50 – 60% de maltosa y formación de β-dextrina límite.
Puesto que la enzima hidroliza enlaces glicosídicos alternados, el producto de

esta reacción es maltosa cuando la enzima actúa en una cadena molecular lineal con
un igual número de residuos de glucosa; cuando la enzima actúa en una cadena
consistente en un desigual número de residuos, parte glucosa y maltotriosa son
también encontrados en los productos finales. La ruptura de la maltotriosa dando
productos glucosa y maltosa, sucede a una velocidad más baja que la β-amilosis
inicial, y, requiere la presencia de una alta concentración de enzima. (Reed, 1975).
2.4. LIQUEFACCION Y SACARIFICACION DE LA α-AMILASA .-

La α-amilasa liquefactante produce solo β-dextrina límite ramificada, ellos
consisten de no mas de nueve unidades de glucosa (Umeki y Yamamoto, 1977), Esta
dextrina es una mezcla de seis sencillas ramificaciones de heptosas con diferentes
puntos ramificados, pero todas ellas contienen unidades de maltosilmaltotriosa en su
estructura, ellas difieren solo en la manera de unión por los enlaces α-1,4 glicosídicos
enlazados por dos unidades de glucosa o un residuo de maltosa al núcleo de la
dextrina. La α-amilasa sacarificante, produce doble dextrina límite ramificada, todas
ellas contienen residuos de α-glucosylmaltotriosa en el extremo reductor y un residuo
de isomaltosyl en el extremo no reductor (Umeki y Yamamoto, 1975). Tanto las
amilasas liquefactantes y sacarificantes, se distinguen por su mecanismo sobre la
degradación del almidón, porque la sacarificación de la α-amilasa produce un
incremento en el poder reductor alrededor de dos veces que el de la enzima
liquefactante.
2.5. CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LA α-AMILASA

Las α-amilasas son generalmente estable a pH 5.5 – 8.0 en presencia de un
complemento de calcio, la actividad óptima de las α-amilasas normalmente ocurre
12
entre pH 4.8 a 6.5 (Maning y Campbell, 1961), pero hay diferencias en las formas de
las curvas de actividad de pH de las diferentes enzimas de amilasas y también en los
valores de pH óptimo (Tabla N° 1). Sin embargo, (Fogarty y Kelly 1979) las clasifica
según el pH a la que actúan en amilasas alcalinas y ácidas; las amilasas alcalinas
tienen un pH óptimo entre 8.0 y 10.5, que se usan en la fabricación de detergentes
principalmente; las amilasas ácidas actúan en un rango de pH de 3.5 a 5.0 cuya
existencia indica una mejora potencial en los procesos de degradación del almidón.
Según la temperatura a la que actúan, las amilasas se pueden clasificar en

amilasas termoestables y termolábiles; las enzimas termoestables son aquellas que
actúan sin perder su actividad en un rango de 60 a 110 °C y la mayoría de ellas son de
origen bacteriano (Tabla N° 1); mientras que las enzimas termolábiles, son aquellas
que actúan hasta 55 °C sin perder su actividad, generalmente varían entre los 20 y 55
°C y son de origen fúngico principalmente (Tabla N° 2), (Wiseman, 1986). La
mayoría de las enzimas purificadas pierden actividad rápidamente encima de los 50 °C
pero ésta inactivación puede ser retardada por la presencia de calcio, las α-amilasas
no cuentan con coenzimas pero ellas son calcio metalo enzimas (Fischer y Stein.
1960); las amilasas tienen por lo menos un átomo del ión calcio por molécula de
enzima. La fuerza de los enlaces de éste metal a las proteínas es dependiente de la
fuente de la enzima, además las α-amilasas requieren de éste metal para la actividad
catalítica, con la presencia de calcio son completamente resistentes a los extremos de
temperatura, pH, tratamiento con urea o exposición a proteasas como pepsina, tripsina,
subtilisina, y papaina (Stein y Fischer, 1958. Yamamoto, 1958). La α-amilasa de
Bacillus subtilis requiere por lo menos cuatro átomo-gramos de calcio por mol de
enzima (Arai y col. 1969). La α-amilasa de Aspergillus orizae necesita 10 atomo-
gramos de calcio por mol de enzima y nueve de estos parece ser que se pierden y
pueden ser removidos sin la actividad catalítica alternante. (Fujita-Ikeda y Isemura,
1960). La remoción del contenido de calcio por EDTA resulta en pérdida de actividad
que puede ser restaurado por adición de calcio (Kato, y col. (1967). Sin embargo, De
Souza y col. (2000), sostienen que la adición de calcio 10 mM, peptona 1%; extracto
de levadura 0.5% a un medio mineral acorta el periodo de latencia mejorando el
crecimiento de las células y la síntesis de α-amilasa de Bacillus sp.
13
Las α-amilasas, en su mayoría tienen pesos moleculares alrededor de 50 000
(Tabla N° 1), una α-amilasa de B. subtilis capaz de sufrir transformación de dímero a
monómero fue reportado por (Menzi y col. 1975), el dímero tuvo un peso molecular
de 100 000 y tratado con agentes quelantes se produjo la forma monomérica. La
dimerización bajo la influencia de zinc parece ser peculiar para la enzima α-amilasa
de B. subtilis, los pesos moleculares del monómero y dímero de la α-amilasa de B.
subtilis han sido determinados por diferentes trabajos existiendo resultados
discordantes, dilucidándose esta controversia con el trabajo de (Detera y Friedberg,
1979), tratando a la α-amilasa de B. subtilis con bromuro de cianuro y estableciéndose
una peso molecular de 48 000 para toda la enzima; mientras que para los dímeros se
estableció un peso molecular de 24 000 según (Connellan y Shaw 1970; Michell y
col. 1973).
2.6. EL ALMIDÓN COMO SUBSTRATO.-

El almidón es un polisacárido de reserva de los vegetales que esta distribuido
tanto en las raíces, tallos y hojas, se encuentran más abundantemente en las semillas
de los cereales y en los tubérculos como las patatas, camote, yuca, etc. (Tabla N° 3),
(Laguna y Peña,. 1979). Los almidones están presentes en los tejidos vegetales en
forma de gránulos intracelulares compactos. La estructura granular de los almidones
puede ser explicado en términos de la fuerza de atracción entre las largas moléculas de
carbohidratos. Dentro de los gránulos se dispone radialmente en capas concéntricas,
una mezclad de moléculas lineales y ramificadas y cuando hay asociaciones paralelas
entre éstas, se mantienen juntas por puentes de hidrógeno de lo que resultan regiones
cristalinas o micelas, lo cual causa que el gránulo sea birrefringente; y evita su
disolución en el agua fría por la formación de una malla molecular que mantiene
juntos los gránulos. Estas fuerzas asociadas entre las moléculas pueden ser vencidas si
se aplica una energía suficiente. (Custer, 1970).
Los gránulos de almidón suelen hincharse progresivamente y los polímeros

más cortos se disuelven cuando se calientan en agua a 60 °C aproximadamente y a
temperaturas más altas los gránulos se gelatinizan y pierden su poder de
birrefringencia, se desintegra y forma una pasta según el origen y la concentración del
14
almidón (Morgan, 1940; Muller, 1942). El rompimiento de la estructura del almidón
por calentamiento en agua se asume en tres etapas. En la primera, se produce una
absorción del agua en forma lenta y reversible a la vez que se produce un ligero
hinchamiento de los gránulos, la viscosidad de la suspensión no aumenta notoriamente
y el gránulo retiene su apariencia y birrefringencia. La segunda etapa, se basa en el
hinchamiento notorio del gránulo incrementándose rápidamente la viscosidad de la
suspensión, los gránulos se alteran, varían en su aspecto interno y pierden su
estructura y birrefringencia. Durante la tercera etapa de hinchamiento, los gránulos se
transforman en sacos deformados (Kerr, 1950).
La insolubilización espontánea del almidón en soluciones acuosas es

denominada retrogradación; esta característica es atribuible a las tendencias de los
polímeros del almidón a enlazar hidrógenos. La fracción de amilosa se retrograda
rápidamente debido a su habilidad para formar enlaces de hidrógeno intermoleculares;
las fracciones ramificadas muestran mucho menos tendencia a formar enlaces de
hidrógeno y retrogradar. Esta reacción es importante en el almacenamiento de los
geles de almidón y en el tiempo de vida de los alimentos cocidos en horno (Reed,
1975). Frecuentemente cuando una solución de almidón esta muy concentrada, se
observa la formación de un gel a manera de un precipitado, este mismo fenómeno se
presenta cuando se enfrían rápidamente o dejan en reposo las soluciones menos
concentradas, denominándose a éste fenómeno como “retrogradación”.
El almidón en su forma nativa se encuentra formado por dos constituyentes la

α-amilosa y la amilopectina. La α-amilosa está constituida por cadenas largas no
ramificadas de D-glucosa que se hallan unidas mediante enlaces α-(1,4), las cadenas
son polidispersas y varían en peso molecular, no es verdaderamente soluble en el
agua pero forma micelas hidratadas, que le confieren un enrollamiento helicoidal. La
amilopectina está muy ramificada, la longitud media de las ramificaciones es de 24 a
30 residuos de glucosa que varían según la especie. Los enlaces glicosídicos son α-
(1,4), pero en los puntos de ramificación son enlaces α-(1,6). La amilopectina produce
disoluciones coloidales o micelas que dan una coloración rojo violácea con el yodo su
peso molecular puede llegar hasta 100 millones. Lehninger, (1985).
15
TABLA N° 1
PROPIEDADES DE ALGUNAS α-AMILASA BACTERIANAS
PH TEMPERATURA PES0
MICROORGANISMO MOLECULAR (Kd)
OPTIMO OPTIMA (°C)
B. acidocaldaricus 3.5 75 6.8X104

B. amiloliquefaciens 5.9 65 4.9X104
B. caldaricus 5.4 70 -.-
B. coagulans 7.5-8.5 85 -.-
B. licheniformis 5.0-8.0 76 2.25X10 4
9.5 91 -.-
6.-7.0 85 2.35X10 4
B. stearothermophilus 7.0-9.0 70-90 6.26X10 4
5.4-6.1 70 5.3X104
4.5-6.5 65-73 4.810 4
B. sp. NRRI. B3881 9.2 50 -.-
B. sp 5.0-6.0 70 -.-
B. subtilis 5.3-6.4 50 4.7X104 -1X104
B. subtilis NRRI.B3411 5.8 63 -.-
6.0 60 4.810 4
Thermophilo V-2 6.0-7.0 70 5X104
Acinetobacter sp 1 7.0 50-55 5.5X104
11 7.0 50-55 6.5X104
Bacteroides amilophilus 6.3 4.3 9.2X104
Micrococcus halophilus 6.0-7.0 50-55 8.9X104
Streptomyces hygroscopicus 5.0-6.0 50-55 4.8X104
Streptomyces aucorfaciens 4.6-5.3 40 4X104
Streptomyces praccox 6.0-7.0 40 -.-
Thermoactinomyces vulgans 5.0 70 -.-
Thermoactinomyces curvata 5.5-6.0 65 6.2X104
Thermomonospora viridis 6.5 55 -.-
Fuente: Fogarty, (1973). Microbial amylases
16
TABLA N° 2
PROPIEDADES DE ALGUNAS α-AMILASA FUNGICAS
MICROORGANISMO PH TEMPERATURA PES0

OPTIMO OPTIMA (°C) MOLECULAR (Kd)
Aspergillus niger 5.0-.6.0 60 -.-

Aspergillus orizae 5.5-5.9 40 5.26X10 4
Mucor pusillos 3.5-4.0 65-70 5.1X10 4 - 4.8X104
Paccilomyces subglobosum 4.0 38 -.-
Lipomyces starkeyi 3.0-4.0 50-60 -.-
Sacharomyces castellii 6.0 60 4X104
Torulopsis ingeniosa 5.5 50 -.-
Endomicopsis fibuliger 5.5 45 -.-
Fuente: Fogarty, (1973). Microbial amylases
TABLA N° 3
COMPOSICIÓN BROMATOLÓGICA DE PRODUCTOS VEGETALES
PRODUCTO ALMID PROT. LÍPIDOS FIBRA CENIZA AGUA
g% en E.S.
Patatas 84 8 0.5 3.0 4.0 78
Tapioca 95 1 0.5 3.0 1.5 12
Trigo 75 12 3.0 3.0 2.0 12
Arroz 75 8 3.0 3.0 2.0 12
Sorgo 75 12 3.0 3.0 2.0 12
Maíz 75 12 3.0 3.0 2.0 12
g% en extracto seco
Gilbolt, (1968), Structure de L’almidon dans “Progres en chimie agricole et
Alimentare.
17
TABLA N° 4
COMPOSICIÓN DE AMILOSA Y AMILOPECTINA EN ALMIDONES

NATURALES
PRODUCTO AMILOSA (%) AMILOPECTINA(%)
Patatas 23 77
Tapioca 20 80
Trigo 20 80
Arroz 15 – 35 63 – 85
Sorgo 25 75
Maíz 25 75
Gilbolt, (1968), Structure de L’almidon dans “Progres en chimie agricole et

Alimentare.
TABLA N° 5
COMPOSICIÓN BROMATOLÓGICA DE ALMIDÓN DE YUCA
VARIABLES MEDIA % DESVIACION CV (%)
% DE BASE SECA
Almidón 83.08 0.354 0.43
Fibra 11.78 0.359 3.05
Azucares totales 1.10 0.017 1.57
Cenizas 1.31 0.015 1.16
Proteínas 1.59 0.060 3.77
Lípidos 0.47 0.040 8.54
CEREDA, (1996). Caracterizaçião, usos e tratamentos de residuos da

industrialização da mandioca. Botucatu: Centro de Raízes Tropicais.
18
2.6. ANTECEDENTES.-
Kwan, H.S. y col. (1993). Determinaron la producción de β-amilasa por
Bacillus circulans aisladas de suelos de Hong-Hong, en la fermentación emplearon
como sustrato almidón soluble, fosfato de amonio, extracto de levadura, citrato de
sodio, sulfato de magnesio y cloruro de calcio, a pH 7.0 y una temperatura de 45 °C
obteniéndose una máxima actividad específica de β-amilasa de 32,2 U/mg. de proteína
después de 36 horas. Los iones calcio 0.5 mM, Bario 1mM y Mn 1mM, estimulan la
producción de β-amilasa de B. Circulans S31.
Achi, O.K, y col. (1992). Reportan el estudio de producción de amilasa por

Bacillus alvei, encontrando una alta actividad de amilasa de 868 U/mL utilizando
almidón de yuca en un medio basal compuesto por fosfato de potasio, sulfato de
magnesio, tryptona, cloruro de calcio, extracto de levadura, citrato de sodio y harina
de soya a pH 6.8 y temperatura de 40 °C, en que demuestran que la fuente de
nitrógeno de origen orgánico como el extracto de levadura, harina de soya, incrementa
el crecimiento celular, mientras que los de origen inorgánico (sulfato de amonio,
cloruro de amonio) decrecen el crecimiento de las células, mientras que la adición de
0.1 % de citrato de sodio en el medio basal estimula la síntesis de amilasa, esto puede
ser por que el calcio es esencial para la producción de amilasa o su estabilización en el
que el citrato ayuda a mantener el calcio en solución.
Mai, N.T.,y col. (1992). Evaluaron 25 bacterias termófilas productoras de

amilasa, asiladas de suelos Vietnamitas, de las cuales se identificaron a Bacillus
stearothermofilos UQM 2104 y Bacillus licheniformis UQM378 T2 y T5, ambas
productoras de amilasa, la actividad encontrada fue de 19, 11, 15 y 13 U/mL
respectivamente, en que usaron almidón de yuca como fuente de carbono en un medio
basal compuesto por extracto de carne, extracto de levadura, fosfato de potasio, sulfato
de amonio, sulfato de magnesio y cloruro de sodio a pH 7.4 y temperatura de 55 °C., y
la mejor fuente de nitrógeno encontrada en la fermentac ión fue extracto de levadura,
seguido de sulfato de amonio.
Rani, y col. (1994). Reportan el estudio de producción de β-amilasa de
Bacillus megaterium y posterior sacarificación de almidón crudo y gelatinizado sobre
19
diferentes sustratos agrícolas. Para la producción de β-amilasa se ha empleado un
medio basal conteniendo peptona, sulfato de amonio, cloruro de potasio, sulfato de
magnesio y como fuente de carbono almidón de yuca, encontrando una actividad de
14 U/mL.
Goyal, y Sidhu, (1995). Reportan la producción y estabilidad de una α-

amilasa termoestable a 70°C de Bacillus sp Mk 716, encontrando una actividad de
4800 U/ml. empleando un medio de crecimiento M9 propuesto por Maniatis y col.
(1989).
Okolo, y col. (1993). Realizaron estudios sobre el rendimiento de la actividad

de amilasa de Thermoactinomyces thalpophilus F13 sobre diferentes sustratos
agrícolas (arroz, yuca, cebada, coco, sorgo, papa y gelatinizado de papa, encontrando
una de las mayores actividades de la enzima amilasa con 15.7 U/mL. para almidón de
yuca en un medio base compuesto por sales.
Niziolek, (1997). Investigó la producción extracelular de beta-amilasa de

Bacillus cereus, Bacillus megaterium y Bacillus polymyxa NCIB 8524, y los máximos
rendimientos de la enzima fueron 3.6; 9.3 y 20.4 U/mL respectivamente. En la
producción de ésta enzima se empleó un medio semi sintético conteniendo sales
inorgánicas, almidón de papa y extracto de soya en vez de peptona y extracto de
carne.
20
III. MATERIALES Y METODOS
3.1.- COLECCIÓN DE LA MUESTRA.-
De la localidad de Huaral, Distrito de Huando del Departamento de Lima, se

colectó 120 muestras representativas de suelos de naranjales de aproximadamente
1,500 g. de suelo de la capa subyacente, entre los 5 y 20 cm. de profundidad, las
muestras se guardaron en bolsas de polietileno previamente rotuladas y llevadas al
laboratorio para su procesamiento.
3.2.- AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE CEPAS PRODUCTORAS DE

AMILASA. -
Para el aislamiento y selección de microorganismos productores de amilasa, se
empleó los métodos microbiológicos según Seeley y Vandemark (1973); que
involucran propagación en medio de aislamiento (MA) según Kwan, (1993) y
sembrado por puntura en agar almidón modificado (AAM) según Achi, (1992),
posteriormente fueron incubadas a temper atura de 37°C. Para encontrar las cepas con
capacidad hidrolítica sobre el almidón, se empleó una solución de yodo de Gram. La
presencia de la enzima amilasa se determinó por difusión radial en medio sólido,
según Neto, y col. (1987); y Ceska, (1971).
3.3. IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS.-

La identificación de las bacterias seleccionadas productoras de amilasa, se
realizó tomando en cuenta los caracteres biológicos, características culturales y
morfológicas, además se realizó la diferenciación bioquímica respectiva de acuerdo a
lo establecido en el Manual de Berge’s of Determinative Bacteriology (1974) y Mac
Faddin (1984), que incluye; reacción de coloración Gram, motilidad, reducción de
nitrito, O-F glucosa, indol, licuefacción de la gelatina, citrato de Simmons, Voges-
Proskauer, ureasa, fenilalanina desaminasa, glucosa, manitol, arabinosa, xilosa,
cloruro de sodio, hidrólisis de almidón. Cabe destacar, que previa a la identificación
bioquímica, se le asignó a cada sepa, un código interno con las siguientes siglas
“MFFB-UNMSM-# que se mantiene en el presente estudio.
21
3.4.- EVALUACIÓN DE BACILLUS PRODUCTORES DE AMILASA. -
En la evaluación de las cepas de Bacillus productores de amilasa, se empleó
agar almidón modificado a pH, 5, 7 y 8; sembrando el cultivo puro por puntura y
luego las placas fueron incubadas a temperaturas de 37°C, 45°C y 55°C por un
periodo de 72 horas. Para determinar las cepas con mayor capacidad hidrolítica sobre
el almidón, se empleó una solución de yodo de Gram; demostrándose la presencia de
la enzima amilasa por una zona clara, que define el diámetro de halo producido en el
agar.
3.5.- INÓCULO.-
La preparación de los inóculos (número de células viables) de los Bacillus
seleccionados con mayor diámetro de halo, se llevaron a cabo de un cultivo de 24
horas crecido sobre agar tripticasa soya; para luego estandarizarlas a una
8
concentración celular de 10 ufc/ml, en un espectrofotómetro SPECTRONIC 20, a una
longitud 630 ηm. con una absorbancia de 0.96. Para determinar el inóculo óptimo,
primero se realizaron ensayos iniciales transfiriendo volúmenes de; 1%; 3%; 6%; 9%;
12% y 15% (v/v) a matraces de 250 ml. poniendo 100 mL de caldo almidón
modificado, luego los matraces fueron incubados a 45°C por un periodo de 48 horas,
con agitación constante de 150 rpm. El porcentaje de inóculo óptimo se determinó
relacionando la mayor producción de amilasa encontrada en los ensayos.
3.6.- EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA. -

La evaluación de la actividad enzimática en los experimentos se realizó por el
método propuesto por Smith y Roe (1949), donde una unidad de actividad fue definida
como el total de enzima presente en el sobrenadante que es capaz de hidrolizar 10 mg
de almidón en 30 minutos a 37°C. Esta evaluación en una primera fase se llevó a cabo
en matraz agitado con caldo almidón modificado según Achi (1992) a pH 7.5,
temperatura de 45°C y agitación constante de 150 rpm por un periodo de 48 horas. Y
en la segunda fase se realizó en biorreactor de tanque agitado con caldo almidón de
yuca a pH 7.5, temperatura de 45°C, agitación constante de 75 rpm y volumen de aire
1.5 vvm por un periodo de 60 horas.
22
3.7.- OPTIMIZACIÓN DE LOS PARÁMETROS VELOCIDAD DE AGITACIÓN
Y VOLUMEN DE AIRE EN LA FERMENTACIÓN
El establecimiento de los parámetros velocidad de agitación y volumen de aire,
para la fermentación de Bacillus megaterium MFFB-UNMSM-39 se efectuó por
ensayos repetitivos mediante un diseño factorial a dos niveles (N = 2k ) en caldo
almidón modificado (medio control) a una temperatura óptima de crecimiento de 45°C
y pH 7.5.
3.8.- OPTIMIZACIÓN DEL SUSTRATO EXPERIMENTAL.-

La optimización del caldo almidón de yuca (medio experimental) se realizó en
tres etapas (screening; optimización ascendente; y optimización final), empleando
almidón de yuca como la principal fuente de carbono; extracto de levadura y sulfato
de amonio como fuentes de nitrógeno; y sales (citrato de sodio, cloruro de calcio,
fosfato de potasio, sulfato de hierro). El screening se realizó siguiendo un diseño
estadístico según Plackett y Burman (1946), el cual nos permitió evaluar los factores
del caldo almidón de yuca. La optimización ascendente se efectuó empleando el
método de pendiente ascendente, según Carpenter y Sweeny (1965); mientras que la
etapa de optimización final, se realizó por el diseño rotable hexagonal según Box y
Wilson (1951).
3.9.- CINÉTICA. -
La evaluación de la cinética de crecimiento de las bacterias y la producción de
amilasa se llevó a cabo por medio de cultivos bach discontinuos, en matraces agitados
y empleando un biorreactor de vidrio construido en el Instituto de Microbiología
“SIMON PEREZ ALVA” de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la UNMSM;
utilizando para este cometido dos tipos de sustratos; a) caldo almidón modificado
(medio control), y, b) caldo almidón de yuca (medio experimental) formulado con
ocho factores y a dos niveles (ver cuadro Nº 12), bajo la influencia de los parámetros
fermentativos (temperatura, pH, agitación y volumen de aire). Para evaluar la
biomasa se recurrió al método de recuento en placa según Seeley y Vandemark;
(1973). La actividad enzimática de amilasa por el método Smith y Roe (1949); y, la
proteína por el método de Lowry.
23
3.10.- ANÁLISIS ESTADÍSTICO. -
Para efectos de análisis y comparación de las pruebas experimentales, el
desarrollo de la presente investigación se diseñó en tres etapas: a) Screening; b)
Optimización ascendente; y c) Optimización final. Para la etapa del screening, se
empleó un diseño según Plackett y Burman (1946) evaluándose ocho factores con dos
niveles que corresponden a la formulación del caldo almidón de yuca (ver cuadro Nº
12); el análisis de varianza, nos permitió evaluar la significancia de los efectos
determinantes sobre el crecimiento de las células, que influyen en la producción de la
enzima amilasa, bajo los parámetros controlados de la fermentación. Para la etapa de
optimización ascendente, se empleó el método de pendiente ascendente, según
Carpenter y Sweeny (1965); por medio del cual se determinó la máxima pendiente de
asenso de los factores significativos y las respuestas respectivas. La etapa de
optimización final, se realizó empleando el diseño rotable hexagonal según Box y
Wilson (1951), que nos permitió encontrar el modelo matemático de segundo orden,
para determinar los valores óptimos de los factores más significativos.
24
IV. RESULTADOS
4.1.- AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE CEPAS PRODUCTORAS DE

AMILASA. -
La tabla N° 6, muestra las cepas productoras de amilasa aisladas en el medio
de aislamiento según Kwan, (1993). Estas 46 cepas representan el 38.33% de las 120
cepas aisladas inicialmente. De las 46 cepas, 6 llegaron a ser productoras de amilasa
con mayor diámetro de halo (mm) 32, 25; 23; 21; 20 y 18 para la cepa MFFB-
UNMSM-39; MFFB-UNMSM-0828; MFFB-UNMSM-47; MFFB-UNMSM-05;
MFFB-UNMSM-10; y, MFFB-UNMSM-78, respectivamente.
4.2.- IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS.-

Las tablas 7, 8 y 9, muestran las características bioquímicas diferenciales,
caracterización final y frecuencia de cepas del Género Bacillus aisladas de suelos de
cítricos, que se realizó de acuerdo a lo establecido en el Manual de Bergey’s of
Determinative Bacteriology (1974) y Mac Faddin (1984). Del que se obtuvo el
número de cepas y sus respectivos porcentajes según especie, Bacillus circulans 13
(28.26%); Bacillus firmus 11 (23.91%); Faenibacillus sp. 8 (7.39%); Bacillus
coagulnas 7 (15.22%); Bacillus megaterium 4 (8.70%); Bacillus alvei 2 (4.35%);
Bacillus lentus 1 (2.17%); respectivamente.
4.3.- EVALUACIÓN DE BACILLUS PRODUCTORES DE AMILASA. -

La tabla N° 10, muestra la evaluación de las 46 cepas de Bacillus productores
de amilasa, empleando agar almidón modificado según Achi, (1992); formulado a tres
pH (5.0, 7.0, 8.0) incubándolos a tres temperaturas de 37°C, 45°C y 55°C
respectivamente, por un periodo de 72 horas; en el que se observa una mayor
capacidad hidrolítica sobre el almidón representado por la zona clara en el agar que
define el diámetro de halo a la temperatura de 45°C y pH 7.0, mientras que ha 37 °C
y 55°C, a pH 7.0, se observa una menor capacidad de hidrólisis de almidón. De esta
población 6 cepas tienen los mayores tamaños de halo (mm) 33, 28, 26, 24, 23, y 21
para Bacillus megaterium MFFB-UNMSM-39; Faenibacillus spp MFFB-UNMSM-
25
08; Faenibacillus spp MFFB-UNMSM-47; Bacillus coagulans MFFB-UNMSM-05;
Bacillus circulans MFFB-UNMSM-10; y, Faenibacillus spp MFFB-UNMSM-78,
respectivamente. Determinándose en éste proceso una temperatura óptima en 45°C
El cuadro N° 1 nuestra la producción de amilasa de 6 cepas de Bacillus

seleccionados con mayor capacidad hidrolítica sobre el almidón, a pH 6.0, 6.5, 7.0,
7.5, 8.0, llevado a cabo en matraces de 1 L. de capacidad con 0.5 L. de caldo almidón
modificado según Achi, (1992), a una temperatura de 45°C, con agitación constante de
150 rpm. e inóculo 3% (v/v) respectivamente. Encontrándose las mayores actividades
de la enzima amilasa a pH 7.5, para Bacillus megaterium MFFB-UNMSM-39 con
16.10 U/mL.; seguido de Faenibacilluss sp MFFB-UNMSM-08 con 14.19 U/mL.;
Faenibacillus MFFB-UNMSM-47 con 11.73 U/mL.; B. coagulans MFFB-UNMM-05
con 10.14 U/mL.; B. circulans MFFB-UNMM-10 con 9.32 U/mL.; Faenibacillus sp.
MFFB-UNMM-78 con 8.51 U/mL.; bajo las condiciones de estudio. De estos
resultados, se obtuvieron una temperatura óptima de 45°C y un pH de 7.5 e inóculo de
3% (v/v).
En el cuadro N° 2 y en los gráficos N° 3 y N° 4, se muestran la cinética de

crecimiento, y la actividad de amilasa de Bacillus megaterium MFFBB-UNMSM-39
producida en matraz agitado de 1 L. de capacidad con 0.5 L. caldo almidón
modificado según Achi, (1992) a una temperatura de 45°C, pH 7.5 y agitación
constante de 150 rpm., inóculo de 3% (v/v), obteniéndose la más alta actividad de
amilasa de 16.10 U/mL. a las 56 horas de crecimiento, con una µm = 0.39 h-1 y un tg
= 1.79 h.
26
TABLA N° 6
SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS AISLADOS DE SUELOS DE CITRICOS

CON CAPACIDAD DE HIDRÓLISIS SOBRE EL ALMIDON
HIDRÓLISIS DIAMETRO
N° CODIGO DE LAS CEPAS DE DE HALO
ALMIDON (mm)
1 MFFB-UNMSM-03 + 12
9 MFFB-UNMSM-16 + 8
27
TABLA N° 7
CARACTERISTICAS BIOQUMICAS DIFERENCIALES DE MICROORGANISMOS

AISLADOS DE SUELOS DE CITRICOS CON CAPACIDAD DE HIDRÓLISIS
SOBRE EL ALMIDON
ION
ALMD
TIO
DESAM.
R
TIR
N
PROSKAUE
GLUCOSA
GO
DE
DEL
.5%
SA
INA
D
CODI
ARABINO
FENILALAN
GLUCOSA
ClNa 7
MOTILIDA
GRAM
UREASA
IOL
IA
IRATO
XILOSA
VOGES
IS
GELATN
IRÓLSI
MANT
REDUC.
IDOL
O/F
CT
HD
N
N
°
1 MFFB-UNMSM-03 + + + F + + - + - - + - - - + +
2 MFFB-UNMSM-04 + + + F + + - + - - + - - - + +
3 MFFB-UNMSM-05 + + + F - - - - - - + + - + + +
4 MFFB-UNMSM-06 + - - F - + - + - - + - - - + +
5 MFFB-UNMSM-08 + - - F + - + + - - + + + + + +
6 MFFB-UNMSM-10 + + + F/O - + - - - - + - - - + +
7 MFFB-UNMSM-11 + + + O - + + - - + + + + + + +
8 MFFB-UNMSM-12 + + + F/O - + - - - - + - - - + +
9 MFFB-UNMSM-16 + + + O - + - - - + + + + + + +
10 MFFB-UNMSM-17 + - - F + - + - - - + + + - + +
11 MFFB-UNMSM-18 + + + F - - - - - - + + - + + +
12 MFFB-UNMSM-19 + + + F - - - - - - + + - + + +
13 MFFB-UNMSM-20 + + + F - - - - - - + + - + + +
14 MFFB-UNMSM-21 + + + O - + + - - + + + + + + +
15 MFFB-UNMSM-22 + + + F/O - + - - - - + - - - + +
16 MFFB-UNMSM-24 + + - O - - - - + - + - - - - +
17 MFFB-UNMSM-29 + + + F - - - - - - + + - + + +
18 MFFB-UNMSM-32 + + + O - + - - - + + + + + + +
19 MFFB-UNMSM-37 + + + O - + - - - + + + + + + +
20 MFFB-UNMSM-39 + + + F - + - - - - A - - - + +
21 MFFB-UNMSM-43 + - - F + + + + - - + + + + + +
22 MFFB-UNMSM-44 + + + F - - - - - - + + - + + +
23 MFFB-UNMSM-45 + + + O - + - - - + + + + + + +
24 MFFB-UNMSM-46 + + + F/O - + - - - - + - - - + +
25 MFFB-UNMSM-47 + - - F + + + + + - + + + + + +
26 MFFB-UNMSM-48 + + + F - + - - - - A - - - + +
27 MFFB-UNMSM-51 + + + F/O - + - - - - + - - - + +
28 MFFB-UNMSM-52 + + + F/O - + - - - - + - - - + +
29 MFFB-UNMSM-55 + + + O - + - - - + + + + + + +
30 MFFB-UNMSM-56 + + + O - + - - - + + + + + + +
31 MFFB-UNMSM-59 + + - F/O + + + - - - + + + + + +
32 MFFB-UNMSM-60 + + + O - + - - - + + + + + + +
33 MFFB-UNMSM-62 + + + F/O - + - - - - + - - - + +
34 MFFB-UNMSM-63 + + + O - + - - - + + + + + + +
35 MFFB-UNMSM-64 + + + F/O - + - - - - + - - - + +
36 MFFB-UNMSM-65 + + + F/O - + - - - - + - - - + +
37 MFFB-UNMSM-67 + + + F/O - + - - - - + - - - + +
38 MFFB-UNMSM-68 + + + F/O - + - - - - + - - - + +
39 MFFB-UNMSM-70 + + + O - + - - - + + + + + + +
40 MFFB-UNMSM-71 + + + F/O - + - - - - + - - - + +
41 MFFB-UNMSM-72 + + + F/O - + - - - - + - - - + +
42 MFFB-UNMSM-74 + + + F/O - + - - - - + - - - + +
43 MFFB-UNMSM-75 + + + O - + - - - + + + + + + +
44 MFFB-UNMSM-76 + + + O - + - - - + + + + + + +
45 MFFB-UNMSM-77 + - + F + + + - - - + + + + + +
46 MFFB-UNMSM-78 + + - F/O + + + - - - + + + + + +
28
TABLA N° 8
IDENTIFICACION DE LOS MICROORGANISMOS AISLADOS DE SUELOS

CITRICOS CON CAPACIDAD DE HIDRÓLISIS DEL ALMIDON
N° CODIGO IDENTIFICACION
1 MFFB-UNMSM-03 Bacillus alvei
2 MFFB-UNMSM-04 Bacillus alvei
3 MFFB-UNMSM-05 Bacillus coagulans
4 MFFB-UNMSM-06 Faenibacillus sp
6 MFFB-UNMSM-10 Bacillus circulans
7 MFFB-UNMSM-11 Bacillus megaterium
9 MFFB-UNMSM-16 Bacillus firmus
16 MFFB-UNMSM-24 Bacillus lentus
29
TABLA N° 9
NUMERO Y PORCENTAJE DE DIFERENTES ESPECIES DE BACILLUS

AISLADOS DE SUELOS DE CITRICOS
BACILLUS NUMERO PORCENTAJE
Bacillus alvei 2 4,35
Bacillus coagulans 7 15,22
Faenibacillus sp 8 17,39
Bacillus circulans 13 28,26
Bacillus megaterium 4 8,70
Bacillus firmus 11 23,91
Bacillus lentus 1 2,17
46 100,00
30
GRAFICO N° 1
NUMERO Y PORCENTAJE DE DIFERENTES ESPECIES DE BACILLUS

AISLADOS DE SUELOS DE CITRICOS
30 28,26
25 23,91
20
Porcentaje %
17,39
15,22
15
10 8,70
4,35
5
2,17
0
s
ns
tus
ei
us
ium
sp
lan
alv
ula
firm
len
us
ter
cu
B.
ag
cill
ga
cir
B.
B.
co
iba
me
B.
B.
en
B.
Fa
31
TABLA N° 10
BACILOS PRODUCTORES DE AMILASA SEGÚN DIAMETRO DE HALO

TEMPERATURA Y pH, EN AGAR ALMIDON MODIFICADO
DIAMETRO DE HALO EN (mm)

TEMPERATURA
N° CODIGO MICROORGANISMO 37°C 45°C 55°C
pH pH pH
5 7 8 5 7 8 5 7 8
1 MFFB-UNMSM-03 Bacillus alvei 5 8 8 5 15 14 6 11 8
2 MFFB-UNMSM-04 Bacillus alvei 5 11 9 6 13 15 2 9 6
3 MFFB-UNMSM-05 Bacillus coagulans 15 21 19 16 24 18 13 20 17
4 MFFB-UNMSM-06 Faenibacillus sp 12 18 16 15 20 20 9 16 13
6 MFFB-UNMSM-10 Bacillus circulans 15 21 19 14 23 20 12 19 16
7 MFFB-UNMSM-11 Bacillus megaterium 5 11 9 5 13 14 2 9 6
9 MFFB-UNMSM-16 Bacillus firmus 3 9 7 5 11 10 0 7 4
16 MFFB-UNMSM-24 Bacillus lentus 5 11 9 5 13 11 2 9 6
32
CUADRO N° 1
PRODUCCION DE AMILASA DE BACILOS A DIFERENTES pHs EN CALDO

ALMIDON MODIFICADO A 45°C Y 150 rpm
ACTIVIDAD DE AMILASA (640 nm) U/mL.

N° MICROORGANISMO TEMPERATURA
pH 45°C
6,0 6,5 7,0 7,5 8,0
1 Bacillus megaterium MFFB-UNMSM-39 8,51 10,54 12,57 16,10 13,25
2 Faenibacillus spp MFFB-UNMSM-08 9,14 12,16 13,78 14,19 11,69
4 Bacillus coagulans MFFB-UNMSM-05 5,67 7,70 9,73 10,14 8,92
5 Bacillus circulans MFFB-UNMSM-10 4,86 6,89 8,92 9,32 10,54
33
CUADRO N° 2
CINETICA DE CRECIMIENTO DE Bacillus megaterium MFFB-UNMSM-39

EN MATRAZ CON CALDO ALMIDON MODIFICADO A 45°C, pH 7.5, 150 rpm
TIEMPO NUMERO DE Log N° DE ACTIVIDAD PROTEINA

(Horas) CELULAS (cél/mL) AMILASA TOTAL
(ufc/mL) (U/mL) (mg/mL)
0 32X106 7,51 0,00 0,00
4 38X106 7,58 0,00 0,00
8 62X106 7,62 0,00 0,00
12 82X106 7,83 0,00 0,00
16 33X107 8,18 0,00 0,00
20 71X108 9,79 0,00 0,00
24 75X109 11,27 0,68 0,15
28 42X1010 11,91 1,93 0,43
32 57X1010 11,99 3,59 0,80
36 59X1010 12,06 14,01 3,13
40 63X1010 12,10 15,21 3,40
44 66X1010 12,14 15,62 3,49
48 66X1010 12,16 15,75 3,52
52 66X1010 12,18 15,96 3,57
56 66X1010 12,23 16,10 3,60
60 75X1010 12,26 16,10 3,60
µm = 0,39 h-1
tg = 1,79 h
Ya = 16,10 U/mL
34
GRAFICO N° 2
CINETICA DE CRECIMIENTO DE Bacillus megaterium MFFB-UNMSM-39 EN

MATRAZ CON CALDO ALMIDON MODIFICADO A 45°C, pH 7.5, y 150 rpm
14
12
Log N° de Células
10
8
N° Células
6
0
0 4 8 12 20 28 36 44 52 60
Tiempo (h)
GRAFICO N° 3
ACTIVIDAD DE AMILASA DE Bacillus megaterium MFFB-UNMSM-39 EN

MATRAZ CON CALDO ALMIDON MODIFICADO A 45°C, pH 7.5 y 150 rpm
18
16
Act. Amilasa (U/mL)
14
12
10
Amilasa
8
6
4
2
0
4 8 12 20 28 36 44 52 60
Tiempo
35
4.4.- OPTIMIZACIÓN DE LOS PARÁMETROS TEMPERATURA Y
AEREACIÓN.-
En los cuadros N° 3 al 11 y Gráfico N° 4, se exhiben los resultados de la
optimización de los parámetros iniciales de la fermentación como son aereación y
velocidad de agitación para Bacillus megaterium MFFB-UNMSM-39, en biorreactor
de vidrio construido en el Instituto de Microbiologia “SIMON PEREZ ALVA” de la
Facultad de Farmacia y Bioquímica de la UNMSM; los cuales se efectuaron por
ensayos repetitivos mediante un diseño factorial de dos factores tomados a dos niveles
(2 X 2) en caldo almidón modificado según Achi, (1992) a 45°C, pH 7.5, Inóculo 3%
(v/v). En el cuadro Nº 5 se presenta los factores significativos, es así, que cuando la
aereación y velocidad de agitación cambian de 0.5 a 2 vvm y 50 a 100 rpm, las
actividades de amilasa aumentan en 8.26 U/mL. y 5.88 U/mL.. En el cuadro Nº 6 se
exhibe el análisis de varianza, donde se encuentra significancia estadística para los
factores aereación y velocidad de agitación con un á = 0.05 y con 1 y 8 GL.. En el
gráfico Nº 4 se aprecia la representación gráfica del modelo matemático lineal, la
figura es una plano en el espacio con pendiente positiva, donde las mejores respuestas
en actividad de amilasa (U/mL) se dan, cuando la velocidad de agitación y la
aereación son altas de acuerdo a los valores de diseño. deduciéndose de estos
resultados una velocidad de agitación óptima 75 rpm con un volumen de aire en una
relación de 1.5 vvm, respectivamente bajo las condiciones de estudio.
En el cuadro N° 11, y en los gráficos N° 5 y 6, se presenta la cinética de

crecimiento de Bacillus megaterium MFFBB-UNMSM-39 realizado en biorreactor de
tanque agitado con 0.5 L. de caldo almidón modificado según Achi, (1992) a
temperatura de 45°C; pH 7.5; agitación constante de 75 rpm; 1.5 vvm., e inóculo de
3% (v/v), obteniéndose una actividad de amilasa de 25.38 U/mL. a las 60 horas de
crecimiento, con una µm = 0.41 h-1 y un tg = 1.67 h.
36
CUADRO N° 3
FACTORES DE EVALUACION AEREACION (vvm) Y

VELOCIDAD DE AGITACION (rpm) EN FERMENTACION
DE Bacillus megaterium MFFB-UNMSM-39
FACTORES NIVELES
(-) (+)
Aereación (vvm) 0,5 2

Velocidad de agitación (rpm) 50 100
CUADRO N° 4
EFECTO DE LA AEREACION Y TEMPERATURA EN LA PRODUCCION DE AMILASA DE

Bacilluus megateriun MFFB-UNMSM-39 EN CALDO ALMIDON MODIFICADO
REPLICAS TOTAL PROMEDIO

N° FACTORES AMILASA (U/mL) AMILASA AMILASA
AEREACION V. AGITAC. I II III U/mL U/mL
1 0,5 50 17,1 16,4 17,5 51,00 17,00
2 2 50 24,5 26,8 26,7 78,00 26,00
3 0,5 100 24,2 23,2 23,4 70,80 23,60
4 2 100 32,5 29,5 31,5 93,50 31,17
37
CUADRO Nº 5
EFECTO DE LOS FACTORES AEREACION Y VELOCIDAD DE AGITACION

QUE INFLUYEN EN LA PRODUCCION DE AMILASA DE Bacillus megaterium
MFFB-UNMSM-39 EN BIORREACTOR DE TANQUE AGITADO CON CALDO
ALMIDON MODIFICADO, DISEÑO FACTORIAL 22 A 45ºC, pH 7.5
Nº F A C T O R E S AMILASA
EXPERIM MEDIA AEREACION AGITACION INTERACCION U/mL.
1 51,00 -51,00 -51,00 51,00 51,00
2 78,00 78,00 -78,00 -78,00 78,00
3 70,80 -70,00 70,80 -70,80 70,80
4 93,50 93,50 93,50 93,50 93,50
SUMA VAL. RESP (Óxj) 293,30 49,70 35,30 -4,30

PROM. RESPU. (Yj) 73,33 12,43 8,83 -1,08
EFECTOS (Xj) 8,28 5,88 -0,72
CUADRO Nº 6
ANALISIS DE VARIANZA DE LOS FACTORES AEREACION Y VELOCIDAD DE AGITACION EN LA

PRODUCCION DE AMILASA DE Bacillus megeterium MFFB-UNMSM-39 EN BIORREACTOR DE
TANQUE AGITADO CON CALDO ALMIDON MODIFICADO, DISEÑO FACTORIAL 22 A 45ºC, pH 7.5
FUENTE DE VARIABILIDAD SC GL CM Fc Ft 0.05

X1 : Aereación (vvm) 205,84 1 205,84 178,47 * 5,32
X2 : Velocidad de Agitación (rpm) 103,84 1 103,54 60,04 *
X1 X2: Interacción 1,54 1 1,54 1,34
Error 9,23 8 1,15
Total 320,45 11
38
CUADRO N° 7
TABLA DE ANALISIS DE RESIDUALES DE LA PRODUCCION DE AMILASA DE Bacillus megaterium MFFB-UNMSM-39 A 45ºC y pH 7.5
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Y observado (Yo) 17,10 24,5 24,2 32,5 16,4 26,8 23,2 29,5 17,5 26,7 23,4 31,5
Y estimada (Ye) 17,36 25,64 23,24 31,53
Residuales (Yo-Ye) -0,26 -1,14 0,96 0,98 -0,96 1,16 -0,04 -2,03 0,14 1,06 0,16 -0,02
Cuad. Resid. (Yo-Ye)2 0,07 1,30 0,92 0,95 0,92 1,34 0,00 4,10 0,02 1,12 0,03 0,00
Suma Cuad. de Res.(SCR) 10,77
bo X1 X2
Coef. 24,44 4,14 2,94
CUADRO N° 8
ANALISIS DE VARIANZA DE RESIDUALES DE LA PRODUCCION DE

AMILASA DE Bacillus megaterium MFFB-UNMSM-39 EN BIORREAC-
TOR DE TANQUE AGITADO, DISEÑO FACTORIAL 22 A 45°C, pH 7.5
FUENTE DE VARIAB SC GL CM R Fc Ft 0.05%
Residual 10,77 9 1,20 1,04 * 3.39
Error 9,23 8 1,15
Total 19,99 11
39
CUADRO N° 9
CENTRO Y RADIO DE DISEÑO DE FACTORES

AEREACION Y VELOCIDAD DE AGITACION
VARIALBES Z1 Z2
NIVEL INFERIOR ( - ) 0,50 50,00
NIVEL SUPERIOR ( + ) 2,00 100,00
CENTRO DE DISEÑO ( Z° ) 1,25 75,00
RADIO DE DISEÑO ( Zj ) 0,75 25,00
RELACION ( ) 1,67 3,00
CUADRO N° 10
COEFICIENTES DEL MODELO MATEMATICO A ESCALA

NATURAL (DECODIFICADA)
FORMULA DESARROLLADA RESPUES.

ao = 24.44 - 4.14(1.67) - (2.94) (3) 8,714
a1 = 4.14/0.75 5,522
a2 = 2.94/25 0,118
Y = 24.54 + 4.13 X1 + 2.93 X2
Y = 8.714 + 5.522 Z1 + 0.118 Z2
40
CUADRO Nº 4
REPRESENTACION GRAFICA DEL MODELO MATEMATICO

LINEAL DE LA ACTIVIDAD DE AMILASA (U/mL) POR EFECTO
DE LOS FACTORES AEREACION (vvm) Y TEMPERATURA (rpm)
41
CUADRO N° 11
CINETICA DE CRECIMIENTO DE Bacillus megaterium MFFB-UNMSM-39

EN BIORREACTOR DE TANQUE AGITADO CON CALDO ALMIDON
MODIFICADO A 45ºC, pH 7.5, 75 rpm, y vvm 1.5

(ufc/mL) (u/mL) (mg/mL)
6
0 41X10 7,61 0,00 0,00
6
4 53X10 7,72 0,00 0,00
6
8 75X10 7,88 0,00 0,00
7
12 72X10 8,08 0,00 0,00
8
16 99X10 9,95 0,00 0,00
9
20 85X10 11,39 0,75 0,17
10
24 65X10 12,22 1,96 0,44
11
28 33X10 12,52 3,16 0,71
11
32 43X10 12,63 16,05 3,59
11
36 56X10 12,75 22,58 5,05
11
40 57X10 12,76 24,39 5,45
11
44 57X10 12,76 24,68 5,52
11
48 57X10 12,76 25,15 5,62
11
52 57X10 12,76 25,23 5,64
11
56 57X10 12,76 25,31 5,66
11
60 64X10 12,81 25,38 5,67
-1
µm = 0,41 h
tg = 1,67 h
Ya = 25,38 U/mL
42
GRAFICO N° 5

BIORREACTOR DE TANQUE AGITADO CON CALDO ALMIDON MODIFICADO
A 45ºC, pH 7.5, 75 rpm, y vvm 1.5
14
12
10
Log N° células
6 N° Células
0
0 4 8 12 20 28 36 44 52 60
Tiempo
GRAFICO N° 6
ACTIVIDAD DE AMILASA DE Bacillus megaterium MFFB-UNMSM -39 EN

BIORREACTOR DE TANQUE AGITADO CON CALDO ALMIDON MODIFICADO
A 45ºC, pH 7.5, 75 rpm, y vvm 1.5
30
Act. Amilasa (U/mL)
25
20
15 Amilasa
10
0
0 4 8 12 20 28 36 44 52 60
Tiempo ( h )
43
4.5. - OPTIMIZACIÓN DEL SUSTRATO EXPERIMENTAL.-
El cuadro N° 12, muestra la formulación del caldo almidón de yuca
suplementado con sales, así como los valores propuesto para el presente estudio.
El cuadro N° 13, muestra las respuestas (actividad de amilasa) de los 12

ensayos en la etapa del screening para Bacillus megaterium MFFB-UNMSM-39, de
acuerdo a la distribución de los factores en el diseño Plackett y Burman, (1946), los
experimentos se llevaron a cabo en un biorreactor de tanque agitado de 1 L. de
capacidad con 0.5 L. de caldo almidón de yuca, a una temperatura de 45°C; pH 7.5;
agitación de 75 rpm; volumen de aire 1.5 vvm e inóculo de 3% (v/v).
En el cuadro N° 14, se exhiben los efectos de las factores significativos de la

producción de amilasa, del cuál se deduce; qué, cuando se aumenta el factor Almidón
de yuca de 10g. a 30 g.; Extracto de levadura de 2g a 6 g.; Citrato de sodio de 0.2g.
a1.5g; Cloruro de calcio de 0.5g a 3g; se incrementa la producción de amilasa en
5.913; 7.967; 5.0; y 5.913 U/mL. bajo las condiciones de estudio.
El cuadro N° 15 expresa los resultados del análisis de varianza de los factores

del caldo almidón de yuca, encontrándose significancia estadística para almidón de
yuca, extracto de levadura, citrato de sodio y cloruro de calcio, con un Fc de 27.080;
49.151; 19.361; 27.080; estos valores fueron analizados por la prueba de F con un α =
0.05 y con 1 y 3 GL bajo las condiciones de estudio.
En el cuadro N° 16 se muestra los resultados del análisis de residuales de la

producción de amilasa, estimado por los valores predichos del modelo matemático;
mientras que en el cuadro N° 17 se exhibe el análisis de varianza de los residuos,
encontrándose para el residual un Fc = 3.24 que fue analizado por la prueba de F con
un α = 0.05 y con 7 y 3 GL; del cual inferimos que no existen diferencias entre las
predicciones y los valores observados es decir las respuestas del experimento, por lo
cuál, el modelo matemático representa adecuadamente el proceso investigado.
44
Para representar el modelo matemático en esta etapa, se toman en cuenta los
coeficientes significativos del cuadro N° 14, que corresponden a los factores almidón
de yuca; extracto de levadura; citrato de sodio; y, cloruro de calcio corroboradas por la
significancia estadística exhibidas en el cuadro N° 15, del cuál se deduce el modelo
matemático a escala codificada siguiente:
Y = 14.05 + 2.96 X1 + 3.98 X2 + 2.50 X4 + 2.96 X5
Tomando como base el modelo matemático a escala codificada, se realiza la

decodificación el modelo matemático a escala natural, resultando las siguientes
ecuaciones:
Cuando :
(X4 , X5 = 0) Y = 0.17 + 0.30 Z1 + 1.96 Z2 (1)

(X2 , X5 = 0) Y = 4.86 + 0.30 Z1 + 3.85 Z4 (2)
(X2 , X4 = 0) Y = 3.99 + 0.30 Z1 + 2.37 Z5 (3)
(X1 , X5 = 0) Y = 2.87 + 1.99 Z2 + 3.85 Z4 (4)
(X1 , X4 = 0) Y = 1.95 + 3.85 Z2 + 2.37 Z5 (5)
(X1 , X2 = 0) Y = 6.63 + 3.85 Z4 + 2.96 Z5 (6)
En los gráficos del Nº 7 al 12, se aprecian la representación gráfica de los

modelos matemáticos lineales que corresponden a las parejas de factores almidón de
yuca y extracto de levadura (1); almidón de yuca y citrato de sodio (2); almidón de
yuca y cloruro de calcio (3); extracto de levadura y citrato de sodio (4); extracto de
levadura y cloruro de calcio (5); y, citrato de sodio y cloruro de calcio (6). Las figuras
que se observan son un plano en el espacio con pendiente positiva, donde las mejores
respuestas en actividad de amilasa se consiguen, cuando se incrementan los niveles de
los factores hasta alcanzar el intervalo definido en el cuadro Nº 12, así mismo, la
parejas de factores (5) muestra una mayor respuesta en actividad de amilasa, mientras
que el resto de las parejas de factores alcanzan menores pero similares respuestas en
actividad de amilasa.
45
I. SCREENING
CUADRO N° 12
FACTORES DE EVALUACION DEL MEDIO DE CULTIVO

ALMIDON DE YUCA SUPLEMENTADO CON SALES
FACTORES DEL SUSTRATO NIVELES (g/L)

(-) (+)
Z1 : Almidon de yuca 10,00 30,00
Z2 : Extracto de levadura 2,00 6,00
Z3 : Mg(SO 4 ) 7H20 0,50 1,50
Z4 : Na 3 C6H5O 7. 2H 20 0,20 1,50
Z5 : Ca Cl 2 0,50 3,00
Z6 : (NH4 )2 SO 4 1,00 3,00
Z7 : K 2 HPO 4 0,20 1,20
Z8 : Fe SO 4 0,10 0,80
CUADRO N° 13
PRODUCCION DE AMILASA DE Bacillus megaterium FFBB-UNMSM-39M SEGÚN DISTRIBUCION DE FACTORES DEL MEDIO DE
CULTIVO ALMIDON DE YUCA EN EL DISEÑO DE PLACKETT Y BURMAN
N° F A C T O R E S ( g/0.5L ) AMILASA
EXPER. ALM. YUCA EXT. LEV. Mg(SO4) 7H20 Na3 C6H5O7.2H20 Ca Cl2 (NH4 ) 2 SO4 K2 HPO4 Fe SO4 U/mL
1 15,00 3,00 0,25 0,75 1,50 0,50 0,10 0,40 27,40
2 15,00 1,00 0,75 0,75 0,25 0,50 0,60 0,05 14,38
3 5,00 3,00 0,75 0,10 0,25 0,50 0,10 0,40 10,27
4 15,00 3,00 0,75 0,10 0,25 1,50 0,60 0,40 19,86
5 15,00 3,00 0,25 0,10 1,50 0,50 0,60 0,05 18,49
6 15,00 1,00 0,25 0,75 0,25 1,50 0,10 0,40 9,59
7 5,00 1,00 0,25 0,10 1,50 1,50 0,60 0,40 5,48
8 5,00 1,00 0,75 0,75 1,50 0,50 0,60 0,40 15,75
9 5,00 3,00 0,25 0,75 0,25 1,50 0,60 0,05 9,59
10 15,00 1,00 0,75 0,10 1,50 1,50 0,10 0,05 12,33
11 5,00 3,00 0,75 0,75 1,50 1,50 0,10 0,05 22,60
12 5,00 1,00 0,25 0,10 0,25 0,50 0,10 0,05 2,88
46
CUADRO N° 14
CALCULO DE EFECTOS DE LA PRODUCCION DE AMILASA DE Bacillus megaterium MFFB-UNMSM-39 EN BIORREACTOR DE

TANQUE AGITADO POR INFLUENCIA DE LOS FACTORES DEL MEDIO DE CULTIVO ALMIDON DEYUCA A 45ºC, pH 7.5, 75 rpm
vvm 1.5, (DIDESÑO PLACKETT BURMAN)
N F A C T O R E S AMILASA
EXP. F2 F3 U/mL
MEDIA A. YUCA EXT. LEV. Mg(SO4)7H20 F1 Na 3C6H5O7.2H20 Ca Cl2 (NH4 ) 2 SO4 K 2 HPO 4 Fe SO4
1 27,40 27,40 27,40 -27,40 27,40 27,40 27,40 -27,40 -27,40 -27,40 27,40 -27,40 27,40
2 14,38 14,38 -14,38 14,38 14,38 14,38 -14,38 -14,38 -14,38 14,38 -14,38 14,38 14,38
3 10,27 -10,27 10,27 10,27 10,27 -10,27 -10,27 -10,27 10,27 -10,27 10,27 10,27 10,27
4 19,86 19,86 19,86 19,86 -19,86 -19,86 -19,86 19,86 -19,86 19,86 19,86 -19,86 19,86
5 18,49 18,49 18,49 -18,49 -18,49 -18,49 18,49 -18,49 18,49 18,49 -18,49 18,49 18,49
6 9,59 9,59 -9,59 -9,59 -9,59 9,59 -9,59 9,59 9,59 -9,59 9,59 9,59 9,59
7 5,48 -5,48 -5,48 -5,48 5,48 -5,48 5,48 5,48 -5,48 5,48 5,48 5,48 5,48
8 15,75 -15,75 -15,75 15,75 -15,75 15,75 15,75 -15,75 15,75 15,75 15,75 -15,75 15,75
9 9,59 -9,59 9,59 -9,59 9,59 9,59 -9,59 9,59 9,59 9,59 -9,59 -9,59 9,59
10 12,33 12,33 -12,33 12,33 12,33 -12,33 12,33 12,33 12,33 -12,33 -12,33 -12,33 12,33
11 22,60 -22,60 22,60 22,60 -22,60 22,60 22,60 22,60 -22,60 -22,60 -22,60 22,60 22,60
12 2,88 -2,88 -2,88 -2,88 -2,88 -2,88 -2,88 -2,88 -2,88 -2,88 -2,88 -2,88 2,88
SUM.V.RESPU. (xj) 168,62 35,48 47,80 21,76 -9,72 30,00 35,48 -9,72 -16,58 -1,52 8,08 -7,00
Nº EXPERIM (N) 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12 12
EFECTOS (Exj) 5,913 7,967 3,627 -1,620 5,000 5,913 -1,620 -2,763 -0,253 1,347 -1,167
47
CUADRO N° 15
ANALISIS DE VARIANZA DE LA PRODUCCION DE AMILASA DE Bacillus megaterium MFFB-UNMSM-39 EN

BIORREACTOR DE TANQUE AGITADO POR INFLUENCIA DE LOS FACTORES DEL CALDO ALMIDON DE YUCA
A 45°C, pH 7.5, 75 rpm y vvm 1.5, DISEÑO PLACKETT Y BURMAN
FUENTE DE VARIACION SC GL CM Fc Ft 0.05
Z1 : Almidon de yuca 104,903 1 104,903 27,080 * 18.5

Z2 : Extracto de levadura 190,403 1 190,403 49,151 *
Z3 : Mg(SO 4 7H2 0) 39,458 1 39,458 10,186
F1 7,873 1 7,873 2,032
Z4 : Na 3 C6 H5 O 7 . 2H 2 0 75,000 1 75,000 19,361 *
Z5 : Ca Cl 2 104,903 1 104,903 27,080 *
Z6 : (NH4 )2 SO 4 7,873 1 7,873 2,032
F2 22,908 1 22,908 5,914
Z7 : K 2 HPO 4 0,193 1 0,193 0,050
Z8 : Fe SO 4 5,441 1 5,441 1,404
F3 4,083 1 4,083 1,054
Error 11,622 3 3,874
Total 574,659 14
48
CUADRO N° 16
TABLA DE ANALISIS DE RESIDUALES DE LA PRODUCCION DE AMILASA DE Bacillus megaterium MFFB-UNAMSM-39 A 45ºC, pH 7.5
75 rpm y vvm 1.5
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Y observado (Yo) 27,40 14,38 10,27 19,86 18,49 9,59 5,48 15,75 9,59 12,33 22,60 2,88
Y estimada (Ye) 26,45 12,57 9,62 15,54 21,45 12,57 7,57 12,57 14,62 13,48 20,54 1,66
Residuales (Yo-Ye) 0,95 1,81 0,65 4,33 -2,96 -2,98 -2,09 3,18 -5,03 -1,15 2,07 1,23
Cuad. Resid. (Yo-Ye) 2 0,91 3,28 0,42 18,71 8,75 8,87 4,36 10,12 25,32 1,33 4,26 1,50
Suma Cuad. de Resid.(SCR) 87,83
bo X1 X2 X4 X5
Coef. 14,05 2,96 3,98 2,50 2,96
CUADRO N° 17
ANALISIS DE VARIANZA DE RESIDUALES DE LA PRODUCCION DE

AMILASA DE Bacillusmegaterium MFFB-UNMSM-39 EN BIORREAC-
TOR DE TANQUE AGITADO, A 45ºC, pH 7.5, 75 rpm , vvm 1.5
DISEÑO PLACKETT Y BURMAN
FUENTE DE VARIAB SCR GL CM R Fc Ft 0.05
Residual 87,83 7 12,55 3,24 * 8.89
Error 11,62 3 3,87
Total 99,45 10
Y = 14.05 + 2.96X1 + 3.98X2 + 2.50X4 + 2.96X5

X4 ,X5 =0 Y = 0.17 + 0.30Z1 + 1.99 Z2
X2,X5 =0 Y = 4.86 + 0.30Z1 + 3.85 Z4
X2,X4 =0 Y = 3.99 + 0.30Z1 + 2.37 Z5
X1 ,X5 =0 Y = 2.82 + 1.99Z2 + 3.85 Z4
X1 ,X4 =0 Y = 1.95 + 3.85Z2 + 2.37 Z5
X1 ,X2 =0 Y = 6.63 + 3.85Z4 + 2.96 Z5
49
GRAFICO N° 7

DE LOS FACTORES ALIMDON DE YUCA Y EXTRACTO DE
LEVADURA
50
GRAFICO N° 8

DE LOS FACTORES ALIMDON DE YUCA Y CITRATO DE
SODIO
51
GRAFICO N° 9

DE LOS FACTORES ALMIDON DE YUCA Y CLORURO DE
CALCIO
52
GRAFICO N° 10

DE LOS FACTORES ALMIDON DE YUCA Y CLORURO DE
CALCIO
53
GRAFICO N° 11
REPRESENTACION GRAFICA DE MODELO MATEMATICO

DE LOS FACTORES EXTRACTO DE LEVADURA Y CLORURO
DE CALCIO
54
GRAFICO N° 12
DE LOS FACTORES CITRATO DE SODIO Y CLORURO DE
CALCIO
55
El cuadro N° 18, representa los factores con significancia estadística. Que se
emplean para el cálculo de los valores de incremento para cada factor de estudio,
tomando como base el incremento del factor cloruro de calcio en 0.3 g/L.; los cuales
se exhiben en el cuadro N° 19.
En el cuadro N° 20, se muestra la formulación del sustrato, empleándose para

este propósito el método de pendiente ascendente según Carpenter y Sweeny (1965);
por medio del cual se determinó la máxima pendiente de asenso de los factores
significativos y las respuestas de actividad de amilasa a 45 °C, pH 7.5, 75 rpm, 1.5
vvm, e inóculo 3% (v/v) encontradas en cada experimento; y con una máxima
producción de amilasa de 32.84 U/mL. para el cuarto experimento de ésta etapa.
56
II. OPTIMIZACION ASCENDENTE
CUADRO N° 18
FACTORES SINGNIFICATIVOS QUE INFLUYEN EN LA PRODUCCION DE AMILASA

DE Bacillus megaterium MFFB-UNMSM-39
FACTORES DEL SUSTRATO NIVELES (g/L)

( -) (+)
Z1 : Almidon de yuca 10,00 30,00
Z2 : Extracto de levadura 2,00 6,00
Z4 : Na 3 C6 H5 O 7 . 2H 2 0 0,20 1,50
Z5 : Ca Cl 2 0,50 3,00
CUADRO N° 19
PLANIFICACION DE LA PENDIENTE ASCENDENTE QUE INFLUYEN EN LA PRODUCCION DE AMILASA DE

Bacillus megaterium MFFB-UNMSM-39 TOMANDO COMO BASE EL INCREMENTO DEL FACTOR
CLORURO DE CALCIO EN 0.3 g/L
FACTORES ASCENDENTES
FORMULA A. YUCA EXT. LEV. Na 3 C6H5O7.2H20 Ca Cl2
Centro de Diseño: Z° j = (Xmáx + Xmín)/2 20,00 4,00 0,85 1,75
Radio de Diseño : Zj= (Xmáx - Xmín)/2 10,00 2,00 0,65 1,25
Coeficiente : bj 2,96 3,98 2,50 2,96
Direc. de ascenso mas empinada: bj * zj 29,57 7,97 1,63 3,70
Incremento de factores: j=(b j Zj* k )/bk Zk 2,40 0,65 0,13 0,30
57
CUADRO N° 20
PRODUCCION DE AMILASA DE Bacillus megaterium MFFB-UNMSM-39 POR

INFLUENCIA DE VALORES ASCENDENTES A LO LARGO DE LA DIRECCION
MAS EMPINADA DE LOS FACTORES EN BIORREACTOR DE TANQUE
AGITADO, A 45°C, pH 7.5, 75 rpm y vvm1.5
N° F A C T O R E S (g/L) AMILASA
EXPER. A. YUCA EXT. LEV. Na 3 C6H5O7.2H20 Ca Cl2 U/mL
1 20,00 4,00 0,85 1,75 26,49
2 22,40 4,65 0,98 2,05 28,65
3 24,80 5,29 1,11 2,35 31,25
4 27,20 5,94 1,25 2,65 32,84
5 29,60 6,59 1,38 2,95 32,50
58
En los cuadros N° 21 y N° 22, se muestra los valores de los factores más
significativos, como son, almidón de yuca y cloruro de calcio, así como, los valores
del centro y radio de diseño que se emplean para el cálculo de los factores mostrados
en el cuadro N° 23.
En el cuadro N° 23 se reporta la producción de amilasa de Bacillus

megaterium MFFB-UNMSM-39, por influencia de los factores almidón de yuca y
cloruro de calcio, a 45°C, pH 7.5, 75 rpm, 1.5 vvm e inóculo 3% (v/v), empleando un
diseño rotable hexagonal, evidenciándose una mayor producción de amilasa en el
experimento 2 con un 33.22 U/mL ,que representa un 1.14 % de incremento de
actividad de amilasa en relación a la producción mas alta en la etapa de optimización
ascendente.
El cuadro N° 24 muestran los coeficientes del modelo matemático, los cuales

se hallaron empleando una matriz para factores lineales y cuadráticos en base a los
valores del diseño rotable hexagonal. Mientras que el cuadros N° 25 exhibe los
resultados de la producción de amilasa con los valores en el centro de diseño del
sustrato formulado según el diseño rotable hexagonal, respectivamente.
En base a los cuadro N° 26 y N° 27, se realiza el análisis de significancia de

los coeficientes del modelo matemático, por influencia de la varianza asociada a cada
coeficiente, encontrándose significancia estadística para los coeficientes de los
términos independientes; lineales; cuadráticos; y, el término interacción, evaluados
mediante el test de Student, con un α = 0.05 y 2 GL.
En los cuadros N° 28 y N° 29, se muestran los procesos de evaluación del

modelo matemático con la finalidad de ver el grado de ajuste a los datos
experimentales, encontrándose la SCFA en 0.11. Del análisis de varianza, se demuestra
que no hay significancia estadística de los residuales evaluados por la prueba de F,
resultando un Fc menor a Ft con α = 0.05 y con 1 y 2 GL, lo cual nos demuestra que
el modelo se ajusta adecuadamente a los datos experimentales.
59
En el Cuadro N° 30 y Gráfico N° 13, se exhiben los resultados de los valores
máximos y mínimos del modelo matemático de segundo orden de los factores almidón
de yuca y cloruro de calcio, que maximiza la respuesta (actividad de amilasa), es
decir, encontramos los valores óptimos de Z1 y Z2 que corresponden a la cima de la
superficie respuesta descrita por el modelo matemático estimado; correspondiendo
para almidón de yuca 25.41 g./L. y cloruro de calcio 2.87 g/L., con una producción de
33.30 U/mL. de amilasa, éstos valores encontrados analíticamente se encuentran muy
cerca de la producción de amilasa obtenida en el experimento 2 que corresponde a
33.22 U/mL de amilasa con 25 g/L. de almidón de yuca y 2.83 g/L. de cloruro de
calcio, mostrada en el cuadro N° 23.
El modelo matemático a escala codificada y natural se deduce en base a los

coeficientes de los factores del cuadro N° 24, que es el siguiente:
Y = 28.03 + 2.07 X1 + 10.55 X2 + 2.94 X1 2 + 6.28 X2 2 + 1.25 X1X2
El modelo matemático a escala natural, se obtiene por cálculo de valores

independientes, lineales, cuadráticos e interacción, resultando la siguiente ecuación:
Y = -11.47 + 1.21 Z1 + 20.52 Z2 - 0.03 Z12 - 4.02 Z2 2 + 0.1 Z1Z2
60
III. OPTIMIZACION FINAL
3.1.- ESTIMACION DEL MODELO MATEMATICO
CUADRO N° 21
FACTORES MAS SIGNIFICATIVOS A ESCALA CODIFICADA QUE

INFLUYEN EN EL PRODUCCION DE AMILASA DE Bacillus
megaterium MFFB-UNMSM-39
FACTORES MAS SIGNIFICATIVOS NIVELES (g/L)

( -) (+)
Z1: Almidon de yuca 10,00 30,00
Z2: Ca Cl2 0,50 3,00
CUADRO N° 22
CENTRO Y RADIO DE DISEÑO DE LOS FACTORES MAS

SIGNIFICATIVOS QUE INFLUYEN EN LA PRODUCCION DE
AMILASA DE Bacillus megaterium MFFB-UNMSM-39
FORMULAS A. YUCA CaCl2

(Z1) (Z2)
Nivel inferior ( - ) 10 0,5

Nivel superior ( + ) 30 3,0
Z°j = (Xmax + Xmin)/2 20 1,75
Zj= (Xmax - Xmin)/2 10 1,25
Relacion ( ) 2,00 1,40
61
CUADRO N° 23
PRODUCCION DE AMILASA DE Bacillus megatterium M FFB - UNMSM-39 POR

INFLUENCIA DE FACTORES ALMIDON DE YUCA Y CaCl2 EN BIORREACTOR DE
TANQUE AGITADO, A 45°C, pH 7.5, 75 rpm y vvm 1.5, DISEÑO ROTABLE HEXAGONAL
MATRIZ DE DISEÑO HEXAGONAL

N° ESCALA ESCALA AMILASA
EXPER. CODIFICADA NATURAL U/mL
X1 X2 Z1 Z2
1 1,0 0,000 30,00 1,75 27,16
2 0,5 0,866 25,00 2,83 33,22
3 -0,5 0,866 15,00 2,83 30,14
4 -1,0 0,000 10,00 1,75 22,95
5 -0,5 -0,866 15,00 0,67 12,95
6 0,5 -0,866 25,00 0,67 13,87
7 0,0 0,000 20,00 1,75 28,14
8 0,0 0,000 20,00 1,75 27,87
9 0,0 0,000 20,00 1,75 27,98
62
CUADRO N° 24
CUADRO RESUMEN DE LOS COEFICIENTES DEL MODELO MATEMATICO A ESCALA CODIFICADA POR CALCULO MATRICIAL
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Y observado (Yo) 27,16 33,22 30,14 22,95 12,95 13,87 28,14 27,87 27,98
Transp.Matriz X*Resp. (XT 224,28 6,21 31,64 72,66 67,63 0,94 - - -
Coefic. (Bj) = (XT X)-1 * XTY 28,03 2,07 10,55 -2,94 -6,28 1,25 - - -
MODELO MATEMATICO A ESCALA CODIFICADA Y NATURAL
Y = 28.03 + 2.07 X1 + 10.55 X2 - 2.94 X12 - 6.28 X22 + 1.25 X1X2
Y = -11.47 + 1.209 Z1 + 20.519 Z2 - 0.029 Z12 - 4.022 Z22 + 0.1 Z1Z2
CUADRO N° 25
PRODUCCION DE AMILASA DE Bacillus m e gaterium MFFB-UNMSM-39 EN EL

CENTRO DEL DISEÑO POR INFLUENCIA DE LOS FACTORES ALMIDON DE YUCA
Y CaCl2 EN BIORREACTOR DETANQUE AGITADO A 45°C, 75 rpm y vvm 1.5
DISEÑO ROTABLE HEXAGONAL
ESCALA ESCALA
Nº CODIFICADA NATRURAL AMILASA
X1 X2 Z1 Z2 U/mL
7 0 0 20,00 1,75 28,14
8 0 0 20,00 1,75 27,87
9 0 0 20,00 1,75 27,98
63
CUADRO N° 26
DESVIACION ESTÁNDAR DE LA PRODUCCION DE AMILASA DE Bacillus megateriumMFFB-UNMS-39

EN EL CENTRO DE DISEÑO, POR INFLUENCIA DE LOS FACTORES ALMIDON DE YUCA Y CaCl2 EN
BIORREACTOR DE TANQUE AGITADO A 45°C, 75 rpm, y vvm 1.5, DISEÑO ROTABLE HEXAGONAL
Nº EXPERIM. Yo Yo - Yp SCE GL CM E Se
7 28,14 0,14 0,02 2
8 27,87 -0,13 0,02 2
9 27,98 -0,02 0,00 2
(xj) 83,99 0,00 0,04 2 0,02 0,136
28,00
CUADRO N° 27
ANALISIS DE SIGNIFICANCIA DE LOS COEFICIENTES DEL MODELO MATEMATICO DE LA PRODUCCION DE

AMILASA DE Bacillus megaterium MFFB-UNMSM-39 POR INFLUENCIA DE LOS FACTORES ALMIDON DE YUCA Y
CaCl2 EN BIORREACTOR DE TANQUE AGITADO A 45°C, 75 rpm, y vvm 1.5, DISEÑO ROTABLE HEXAGONAL
F de V Se Cjj (Cjj)1/2 Sbj bj tj t0.05

X1 0,136 0,333476 0,577 0,078 2,07 26,41 * 4.3
X2 0,136 0,333333 0,577 0,078 10,55 134,56 *
X12 0,136 0,833333 0,913 0,124 -2,94 -23,73 *
X22 0,136 0,833431 0,913 0,124 -6,28 -50,70 *
X1X2 0,136 1,333412 1,155 0,157 1,25 7,95 *
64
3.2.- EVALUACION DEL MODELO MATEMATICO
CUADRO N° 28
EVALUACION DE RESIDUALES DE LA PRODUCCION DE AMILASA DE Bacillus megaterium

MFFB-UNMSM-39, POR INFLUENCIA DE FACTORES ALMIDON DE YUCA Y CaCl2 EN
BIORREACTOR DE TANQUE AGITADO, A 45°C, pH 7.5, 75 rpm y vvm 1.5, DISEÑO
DIESEÑO ROTABLE HEXAGONAL
Yo Yest= X*Bj Yo - Yest SCR SCE SCFA
27,16 27,16 0,00 0,000

33,22 33,29 -0,07 0,005
30,14 30,14 0,00 0,000
22,95 23,26 -0,31 0,096
12,95 12,95 0,00 0,000
13,87 13,94 -0,07 0,005
28,14 28,03 0,11 0,012
27,87 28,03 -0,16 0,025
27,98 28,03 -0,05 0,002
TOTAL 0,146 0,04 0,11
CUADRO N° 29
ANALISIS DE VARIANZA DE LA FALTA DE AJUSTE ( FA) DE RESIDUALES, DE LA PRODUCCION

DE AMILASA DE Bacillus megaterium M FFB - UNMSM-39, POR INFLUENCIA DE FACTORES
ALMIDON DE YUCA Y CaCl2 EN BIORREACTOR DE TANQUE AGITADO, A 45°C, pH 7.5, 75 rpm
vvm 1.5, DISEÑO ROTABLE HEXAGONAL
FUENTE DE VARIABILIDAD SC GL CM Fmod Ft 0.05

FA 0,11 1 0,11 5,94 * 18.5
ERROR 0,04 2 0,02
RESIDUAL 0,146 3 0,05
65
CUADRO Nº 30
ANALISIS DE MAXIMOS Y MINIMOS DEL MODELO MATEMATICO EN BASE A LA PRODUCCION DE AMILASA DE Bacillus megaterium
MFFB-UNMSM-39, POR INFLUENCIA DE FACTORES ALMIDON DE YUCA Y CaCl2 EN BIORREACTOR DE TANQUE AGITADO A 45°C
pH 7.5, 75 rpm y vvm 1.5, DISEÑO ROTABLE HEXAGONAL
Xo X1 X2 X12 X22 X1X2

A) MODELO MATEMATICO 28,03 2,07 10,55 -2,94 -6,28 1,25
B) SEGUNDA DERIVADA d2 / X12 = -5,88 d2 / X22 = -12,57 d2 / X1 *X2 X = 1,25
C) MATRIZ HESSIANA H11 = -5,88 H22 = -5,88 1,25

1,25 -12,57 72,38
D) DERIVADAS PARCIALES PARA CADA dY/dx1= -5,88 1,25 = -2,07

FACTOR dY/dx2= 1,25 -12,57 = -10,55
E) VALORES OPTIMOS DE LOS FACTORES X1 = 0,54 X2 = 0,89
F) CENTRO DE DISEÑO PARA (X1 y X2) 20 1,75

RADIO DE DISEÑO PARA (X1 y X2) 10 1,25
G) VALORES OPTIMOS A ESCALA NATURAL Z1 = 20 + (0.54*10) = 25,41 g/L

(Zj = Z° + Xj * Zj) Z2 = 1.75 + (0.89*1.25) = 2,87 g/L
H) RENDIMIENTO OPTIMO (Y óptimo) 33,30 U/mL
66
GRAFICO N° 13

DE SEGUNDO ORDEN DE LA ACTIVIDAD DE AMILASA (U/mL)
POR EFECTO DE LOS FACTORES ALMIDON DE YUCA Y
CLORURO DE CALCIO EN LA PRODUCCION DE AMILASA
70
V. DISCUSIÓN
.
De 120 microorganismos aislados de suelos de naranjales, se identificaron 46

cepas con capacidad de hidrólisis sobre el almidón, que representan el 38.33% de las
cepas evaluadas. La presencia de la enzima amilasa en la etapa de selección de los
microorganismos, se determinó por difusión radial en medio sólido, encontrándose
diámetros mayores (mm.) en las cepas Bacillus megaterium MFFB-UNMSM-39;
Faenibacillus spp MFFB-UNMSM-08; Faenibacillus spp MFFB-UNMSM-47;
Bacillus coagulans MFFB-UNMSM-05; Bacillus circulans MFFB-UNMSM-10;
Faenibacillus spp MFFB-UNMSM-78, de 33, 28, 26, 24, 23 y 21 mm.
respectivamente (Tablas N° 6 y 10). Estos resultados son semejantes con los trabajos
de Kwan y col. (1993) que reporta a Bacillus circulans aislado de suelos de Hong
Kong; Rani y col. (1994) que identifica a Bacillus megaterium de suelos de la India;
Goyal y col. (1995) que determina a Bacillus sp, Ferreira y col. (1998) que identifica
a Bacillus subtilis. Cabe destacar que los autores mencionados han aislado cepas
silvestres al igual que en el presente trabajo.
La optimización de los parámetros aereación y velocidad de agitación

(Cuadros N° 03 al 11 y Gráfico N° 4) para Bacillus megaterium MFFB-UNMSM-39
en biorreactor de tanque agitado, con caldo almidón modificado según Achi, (1992),
se efectuaron mediante un diseño factorial a dos niveles (N = 22). Encontrándose una
alta producción de amilasa cuando el consumo de aire y la velocidad de agitación se
incrementan en el rango establecido, deduciéndose de estos resultados una velocidad
de agitación óptima 75 rpm con un volumen de aire en una relación de 1.5 vvm, bajo
las condiciones de estudio. Estos resultados tienen similitud en cuanto a metodología
de trabajo con los estudios realizado por Pastor y Col. (2001), en el que determinaron
un volumen de aire promedio de 1 vvm y una velocidad de agitación de 750 rpm. para
la producción de una proteasa a partir de Bacillus subtilis NRL 3411 y amaranto como
sustrato; en éste estudio también determinaron la relación vvm y rpm; estableciendo,
que cuando aumentan el volumen de aire de 053 a 056 vvm y la velocidad de
agitación de 350 a 750 rpm se incrementa la producción de la proteasa. Cabe destacar
71
que Pastor y Col. (2001), han trabajado en condiciones diferentes utilizando un
microorganismo y sustrato diferente.
La producción de amilasa de Bacillus megaterium MFFB-UNMSM-39 en

biorreactor de tanque agitado con 0.5 L. con caldo almidón modificado según Achi,
(1992), a temperatura de 45°C; pH 7.5; agitación constante de 75 rpm.; 1.5 vvm,
inóculo 3% (v/v), (Cuadro N° 11; y, Gráficos N° 5 y 6) fue de 25.38 U/mL,
incrementándose la actividad en 9.28 U/mL. (57.63 %) por efecto de la inyección de
aire y la distribución del mismo por la agitación, frente a la fermentación llevada en
matraz agitado que arrojó una producción de amilasa de 16.10 U/mL. Este resultado
tiene concordancia con lo establecido por Scragg, (1996); y Crueger (1993) que
manifiestan que la transferencia de oxígeno hacia las células y el mezclado del mismo
aumenta la biomasa. La cinética de crecimiento fue gradual con una µm = 0.41 h-1 y
un tg = 1.67 h. En cuanto a µ m, al parecer tiene concordancia con lo establecido por
Crueger (1993) que establece que el valor de µm depende del microorganismo y las
condiciones de fermentación y las µm varían entre 0.090 y 0.61 h-1 , también se
evidencia que el microorganismo tiene una fase de latencia de 12 horas, estos datos
concordarían con los enunciados de Crueger (1993); Scragg (1996) que manifiestan
que en la fase de latencia los microorganismos se encuentran en una etapa de
adaptación a su nuevo ambiente y que los microorganismos debe inducir nuevos
sistemas de transportes para su metabolismo, así mismo, necesitan energía adicional
para degradar substratos de cadena larga y como en el presente estudio se ha utilizado
almidón de yuca como la principal fuente de carbono y éste sustrato es una molécula
de cadena larga se justificaría el tiempo en la fase de latencia. La producción de
amilasa empieza levemente a las 20 horas, hacia finales de la fase logarítmica para
luego incrementarse y alcanzar la máxima producción en la fase estacionaria; del
análisis se concluye, que la enzima amilasa producida por el Bacillus megaterium
MFFB-UNMSM-39 es una enzima inductiva según Lehninger (1985).
La optimización del sustrato experimental en el screening empleando almidón

de yuca suplementado con sales (Cuadro N° 12), a través de 12 ensayos (Cuadro N°
13) llevado a cabo en biorreactor de tanque agitado de 1 L. de capacidad, a una
72
temperatura de 45°C, pH 7.5, agitación constante de 75 rpm. y volumen de aire 1.5
vvm, inóculo 3% (v/v). Bajo estas condiciones, se encontraron diferentes respuestas
en actividad de amilasa. Del cálculo de los efectos (Cuadro N° 14) podemos ver como
varían las respuesta en función de los niveles de los factores; es así, que cuando
aumenta la cantidad de almidón de yuca de10 a 30 g; Extracto de levadura de 2 a 6 g.;
Citrato de sodio de 0.2 a 1.5; Cloruro de calcio de 0.5 a 3; se incrementa la producción
de amilasa en 5.913; 7.967; 5.00; y 5.913 U/mL respectivamente. Esto nos indica que
el nivel óptimo de aplicación de los factores probablemente no han sido alcanzados
todavía y por lo tanto nos sugiere realizar ensayos posteriores.
Del análisis de varianza (Cuadro N° 15), se tiene significancia estadística para

los factores almidón de yuca; extracto de levadura; citrato de sodio; y, cloruro de
calcio, con un α = 0.05 y con 1 y 3 GL. Esto nos señala que el microorganismo tiene
preferencias alimenticias por los cuatro factores y que la producción de amilasa va
depender en gran medida de éstos factores. En el mismo cuadro, no se encontró
significancia estadística para el factor sulfato de amonio que es una fuente de
nitrógeno de carácter inogánico; así como para sulfato de magnesio; fosfato de
potasio; y sulfato de hierro; sugiriéndomos que el microorganismo no los aprovecha
para su metabolismo y que dichos factores tienen efectos independientes sobre la
producción de amilasa. Estos resultados tendrían alguna concordancia con el trabajo
de Achi, (1992), que comparó extracto de levadura y sulfato de amonio en la
producción de amilasa con Bacillus alvei, encontrando alta producción de amilasa con
extracto de levadura mientras que con sulfato de amonio la producción de amilasa fue
baja; del mismo modo, Kwan (1993) evaluó el efecto de los iones Ba +2 ; Ca+2; Cu+;
Mg2+; Ni+2 y Zn+2 ; Fe2+; sobre la producción de â -amilasa con Bacillus circulans,
encontrando inhibición en el crecimiento y producción de â -amilasa por efecto del
Cu+; Fe2+; Z+2 ;y, Ni+2 ; mientras que los iones Ca+2 y Ba+2 ; estimulan el crecimiento y
la producción de â -amilasa.
Del análisis de residuales de los coeficientes significativos del modelo

matemático (cuadros N° 16 y N° 17) que influyen en la producción de amilasa, y el
análisis de varianza respectiva, no se encuentra significancia estadística para el
73
residual por medio de la prueba de F con un α = 0.05 y con 7 y 3 GL, lo cual explica
que el modelo matemático representa adecuadamente el proceso investigado.
La máxima producción de amilasa para Bacillus megaterium MFFB-UNMSM-

39 en esta etapa fue de 27.40 U/mL, utilizando almidón de yuc a como sustrato, éste
resultado es superior al reportado por Rani, y col. (1994); Okolo y col. (1993); Mai, y
Col. (1992); Grupta y Col. (1995); pero inferior a los sostenidos por Goyal y Col.
(1995); y, Achi y Col. (1992). Este resultado tiene concordancia con los estudios de
Rani, y col. (1994) que reportaron la producción de β -amilasa de Bacillus megaterium,

empleando almidón de yuca gelatinizado, encontrando una actividad de 14 U/mL. Con
los otros autores que citamos para efecto de comparación, el presente trabajo tendría
sólo concordancia con el uso del sustrato, es decir, almidón de yuca más no con el tipo
de microorganismo ya cada autor ha empleado un microorganismo en particular. Es
así, que Okolo y col. (1993), han realizado estudios sobre el rendimiento de la
actividad de amilasa empleando como sustrato almidón de yuca no gelatinizado,
encontrando una actividad enzimática de amilasa de 15.7 U/mL producida por
Thermoactinomyces thalpophilus F13. Asimismo, Mai, y Col. (1992). Encontraron
actividad de amilasa en 19, 15 y 13 U/mL a partir de B. steaarothermophilus UQM
2104; B.licheniformis UQM 378 T2; y, B. licheniformis UQM 378 T5;
respectivamente, utilizando almidón de yuca como sustrato principal. Del mismo
modo, Grupta y Col. (1995), reportaron el rendimiento de amilasa producida por un
mutante de Malbranchea sulfurea, en 18 U/mL. utilizando como sustrato almidón de
papa suplementado con sales. Pero, Goyal y Col. (1995), reportaron el rendimiento
de actividad de amilasa en 140 U/mL. producido por Bacillus sp MK 716, empleando
almidón soluble; y Achi y Col. (1992), reportan una actividad muy superior al
encontrado en el presente estudio, 868 U/mL. producidos por Bacillus alvei utilizando
como sustrato almidón de yuca; como se puede apreciar en los estudios de Goyal y
Col. (1995); y, Achi y Col. (1992), la actividad de amilasa es alta a la obtenida en el
presente estudio, esto se debería a que los autores mencionados probablemente hayan
trabajado con cepas mutadas. Sin embargo cabe señalar que las comparaciones no
serían apropiadas y sólo servirían de marco referencial, porque la fermentación
74
realizada en el presente estudio fue realizada en biorreactor de tanque agitado y las
investigaciones de los autores citados fueron conducidas en matraz agitado.
La segunda etapa que comprende la optimización ascendente, (Cuadro 18, 19

y 20) se llevó a cabo por el método de pendiente ascendente según Carpenter y
Sweeny (1965); determinándose la máxima pendiente de asenso de los factores
significativos, tomando como base el incremento de cloruro de calcio en 0.3 g/L. y,
en base a ésta pendiente de cinco experimentos, se encontró que las respuestas de
producción de amilasa en cada experimento se incrementa, obteniéndose una máxima
producción de actividad enzimática de 32.84 y 32.50 U/mL. en los experimentos 4 y
5. De los resultados se infiere, que la región óptima ha sido ubicada, pero existe un
efecto de curvatura en los experimentos 4 y 5 y, por lo tanto, fue necesario aplicar en
estos puntos un diseño experimental de segundo orden. El incremento de la
producción de amilasa en esta etapa, se debería a que la enzima amilasa es calcio
dependiente y que coadyuva en su expresión y estabilidad respectivamente, Estos
resultados concuerdan con Fischer y Stein (1960) quienes manifiestan que las amilasas
son calcio metalo enzimas. Del mismo estos resultados son similares o se acercan a los
estudios de Arai y Col. (1969) que manifiestan que la α -amilasa de Bacillus subtilis
requiere por lo menos 0.16 g/L. de calcio por mol de enzima. Fujita, y Col. (1960),
encontraron que la α -amilasa de Aspergillus orizae necesita 0.4 g/L de calcio por mol
de enzima. Hewitt y Solomons (1996), reportan que los cultivos de Bacillus
amyloliquefaciens requiere de 0.4 g/L. de calcio. Sin embargo, De Souza y Col.
(2000), sostienen que la adición de calcio 0.4 g/L. peptona 1%; extracto de levadura
0.5% a un medio mineral acorta el periodo de latencia mejorando el crecimiento de las
células y la síntesis de α -amilasa de Bacillus sp. De otro lado Okolo y col (1996)
emplea 3.0 g/L. de CaCl2 para la producción de amilasa empleando
Thermoactinomyces thalpophilus F13. Como se puede apreciar los niveles de calcio
empleado por los investigadores mencionados varían el uno al otro. En referencia al
presente trabajo nuestros resultados son superiores en cuanto a requerimientos de
calcio con los estudios de Arai y Col. (1969); Fujita y Col. (1960); Hewitt y
Solomons (1996); y De Souza y col (2000) que emplearon 0.16 g/L.; 0.4g/L.; 0.4 g/L.;
75
0.4 g/L. Mientras que con el estudio de Okolo y Col. (1996) se tiene bastante
similitud, ya que emplea 3.0 g/L de calcio.
En la tercera etapa, que comprende la optimización final, la producción de

actividad de amilasa (Cuadro N° 23) producida por Bacillus megaterum MFFB-
UNMSM-39, de acuerdo al sustrato formulado (Cuadro N° 22) con los factores más
significativos (Cuadro N° 21), empleando un diseño rotable hexagonal, es de 33.22
U/mL. en el experimento 2, que se incrementa en un 1.0% en relación ha la
producción más alta de la etapa de optimización ascendente (32.84 U/mL). Se ha
encontrado una desviación estándar de 0.136 para la producción de amilasa en el
centro de diseño (Cuadro N° 26), lo cual influye positivamente para el análisis de
varianza asociada a cada coeficiente del modelo matemático (Cuadro N° 27),
obteniéndose significancia estadística con un α = 0.05 con 2 GL a través de un Test de

Student, para los términos independiente; lineales; cuadráticos; e interacción. Con esto
demostramos que los coeficientes del modelo matemático se ajustan al proceso
investigado, y que los datos de las respuestas proporcionan evidencia suficiente, de
que el almidón de yuca asociado al cloruro de calcio son variables útiles para predecir
la producción de amilasa. Del mismo modo el modelo matemático derivado del
diseño rotable hexagonal, se ha evaluado estadísticamente para ver el grado de ajuste a
los datos experimentales, (Cuadro N° 29) no existiendo diferencia significativa con un
á = 0.05 y 1 y 2 GL. De lo que podemos inferir, que el modelo representa
adecuadamente a los datos experimentales. Al estimar el modelo de segundo orden
(cuadro N° 30) por el criterio de la matriz Hessiana, se obtiene un valor máximo y
mínimo (+71.85 y -5.83), lo que nos indica que el modelo matemático tiene un
máximo en el rango investigado y que la forma de la superficie respuesta se asemeja a
una elipse cóncava hacia abajo. Del mismo modo en base al modelo matemático, al
estimar las soluciones optimas, se ha encontrado los valores de los factores almidón de
yuca (X1 ) y cloruro de calcio (X2 ) que maximiza la respuesta (producción de amilasa
en U/mL), en 25.41 g. y 2.87 g. respectivamente; estos valores son los óptimos y
corresponden a la cima de la superficie respuesta descrita por el modelo matemático
estimado, que como se puede ver, difieren muy poco de los obtenidos en el
experimento 2 del diseño rotable hexagonal, 25 g/L. de almidón de yuca y 2.83 g/L. de
cloruro de calcio.
76
La evaluación de la cinética de crecimiento (células) con caldo almidón de
yuca en biorreactor de tanque agitado; en la etapa del Screening se observa una fase de
latencia de 12 horas para luego entrar a la fase logarítmica hasta las 28 horas en que
comienza la fases estacionaria hasta las 60 horas. En la etapa de optimización
ascendente y optimización final, se acorta el periodo de latencia a 8 horas
manteniéndose en fase logarítmica hasta las 20 horas para luego entrar en fase
estacionaria hasta las 60 horas.
La enzima amilasa en biorreactor de tanque agitado con caldo almidón de yuca

en la fase del Screening parece levemente de las 20 a las 28 horas hacia finales de la
fase logarítmica, incrementándose rápidamente hasta las 40 horas aquí empieza a
desacelerar la producción de amilasa observándose un crecimiento lento hasta
alcanzar la máxima producción a las 60 horas en la fase estacionaria, (Cuadro S-1, y
gráficos S-1 y S-2; Experimento 1); en la etapa de optimización ascendente, la enzima
aparece de las 20 a las 24 horas que corresponde a finales de la fase logarítmica,
incrementándose velozmente hasta las 36 horas a partir de éste punto la enzima
aumenta lentamente alcanzando su máxima producción a las 60 horas en la fase
estacionaria, (Cuadro OA-4, y gráficos OA-7 y 8; Experimento 4); en la etapa de
optimización final, la enzima se detecta levemente de las 16 a 24 horas y luego se
incrementa hasta las 36 horas para alcanzar la máxima producción a las 60 horas en la
fase estacionaria, (Cuadro OF-2, y gráficos OF-3 y 4; Experimento 2).
La síntesis de la á -amilasa ha sido reportado por varios grupos de

investigadores, concordando nuestros resultados con las investigaciones de Priest
(1977) y Kosenkrants (1985), que reportan que la expresión de la á -amilasa se expresa
fundamentalmente después de la fase logarítmica. Coleman y Elliot (1962), Fukomoto
y Col. (1957) y Nomura y Col. (1958); demostraron que la síntesis de á -amilasa de B.
subtilis se expresaba en la fase post-logarítmica del crecimiento bacteriano. Walker y
Campbell (1967), encontraron que la producción de á -amilasa de B. amiloliquefaciens
no se producía hasta que el cultivo ingresara a la fase estacionaria. Por estas
circunstancias, concluimos, que la enzima amilasa producida por el Bacillus
megaterium MFFB-UNMSM-39 es una enzima inductiva según Lehninger (1985).
77
CONCLUSIONES
1.- De 120 microorganismos aislados de suelos de naranjales, se identificaron 46

cepas con capacidad de hidrólisis sobre el almidón que representan el 38.33%
2.- De las 46 cepas identificadas existe un predominio de Bacillus circulans
(28.26%); Bacillus firmus (23.91%); Faenibacillus spp. (17.39%); Bacillus
coagulans (15.22%); Bacillus megaterium (8.70%); Bacillus alvei (4.35%);
Bacillus lentus (2.17%).
3.- Se ha encontrado los parámetros óptimos operacionales para el proceso de
fermentación de Bacillus megaterium MFFB-UNMSM-39, que corresponden
ha temperatura de 45°C, pH 7.5, agitación 75 rpm, y 1.5 vvm.
4.- Al evaluar los ingredientes del sustratos almidón de yuca, se ha encontrado
significancia estadística con un α = 0.05, para almidón de yuca, extracto de
levadura, citrato de sodio y cloruro de calcio.
5.- Se ha encontrado los valores óptimos de los factores Z1 = 25.41 g (almidón de
yuca) y Z2 = 2.87 g (cloruro de calcio) que maximizan la respuesta
(producción de amilasa en U/mL), estos valores corresponden a la cima de la
superficie respuesta descrita por el modelo matemático estimado.
6.- La enzima amilasa en tanque agitado con caldo almidón de yuca, tanto en la
fase del screening, optimización ascendente, y optimización final, hace su
aparición hacia finales de la fase logarítmica para alcanzar la máxima
producción en la fase estacionaria, considerándose por ello como una enzima
inductiva.
78
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82
ANEXOS
83
ANEXO A-1: MEDIOS DE CULTIVO
1. Medio de aislamiento (MA) según Kwan, (1993) g/l.

peptona, 5
Extracto de levadura 3
Fosfato di potasio (K2 HPO4 ) 3.9
Fosfato mono potásico (KH2 PO4 ) 1.47
pH 7.0
2. Agar almidón modificado (AAM) según Achi, OK. (1992) g/L.

Triptona, 5
Extracto de carne 3
Almidón de papa 20
Fosfato di potasico (K2HPO4) 5
Sulfato de magnesio (MgSO4.7H2 0) 0.5
Cloruro de calcio (CaCl2 ) 0.3
Citrato de sodio (Na 3C5H5O7 .2H2 O) 0.5
Agar 15
pH 7.0
3. Caldo almidón modificado (CAM) según Achi, OK. (1992) g/L.

Tristona 5
Extracto de carne 3
Almidón de papa 20
Fosfato di potásico (K2HPO4) 5
Sulfato da magnesio (MgSO4.7H2 0) 0.5
Cloruro de calcio (CaCl2 ) 0.3
Citrato de sodio (Na 3C5H5O7 .2H2 O) 0.5
pH, 7.5
4. Caldo almidón de yuca (CAY) g/L.

Almidón de yuca 27.20
Extracto de levadura 05.94
Sulfato da magnesio (MgSO4.7H2 0) 0.5-1.5
Citrato de sodio (Na3C5H5O7 .2H2 O) 1.25
Cloruro de calcio(CaCl2) 2.85
Sulfato de amonio (NH4)2 SO4 1.0-3.0
Fosfato di potásico (K2 HPO4 ) 0.2-1.2
Sulfato de fierro (FeSO4 ) 0.1-0.8
pH 7.5
5. Solución de yodo de Gram;

Yodo 0.33 %
Ioduro de potasio (KI) 0.67%
84
CUADRO N° S-1
EXPERIMENTO 1

BIORREACTOR DE TANQUE AGITADO CON CALDO ALMIDON DE YUCA
A 45°C, pH 7.5, 75 rpm, vvm 1.5 (DISEÑO PLACKETT Y BURMAN)

(ufc/mL) (u/mL) (mg/mL)
6
0 55X10 7,74 0,00 0,00
6
4 63X10 7,80 0,00 0,00
6
8 88X10 7,94 0,00 0,00
7
12 32X10 8,18 0,00 0,00
8
16 51X10 9,71 0,00 0,00
9
20 69X10 11,46 0,82 0,18
10
24 93X10 12,47 2,05 0,46
11
28 47X10 12,83 3,84 0,86
11
32 99X10 13,00 13,70 3,06
11
36 150X10 13,18 23,97 5,36
11
40 156X10 13,19 26,03 5,82
11
44 155X10 13,19 26,71 5,97
11
48 166X10 13,22 27,12 6,06
11
52 157X10 13,20 27,26 6,09
11
56 160X10 13,20 27,36 6,12
11
60 170X10 13,23 27,40 6,12
-1
µm = 0,41 h
tg = 1,69 h
Ya = 27,40 u/ml
85
GRAFICO N° S-1

A 45°C, pH 7.5, 75 rpm, y vvm 1.5 (S-E1,DISEÑO PLACKETT Y BURMAN)
14
12
10
Log N° Céluas
8
N° Células
6
0
0 4 8 12 20 28 36 44 52 60
Tiempo ( h )
GRAFICO N° S-2

A 45°C, pH 7.5, 75 rpm, y vvm 1.5 (S-E1, DISEÑO PLACKETT Y BURMAN)
30
Act. Amilasa U/mL
25
20
15
Amilasa
10
0
0 4 8 12 20 28 36 44 52 60
Tiempo ( h )
86
CUADRO N° OA-4
EXPERIMENTO 4

A 45°C, pH 7.5, 75 rpm, vvm 1.5 (DISEÑO PENDIENTE ASCENDENTE)

(Horas) CELULAS cél/ml. AMILASA TOTAL
(ufc/ml) (u/ml) (mg/ml)
6
0 64X10 7,81 0,00 0,00
6
4 75X10 7,88 0,00 0,00
7
8 11X10 8,04 0,00 0,00
8
12 61X10 9,79 0,00 0,00
9
16 297X10 11,47 0,41 0,09
10
20 275X10 12,44 2,05 0,46
11
24 47X10 12,67 3,56 0,80
11
28 43X10 12,63 13,15 2,94
11
32 56X10 12,75 28,77 6,43
11
36 61X10 12,79 31,44 7,03
11
40 89X10 12,95 31,58 7,06
11
44 99X10 13,00 31,71 7,09
11
48 115X10 13,06 31,85 7,12
11
52 115X10 13,06 32,19 7,19
11
56 115X10 13,06 32,33 7,23
11
60 115X10 13,06 32,84 7,34
-1
µm = 0,43 h
tg = 1,62 h
Ya = 32,84 U/mL
87
GRAFICO N° E-7

A 45°C, pH 7.5, 75 rpm, y vvm 1.5 (OA-E4,DISEÑO PENDIENTE ASCENDENTE)
14
12
Log N° Células
10
8
N° células
6
0
0 4 8 12 20 28 36 44 52 60
Tiempo ( h )
GRAFICO N° E-8

A 45°C, pH 7.5, 75 rpm, y vvm 1.5 (OA-E4, DISEÑO PENDIENTE ASCENDENTE)
35
Act. Amilasa (U/mL)
30
25
20
Amilasa
15
10
0
0 4 8 12 20 28 36 44 52 60
Tiempo ( h )
88
CUADRO N° O-2
EXPERIMENTO 2

A 45°C, pH 7.5, 75 rpm, y vvm 1.5 (DISEÑO ROTABLE HESAGONAL)

(Horas) CELULAS cél/ml. AMILASA TOTAL
(ufc/ml) (u/ml) (mg/ml)
6
0 31X10 7,49 0,00 0,00
6
4 49X10 7,61 0,00 0,00
7
8 13X10 8,11 0,00 0,00
8
12 62X10 9,79 0,00 0,00
9
16 257X10 11,41 1,15 0,26
10
20 291X10 12,46 2,05 0,46
11
24 75X10 12,88 4,11 0,92
11
28 89X10 12,95 18,08 4,04
11
32 95X10 12,98 28,49 6,37
11
36 105X10 13,02 31,85 7,12
11
40 121X10 13,08 32,19 7,19
11
44 140X10 13,15 32,88 7,35
11
48 143X10 13,16 33,08 7,39
11
52 157X10 13,20 33,15 7,41
11
56 166X10 13,22 33,22 7,42
11
60 174X10 13,24 33,22 7,42
-1
µm = 0,41 h
tg = 1,68 h
Ya = 33,22 U/mL
89
GRAFICO N° O-3

A 45°C, pH 7.5, 75 rpm, y vvm 1.5 (O-E2,DISEÑO ROTABLE HEXAGONAL)
Amilasa
14
12
Log N° Células
10
8
Amilasa
6
0
0 4 8 12 20 28 36 44 52 60
Tiempos ( h )
GRAFICO N° O-4
ACTIVIDAD DE AMILASA DE Bacillus megaterium MFFB-UNMSM - 39 EN

A 45°C, pH 7.5, 75 rpm, y vvm 1.5 (OF-E2, DISEÑO ROTABLE HEXAGONAL)
35
Act. Amilasa (U/mL)
30
25
20
Amilasa
15
10
0
0 4 8 12 20 28 36 44 52 60
Tiempo ( h )
90

Vargas As

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A Dora Amalia, por su constante

A Luis Fernando, por animarme a

A la Mg. Mirtha Roque Alcarraz, por su

A los señores profesores de la Facultad

Presidenta: Dra. Elizabeth Gonzales Loayza

Of the 120 isolated microorganisms of floors of citric of the town of Huaral,

Key word: Isolation of bacteria, cassava starch, amylase production

De los 120 microorganismos aislados de suelos de cítricos de la localidad de

Las amilasas son enzimas extracelulares que hidrolizan el almidón, y que

Actualmente en nuestro medio, no se han profundizado estudios de producción

En el presente trabajo de investigación hemos realizado el aislamiento y luego

Para llevar adelante el presente estudio, se evaluó la producción de amilasa de

La hipótesis planteada fue:

2.2. DISTRIBUCIÓN Y MODO DE ACCIÓN DE LA α-AMILASA. -

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pobre. (Walker y Whelan. 1960). La hidrólisis de los enlaces glicosídicos α-(1,4)

2.3. DISTRIBUCIÓN Y OCURRENCIA DE LA β-AMILASA. -

embargo incompleta. La acción de la β-amilasa sobre la amilopectina resulta en la

Puesto que la enzima hidroliza enlaces glicosídicos alternados, el producto de

2.4. LIQUEFACCION Y SACARIFICACION DE LA α-AMILASA .-

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2.6. EL ALMIDÓN COMO SUBSTRATO.-

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La insolubilización espontánea del almidón en soluciones acuosas es

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PROPIEDADES DE ALGUNAS α-AMILASA BACTERIANAS

B. acidocaldaricus 3.5 75 6.8X104

Fuente: Fogarty, (1973). Microbial amylases

PROPIEDADES DE ALGUNAS α-AMILASA FUNGICAS

MICROORGANISMO PH TEMPERATURA PES0

Aspergillus niger 5.0-.6.0 60 -.-

Fuente: Fogarty, (1973). Microbial amylases

COMPOSICIÓN BROMATOLÓGICA DE PRODUCTOS VEGETALES

PRODUCTO ALMID PROT. LÍPIDOS FIBRA CENIZA AGUA

COMPOSICIÓN DE AMILOSA Y AMILOPECTINA EN ALMIDONES

PRODUCTO AMILOSA (%) AMILOPECTINA(%)

Gilbolt, (1968), Structure de L’almidon dans “Progres en chimie agricole et

COMPOSICIÓN BROMATOLÓGICA DE ALMIDÓN DE YUCA

VARIABLES MEDIA % DESVIACION CV (%)

CEREDA, (1996). Caracterizaçião, usos e tratamentos de residuos da

Achi, O.K, y col. (1992). Reportan el estudio de producción de amilasa por

Mai, N.T.,y col. (1992). Evaluaron 25 bacterias termófilas productoras de

Goyal, y Sidhu, (1995). Reportan la producción y estabilidad de una α-

Okolo, y col. (1993). Realizaron estudios sobre el rendimiento de la actividad

Niziolek, (1997). Investigó la producción extracelular de beta-amilasa de

3.1.- COLECCIÓN DE LA MUESTRA.-

De la localidad de Huaral, Distrito de Huando del Departamento de Lima, se

3.2.- AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE CEPAS PRODUCTORAS DE

3.3. IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS.-

3.6.- EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA. -

3.8.- OPTIMIZACIÓN DEL SUSTRATO EXPERIMENTAL.-

4.1.- AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE CEPAS PRODUCTORAS DE

4.2.- IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS.-

4.3.- EVALUACIÓN DE BACILLUS PRODUCTORES DE AMILASA. -

El cuadro N° 1 nuestra la producción de amilasa de 6 cepas de Bacillus

En el cuadro N° 2 y en los gráficos N° 3 y N° 4, se muestran la cinética de

SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS AISLADOS DE SUELOS DE CITRICOS

CARACTERISTICAS BIOQUMICAS DIFERENCIALES DE MICROORGANISMOS

IDENTIFICACION DE LOS MICROORGANISMOS AISLADOS DE SUELOS

NUMERO Y PORCENTAJE DE DIFERENTES ESPECIES DE BACILLUS

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