LABORATORIO VIRTUAL, DETERMINACIÓN DE LA GLUCEMIA

(CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA EN SANGRE)

A través de un navegador en la red de internet, debe ingresar haciendo click en la siguiente

dirección electrónica

http://biomodel.uah.es/lab/abs/ensayo.htm

En la página inicial, encontrará una pestaña de instrucciones; para trabajar la actividad

correspondiente, usted debe seleccionar la pestaña “Glucemia”, se cargará entonces un
entorno virtual en el que observará a la izquierda la guía operativa, y a la derecha, el
simulador de la práctica con lo necesario para ejecutarla.

INTRODUCCION

En la actualidad existen varios métodos para la medición de la glucosa en sangre, siendo los
más conocidos: la glicemia central; la glucosa capilar por medio de un glucómetro, y el
monitoreo continuo de glucosa por medio de un sensor.
La glicemia central es la medida de la glucosa libre extraída del plasma en una muestra
venosa y varía según el ayuno (menor a 100 mg/dL) o postprandial (menor a 140 mg/dL) dos
horas después de la ingesta de alimento en personas normales.

FUNDAMENTO:
Reacción catalizada por la enzima, que permite la detección de su actividad:
glucosa ácido glucónico d-gluconolactona
H O HO O
O
C C C

O 2, H 2O
H C OH H C OH H C OH

O
HO C H HO C H HO C H

H C OH glucosa oxidasa H C OH H C OH

H C OH H C OH
H 2O 2 H C

H2C OH H2C OH CH2 OH

4-aminofenazona
fenol quinonaimina
(4-aminoantipirina)
(coloreada, lmáx=505 nm)
2 H2O2 4 H2O
H3C H3C

N CH3 N CH3
N
+ OH N

NH2 peroxidasa N O
O O

La enzima glucosa oxidasa es una oxidorreductasa que cataliza la oxidación de

la glucosa para formar peróxido de hidrógeno y D-glucono-δ-lactona. en las células
contribuye a degradar los azúcares hacia sus metabolitos.

La glucosa oxidasa es ampliamente utilizada para la determinación y cuantificación de

glucosa libre en los fluidos biológicos, tales como sangre y orina, en materia prima vegetal y
en la industria de los alimentos. Tiene además muchas aplicaciones en biotecnología, y se
utiliza para la fabricación de biosensores sensibles a glucosa.1 Usualmente se extrae de
Aspergillus niger.

Estructura tridimensional de la Glucosa oxidasa

Actividad de la Glucosa Oxidasa

A pH 7, la glucosa está presente en solución en forma de hemiacetal cíclico, siendo un 63,6%
β-D-glucopiranosa y un 36,4% α-D-glucopiranosa (la proporción de moléculas lineales y de
furanosa es despreciable). La glucosa oxidasa se une específicamente a la β-D-glucopiranosa
y no interacciona con α-D-glucopiranosa. Es capaz de oxidar toda la glucosa en la solución,
dado que el equilibrio entre los anómeros α y β es conducido hacia la forma β conforme ésta
va siendo consumida en la reacción.

La glucosa oxidasa cataliza la oxidación de β-D-glucosa en D-glucono-1,5-lactona, que es

hidrolizada a ácido glucónico.

Para actuar como catalizador, la GOx requiere un cofactor, el flavín adenín dinucleótido
(FAD). El FAD es un componente común en las reacciones de oxidorreducción biológicas.
Las reacciones redox conllevan una pérdida o ganancia de electrones de una molécula. En la
reacción redox catalizada por la GOx, el FAD actúa como el aceptor inicial de electrones y
es reducido a FADH2. Después el FADH2 es oxidado por oxígeno molecular (O2) que
desempeña el papel de aceptor final de electrones. El oxígeno es capaz de ello debido a que
tiene un potencial de reducción mayor. Como consecuencia el O2 es reducido a peróxido de
hidrógeno (H2O2).

Aplicaciones
La glucosa oxidasa es ampliamente utilizada acoplada a una reacción mediada por la
peroxidasa que permite visualizar colorimétricamente el H2O2 formado, de este tipo son los
ensayos para la determinación de glucosa libre en el suero o plasma sanguíneo utilizados con
finalidades diagnósticas. La reacción es adaptable a procedimientos manuales utilizando un
espectrofotómetro o a técnicas automatizadas, e incluso para su utilización en ensayos
rápidos como los de las tiras reactivas de orina. Ensayos similares permiten monitorear los
niveles de glucosa en procesos de fermentación, biorreactores, y el control de niveles de
glucosa en materia prima vegetal y productos alimentarios.

Los biosensores de electrodo enzimático permiten detectar los niveles de glucosa al llevar un
registro de los electrones que pasan a través de la enzima. La enzima se encuentra depositada
sobre un electrodo y lo que se mide es el potencial eléctrico generado por la reacción. Esto
ha hecho posible la fabricación de microsensores que resultan verdaderas proezas
nanotecnológicas y que son utilizados, por ejemplo, en los sensores caseros que miden el
nivel de glucosa sanguínea utilizados por muchos diabéticos.

Enzima peroxidasa
La peroxidasa, es una enzima que cataliza la oxidación de un amplio número de sustratos
orgánicos e inorgánicos, utilizando el poder oxidante del peróxido de hidrógeno.

Donante + H2O2 Donante oxidado + H2O

Esta enzima utiliza como cofactor el grupo hemo y es utilizada ampliamente en bioquímica
clínica. Así, los ensayos para la determinación y cuantificación de metabolitos como glucosa,
ácido úrico, colesterol o triglicéridos en fluidos biológicos usan peroxidasa como enzima
acoplada. También se utiliza en inmunoensayos para la detección de virus tan conocidos
como el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) causante del sida o el herpesvirus. La
peroxidasa también se utiliza como biocatalizador para la generación de productos de interés
biotecnológico e industrial como resinas fenólicas, adhesivos, antioxidantes, antiestáticos y
protectores de radiación magnética, colorantes alimentarios y componentes bioactivos de
detergentes.

PROCEDIMIENTO DE LABORATORIO VIRTUAL

Determinación de la glucemia (concentración de glucosa en sangre)

Materiales:

• Dos muestras de suero en las que se quiere deteminar la concentración de glucosa

• Disolución control de glucosa (o patrón), con concentración verificada de 100 mg/dℓ
• Disolución salina: NaCl 0.9 g/ℓ
• R: reactivo cromógeno, que contiene:
o glucosa oxidasa (EC 1.1.3.4)
o peroxidasa (EC 1.11.1.7)
o fenol
o 4-aminofenazona (PubChem CID: 6009; InChIKey:
RMMXTBMQSGEXHJ-UHFFFAOYSA-N)
o tampón Tris 92 mM, pH=7.4

Preparación del experimento:

Conecta el espectrofotómetro y ajusta la longitud de onda a 505 nm.

Empleando las micropipetas de volumen variable P200 y P1000, prepara en los tubos de
ensayo las mezclas descritas en la tabla:
Notas:
• El control se va a analizar por triplicado (tubos 1, 2, 3).
• Las diluciones del suero no se pueden realizar en este laboratorio virtual, pero se
aplican internamente: aunque la pipeta tome muestra del frasco sin diluir, lo que se
ponga en los tubos 7 y 10 se considerará diluido 1/2 y en los tubos 8 y 11 diluido 1/5.

Cuando estén todos completos, añade 2 mℓ del reactivo cromógeno a cada uno de los tubos
y espera para que se desarrolle la reacción (15 min virtuales).

Usa la pipeta Pasteur para transferir el contenido del tubo nº 0 a la cubeta de

espectrofotómetro. Mete la cubeta al especrofotómetro y pulsa el botón “A=0”. Saca la cubeta
y vacíala.

Transfiere con la pipeta Pasteur el contenido del tubo nº 1 a la cubeta, mete ésta al
espectrofotómetro y anota el valor de absorbancia en tu cuaderno de laboratorio. Puedes
pulsar el botón para registrar la lectura de absorbancia en la pantalla inferior.
Repite el procedimiento para el resto de tubos.

Construye una tabla con las medidas. Puedes pulsar el botón para copiar el listado de
valores de absorbancia.

Análisis de resultados:
Anota en tu Informe de laboratorio el código asignado a tu experimento (por
ejemplo XXX).
Calcula la concentración de glucosa en los tubos control (1 a 3) y calcula el promedio de
sus absorbancias.
Empleando la ley de Lambert-Beer: A = ε × ℓ × c, mediante comparación de cada muestra
problema con el control, calcula:
• la concentración de glucosa en cada uno de los tubos 6 a 11;
• la concentración de glucosa en cada uno de los dos sueros de partida (A y B).

NOTA ADICIONAL
Puedes practicar los cálculos para la determinación de concentraciones en el siguiente
enlace:
http://biomodel.uah.es/lab/calculos/glucosa/inicio.htm
Para realizar una regresión simple a partir de datos experimentales y construir una recta

https://www.youtube.com/watch?v=4PiiSUxcalg

Para ajustar los datos con diversas tendencias

https://www.excelavanzado.com/2018/03/regresion-polinomica.html