Cromatografía de Intercambio iónico

Una resina de intercambio iónico, consiste en una matriz insoluble con grupos cargados unidos
covalentemente. Existen resinas disponibles comercialmente con carga negativa y positiva. Las
resinas cargadas negativamente enlazan moléculas cargadas positivamente (cationes). Estas
resinas pueden enlazar un catión, pero al estar presente otro tipo de catión, este puede
desplazar al primero,  intercambiarse con él. Por esto estas resinas se llaman intercambiadoras
de cationes. De manera similar, resinas intercambiadoras de aniones están cargadas positivo y
enlazan (intercambian) iones cargados negativamente (aniones)

A resina intercambiadora de cationes con contra-iones positivos enlazados

B resina intercambiadora de cationes con contra-iones positivos enlazados

Las proteínas son moléculas cargadas. Muchas cadenas laterales de los aminoácidos son
ionizables, (ej. Lisina o ácido glutámico), como también los extremos amino y C terminal de un
polipéptido. Esta característica puede ser utilizada para separar diferentes proteínas por
cromatografía de intercambio iónico. Las dos resinas más utilizadas son carboximetilcelulosa
(CM-cellulose) y dietilaminetilen-celulosa (DEAE-cellulose). Estas son celulosas granulares que
han sido químicamente modificadas. En la CM-cellulose los grupos CH 2OH del carbohidrato,
han sido convertidos a grupos –CH2OCH2COOH. A pH neutro este grupo se encuentra ionizado
como –CH2OCH2COO-  , entonces la CM-celulosa esta negativamente cargada y es un
intercambiador de cationes.  La DEAE-cellulose contiene una amina terciaria como grupo
ionizable. Se encuentra cargada positivamente a pH neutro y es un intercambiador de aniones.
Esta simulación incluye las siguiente resinas intercambiadoras: CM celullose, DEAE-cellulose,
Q-sepharose Fast Flow y S-Sepharose Fast Flow. El grupo cargado de la Q-Sepharosa es una
amina cuaternaria que contiene una carga positiva no titulable, por lo tanto esta resina puede
ser utilizada a pH alcalino donde la carga positiva del grupo DEAE estaría neutralizada. El
grupo cargado de la S-sepharosa es el grupo sulfonil (-SO 3-).

El fraccionamiento de proteínas por cromatografía de intercambio iónico depende de las

diferencias en las cargas de las proteínas. La carga de una proteína dependerá del número y el
tipo de aminoácidos con cadenas laterales ionizables que contenga. Los residuos de lisina, por
ejemplo tienen una cadena lateral que adquiere carga positiva, mientras que el ácido glutámico
adquiere carga negativa cuando se ioniza. Cada grupo ionizable posee su pKa distinto; que
representa al pH donde se produce la mitad de la disociación. Debido a que diferentes
proteínas tienen diferente composición de aminoácidos, tenderán a tener diferentes cargas a un
mismo pH, por lo que pueden ser separadas por este principio.

La resina es mezclada con buffer para formar una suspensión la cual es vaciada en una
columna de cromatografía. El pH del buffer inicial es importante ya que va a determinar la carga
de las proteínas a separar. El buffer inicial debe estar al menos una unidad bajo o sobre el pI
de la proteína para poder ser enlazada. De todas maneras las resinas de CM-cellulosa o
DEAE-cellulosa solo son efectivas entre pH 5-9. Además de cuidar el pH correcto del buffer
inicial, hay que tener cuidado en la concentración salina de la fase móvil, esta debe ser lo
suficientemente baja ya que la afinidad de las proteínas por la resina de intercambio disminuye
al aumentar la fuerza iónica de la fase móvil. De hecho esta propiedad es utilizada como un
método para eluir la columna de proteínas.

Cuando se compran las resinas de intercambio iónico, los iones unidos ala resina se llaman
contra-iones. Para la CM-celullose el contra-ión es usualmente Na + y para la DEAE- celullosa el
contra-ion es normalmente Cl-.Una vez preparada la columna, se lava la resina con buffer inicial
y posteriormente se aplica la mezcla de proteínas. Las proteínas que tengan una carga opuesta
a la resina se unirán a ella, desplazando los contra-iones. Proteínas con la misma carga que la
resina no se unirán a esta y continuaran por la columna. Las diferentes proteínas enlazadas en
la columna, tendrán diferentes afinidades por el intercambiador iónico, debido a sus cargas
netas. Estas afinidades se pueden cambiar, ya sea variando el pH de la fase móvil o la
concentración salina de esta.

Purificación de la proteína 49
Cromatografía de Afinidad
La cromatografía de afinidad es mucho más específica que otras técnicas de purificación. Se
basa en la preparación de una matriz en la cual la proteína de interés, y preferiblemente sólo
esta proteína, se unirá irreversiblemente. La matriz es usualmente agarosa granulada
(Sepharosa o BioGel A), poliacrilamida (por ej: Biogel P) o dextrano entrelazado( ej. Sephacryl)
a la cual se une covalentemente un ligando.

La naturaleza química del ligando se determina por la especificidad biológica conocida de la

proteína de interés. En la práctica, la cromatografía de afinidad ha sido utilizado para purificar
proteínas como inmunoglobulinas, receptores de membrana, enzimas y hormonas, así como
ácidos nucleicos e incluso células completas. En el caso de una enzima, el ligando escogido
será probablemente un sustrato o inhibidor reversible o activador. Se puede tratar de utilizar un
ligando que es absolutamente específico o en su defecto, específico para un grupo de enzimas.
Por ejemplo si se utiliza 5’AMP como ligando, su similitud estructural a NAD+ causa que se
enlacen muchas deshidrogenasas NAD+ dependientes  que son posteriormente purificadas
individualmente.

El procedimiento para la cromatografía de afinidad para proteínas es similar a otros tipos de

cromatografía líquida. La matriz es empaquetada en una columna en un buffer optimo para el
enlace proteína-ligando. El buffer debe contener cofactores como iones metálicos que sean
necesarios para el enlace. La muestra se aplica en la columna. Idealmente, solo la enzima de
interés debería enlazar.  Puede ser eluída específicamente agregando una alta concentración
de sustrato o inhibidor competitivo, o cambiando el pH /fuerza iónica para interrumpir la
interacción enzima-ligando.

Un protocolo alternativo puede ser utilizado si está disponible un anticuerpo específico para la
proteína de interés. Este procedimiento es aplicable a todas las proteínas sin importar sus
actividades funcionales. El anticuerpo es unido covalentemente a una matriz adecuada y luego
la matriz es empaquetada en una columna ,la que posteriormente es cargada con la mezca de
proteínas. Sólo la proteína de interés se unira al anticuerpo y posteriormente puede ser eluida
utilizando condiciones que debiliten la interacción antígeno-anticuerpo.

La cromatografía de afinidad  es teóricamente capaz de purificar una sola proteína de una

mezcla compleja en un solo paso. De todas maneras, aunque  esta condición teórica no sea
alcanzada experimentalmente, el grado de purificación es comúnmente óptimo. Esta técnica es
quizás la técnica de purificación preparativa más poderosa, disponible actualmente. La
cromatografía de afinidad puede ser utilizada sólo cuando la actividad funcional de la proteína
de interés es conocida y se dispone de un ligando adecuado, o cuando se dispone de un
anticuerpo específico para la proteína de interés. Desafortunadamente, en muchos casos
ninguna de estas condiciones es satisfecha y la purificación de proteínas debe realizarse por
procedimientos más generales.

 En esta simulación, se encuentran disponibles tres tipos de anticuerpos monoclonales

inmovilizados para cada proteína de la mezcla. Estos difieren en sus afinidades por la proteína.
Anticuerpos de baja afinidad no enlazarán la proteína con la fuerza suficiente para prevenir su
pasaje a través de la columna. Anticuerpos de muy alta afinidad enlazarán tan firmemente la
proteína,que impedirán la elución de la forma activa de la enzima.Entonces necesitará utilizar
los anticuerpos de afinidad mediana. Usted necesitará realizar algunos experimentos para
averiguar la fuerza de unión de los anticuerpos!. Una preparación de IgG policlonal inmovilizada
también está disponible y para algunas proteínas , un inhibidor competitivo inmovilizado.
Cromatografía de Intercambio iónico
Una resina de intercambio iónico, consiste en una matriz insoluble con grupos cargados unidos
covalentemente. Existen resinas disponibles comercialmente con carga negativa y positiva. Las
resinas cargadas negativamente enlazan moléculas cargadas positivamente (cationes). Estas
resinas pueden enlazar un catión, pero al estar presente otro tipo de catión, este puede
desplazar al primero,  intercambiarse con él. Por esto estas resinas se llaman intercambiadoras
de cationes. De manera similar, resinas intercambiadoras de aniones están cargadas positivo y
enlazan (intercambian) iones cargados negativamente (aniones)

A resina intercambiadora de cationes con contra-iones positivos enlazados

B resina intercambiadora de cationes con contra-iones positivos enlazados

Las proteínas son moléculas cargadas. Muchas cadenas laterales de los aminoácidos son
ionizables, (ej. Lisina o ácido glutámico), como también los extremos amino y C terminal de un
polipéptido. Esta característica puede ser utilizada para separar diferentes proteínas por
cromatografía de intercambio iónico. Las dos resinas más utilizadas son carboximetilcelulosa
(CM-cellulose) y dietilaminetilen-celulosa (DEAE-cellulose). Estas son celulosas granulares que
han sido químicamente modificadas. En la CM-cellulose los grupos CH 2OH del carbohidrato,
han sido convertidos a grupos –CH2OCH2COOH. A pH neutro este grupo se encuentra ionizado
como –CH2OCH2COO-  , entonces la CM-celulosa esta negativamente cargada y es un
intercambiador de cationes.  La DEAE-cellulose contiene una amina terciaria como grupo
ionizable. Se encuentra cargada positivamente a pH neutro y es un intercambiador de aniones.
Esta simulación incluye las siguiente resinas intercambiadoras: CM celullose, DEAE-cellulose,
Q-sepharose Fast Flow y S-Sepharose Fast Flow. El grupo cargado de la Q-Sepharosa es una
amina cuaternaria que contiene una carga positiva no titulable, por lo tanto esta resina puede
ser utilizada a pH alcalino donde la carga positiva del grupo DEAE estaría neutralizada. El
grupo cargado de la S-sepharosa es el grupo sulfonil (-SO 3-).

El fraccionamiento de proteínas por cromatografía de intercambio iónico depende de las

diferencias en las cargas de las proteínas. La carga de una proteína dependerá del número y el
tipo de aminoácidos con cadenas laterales ionizables que contenga. Los residuos de lisina, por
ejemplo tienen una cadena lateral que adquiere carga positiva, mientras que el ácido glutámico
adquiere carga negativa cuando se ioniza. Cada grupo ionizable posee su pKa distinto; que
representa al pH donde se produce la mitad de la disociación. Debido a que diferentes
proteínas tienen diferente composición de aminoácidos, tenderán a tener diferentes cargas a un
mismo pH, por lo que pueden ser separadas por este principio.

La resina es mezclada con buffer para formar una suspensión la cual es vaciada en una
columna de cromatografía. El pH del buffer inicial es importante ya que va a determinar la carga
de las proteínas a separar. El buffer inicial debe estar al menos una unidad bajo o sobre el pI
de la proteína para poder ser enlazada. De todas maneras las resinas de CM-cellulosa o
DEAE-cellulosa solo son efectivas entre pH 5-9. Además de cuidar el pH correcto del buffer
inicial, hay que tener cuidado en la concentración salina de la fase móvil, esta debe ser lo
suficientemente baja ya que la afinidad de las proteínas por la resina de intercambio disminuye
al aumentar la fuerza iónica de la fase móvil. De hecho esta propiedad es utilizada como un
método para eluir la columna de proteínas.

Cuando se compran las resinas de intercambio iónico, los iones unidos ala resina se llaman
contra-iones. Para la CM-celullose el contra-ión es usualmente Na + y para la DEAE- celullosa el
contra-ion es normalmente Cl-.Una vez preparada la columna, se lava la resina con buffer inicial
y posteriormente se aplica la mezcla de proteínas. Las proteínas que tengan una carga opuesta
a la resina se unirán a ella, desplazando los contra-iones. Proteínas con la misma carga que la
resina no se unirán a esta y continuaran por la columna. Las diferentes proteínas enlazadas en
la columna, tendrán diferentes afinidades por el intercambiador iónico, debido a sus cargas
netas. Estas afinidades se pueden cambiar, ya sea variando el pH de la fase móvil o la
concentración salina de esta.

Purificación de la proteína 12
Cromatografía de Afinidad
La cromatografía de afinidad es mucho más específica que otras técnicas de purificación. Se
basa en la preparación de una matriz en la cual la proteína de interés, y preferiblemente sólo
esta proteína, se unirá irreversiblemente. La matriz es usualmente agarosa granulada
(Sepharosa o BioGel A), poliacrilamida (por ej: Biogel P) o dextrano entrelazado( ej. Sephacryl)
a la cual se une covalentemente un ligando.

La naturaleza química del ligando se determina por la especificidad biológica conocida de la

proteína de interés. En la práctica, la cromatografía de afinidad ha sido utilizado para purificar
proteínas como inmunoglobulinas, receptores de membrana, enzimas y hormonas, así como
ácidos nucleicos e incluso células completas. En el caso de una enzima, el ligando escogido
será probablemente un sustrato o inhibidor reversible o activador. Se puede tratar de utilizar un
ligando que es absolutamente específico o en su defecto, específico para un grupo de enzimas.
Por ejemplo si se utiliza 5’AMP como ligando, su similitud estructural a NAD+ causa que se
enlacen muchas deshidrogenasas NAD+ dependientes  que son posteriormente purificadas
individualmente.

El procedimiento para la cromatografía de afinidad para proteínas es similar a otros tipos de

cromatografía líquida. La matriz es empaquetada en una columna en un buffer optimo para el
enlace proteína-ligando. El buffer debe contener cofactores como iones metálicos que sean
necesarios para el enlace. La muestra se aplica en la columna. Idealmente, solo la enzima de
interés debería enlazar.  Puede ser eluída específicamente agregando una alta concentración
de sustrato o inhibidor competitivo, o cambiando el pH /fuerza iónica para interrumpir la
interacción enzima-ligando.

Un protocolo alternativo puede ser utilizado si está disponible un anticuerpo específico para la
proteína de interés. Este procedimiento es aplicable a todas las proteínas sin importar sus
actividades funcionales. El anticuerpo es unido covalentemente a una matriz adecuada y luego
la matriz es empaquetada en una columna ,la que posteriormente es cargada con la mezca de
proteínas. Sólo la proteína de interés se unira al anticuerpo y posteriormente puede ser eluida
utilizando condiciones que debiliten la interacción antígeno-anticuerpo.

La cromatografía de afinidad  es teóricamente capaz de purificar una sola proteína de una

mezcla compleja en un solo paso. De todas maneras, aunque  esta condición teórica no sea
alcanzada experimentalmente, el grado de purificación es comúnmente óptimo. Esta técnica es
quizás la técnica de purificación preparativa más poderosa, disponible actualmente. La
cromatografía de afinidad puede ser utilizada sólo cuando la actividad funcional de la proteína
de interés es conocida y se dispone de un ligando adecuado, o cuando se dispone de un
anticuerpo específico para la proteína de interés. Desafortunadamente, en muchos casos
ninguna de estas condiciones es satisfecha y la purificación de proteínas debe realizarse por
procedimientos más generales.

 En esta simulación, se encuentran disponibles tres tipos de anticuerpos monoclonales

inmovilizados para cada proteína de la mezcla. Estos difieren en sus afinidades por la proteína.
Anticuerpos de baja afinidad no enlazarán la proteína con la fuerza suficiente para prevenir su
pasaje a través de la columna. Anticuerpos de muy alta afinidad enlazarán tan firmemente la
proteína,que impedirán la elución de la forma activa de la enzima.Entonces necesitará utilizar
los anticuerpos de afinidad mediana. Usted necesitará realizar algunos experimentos para
averiguar la fuerza de unión de los anticuerpos!. Una preparación de IgG policlonal inmovilizada
también está disponible y para algunas proteínas , un inhibidor competitivo inmovilizado.