“Año de la Universalización de la Salud“

UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA

FACULTAD DE INGENERIA PESQUERA

DEPARTAMENTO ACADEMICO DE INGENERIA PESQUERA

INFORME 2
“COLORACIONES Y CARACTERÍSTICAS
MORFOLÓGICAS DE BACTERIAS COMUNES”

CURSO : MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS

ALUMNOS : ARRUNATEGUI TIMANA CRISTHIAN

TALLEDO RAMIREZ CESAR

DOCENTE : ING. LEYTON MASIAS HUALTER

INTRODUCCIÓN

Como casi todos los microorganismos son casi incoloros cuando se los observa a
través de un microscopio óptico estándar, a menudo es preciso prepararlos para la
observación y una de las maneras de hacerlo consiste en someterlos a tinción
(coloración). (Allen, 2008)

La mayoría de observaciones iniciales de los microorganismos se realiza con

preparados teñidos. El término tinción significa simplemente colorear los
microorganismos con un colorante que destaque ciertas estructuras. Sin embargo
antes de teñir a los microorganismos se los debe fijar (adherir) al portaobjetos. El
proceso de fijación produce la muerte simultánea de los microorganismos y su
adherencia al portaobjetos. También preserva diversas partes de los microbios en su
estado natural con una distorsión mínima. (Tortora et al, 2007)

Los colorantes son sales compuestas por un ión positivo y un ión negativo, uno de
los cuales está coloreado y se conoce como cromóforo. El color de los denominados
colorantes básicos está en el ión positivo; en los colorantes ácidos, está en el ión
negativo. En un PH de 7 las bacterias presentan una carga levemente negativa. Por
lo tanto el ión positivo coloreado en un colorante básico es atraído hacia la célula
bacteriana con carga negativa. Los colorantes básicos entre los que se encuentran el
violeta de genciana, azul de metileno, verde de malaquita y la safranina, se utilizan
con más frecuencia que los colorantes ácidos. Son ejemplos de colorantes ácidos la
eosina, la fucsina ácida y la nigrosina. Para aplicar los colorantes ácidos o básicos
los microbiólogos emplean tres técnicas de tinción: simple, diferencial y especial.
(Tortora et al, 2007)

La tinción diferencial de Gram, es la más importante y la que más se emplea para

observar las bacterias; utiliza un colorante (violeta), un fijador (yodo), un
decolorante (alcohol), y otro colorante para teñir de diferente color las bacterias que
se decoloran en la primera fase de la tinción (normalmente colorante rojo). La
tinción Gram, permite clasificar las bacterias en gramnegativas ( se decoloran con el
alcohol y vuelven a colorearse con el segundo colorante, por lo que se ven rojas) y
grampositivas (no se decoloran con el alcohol y siguen de color azul violeta). (De la
Rosa et al, 2003)

En general, las técnicas de tinción son imprescindibles para el estudio

microbiológico de las bacterias, constituyendo el primer paso en el examen
bacteriológico que, para completarse y conducir a la identificación, precisa de otras
técnicas complementarias de identificación como, por ejemplo, las pruebas
bioquímicas. (Granados et al, 1997)

Las técnicas de coloración, como primer paso, constituyen una práctica diaria en el
laboratorio de microbiología, por lo que se deberá considerar que son muchos los
factores que pueden alterar los resultados obtenidos en toda técnica de tinción; una
de ellas y la más importante, la pureza del colorante, aí como la concentración, PH
entre otros factores. (Granados et al, 1997)
El objetivo de la práctica fue familiarizarnos con las técnicas de observación de
microorganismos mediante preparaciones en fresco y en seco así como aplicar las
técnicas básicas de coloraciones diferenciales Gram y tinción de esporas.

MATERIAL Y MÉTODOS
II.-

PARTES DEL MICROSCOPIO ÓPTICO, DE CAMPO CLARO

Al iniciar la clase se identificaron las partes del microscopio óptico de campo claro, para su
buena utilización.

OBSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS MEDIANTE PREPARACIONES EN

FRESCO

MONTAJE HÚMEDO:
Se colocó sobre el portaobjetos una gota de agua verde que contenía micro algas; se cubrió
ésta con un cubreobjetos procurando evitar la entrada de aire. La observación fue a gran
aumento. En otro portaobjetos se colocó una pequeña muestra de inoculo de E.M
(microorganismos efectivos) se cubrió con un cubreobjetos y se observó en el microscopio
a mayor aumento.
OBSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS MEDIANTE PREPARACIONES EN SECO

COLORACIÓN SIMPLE:

Sobre un portaobjeto limpio se colocó una gota de agua, luego se añadió una porción
pequeña de la sustancia portadora del inoculo: Escherichia coli. se extendió la preparación
y se fijó pasando la lámina a través de la llama hasta que la extensión se seque. se cubrió la
extensión con colorante azul de metileno por 1 minuto. Se lavó el exceso del colorante
evitando el desprendimiento del preparado, se secó al medio ambiente. Esta muestra se
observó en el microscopio utilizando el objetivo de inmersión, colocando previamente
sobre la extensión, una gota de aceite de cedro.

COLORACIONES COMPUESTAS:

 COLORACIÓN GRAM: En una lado del portaobjeto se hizo una circunferencia con
el marcador, al reverso de la lámina se colocó una gota de medio líquido con
bacterias Staphylococcus aureus y Escherichia coli, luego se extendió la muestra
sobre el área marcada en la circunferencia. Se fijó la muestra pasándola por el
mechero, siempre controlando la temperatura con nuestras manos. Luego se cubrió
la muestra con cristal violeta por 1 minuto aproximadamente, pasado éste tiempo se
lavó el portaobjetos con agua a chorro. Se cubrió con lugol y se deja actuar por 2
minutos, luego se lavó y se procedió a decolorar con alcohol acetona hasta que no se
desprendiera más colorante de la lámina, luego se lavó y se agregó safranina por 30
segundos; finalmente, se lavó, secó y se observó con el objetivo de inmersión.

 COLORACIÓN DIFERENCIAL DE ESPORAS Y CÉLULAS VEGETTIVAS:

Se hizo la extensión bacteriana de Bacillus sp. , y se fijó al calor, luego se agregó
verde de malaquita; se calentó sin que éste hierva hasta el desprendimiento de
vapores por 3-4 veces aproximadamente 5 minutos, se lavó y luego se agregó la
safranina por un minuto; se lavó y secó para luego ser observado en el microscopio;
las esporas eran de color verde mientras que las células vegetativas de color rojo.
 RESULTADOS
IV.-

MICROSCOPIO
ÓPTICO DE CAMPO
CLARO

MONTAJE HÚMEDO.
PREPARACIÓN EN FRESCO
MICROORGANISMOS EFECTIVOS (E.M)

100X
E.M: PODEMOS OBSERVAR
BACILOS, COCOS QUE SON LOS
MÁS PEQUEÑOS, MIENTRAS
QUE LOS MÁS GRANDES SON
LEVADURAS.
400X

PREPARADOS EN SECO

TINCIÓN DIFERENCIAL

MARCAMOS EL
PORTAOBJETOS HACIENDO
UNA CIRCUNFERENCIA

SE CALIENTA EL ASA EN EL
MECHERO HASTA QUE ESTÉ
A ROJO VIVO, LUEGO SE
DEJA ENFRIAR UN POCO.

SE ABRE EL TUBO DE ENSAYO DONDE

ÉSTA EL CULTIVO, SE EXPONE AL
FUEGO UNOS SEGUNDOS.
LUEGO CON EL ASA SE SACA UN
POCO DEL INÓCULO.

SE EXTIENDE CON EL AS UN
POCO DEL INOCULO, DENTRO DE
LA CIRCUNFERENCIA MARCADA
EN EL PORTAOBJETO.

LUEGO SE FIJA LA MUESTRA,

PASANDO ÉSTA POR EL MECHERO, Y
CONTROLANDO QUE NO HIERVA NI
ESTÉ MUY CALIENTE, CON LA MANO

SE LE AGREGA UNA GOTA DE

CRISTAL VIOLETA; Y SE
EXTIENDE, DEJANDO ACTUAR
POR 1 MINUTO
 PASADO EL TIEMPO
DETERMINADO; SE LAVA LA
MUESTRA CON AGUAHASTA
QUE NO HAYA COLORANTE
VIOLETA.

LUEGO AGREGAMOS UNA

GOTA DE LUGOL Y DEJAMOS
ACTUAR POR UN MINUTO.

AGREGAR UNA GOTA DE

SAFRANINA POR 30 SEGUNDOS

SE LAVA, Y LUEGO SE SECA

COMPLETAMENTE
SE AGREGA UNA GOTA DE ACEITE
DE CEDRO A LA MUESTRA, PARA
ONSERVARLA CON EL OBJETIVO
DE INMERSIÓN.

OBSERVACIÓN DE
Staphylococcus aureus.

AL TEÑIRSE AZUL VIOLETAS,

SON GRAMPOSITIVAS

1000X

OBSERVACIÓN DE Escherichia
coli.

AL TEÑIRSE COLOR ROJO

TINCIÓN DIFERENCIAL DE ESPORAS Y CUERPOS VEGETATIVOS

SE SACA CON EL ASA UN

POCO DEL INOCULO DE
Bacillus sp Y SE PONE EN EL
PORTAOBJETOS,
AGREGAMOS VERDE DE
MALAQUITA

SE SECA LA MUESTRA, SIN

QUE HIERVA, HASTA QUE
HAYA DESPRENDIDO 3
VAPORES, LUEGO SE
AGREGA SAFRANINA POR
UN MINUTO; SE LAVA Y
SECA

OBSERVACIÓN DE
MUESTRA DE GÉNERO
Bacillus, SE OBSERVAN LAS
ESPORAS FUERA DE LOS
CUERPOS VEGETATIVOS
 DISCUSIÓN
V.-
El microscopio de campo claro está formado por un cuerpo metálico compacto que incluye
una base o soporte y un brazo, donde se fijan el resto de las partes. En la base se encuentra
la fuente de luz; en la parte inferior del brazo se encuentran los botones de enfoque fino y
grueso, los cuales mueven la platina para enfocar la imagen. En la parte media del brazo s
encuentra la platine dónde se coloca el portaobjetos y los dispositivos del control para
moverlo; por debajo de la platina se encuentra el condensador de la luz, la cual es dirigida
hacia el portaobjetos y el diafragma iris, que junto con el sistema de ajuste del condensador,
regulan su abertura. En el tercio superior y curvo del brazo se encuentra el portaobjetivos o
revólver, que sostiene 4 objetivos de diferentes magnificaciones y en el extremo, la cabeza
portaoculares y los oculares. (Rodriguez, 2005). Al iniciar la práctica se reconocieron las
partes que constituyen un microscopio de éste tipo, debido a que es el que usamos
frecuentemente para las observaciones microbiológicas. Lo primero que debemos
ajustar cuando utilizamos un microscopio de campo claro, es la luz, regularla para la
óptima visualización de microorganismos, luego ajustamos sutilmente el micrométrico
y vamos observando desde el menor aumento hasta el mayor aumento, que son los
objetivos denominados a seco, mientras que el lente de inmersión se denomina húmedo,
debido a que se utiliza una gota de aceite de cedro para su observación.

En el montaje directo húmedo o examen en fresco; las muestras se extienden directamente

sobre la superficie de un portaobjetos para su observación. El material que es demasiado
espeso para permitir la diferenciación de sus elementos puede diluirse con igual volumen
de solución salina fisiológica estéril. (Rodriguez, 2005). Éste montaje húmedo se realizó
con una muestra de microalgas, observándose en el microscopio óptico a mediano aumento,
se pudo visualizar algas filamentosas; en éste proceso, no se utiliza ningún tipo de
colorante, por ello es muestra fresca. También se realizó el montaje húmedo en E.M
(microorganismos efectivos) en la muestra se observó a mayor aumento bacilos, también
cocos, que eran los microorganismos más pequeños mientras que también se observaron
formas cocoides más grandes que eran levaduras.

Una tinción simple es una solución acuosa o alcohólica de un colorante básico único.
Aunque los diferentes colorantes se unen de forma específica a las distintas partes de las
células. El propósito principal de una tinción simple es destacar el microorganismo
completo para que se vean las formas y las estructuras celulares básicas. El colorante se
aplica al extendido fijado durante un tiempo determinado y luego se lava, a continuación el
portaobjetos se seca y se examina. En ocasiones se agrega una sustancia química a la
solución para intensificar la coloración, este aditivo se denomina mordiente. Algunas de las
tinciones simples utilizadas en el laboratorio son el azul de metileno, la carbolfucsina, el
violeta de genciana (cristal violeta) y la safranina. (Tortora et al, 2007), en el
laboratorio se realizó la tinción simple para colorear el inóculo del cultivo de
Escherichia coli, se utilizó azul de metileno y luego el secado utilizando el mechero, se
procedió a observar en el microscopio con el lente de inmersión utilizando una gota de
aceite de cedro. Los resultados no fueron óptimos ya que no se pudo observar estos
microorganismos, quizá por la mala manipulación de los materiales del proceso de tinción.

A diferencia de las tinciones simples, las tinciones diferenciales reaccionan de modo

diferente con las distintas clases de bacterias y por tanto pueden ser empleadas para
establecer una distinción entre ellas, una de las más comunes es la tinción de Gram, es uno
de los procedimientos de tinción más útiles porque permite clasificar las bacterias en dos
grandes grupos: grampositivas y gramnegativas. El colorante violeta y el yodo se combinan
en el citoplasma de cada bacteria y lo colorea de violetaoscuro o púrpura. Las bacterias que
conservan éste color después de haberles agregado el alcohol para decolorarlas se clasifican
como grampositivas; las bacterias que pierden el color violeta después de la decoloración
se consideran gramnegativas; como las bacterias gramnegativas son incoloras después del
lavado con alcohol, dejan de ser visibles. Por ese motivo se les aplica safranina que
contrasta con el colorante primario. (Tortora et al, 2007). Se realizó la tinción de Gram
en el laboratorio con dos cultivos: Staphylococcus aureus y Escherichia coli, siguiendo los
pasos para la correcta tinción. Se observó con el microscopio que Staphylococcus aureus
eran bacterias grampositivas debido a que se colorearon azul; mientras que Escherichia
coli, fue gramnegativa debido a que se tiñó de rojo. La explicación de estas coloraciones
radica en la composición de la pared celular de los diferentes microorganismos que
determina la retención o escape del complejo violeta yodo. Las bacterias grampositivas
tienen peptidoglucano (disacárido y aminoácido) en su pared ceular que es más gruesa que
las gramnegativas. Además las bacterias gramnegativas contienen una capa de
lipopolisacáridos (lípidos y polisacáridos) como parte de su pared celular. Cuando se aplica
el violeta de genciana y yodo, ingresan con faciloidad en cuyo interior se combinan para
formar el complejo CV-Y, éstas moléculas son más grandes que la violeta de genciana que
ingresó y por su tamaño no puede ser eliminado por el agregado de alcohol de la capa de
peptidoglucano en las células grampositivas y por ende retienen el colorante violeta de
genciana, sin embargo en las gramnegativas el alcohol altera la capa externa de
lipopolisacáridos y el complejo CV-Y se elimina de la capa delgada de peptidoglucano, por
ende éstas quedan incoloras, y luego son teñidas por la safranina de un tono rojizo.

Algunos géneros bacterianos entre los que destacan Clostridium y Bacillus, producen en su
interior formas de resistencia denominadas endosporas, cuando las condiciones ambientaes
son desfavorables, formándose una espora por cada forma vegetativa, luego la espora se
libera y su capacidad de germinación perdura durante años, algunas de éstas son patógenas
por lo que su estudio y observación son de enorme interés. Las cubiertas de las esporas son
muy resistentes y hacen que aparezcan en el microscopio óptico como estructuras
refringentes y de difícil tinción; la tinción específica requiere de dos colorantes: verde de
malaquita; capaz de teñir a las esporas en caliente y la safranina; colorante de contraste que
tiñe a las formas vegetativas. (Allaert et al, 2003). Se realizó también una tinción
diferencial de esporas a una muestra de cultivo de Bacillus sp., aplicando la metodología
mencionada con los dos colorantes principales, al lavar la muestra luego de haber aplicado
el verde de malaquita, se elimina toda la tinción de las células salvo donde se encuentran
las esporas y endosporas, al agregar la safranina que sirve para el contraste, se colorea las
porciones de las células distintas de las endosporas; por ello en la observación final las
esporas aparecen verdes fuera de células rojas o rosadas que son las células vegetativas.
Debido a que las endosporas presentan un alto índice de refracción se las puede detectar
con el microscopio óptico, pero no de las inclusiones del material reserva sin una tinción
especial; sin embargo no se observaron endosporas en la muestra.

La posición y la morfología de la endospora en el interior de la bacteria constituyen un

carácter taxonómico útil para diferenciar especies dentro de un mismo género. Por la
localización y morfología de la esporas en el género Bacillus; la endospora esférica con
localización terminal y deformante de la célula vegetativa pertenece a B. sphaericus. B
thuringiensis tiene localizada la endospora elipsoidal en el centro de la célula vegetativa, lo
que provoca un abombamiento característico denominado “el huso”. B. subtilis forma una
espora cilíndrca subterminal no deforme. (Rodriguez, 2005). En la tinción diferencial de
esporas, no se observaron endosporas por ende, no se observaron las diferentes
posiciones que pueden ocupar éstas; pero si fueron mencionadas en la práctica para el
conocimiento de los alumnos.

Vi.- CONCLUSIÓN

Se realizó una preparación de muestra en fresco utilizando microalgas.

Se realizaron dos preparaciones de muestras en seco para ella utilizamos las técnicas
de tinción simple para el cultivo de Escherichia coli. La técnica de tinción de Gram para
los cultivos de Staphylococcus aureus (grampositivas) y Escherichia coli (gramnegativas) y
también se realizó la tinción diferencial de esporas utilizando bacterias del género Bacillus.
VII.- REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Allaert, C. Escolá, M. 2003. Métodos de análisis microbiológicos de alimentos. Edit.

Diaz. Pag,272.
Allen, S. 2008. Koneman: diagnóstico microbiológico. 6 ta edic. Edit. Médica
Panamericana. Pag 1671.
De la Rosa, F. Prieto, J. 2003. Microbiología en ciencias de la salud: conceptos y
aplicaciones. 2da edic. Edit. Elzevier. España.

Gerard, J. Tortora. Berdell, R. Funke. Case, C. 2007. Introducción a la

microbiología. 9na edic. Edit. Médica Panamericana. Pag 959.

Granados, R. Villaverde , M. 1997. Microbiología, volumen 1. Edit. Paraninfo. Pag.

352.

Rodriguez, E. 2005. Bacteriología general: principios y prácticas de

laboratorio. Edt. Universidad de Costa Rica. Pag 475.