INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ESCUELA SUPERIOR DE INGENIERÍA

QUÍMICA E INDUSTRIAS EXTRACTIVAS

ACADEMIA DE QUÍMICA ANALÍTICA.

LABORATORIO DE ESPECTROSCOPIA
MOLECULAR Y ATÓMICA.

PRÁCTICA 1.
RUTINAS DE DIAGNOSTICO.

FECHA DE ENTREGA: 29 DE MARZO DE 2021.

OBJETIVOS.
Conocer las partes principales, el manejo de un Espectrofotómetro UV-visible y
verificar las condiciones actuales del equipo.
MARCO TEÓRICO.
La calibración de un espectrofotómetro UV-Vis, comprende un conjunto de
pruebas realizadas con el fin de conocer los errores inherentes que puede
presentar el instrumento cuando realiza una medición. Los valores obtenidos en
estas mediciones, a condiciones determinadas, se comparan con los valores de
los materiales de referencia certificados, utilizados como patrones de medición y
finalmente, se estima la incertidumbre asociada a la calibración.
Los espectrofotómetros UV-Vis cuentan con dos escalas, la escala de longitud de
onda y la escala fotométrica; para cada una cuenta con su respectivo método de
calibración y patrón de medición. Así mismo, existen parámetros instrumentales
que afectan los resultados de la calibración y que por lo tanto se deben tener en
cuenta.
 Control de la exactitud de la longitud de onda.
La desviación de la longitud de onda puede causar errores en los resultados
cuantitativos de la lectura en el UV-Vis. En este control se verifica el grado de
concordancia entre la longitud de onda seleccionada para la máxima absorbancia
y la longitud de onda de referencia. Con una misma cubeta, ajustar el cero (0) del
instrumento con la solución de ácido perclórico al 10%. Se recomienda medir
según el rango espectral una longitud de onda para el espectro UV y tres
longitudes de onda para el espectro Vis. Dependiendo del ancho de banda del
equipo, la máxima absorción de la solución de óxido de holmio en ácido perclórico
se detectará a las longitudes de onda indicadas en la tabla

 Control de la exactitud fotométrica.

La exactitud fotométrica se determina comparando la absorbancia de una solución
de referencia con la lectura de ésta, obtenida en el espectrofotómetro. Para cubrir
satisfactoriamente el rango UV-Vis del espectro, se utilizan dos soluciones
diferentes: dicromato de potasio, para el espectro UV y sulfato de cobre, para el
espectro Vis.
 Control de la precisión fotométrica.
Se denomina precisión fotométrica a la medida de la dispersión de una serie de
mediciones de absorbancia alrededor de la media, y se expresa como coeficiente
de variación porcentual. Para la determinación, utilizar los datos obtenidos en la
prueba de exactitud fotométrica (5.2.2), con la solución de dicromato de potasio de
0,06 g L-1 a las siguientes longitudes de onda: 235, 257, 313, 350 nm.
 Control de la linealidad fotométrica.
El estudio de la linealidad fotométrica permite establecer el rango de absorbancia
en el que el instrumento tiene respuesta proporcional a los cambios de
concentración. Para ello se determina la respuesta del espectrofotómetro a
diferentes concentraciones de una sustancia que cumpla con la ley de Lambert-
Beer. Se evalúa la linealidad fotométrica realizando lecturas de absorbancia de la
serie de soluciones de dicromato de potasio (0,02; 0,04; 0,06; 0,08 y 0,1 g L-1),
utilizando la solución de ácido sulfúrico 0,005 mol L-1 para realizar el ajuste a 0 de
absorbancia del equipo. Las longitudes de onda a que se realizan las lecturas
serán: 235, 257, 313 y 350 nm.
 Control de Luz difusa o parásita.
Se denomina así a toda radiación electromagnética de longitud de onda distinta a
la seleccionada por el monocromador, que alcanza el detector y por lo tanto queda
registrada por el instrumento. Este control se basa en la medida del porcentaje de
transmitancia de una solución de nitrito de sodio 50 g L-1. Esta sustancia tiene la
propiedad de que sus soluciones absorben toda la radiación incidente de
longitudes de onda menores a los 390 nm, es decir, que es ópticamente opaca a
la luz. Por lo tanto, la transmitancia a 340 nm de esta solución debe ser igual a
cero, y toda transmitancia detectada corresponde a luz parásita. El ajuste del
equipo a 0 de transmitancia se realiza con aire, luego se mide la transmitancia de
la solución de nitrito de sodio a una longitud de onda de 340 nm. Realizar las
lecturas por triplicado.
 Parámetros instrumentales
Los parámetros instrumentales del IBC hacen parte del conjunto de condiciones a
las cuales se va a realizar la calibración. La combinación de ellos proporcionará un
resultado de medición específico, y es por esto que se recomienda que la
calibración se lleve a cabo a las mismas condiciones en las que el dueño del IBC
realice sus mediciones. Existen espectrofotómetros que tienen fijos algunos de
estos parámetros y, por lo tanto, el operador no puede realizar ningún cambio; sin
embargo, ciertos espectrofotómetros permiten variarlos y en este caso es
indispensable tenerlos en cuenta a la hora de realizar el procedimiento de
calibración. A continuación, se presenta una descripción de los parámetros
instrumentales que se deben tener en cuenta a la hora de realizar un servicio de
calibración:
 Tiempo promedio de señal (SAT)
Es el tiempo durante el cual el instrumento va a recolectar datos en una medición.
Este parámetro está dado en unidades de segundo (s).
 Intervalo de datos (ID)
El intervalo de datos hace referencia a cada cuanto nanómetro el instrumento
recolectará datos. Este parámetro está directamente relacionado con la resolución
del instrumento y se da en unidades de nanómetros (nm).
 Velocidad de barrido
Este parámetro hace referencia a la velocidad a la cual el instrumento va a realizar
un barrido del espectro en la escala de longitud de onda, para un intervalo
definido. La velocidad de barrido está definida por los dos parámetros anteriores y
ID
se expresa en unidades de (nm/min): V Barrido = ∗100
SAT
Entre mayor sea la velocidad de barrido el tiempo de una medición será menor, sin
embargo, el intervalo de datos (parámetro estrechamente relacionado con la
resolución) será mayor, lo cual influye directamente en la incertidumbre asociada a
la medición.
 Ancho de banda espectral
El ancho de banda espectral (SBW, por sus siglas en inglés) está definido como el
intervalo de longitud de onda, a la mitad de la intensidad máxima de la banda de
luz que sale del monocromador. Este parámetro es clave para lograr obtener
espectros con mejor exactitud, ya que entre más grande sea el ancho de banda
espectral, mayor cantidad de radiación saldrá del monocromador y por lo tanto el
instrumento no podrá resolver las bandas de absorción. Así mismo, el SBW influye
tanto la relación señal/ruido como la resolución del instrumento. Con un SBW alto
la muestra será irradiada con varias longitudes de onda, reduciendo la habilidad
del equipo de distinguir las bandas, mientras que con un SBW bajo el equipo
podrá diferenciar de mejor manera las bandas cercanas, pero reducirá la cantidad
de luz que alcanza el detector lo que genera mayor ruido
DESARROLLO EXPERIMENTAL

RUTINAS DE
DIAGNÓSTICO

Preparación de Desarrollo de la práctica

soluciones

Empleando el filtro de óxido de holmio

Ácido sulfúrico 0.2 N: Obtener el espectro bajo las siguientes condiciones:
Medir 2.69 mL de H2SO4
y aforar a 500 mL con
agua destilada

Dicromato de potasio
100 ppm:
Pesar 0.01 gr de
dicromato de potasio y Empleando el vapor de benceno
aforar a 100 mL con Obtener el espectro bajo las siguientes condiciones:
H2SO4 0.2N

Analizar la absorbancia de
cada uno de los estándares a
Linealidad fotométrica
la longitud de onda máxima
Preparar una solución de K2Cr2O7 de 100 ppm
teórica de 350 nm.
Determinar la longitud de onda usando como solvente H2SO4 0.2N.
máxima y compararla con la Preparar a partir de la solución madre tres
teórica. estándares de 25, 50 y 75 ppm analizar los
Construir la curva de estándares con las siguientes condiciones:
calibración (absorbancia vs
concentración).
TABLA DE RESULTADOS
Vapor de Benceno
Longitud de onda
No.
máx. ( λ max)
1 273.2 nm
2 242.10 nm
3 247.46 nm
4 253.1 nm
5 259.22 nm
6 267.00 nm

Óxido de Holmio
Longitud de onda
No.
máx. ( λ max)
1 279.09 nm
2 287.66 nm
3 360.95 nm
4 418.55 nm
5 445.53 nm
6 455.50 nm
7 459.98 nm
8 536.28 nm

K 2 Cr2 O7

Concentración ppm Absorbancia

25 ppm 0.2494
50 ppm 0.5006
75 ppm 0.7634

CÁLCULOS
% de Exactitud de Vapor de Benceno
λmax Teo − λmax Expe
% d= x 100
λ max Teo

Dato no. 1
 237.0−237.2
% d 1= x 100=−0.084
237.0
Dato no. 2
242.2−242.1
% d 2= x 100=0.041
242.2
Dato no. 3
247.8−247.46
% d 3= x 100=0.137
247.8
Dato no. 4
253.6−253.21
% d 4= x 100=0.153
253.6
Dato no. 5
259.6−259.22
% d 5= x 100=0.146
259.6
Dato no. 6
266.8−267.0
% d 6= x 100=−0.074
266.8

% de Exactitud de Óxido de Holmio

Dato no. 1
279.0−279.09
% d 1= x 100=−0.007
279.0
Dato no. 2
287.0−287.66
% d 2= x 100=−0.299
287.0
Dato no. 3
247.8−247.46
% d 3= x 100=0.137
247.8
Dato no. 4
418.0−418.55
% d 4= x 100=−0.131
418.0
Dato no. 5
 445.0−445.53
% d 5= x 100=−0.119
445.0
Dato no. 6
453.0−453.50
% d 6= x 100=−0.110
453.0
Dato no. 7
459.5−459.98
% d 7= x 100=−0.104
459.5
Dato no. 8
536.0−536.28
% d 8= x 100=−0.052
536.0

Absorbancia vs Concentración
0.04
0.03

0.03 0.03

0.03 0.02
Absorbancia nm

0.02

0.02

0.01

0.01

0
20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100105110115120125130135140145150155
Concentración ppm

Gráfica de Concentración de K 2 Cr2 O7 en ppm vs Absorbancia

OBSERVACIONES.
El equipo utilizado para la experimentación es un espectrofotómetro Lambda 25 de
la marca Perkin Elmer, con el programa Perkin Elmer Uv Winlab.
Para poder realizar los espectros, es necesario tener los datos de los parámetros
de intervalo de barrido, velocidad de barrido y tiempo de barrido, para así anexar
al equipo y realice la lectura.
Al realizar el espectro del K₂Cr₂O₇, el pico de mayor absorbancia se ubica a 350
nm, no se encuentra muy definido ya que es muy ancho.
CONCLUSIONES.
Al finalizar está practica se pudo conocer de forma óptima y adecuada las partes y
el funcionamiento de un equipo UV-Visible, ya que es de suma importancia
entender cómo funciona cada una de sus partes y así poder estar seguro de cómo
manejar este tipo de equipo, además también se pudo ver, observar y entender el
software con en que se maneja el equipo, entendido esto se puede decir que solo
podemos realizar las rutinas de verificación más no reparar la falla que tenga el
equipo y que un técnico será el más capacitado para reparar el equipo, ya que son
equipos complejos.
Las rutinas de verificación en estos equipos son muy importantes ya que estas
rutinas nos ayudaran a tener un panorama general de las condiciones del equipo y
garantizar que el equipo este en un estado óptimo en un periodo de dos
calibraciones, haciendo las rutinas de verificaciones se puede anticipar que
nuestros espectros salgan mal, además es muy importante de colocar de acuerdo
con la rutina de verificación los parámetros adecuados, para así cuando se realice
la calibración, este sea optima, con la bibliografía de referencia.

El objetivo de la práctica es conocer el manejo de un espectrofotómetro, la manera

en que se realiza la rutina de verificación para así tener un equipo calibrado y con
ellos obtener lecturas confiables y exactas,
La teoría de la practica nos permiten identificar las partes del espectrofotómetro,
así como su manejo y podríamos indicar que el espectrofotómetro es un excelente
instrumento de medición debido a que permite analizar transiciones de la muestra
y con esto podemos determinar el rango de absorción.
En cuanto al espectrofotómetro que se utilizó fue un espectrofotómetro Lambda 25
de la marca Perkin Elmer con el programa de Perkin Elmer Uv Winlab. Es
importante conocer el software que maneja dicho equipo ya que de lo contrario no
se tiene la seguridad de que el equipo está trabajando correctamente, ya que al
colocar un parámetro erróneo puede darnos espectros equivocados.

CUESTIONARIO.
1.- Cual es el fundamento de los métodos espectroscópicos de análisis?
R: La interacción de la radiación electromagnética con la materia
2.- Que entiende por transiciones electrónicas?
R: Las transiciones electrónicas implica la absorción de la radiación UV-Vis por
electrones situados en orbitales n , π ,ó σ de las moléculas.
3.- ¿Cuáles son las transiciones electrónicas que se presentan en los compuestos
orgánicos?
R: Son 4 transiciones y son σ ↔ σ ¿ ; n ↔ σ ¿ ; π ↔ π ¿ ; n ↔ π ¿ ;
4.- ¿Qué tipo de compuestos se pueden analizar por esta técnica?
R: Los compuestos orgánicos insaturados o bien los compuestos que contenga
heteroátomos los cuales tienen transiciones de tipo n ↔ π ¿ y los compuestos y los
compuestos insaturados que presentan transiciones de tipo π ↔ π ¿
5.- De dos ejemplos de compuestos que absorban en la región UV-Vis.
Proporcione la formula desarrolla.
R: Eteno: C2H4 2- propanona: CH3COCH3
6.- Describa brevemente, ¿Cuál es el objetivo de la práctica?
R: Conocer las partes del equipo de espectro UV-Visible y verificar las condiciones
del equipo con las rutinas de verificación.
7.- Mencione. ¿Cuáles son las partes que constituyen un espectrofotómetro UV-
Vis?
R: 1) Fuente de energía; 2) Selector de longitud de onda; 3) Celda de Muestra; 4)
Transductor de señal; 5) Procesador de señal y sistema de lectura.
8.- Explique cuál es el propósito de verificar los equipos antes de realizar cualquier
tipo de análisis?
R: Garantizar que el equipo este en un estado óptimo en un periodo de dos
calibraciones.
9.- ¿Qué se entiende por barrido espectral?
R: Es u perfil de absorción de un compuesto o muestra a diferentes rangos de
longitud de onda lo que nos da como resultado un espectro.
10.- ¿Qué información analítica proporciona los resultados de un espectrograma?
R: En el eje de las e información cuantitativa y en el eje de las x información
cualitativa.
11.- En que tipo de industrias se puede aplicar la técnica UV-Vis?
R: Se utiliza en la industria farmacéutica y cosmética, química y medio ambiental,
bebidas y alimentación, en la petroquímica, aplicaciones en las ciencias de la vida
y soluciones multiparamétricas.

BIBLIOGRAFÍA.
 Laboratorio de Suelo y Agua. E.E.A. Anguil. Guía para la verificación de
espectrofotómetros UV-Visible utilizados en el análisis de suelo y agua.
Recuperado de: https://inta.gob.ar/sites/default/files/script-tmp-
guia_espectrofotmetros_uv.pdf
 Instituto Nacional de Metrología de Colombia – INM.Guia de calibración de
espectrofotómetros UV-Vis INM/GTM-FR-E/01. Recuperado de:
http://www.inm.gov.co/nueva/wp-
content/uploads/2019/12/Guia_calibracion_UV-VIS2019.pdf