Proyecto de Directriz de Prueba Actualizada 431 Sobre Corrosión Cutánea Invitro, Métodos de Prueba de Epidermis Humana Reconstruida

15/3/2021 PROYECTO DE DIRECTRIZ DE PRUEBA ACTUALIZADA 431 SOBRE CORROSIÓN CUTÁNEA INVITRO, MÉTODOS DE PRUE…
Página 1
Sección 4
Efectos en la salud
Directriz de prueba No. 431

Corrosión cutánea in vitro : reconstruida
Método de prueba de la epidermis humana (RhE)
18 de junio de 2019
Directrices de la OCDE para la

Prueba de productos químicos
Página 2
https://translate.googleusercontent.com/translate_f 1/23
OCDE / OCDE 431

Adoptado:
14 de junio de 2019
DIRECTRICES DE LA OCDE PARA PRUEBAS DE PRODUCTOS QUÍMICOS
Corrosión cutánea in vitro:

Método de prueba de epidermis humana reconstruida (RhE)
INTRODUCCIÓN
1. La corrosión cutánea se refiere a la producción de daños irreversibles en la piel.

manifestado como necrosis visible a través de la epidermis y en la dermis, siguiendo el
aplicación de una sustancia problema [según la definición de las Naciones Unidas (ONU) Globally Harmonized
Sistema de clasificación y etiquetado de productos químicos (GHS)] (1). Esta prueba actualizada
La directriz 431 proporciona un procedimiento in vitro que permite la identificación de sustancias no corrosivas.
y sustancias y mezclas corrosivas de acuerdo con UN GHS (1). También permite una
subcategorización parcial de corrosivos.
2. La evaluación del potencial de corrosión cutánea de los productos químicos ha involucrado típicamente la
uso de animales de laboratorio (Directriz de ensayo 404 de la OCDE (TG 404); adoptada originalmente en 1981
y revisada en 1992, 2002 y 2015) (2). Además del actual TG 431, otros dos en
Se han validado y validado los métodos de ensayo in vitro para comprobar el potencial de corrosión de los productos químicos.
adoptadas como directrices de examen de la OCDE 430 (3) y 435 (4). Además, el TG de la OCDE in vitro
439 (5) se ha adoptado para probar el potencial de irritación cutánea. Un documento sobre Integrado
Enfoques de pruebas y evaluación (IATA) para la corrosión e irritación cutáneas describe
varios módulos que agrupan fuentes de información y herramientas de análisis, y proporciona
orientación sobre (i) cómo integrar y utilizar los datos de prueba y no prueba existentes para la
evaluación de los potenciales de irritación cutánea y corrosión cutánea de los productos químicos y (ii) propone una
enfoque cuando se necesitan más pruebas (6).
3. Esta guía de prueba aborda el punto final de la corrosión cutánea para la salud humana. Hace
uso de epidermis humana reconstruida (RhE) (obtenida de
queratinocitos epidérmicos transformados) que imita de cerca el histológico,
Propiedades morfológicas, bioquímicas y fisiológicas de las partes superiores del ser humano.
piel, es decir, la epidermis. Esta guía de prueba se adoptó originalmente en 2004 y se actualizó en
2013, 2016 y 2019 para incluir métodos de prueba adicionales utilizando los modelos RhE. La prueba
La directriz también se actualizó en 2015 para introducir la posibilidad de utilizar los métodos para
respaldar la subcategoría de productos químicos corrosivos y consultar la guía de la IATA
documentar e introducir el uso de un procedimiento alternativo para medir la viabilidad.
© OCDE, (2019)
Usted es libre de utilizar este material sujeto a los términos y condiciones disponibles en http://www.oecd.org/termsandconditions/ .
Página 3
2│ 431 OCDE / OCDE

4. Se incluyen cinco métodos de prueba validados que utilizan modelos de RhE disponibles comercialmente
en esta Guía de prueba, como se describe a continuación. Estudios de prevalidación (7), seguidos de una formal
estudio de validación para evaluar la corrosión cutánea (8) (9) (10) se han realizado (11) (12) para
dos de estos métodos de prueba disponibles comercialmente, EpiSkin ™ Standard Model (SM), y
Prueba de corrosión cutánea EpiDerm ™ (SCT) (EPI-200) (a la que se hace referencia en el siguiente texto como
Métodos de referencia validados: VRM, EpiSkin TM = VRM1, EpiDerm TM = VRM2). los
El resultado de estos estudios llevó a la recomendación de que los dos VRM mencionados anteriormente
podría utilizarse con fines reglamentarios para distinguir corrosivo (C) de no corrosivo
(NC), y que el EpiSkin ™ podría usarse además para apoyar sub-
categorización de sustancias corrosivas (13) (14) (15). Otros dos disponibles comercialmente en
Los métodos de prueba de RhE de corrosión cutánea in vitro han mostrado posteriormente resultados similares a los
EpiDerm ™ SCT según Validación basada en PS (16) (17) (18). Estos son los
SkinEthicTM RHE1 y epiCS® (anteriormente llamado EST-1000) que también se pueden utilizar para
fines reglamentarios para distinguir las sustancias corrosivas de las no corrosivas (19) (20).
Estudios posteriores a la validación realizados por los productores del modelo RhE en los años 2012 a 2014
con un protocolo refinado que corrige las interferencias de la reducción inespecífica de MTT por la prueba
Los productos químicos mejoraron el rendimiento tanto de la discriminación de C / NC como de apoyo
subcategorización de corrosivos (21) (22). Más análisis estadísticos de la posvalidación
Se han realizado datos generados con Epiderm ™ SCT, SkinEthic ™ RHE y epiCS®
para identificar modelos de predicción alternativos que mejoraron la capacidad predictiva de sub-
categorización (23). Finalmente, el LabCyte EPI-MODEL24 es otro comercial
prueba de RhE de corrosión cutánea in vitro disponible que demostró ser científicamente similar a la
VRM y, por lo tanto, se pueden utilizar con fines reglamentarios para distinguir entre corrosivos y no
sustancias corrosivas, así como la subcategoría de apoyo de los corrosivos (40) (41) (42) (43).
5. Antes de un método de prueba de RhE in vitro similar o modificado propuesto para la corrosión cutánea
distintos de los VRM se pueden utilizar con fines regulatorios, su confiabilidad, relevancia
(precisión), y las limitaciones para su uso propuesto deben determinarse para asegurar su similitud
a los VRM, de acuerdo con los requisitos de las Normas de Desempeño (PS) (24)
establecidos de acuerdo con los principios del Documento de Orientación No 34 (25). La Mutua
La aceptación de datos solo se garantizará después de cualquier método de prueba nuevo o actualizado propuesto
que siguen el PS han sido revisados e incluidos en esta Guía de prueba. Los métodos de prueba
incluido en esta guía de prueba se puede utilizar para abordar los requisitos de los países para la prueba
resultados en el método de prueba in vitro para la corrosión cutánea, mientras se beneficia de la Mutual
Aceptación de datos.
DEFINICIONES
6. Las definiciones utilizadas se proporcionan en el anexo I.
CONSIDERACIONES INICIALES
7. Esta directriz de prueba permite la identificación de corrosivos y no corrosivos

sustancias y mezclas de acuerdo con el SGA de las Naciones Unidas (1). Esta guía de prueba más
apoya la subcategoría de sustancias y mezclas corrosivas en subcategorías opcionales
categoría 1A, de acuerdo con UN GHS (1), así como una combinación de Sub-
categorías 1B y 1C (21) (22) (23). Una limitación de esta guía de prueba es que no
Permitir discriminar entre la subcategoría 1B y la subcategoría 1C corrosivas para la piel en
de acuerdo con el SGA de las Naciones Unidas (1) debido al conjunto limitado de agentes corrosivos in vivo bien conocidos
Productos químicos de la subcategoría 1C. Los cinco métodos de prueba bajo esta guía de prueba pueden
discriminar las subcategorías 1A versus 1B-y-1C versus NC.
© OCDE 2019
Página 4
OCDE / OCDE 431 │ 3

8. Se ha elaborado una amplia gama de productos químicos que representan principalmente sustancias individuales.
probado en los estudios de validación que respaldan los métodos de prueba incluidos en esta Guía de prueba.
La base de datos original del estudio de validación realizado para la identificación de no corrosivos.
versus corrosivos ascendió a 60 productos químicos que cubren una amplia gama de clases de productos químicos (8)
(9) (10). Pruebas para demostrar sensibilidad, especificidad, precisión y dentro del laboratorio.
La reproducibilidad del ensayo para la subcategorización se realizó adicionalmente mediante el método de prueba.
desarrolladores que utilizan de 79 a 80 productos químicos que también cubren una amplia gama de clases de productos químicos, y
Los resultados fueron revisados por la OCDE (21) (22) (23). Sobre la base de los datos generales
disponible, la directriz de prueba es aplicable a una amplia gama de clases químicas y físicas
estados que incluyen líquidos, semisólidos, sólidos y ceras. Los líquidos pueden ser acuosos o no
acuoso; los sólidos pueden ser solubles o insolubles en agua. Siempre que sea posible, los sólidos deben
molido hasta obtener un polvo fino antes de la aplicación; ningún otro tratamiento previo de la muestra es
requerido. En los casos en que se pueda demostrar evidencia sobre la no aplicabilidad de la prueba
métodos incluidos en las Directrices de prueba para una categoría específica de sustancias problema, estas pruebas
Los métodos no deben utilizarse para esa categoría específica de sustancias problema. Además, este
Se supone que las Directrices de ensayo son aplicables a las mezclas como una extensión de su aplicabilidad.
a las sustancias. Sin embargo, debido al hecho de que las mezclas cubren un amplio espectro de categorías
y composición, y que actualmente solo se dispone de información limitada sobre las pruebas de
mezclas, en los casos en que se pueda demostrar la no aplicabilidad de la prueba
Directriz para una categoría específica de mezclas (por ejemplo, siguiendo una estrategia como la propuesta en (26)),
las Directrices de ensayo no deben utilizarse para esa categoría específica de mezclas. Cuando
considerar la realización de pruebas de mezclas, sustancias químicas difíciles de analizar (p. ej., inestables) o sustancias químicas de prueba
no claramente dentro del dominio de aplicabilidad descrito en esta Guía, por adelantado
Se debe considerar si los resultados de tales pruebas arrojarán resultados que
son científicamente significativos. Tales consideraciones no son necesarias, cuando hay un
requisito reglamentario para la prueba de la mezcla. Los gases y aerosoles no se han
evaluados aún en estudios de validación (8) (9) (10). Si bien es concebible que estos puedan ser
Probado con tecnología RhE, la Guía de prueba actual no permite la prueba de gases y
aerosoles.
9. Sustancias de prueba que absorben luz en el mismo rango que MTT formazán y prueba
Los productos químicos capaces de reducir directamente el tinte vital MTT (a MTT formazan) pueden interferir con
las mediciones de la viabilidad del tejido y necesitan el uso de controles adaptados para las correcciones. los
El tipo de controles adaptados que pueden ser necesarios variará según el tipo de
interferencia producida por la sustancia problema y el procedimiento utilizado para medir el MTT
formazan (véanse los párrafos 25 a 31).
10. Si bien esta guía de prueba no proporciona información adecuada sobre la irritación de la piel,
Cabe señalar que la OCDE TG 439 aborda específicamente el efecto sobre la salud de la irritación de la piel.
in vitro y se basa en el mismo sistema de prueba RhE, aunque con otro protocolo (5). Para
evaluación completa de los efectos cutáneos locales después de una sola exposición dérmica, el Documento de orientación
Debería consultarse el núm. 203 sobre enfoques integrados para la evaluación de pruebas (6). Esta
El enfoque de IATA incluye la realización de pruebas in vitro de corrosión cutánea (como las descritas
en esta guía de prueba) e irritación de la piel antes de considerar la prueba en animales vivos. Es
reconoció que el uso de piel humana está sujeto a normas éticas nacionales e internacionales
consideraciones y condiciones.
PRINCIPIO DE LA PRUEBA
11. La sustancia problema se aplica por vía tópica a un modelo RhE tridimensional, compuesto
de queratinocitos epidérmicos de origen humano no transformados, que se han cultivado para
© OCDE 2019
Página 5

forman un modelo multicapa y altamente diferenciado de la epidermis humana. Consiste en
capas basales, espinosas y granulares organizadas, y un estrato córneo de varias capas
que contiene capas de lípidos lamelares intercelulares que representan las principales clases de lípidos análogas a
los encontrados in vivo.
12. El método de prueba RhE se basa en la premisa de que los productos químicos corrosivos pueden
penetran en el estrato córneo por difusión o erosión, y son citotóxicos para las células del
capas subyacentes. La viabilidad celular se mide mediante la conversión enzimática del tinte vital MTT
Bromuro de [3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio, azul de tiazolilo
bromuro de tetrazolio; CAS número 298-93-1], en una sal de formazán azul que es
medido cuantitativamente después de la extracción de los tejidos (27). Los productos químicos corrosivos son
identificados por su capacidad para disminuir la viabilidad celular por debajo de los niveles de umbral definidos (ver
apartados 35 y 36). Los métodos de prueba de corrosión cutánea basados en RhE han demostrado ser
predictivo de los efectos de corrosión cutánea in vivo evaluados en conejos según la OCDE
directriz 404 (2).
DEMOSTRACIÓN DE COMPETENCIA
13. Antes del uso rutinario de cualquiera de los cinco métodos de prueba de RhE validados que se adhieren a este
Directriz de prueba, los laboratorios deben demostrar competencia técnica al
clasificando las doce Sustancias de aptitud enumeradas en la Tabla 1. En caso del uso de un
método de subclasificación, también debe demostrarse la subcategorización correcta.
En situaciones en las que una sustancia incluida en la lista no está disponible o cuando se justifica, otra sustancia
para los que se disponga de datos de referencia in vivo e in vitro adecuados (p. ej.
la lista de productos químicos de referencia (24)) siempre que los mismos criterios de selección descritos
en la Tabla 1 se aplican.
Tabla 1. Lista de sustancias de competencia 1
Naciones Unidas Viabilidad celular media para

GHS VRM
Gato. Basado
Gato.
Químico en Físico
Sustancia CASRN Basado VRM1 VRM2
Clase 2 In vitro Expresar
en En
resultados 4
Vivo
3 min 60 min. 3 min. 60 min
resultados 3
Subcategoría 1A Corrosivos in vivo

Bromoacético 79-08-3 Ácido orgánico 1A (3) 1A 3 2.8 3.2 2.8 S
ácido
Boro (3) 1A 2.4 4.2 4.4 10.1 L
13319-75- Ácido inorgánico 1A
trifluoruro
01
dihidrato
Fenol 108-95-2 Fenol 1A (3) 1A 29,8 21,8 22,6 13,5 S
Dicloroacetilo 79-36-7 Electrófilo 1A (3) 1A 5,6 6.3 1.3 1.4 L

cloruro
Combinación de subcategorías 1B-y-1C Corrosivos in vivo
Ácido glioxílico 563-96-2 Ácido orgánico 1B-y-1C (3) 1B-y-1C 110,4 22,5 90,4 3,1 S
monohidrato
Ácido láctico 598-82-3 Ácido orgánico 1B-y-1C (3) 1B-y-1C 80,2 9.4 90 3,5 L
Etanolamina 141-43-5 Base orgánica 1B (3) 1B-y-1C 66,2 40,3 69,7 9,3 Viscoso
Clorhídrico 7647-01-0 Ácido inorgánico 1B-y-1C (3) 1B-y-1C 69,3 5.7 80,8 9 L
ácido
(14,4%)
© OCDE 2019
Página 6

In Vivo No Corrosivos
Fenetilo 103-63-9 Electrófilo CAROLINA DEL (3)
NORTE
NC 141 117,2 112,5 71,2 norte
bromuro
4-Amino- 584-13-4 Base orgánica CAROLINA DEL (3)
NORTE
NC 116,8 120,6 105,7 88,2 norte
1,2,4-
triazol
4- (metiltio) - 3446-89-7 Electrófilo CAROLINA DEL (3)
NORTE
NC 136,7 150,4 85,4 81,6 norte
benzaldehído
Acido laurico 143-07-7 Ácido orgánico CAROLINA DEL (3)
NORTE
NC 102 117,4 90,7 64,4 norte
Abreviaturas: CASRN = Número de registro del Servicio de Resúmenes Químicos; UN GHS = Naciones Unidas a nivel mundial
Sistema Armonizado (1); VRM = Método de referencia validado, EpiSkin TM = VRM1, EpiDerm TM = VRM2;
NC = No corrosivo
1 Las sustancias de aptitud, clasificadas primero por corrosivos frente a no corrosivos, luego por subcategoría de corrosivos
y luego por clase química, se seleccionaron de las sustancias utilizadas en los estudios de validación ECVAM EpiSkin ™
y EpiDerm ™ (8) (9) (10) y de estudios posteriores a la validación basados en datos proporcionados por EpiSkin ™ (22),
Desarrolladores EpiDerm ™, SkinEthic ™ y epiCS® (23). A menos que se indique lo contrario, las sustancias se analizaron
al nivel de pureza obtenido cuando se compra de una fuente comercial (8) (10). La selección incluye, al
en la medida de lo posible, sustancias que: (i) son representativas del rango de respuestas de corrosividad (por ejemplo, no corrosivos;
corrosivos débiles a fuertes) que los VRM son capaces de medir o predecir; (ii) son representativos de la
clases químicas utilizadas en los estudios de validación; (iii) tener estructuras químicas bien definidas; (iv) inducir
resultados reproducibles en el VRM; (v) inducir resultados definitivos en el método de prueba de referencia in vivo; (vi) son
comercialmente disponible; y (vii) no están asociados con costos prohibitivos de disposición.
2 Clase química asignada por Barratt et al. (8).
3 Los grupos de embalaje de las Naciones Unidas correspondientes son I, II y III, respectivamente, para el SGA de las Naciones Unidas 1A, 1B y 1C.
4 Las predicciones in vitro informadas en esta tabla se obtuvieron con los cinco métodos de prueba cubiertos en TG 431; por
el fenol aunque el LabCyte EPI-MODEL24 tuvo resultados ligeramente discordantes entre los experimentos, es decir, 1A-1BC-1BC; otro
Los métodos lograron estas clasificaciones en las pruebas de validación o posvalidación realizadas por el método de prueba.
desarrolladores.
5 Los valores de viabilidad obtenidos en los estudios de validación de corrosión cutánea ECVAM no se corrigieron para
Reducción de MTT (no se realizaron controles muertos en los estudios de validación). Sin embargo, los datos posteriores a la validación
generados por los desarrolladores de métodos de prueba que se presentan en esta tabla fueron adquiridos con controles adaptados
(23).
14. Como parte del ejercicio de competencia, se recomienda que el usuario verifique la
propiedades de barrera de los tejidos después de la recepción según lo especificado por el fabricante del modelo RhE.
Esto es particularmente importante si los tejidos se envían a largas distancias / períodos de tiempo. Una vez
Se ha establecido con éxito un método de prueba y se ha demostrado la competencia en su uso.
demostrado, dicha verificación no será necesaria de forma rutinaria. Sin embargo cuando
utilizando un método de prueba de forma rutinaria, se recomienda continuar evaluando las propiedades de barrera
a intervalos regulares.
PROCEDIMIENTO
15. La siguiente es una descripción genérica de los componentes y procedimientos del

Métodos de prueba de RhE para la evaluación de la corrosión cutánea cubiertos por esta guía de prueba. El RhE
modelos aprobados como científicamente válidos para su uso dentro de esta guía de prueba, es decir, el EpiSkin ™
(SM), EpiDerm ™ (EPI-200), SkinEthic ™ RHE, epiCS® y LabCyte EPI-MODEL24
(16) (17) (19) (28) (29) (30) (31) (32) (33) (40) (41), se puede obtener de
fuentes. Están disponibles los procedimientos operativos estándar (SOP) para estos cinco modelos RhE
(34) (35) (36) (37) (42), y sus principales componentes del método de ensayo se resumen en el anexo.
2. Se recomienda que se consulte el POE pertinente al implementar y utilizar una
de estos métodos en el laboratorio. Prueba con los cinco métodos de prueba de RhE cubiertos por este
La guía de prueba debe cumplir con lo siguiente:
© OCDE 2019
Página 7

COMPONENTES DEL MÉTODO DE PRUEBA RHE
Condiciones generales
dieciséis.Se deben utilizar queratinocitos humanos no transformados para reconstruir la
epitelio. Múltiples capas de células epiteliales viables (capa basal, estrato espinoso, estrato
granulosum) debe estar presente bajo un estrato córneo funcional. El estrato córneo
debe tener varias capas que contengan el perfil de lípidos esenciales para producir una barrera funcional
con robustez para resistir la rápida penetración de sustancias químicas citotóxicas de referencia, por ejemplo, sodio
sulfato de dodecilo (SDS) o Triton X-100. Debe demostrarse la función de barrera y
puede evaluarse mediante la determinación de la concentración a la que se
el producto químico reduce la viabilidad de los tejidos en un 50% (IC50) después de un tiempo de exposición fijo, o
mediante la determinación del tiempo de exposición necesario para reducir la viabilidad celular en un 50% (ET50)
aplicación del producto químico de referencia a una concentración fija especificada (véase el párrafo
18). Las propiedades de contención del modelo RhE deben evitar el paso de material.
alrededor del estrato córneo hasta el tejido viable, lo que conduciría a un modelado deficiente de
exposición de la piel. El modelo RhE debe estar libre de contaminación por bacterias, virus,
micoplasma u hongos.
Condiciones funcionales
Viabilidad
17. El ensayo utilizado para cuantificar la viabilidad de los tejidos es el ensayo MTT (27). El viable
las células de la construcción de tejido RhE reducen el tinte vital MTT en un formazan azul MTT
precipitado, que luego se extrae del tejido utilizando isopropanol (o un disolvente similar).
La DO del disolvente de extracción solo debe ser suficientemente pequeña, es decir, DO <0,1. los
El formazán MTT extraído puede cuantificarse utilizando una absorbancia estándar (DO)
medición o un procedimiento de espectrofotometría de HPLC / UPLC (38). Los usuarios del modelo RhE
debe asegurarse de que cada lote del modelo RhE utilizado cumpla con los criterios definidos para el resultado negativo
control. Un rango de aceptabilidad (límite superior e inferior) para los valores de DO del control negativo
debe ser establecido por el desarrollador / proveedor del modelo RhE. Rangos de aceptabilidad para el
valores de DO del control negativo para los cinco métodos de prueba de RhE validados incluidos en esta prueba
Las pautas se dan en la Tabla 2. Un usuario de HPLC / UPLC-Espectrofotometría debe usar el
Los rangos de DO del control negativo proporcionados en la Tabla 2 como criterio de aceptación para el
control. Debe documentarse que los tejidos tratados con control negativo son estables en
cultivo (proporcione mediciones de DO similares) durante el período de exposición.
Tabla 2. Rangos de aceptabilidad de los valores de DO del control negativo para controlar la calidad del lote
Límite de aceptación inferior Límite de aceptación superior

EpiSkin ™ (SM) ≥ 0,6 ≤ 1,5
EpiDerm ™ SCT (EPI-200) ≥ 0,8 ≤ 2,8
SkinEthic ™ RHE ≥ 0,8 ≤ 3,0
epiCS ≥ 0,8 ≤ 2,8
LabCyte EPI-MODEL24 SCT ≥ 0,7 ≤ 2,5
© OCDE 2019
Página 8

Función barrera
18. El estrato córneo y su composición lipídica deben ser suficientes para resistir la
penetración rápida de ciertos productos químicos citotóxicos de referencia (por ejemplo, SDS o Triton X-100), como
estimado por IC50 o ET50 (Tabla 3). La función de barrera de cada lote del modelo RhE
El desarrollador / vendedor del modelo RhE debe demostrarlo al suministrar el
tejidos al usuario final (véase el párrafo 21).
Morfología
19. Se debe realizar un examen histológico del modelo RhE que demuestre
estructura similar a la epidermis humana multicapa que contiene estrato basal, estrato espinoso,
estrato granuloso y estrato córneo y exhibe un perfil de lípidos similar al perfil de lípidos
de la epidermis humana. Examen histológico de cada lote del modelo RhE utilizado
El modelo RhE debe proporcionar una morfología adecuada de los tejidos.
desarrollador / vendedor al suministrar los tejidos al usuario final (ver párrafo 21).
Reproducibilidad
20. Los usuarios de métodos de prueba deben demostrar la reproducibilidad de los métodos de prueba a lo largo del tiempo.
con los controles positivos y negativos. Además, el método de prueba solo debe usarse
si el desarrollador / proveedor del modelo RhE proporciona datos que demuestren la reproducibilidad a lo largo del tiempo
con productos químicos corrosivos y no corrosivos de, por ejemplo, la lista de sustancias de aptitud
(Tabla 1). En caso de utilizar un método de prueba para la subcategorización, la reproducibilidad con
también debe demostrarse el respeto a la subcategorización.
Control de calidad (QC)

21. El modelo RhE solo debe usarse si el desarrollador / proveedor demuestra que
cada lote del modelo RhE utilizado cumple con los criterios de liberación de producción definidos, entre los cuales
los de viabilidad (párrafo 17), función barrera (párrafo 18) y morfología
(párrafo 19) son los más relevantes. Estos datos se proporcionan a los usuarios del método de prueba, por lo que
que pueden incluir esta información en el informe de prueba. Solo resultados producidos con
Los lotes de tejidos aceptados por control de calidad pueden aceptarse para una predicción confiable de corrosivos
clasificación. Un rango de aceptabilidad (límite superior e inferior) para el IC50 o el ET50 es
establecido por el desarrollador / proveedor del modelo RhE. Los rangos de aceptabilidad para los cinco
Los métodos de prueba validados se dan en la Tabla 3.
© OCDE 2019
Página 9

Tabla 3. Criterio de liberación de lotes de CC
Límite de aceptación inferior Límite de aceptación superior
EpiSkin ™ (SM) IC 50 = 1,0 mg / ml IC 50 = 3,0 mg / ml

(18 horas de tratamiento con SDS) (33)
EpiDerm ™ SCT (EPI-200) ET 50 = 4.0 horas ET 50 = 8,7 horas
(Tritón X-100 al 1%) (34)
SkinEthic ™ RHE ET 50 = 4.0 horas ET 50 = 10.0 horas
(Tritón X-100 al 1%) (35)
epiCS (Triton X-100 al 1%) (36) ET 50 = 2,0 horas ET 50 = 7,0 horas
LabCyte EPI-MODEL24 SCT IC 50 = 1,4 mg / ml IC 50 = 4,0 mg / mL

(18 horas de tratamiento con SDS) (42)
Aplicación de la sustancia problema y las sustancias de control

22. Deben utilizarse al menos dos réplicas de tejidos para cada sustancia problema y controles para
cada tiempo de exposición. Tanto para productos químicos líquidos como sólidos, cantidad suficiente de producto problema
debe aplicarse para cubrir uniformemente la superficie de la epidermis evitando una dosis infinita,
es decir, debe utilizarse un mínimo de 70 μL / cm2 o 30 mg / cm2. Dependiendo de los métodos,
La superficie de la epidermis debe humedecerse con agua desionizada o destilada antes
aplicación de productos químicos sólidos, para mejorar el contacto entre el producto problema y el
superficie de la epidermis (34) (35) (36) (37) (42). Siempre que sea posible, los sólidos deben probarse como
polvo fino. El método de aplicación debe ser apropiado para la sustancia problema (véase, por ejemplo,
referencias (34-37). Al final del período de exposición, la sustancia problema debe ser cuidadosamente
lavado de la epidermis con un tampón acuoso o NaCl al 0,9%. Dependiendo de cual de
se utilizan los cinco métodos de prueba de RhE validados, se utilizan dos o tres períodos de exposición por prueba
químico (para los cinco modelos RhE válidos: 3 min y 1 hora; para EpiSkin ™ un adicional
tiempo de exposición de 4 horas). Dependiendo del método de prueba de RhE utilizado y el período de exposición
evaluado, la temperatura de incubación durante la exposición puede variar entre la temperatura ambiente
y 37ºC.
23. Los controles simultáneos negativos y positivos (PC) deben usarse en cada ejecución para
demostrar que la viabilidad (con controles negativos), la función de barrera y el tejido resultante
La sensibilidad (con el CP) de los tejidos se encuentra dentro de un rango de aceptación histórico definido. los
Los productos químicos sugeridos para PC son ácido acético glacial o KOH 8N según el modelo de RhE
utilizado (consulte el Anexo 2 y los procedimientos operativos estándar correspondientes para obtener más detalles). Cabe señalar que el KOH 8N es un
Reductor MTT que podría requerir controles adaptados como se describe en los párrafos 25 y 26. El
Los controles negativos sugeridos son NaCl al 0,9% (p / v) o agua.
Medidas de viabilidad celular

24. El ensayo MTT, que es un ensayo cuantitativo, debe usarse para medir la
viabilidad con arreglo a esta directriz de ensayo (27). La muestra de tejido se coloca en una solución MTT de
concentración apropiada (0.3, 0.5 o 1 mg / mL, consulte el Anexo 2 y el POE relevante para más detalles)
durante 3 horas. A continuación, el producto de formazán azul precipitado se extrae del tejido utilizando
un disolvente (por ejemplo, isopropanol, isopropanol ácido), y la concentración de formazán es
© OCDE 2019
Página 10

medido determinando la DO a 570 nm utilizando un paso de banda de filtro de un máximo de ± 30 nm,
o mediante un procedimiento de espectrofotometría de HPLC / UPLC (véanse los párrafos 30 y 31) (38).
25. Los químicos de prueba pueden interferir con el ensayo MTT, ya sea por reducción directa del
MTT en formazán azul y / o por interferencia de color si la sustancia problema absorbe,
naturalmente o debido a procedimientos de tratamiento, en el mismo rango de DO del formazán (570 ± 30 nm,
principalmente productos químicos azules y púrpuras). Deben utilizarse controles adicionales para detectar y corregir
para detectar una posible interferencia de estas sustancias problema, como el MTT no específico
control de reducción (NSMTT) y el control de color no específico (NSC) (véanse los apartados 26
al 30). Esto es especialmente importante cuando una sustancia problema específica no se elimina por completo.
del tejido enjuagando o cuando penetra en la epidermis, y por lo tanto está presente en
los tejidos cuando se realiza la prueba de viabilidad MTT. Descripción detallada de cómo corregir
La reducción directa de MTT y las interferencias por agentes colorantes está disponible en los SOP para el
métodos de prueba (34) (35) (36) (37) (42).
26. Para identificar los reductores MTT directos, debe añadirse cada sustancia problema a
medio MTT preparado (34) (35) (36) (37) (42). Si la mezcla de MTT que contiene la prueba
la sustancia química se vuelve azul / violeta, se presume que la sustancia problema reduce directamente el MTT, y
Se debe realizar un control funcional adicional de la epidermis no viable, independientemente de
utilizando la medición estándar de absorbancia (DO) o una espectrofotometría HPLC / UPLC
procedimiento. Este control funcional adicional emplea tejidos muertos que poseen solo
actividad metabólica residual, pero absorben la sustancia problema en una cantidad similar a la de los tejidos viables.
Cada producto químico reductor de MTT se aplica en al menos dos réplicas de tejido muerto por exposición.
tiempo, que se somete a toda la prueba de corrosión cutánea. La verdadera viabilidad del tejido es entonces
calculado como el porcentaje de viabilidad del tejido obtenido con tejidos vivos expuestos al MTT
reductor menos el porcentaje de reducción de MTT inespecífica obtenido con los tejidos muertos
expuesto al mismo reductor MTT, calculado en relación con la ejecución del control negativo
simultáneamente a la prueba que se está corrigiendo (% NSMTT).
27. Para identificar la posible interferencia de productos químicos de prueba de color o productos químicos de prueba que
se colorean cuando entran en contacto con agua o isopropanol y deciden la necesidad de
controles adicionales, análisis espectral de la sustancia problema en el agua (entorno durante
exposición) y / o isopropanol (solución de extracción). Si la sustancia problema
en agua y / o isopropanol absorbe la luz en el rango de 570 ± 30 nm, colorante adicional
Se deben realizar controles o, alternativamente, una espectrofotometría de HPLC / UPLC
Se debe utilizar este procedimiento, en cuyo caso estos controles no son necesarios (véanse los párrafos 30
y 31). Al realizar la medición de absorbancia estándar (DO), cada interferencia
la sustancia problema coloreada se aplica en al menos dos repeticiones de tejido viable por tiempo de exposición,
que se someten a toda la prueba de corrosión cutánea pero se incuban con medio en lugar de MTT
solución durante el paso de incubación MTT para generar un color no específico (NSCliving)
control. El control de NSCliving debe realizarse simultáneamente por tiempo de exposición por
sustancia problema coloreada (en cada ejecución) debido a la variabilidad biológica inherente de los
tejidos. La verdadera viabilidad del tejido se calcula luego como el porcentaje de viabilidad del tejido obtenido.
con tejidos vivos expuestos a la sustancia problema que interfiere e incubados con MTT
solución
sustanciamenos el porcentaje
problema de color
que interfiere inespecífico
y se incuban con obtenido
medio sincon tejidos
MTT, vivos expuestos
se procesan al mismoa tiempo
la
prueba que se corrige (% NSCliving).
28. Sustancias de prueba que se identifican como productoras de reducción directa de MTT (ver
párrafo 26) y la interferencia de color (ver párrafo 27) también requerirá un tercer conjunto de
controles, aparte de los controles NSMTT y NSCliving descritos en el
© OCDE 2019
Página 11
10 │ 431 OCDE / OCDE

párrafos, al realizar la medición estándar de absorbancia (DO). Esto suele ser
el caso de las sustancias problema de color oscuro que interfieren con el ensayo MTT (p. ej., azul,
púrpura, negro) porque su color intrínseco impide la evaluación de su capacidad para
reducir directamente el MTT como se describe en el párrafo 26. Estas sustancias problema pueden unirse tanto a
tejidos vivos y muertos y, por lo tanto, el control NSMTT puede no solo corregir el potencial
reducción directa de MTT por la sustancia problema, sino también para la interferencia de color derivada de la
unión de la sustancia problema a los tejidos muertos. Esto podría conducir a una doble corrección para
interferencia de color ya que el control NSCliving ya corrige la interferencia de color
derivados de la unión de la sustancia problema a tejidos vivos. Para evitar un posible doble
corrección de la interferencia de color, un tercer control para el color no específico en tejidos muertos
(NSCkilled) debe realizarse. En este control adicional, se aplica la sustancia problema.
en al menos dos réplicas de tejido muerto por tiempo de exposición, que se someten a todas las pruebas
procedimiento pero se incuban con medio en lugar de solución MTT durante el MTT
paso de incubación. Un único control calificado NSC es suficiente por sustancia problema, independientemente de la
número de pruebas / ejecuciones independientes realizadas, pero deben realizarse al mismo tiempo
Control NSMTT y, cuando sea posible, con el mismo lote de tejido. La verdadera viabilidad del tejido
Luego se calcula como el porcentaje de viabilidad del tejido obtenido con tejidos vivos expuestos al
sustancia problema menos% NSMTT menos% NSCliving más el porcentaje de color no específico
obtenido con tejidos muertos expuestos a la sustancia problema que interfiere e incubados con
medio sin MTT, calculado en relación con el control negativo ejecutado al mismo tiempo que el
prueba que se está corrigiendo (% NSCkilled).
29. Es importante tener en cuenta que la reducción de MTT no específica y el color no específico
Las interferencias pueden aumentar las lecturas del extracto de tejido por encima del rango de linealidad del
espectrofotómetro. Sobre esta base, cada laboratorio debe determinar el rango de linealidad de
su espectrofotómetro con MTT formazan (CAS # 57360-69-7) de un comercial
fuente antes de iniciar las pruebas de las sustancias problema con fines reglamentarios. En particular,
La medición estándar de absorbancia (DO) usando un espectrofotómetro es apropiada para
evaluar los reductores MTT directos y las sustancias problema que interfieren en el color cuando las DO de la
extractos de tejido obtenidos con la sustancia problema sin ninguna corrección para MTT directo
la reducción y / o la interferencia de color están dentro del rango lineal del espectrofotómetro
o cuando el porcentaje de viabilidad sin corregir obtenido con la sustancia problema ya definida
como corrosivo (véanse los apartados 35 y 36). Sin embargo, los resultados de las sustancias problema
producir% NSMTT y / o% NSCliving ≥ 50% del control negativo debe tomarse
con cuidado.
30. Para sustancias problema coloreadas que no son compatibles con la absorbancia estándar
(DO) debido a una interferencia demasiado fuerte con el ensayo MTT, la alternativa
Puede emplearse un procedimiento de espectrofotometría de HPLC / UPLC para medir MTT formazán
(ver párrafo 31) (37). El sistema de espectrofotometría HPLC / UPLC permite la
separación del MTT formazán de la sustancia problema antes de su cuantificación (38). Para
Por esta razón, nunca se requieren controles NSCliving o NSCkilled cuando se usa HPLC / UPLC-
espectrofotometría, independientemente del producto químico que se esté probando. Los controles NSMTT deben
no obstante, se utilizará si se sospecha que la sustancia problema reduce directamente el MTT o tiene un color
que impide la evaluación de la capacidad de reducir directamente el MTT (como se describe en
párrafo 26). Cuando se utiliza espectrofotometría HPLC / UPLC para medir MTT formazan,
el porcentaje de viabilidad tisular se calcula como porcentaje del área del pico de formazán de MTT obtenido con
tejidos vivos expuestos a la sustancia problema en relación con el pico de formazán de MTT obtenido con
el control negativo concurrente. Para productos de prueba capaces de reducir directamente el MTT, tejido verdadero
La viabilidad se calcula como el porcentaje de viabilidad del tejido obtenido con tejidos vivos expuestos a
la sustancia problema menos% NSMTT. Por último, cabe señalar que los reductores MTT directos
© OCDE 2019
Pagina 12

que también pueden interferir con el color, que se retienen en los tejidos después del tratamiento y
reducen el MTT tan fuertemente que conducen a OD (usando la medición estándar de OD) o pico
áreas (utilizando UPLC / HPLC-espectrofotometría) de los extractos de tejido probados que quedan fuera
del rango de linealidad del espectrofotómetro no se puede evaluar, aunque estos son
se espera que ocurra solo en situaciones muy raras.
31. La espectrofotometría HPLC / UPLC también se puede utilizar con todos los tipos de sustancias problema.
(reductores MTT coloreados, no coloreados y reductores no MTT) para la medición de MTT
formazán (38). Debido a la diversidad de sistemas de espectrofotometría HPLC / UPLC,
Debe demostrarse la calificación del sistema de espectrofotometría de HPLC / UPLC
antes de su uso para cuantificar MTT formazán de extractos de tejido cumpliendo con la aceptación
criterios para un conjunto de parámetros de calificación estándar basados en los descritos en los EE. UU.
Orientación de la Administración de Alimentos y Medicamentos para la industria sobre la validación de métodos bioanalíticos
(38) (39). Estos parámetros clave y sus criterios de aceptación se muestran en el Anexo 4. Una vez
se han cumplido los criterios de aceptación definidos en el Anexo 4, la HPLC / UPLC-
El sistema de espectrofotometría se considera calificado y listo para medir MTT formazan
en las condiciones experimentales descritas en esta guía de prueba.
Criterios de aceptación
32. Para cada método de prueba que utilice modelos RhE válidos, los tejidos tratados con el negativo
el control debe exhibir una DO que refleje la calidad de los tejidos como se describe en la tabla 2 y
no debe estar por debajo de los límites establecidos históricamente. Tejidos tratados con la PC, es decir
ácido acético glacial o KOH 8N, debe reflejar la capacidad de los tejidos para responder a un
químico corrosivo en las condiciones del método de prueba (ver Anexo 2 y SOP relevante
para detalles). La variabilidad entre las réplicas tisulares de la sustancia problema y / o el control.
Las sustancias deben estar dentro de los límites aceptados para cada modelo de RhE válido.
(ver el Anexo 2 y el POE relevante para más detalles) (por ejemplo, la diferencia de viabilidad entre los dos
las réplicas de tejido no deben exceder el 30%). Si el control negativo o el PC incluido en un
la ejecución cae fuera de los rangos aceptados, la ejecución se considera no calificada y debe ser
repetido. Si la variabilidad de las sustancias problema cae fuera del rango definido, su prueba
debe repetirse.
Interpretación de resultados y modelo de predicción

33. Los valores de DO obtenidos para cada sustancia problema deben utilizarse para calcular
porcentaje de viabilidad relativo al control negativo, que se establece en 100%. En caso
Se utiliza espectrofotometría HPLC / UPLC, el porcentaje de viabilidad tisular se calcula como
porcentaje del área del pico de formazán de MTT obtenido con tejidos vivos expuestos a la sustancia problema
en relación con el pico de MTT formazán obtenido con el control negativo concurrente. El corte-
fuera de los valores de viabilidad de la celda porcentual que distinguen la prueba corrosiva de la no corrosiva
químico (o discriminando entre diferentes subcategorías corrosivas) se definen a continuación
en los párrafos 35 y 36 para cada uno de los métodos de prueba cubiertos por esta Guía de prueba y
debe utilizarse para interpretar los resultados.
34. Una sola ejecución de prueba compuesta por al menos dos réplicas de tejido debería ser suficiente
para una sustancia problema cuando la clasificación resultante sea inequívoca. Sin embargo, en los casos de
resultados dudosos, como mediciones repetidas no concordantes, se puede
considerado, así como un tercero en caso de resultados discordantes entre las dos primeras carreras.
35. El modelo de predicción para el método de prueba de corrosión cutánea EpiSkin ™ (9) (34) (22),
asociado con el sistema de clasificación UN GHS (1), se muestra en la Tabla 4:
© OCDE 2019
Página 13
Tabla 4. Modelo de predicción de EpiSkin ™
Viabilidad medida después del tiempo de exposición

Predicción a considerar
puntos (t = '3,' 60 y 240 minutos)
<35% después de 3 min de exposición Corrosivo:

Subcategoría opcional 1A *
≥ 35% después de 3 min de exposición Y <35% después Corrosivo:
60 min de exposición Una combinación de Sub-
O categorías 1B-y-1C
≥ 35% después de 60 min de exposición Y <35% después de 240
exposición mínima
≥ 35% después de 240 min de exposición No corrosivo
*) Según los datos generados con vistas a evaluar la utilidad de los métodos de prueba RhE para
de apoyo a la subcategoría, se demostró que alrededor del 22% de los resultados de la subcategoría 1A del
El método de prueba EpiSkin ™ puede constituir en realidad la subcategoría 1B o la subcategoría 1C
sustancias / mezclas (es decir, sobre clasificaciones) (véase el anexo 3).
36. Los modelos de predicción para EpiDerm ™ SCT (10) (23) (35), SkinEthic ™
RHE (17) (18) (23) (36), el epiCS® (16) (23) (37) y LabCyte EPI-MODEL24 (41) (42)
Los métodos de prueba de corrosión cutánea, asociados con el sistema de clasificación UN GHS (1), son
se muestra en la Tabla 5:
© OCDE 2019
Página 14

Tabla 5. EpiDerm ™ SCT, SkinEthic ™ RHE epiCS ® y LabCyte EPI-MODEL24
SCT
Viabilidad medida después del tiempo de exposición

Predicción a considerar
puntos (t = 3 y 60 minutos)
PASO 1 para EpiDerm ™ SCT, SkinEthic ™ RHE, epiCS ® y LabCyte EPI-MODEL24 SCT
<50% después de 3 min de exposición Corrosivo

≥ 50% después de 3 min de exposición Y Corrosivo
<15% después de 60 min de exposición
≥ 50% después de 3 min de exposición Y No corrosivo
≥ 15% después de 60 min de exposición
PASO 2 para EpiDerm ™ SCT - para sustancias / mezclas identificadas como corrosivas en el paso 1
<25% después de 3 min de exposición Subcategoría opcional 1A *

≥ 25% después de 3 min de exposición Una combinación de subcategorías opcionales 1B-
y-1C
PASO 2 para SkinEthic ™ RHE - para sustancias / mezclas identificadas como Corrosivas en el paso 1

y-1C
PASO 2 para epiCS ® - para sustancias / mezclas identificadas como Corrosivas en el paso 1
y-1C
PASO 2 para LabCyte EPI-MODEL24 SCT - para sustancias / mezclas identificadas como corrosivas en el paso 1

y-1C
* Según los datos generados con vistas a evaluar la utilidad de los métodos de prueba RhE para
apoyando la subcategorización, se demostró que alrededor del 29%, 31%, 33% y 30% de los
Resultados de categoría 1A de EpiDerm ™ SCT, SkinEthic ™ RHE epiCS® y LabCyte EPI-
MODEL24 SCT, respectivamente, puede constituir en realidad la subcategoría 1B o la subcategoría 1C
sustancias / mezclas (es decir, sobreclasificaciones) (véase el anexo 3).
DATOS E INFORMES
Datos
37. Para cada prueba, los datos de los tejidos individuales se replican (p. Ej., Valores de DO y
Deberá indicarse el porcentaje de viabilidad celular de cada sustancia problema, incluida la clasificación).
en forma de tabla, incluidos los datos de experimentos repetidos, según corresponda. Además, significa
y se deben informar los rangos de viabilidad y CV entre las réplicas de tejido para cada prueba.
Interacciones observadas con el reactivo MTT mediante reductores MTT directos o sustancias problema coloreadas
debe informarse para cada sustancia probada.
© OCDE 2019
Página 15

Informe de prueba
38. El informe de prueba debe incluir la siguiente información:
Sustancias químicas de prueba y de control:

• Sustancia monoconstituyente: identificación química, como IUPAC o CAS
nombre, número CAS, código SMILES o InChI, fórmula estructural, pureza, producto químico
identidad de impurezas según sea apropiado y prácticamente factible, etc .;
• Sustancia multiconstituyente, UVCB y mezcla: caracterizada en la medida de lo posible
por identidad química (ver arriba), ocurrencia cuantitativa y relevancia
propiedades fisicoquímicas de los constituyentes;
• Apariencia física, solubilidad en agua y cualquier fisicoquímico relevante adicional.
propiedades;
• Fuente, número de lote si está disponible;
• Tratamiento de la sustancia problema / sustancia de control antes de la prueba, si corresponde (p. Ej.
calentamiento, molienda);
• Estabilidad de la sustancia problema, fecha límite de uso o fecha del nuevo análisis, si se conoce;
• Condiciones de almacenaje.
Modelo y protocolo de EHR utilizados y justificación (si corresponde)

Condiciónes de la prueba:
• Modelo de RhE utilizado (incluido el número de lote);
• Información de calibración para el dispositivo de medición (por ejemplo, espectrofotómetro), longitud de onda
y banda
• aprobado (si corresponde) utilizado para cuantificar MTT formazan, y rango de linealidad de
dispositivo de medición;
• Descripción del método utilizado para cuantificar MTT formazan;
• Descripción de la calificación del sistema de espectrofotometría HPLC / UPLC, si

aplicable;
• Información de apoyo completa para el modelo RhE específico utilizado, incluido su
rendimiento. Esto debe incluir, pero no se limita a:
oi) Viabilidad;
o ii) Función barrera;
o iii) Morfología;
o iv) Controles de calidad (QC) del modelo;
• Referencia a datos históricos del modelo. Esto debe incluir, pero no se limita a
aceptabilidad de los datos de CC con referencia a los datos históricos de los lotes;
• Demostración de competencia en la realización del método de prueba antes del uso de rutina por
ensayo de las sustancias de aptitud.
© OCDE 2019
Página 16

Procedimiento de prueba:
• Detalles del procedimiento de prueba utilizado (incluidos los procedimientos de lavado utilizados después
período de exposición);
• Dosis de sustancia problema y sustancias de control utilizadas;
• Duración del período (s) de exposición y temperatura (s) de exposición;
• Indicación de los controles utilizados para los reductores MTT directos y / o prueba de coloración
productos químicos, si aplica;
• Número de réplicas de tejido utilizadas por sustancia problema y controles (PC, negativo
control, y NSMTT, NSCliving y NSCkilled, si corresponde), por tiempo de exposición;
• Descripción de los criterios de decisión / modelo de predicción aplicado en base al modelo RhE
usado;
• Descripción de cualquier modificación del procedimiento de prueba (incluido el lavado
procedimientos).
• Criterios de aceptación de ejecución y prueba:
• Valores medios de control positivo y negativo y rangos de aceptación basados en

información histórica;
• Variabilidad aceptable entre réplicas de tejido para controles positivos y negativos;
• Variabilidad aceptable entre las réplicas de tejidos para la sustancia problema.
Resultados:
• Tabulación de datos para controles y sustancias problema individuales, para cada exposición
período, cada ejecución y cada medición replicada, incluido el formazan OD o MTT
área de pico, porcentaje de viabilidad tisular, porcentaje medio de viabilidad tisular, diferencias
entre réplicas, SD y / o CV si procede;
• Si corresponde, los resultados de los controles utilizados para los reductores MTT directos y / o la prueba de coloración
productos químicos que incluyen OD o MTT área de pico de formazán,% NSMTT,% NSCliving,
% NSC calificados, diferencias entre réplicas de tejido, SD y / o CV (si corresponde),
y el porcentaje correcto final de viabilidad del tejido;
• Resultados obtenidos con la (s) sustancia (s) problema (s) y las sustancias de control en relación con
criterios de aceptación de ejecución y prueba definidos;
• Descripción de otros efectos observados;
• La clasificación derivada con referencia al modelo de predicción / criterios de decisión

usado.
Discusión de los resultados:
Conclusiones:
© OCDE 2019
Página 17

LITERATURA
1. ONU. (2013). Sistema de Clasificación Globalmente Armonizado de las Naciones Unidas y

Etiquetado de productos químicos (GHS), quinta edición revisada, ONU Nueva York y Ginebra.
Disponible a:
[http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev05/05files_e.html]
2. OCDE. (2015). Directriz para pruebas de productos químicos. (No. 404.): Dérmica aguda
Irritación, Corrosión, Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económicos,
París.
3. OCDE. (2015). Directriz para la prueba de productos químicos (No. 430.): Piel in vitro
Corrosión: Resistencia eléctrica transcutánea (TER). Organización para
Cooperación y desarrollo económicos, París.
4. OCDE. (2015). Directriz para la prueba de productos químicos (No. 435.): In Vitro
Método de prueba de barrera de membrana. Organización para la Cooperación Económica y
Desarrollo, París. (5) OCDE. (2015). Directriz para la prueba de productos químicos
(No. 439.): Irritación de la piel in vitro: Método de prueba de epidermis humana reconstruida.
Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económicos, París.
5. OCDE. (2015). Directriz para la prueba de productos químicos (No. 439.): Piel in vitro
Irritación: Método de prueba de epidermis humana reconstruida. Organización para
6. OCDE. (2014). Documento de orientación sobre enfoques integrados para pruebas y
Evaluación de la irritación / corrosión de la piel. Medio Ambiente, Salud y Seguridad
Publicaciones, Serie sobre Pruebas y Evaluación, (No. 203.) Organización para
7. Botham PA, Chamberlain M., Barratt MD, Curren RD, Esdaile DJ, Gardner
JR, Gordon VC, Hildebrand B., Lewis RW, Liebsch M., Logemann P.,
Osborne R., Ponec M., Regnier JF, Steiling W., Walker AP y Balls M. (1995).
Un estudio previo a la validación de las pruebas de corrosión cutánea in vitro. El informe y
Recomendaciones del taller ECVAM 6.ATLA 23, 219-255.
8. Barratt MD, Brantom PG, Fentem JH, Gerner I., Walker AP y Worth AP
(1998). El estudio de validación internacional ECVAM sobre pruebas in vitro para la piel
Corrosividad. 1. Selección y distribución de las sustancias problema. Toxicol.In Vitro
12, 471-482.
9. Fentem JH, Archer GEB, Balls M., Botham PA, Curren RD, Earl LK,
Esdaile DJ, Holzhutter H.- G. y Liebsch M. (1998). El ECVAM Internacional
Estudio de validación de pruebas in vitro de corrosividad cutánea. 2. Resultados y evaluación
por el Equipo Directivo. Toxicol. In Vitro 12, 483-524.
10. Liebsch M., Traue D., Barrabas C., Spielmann H., Uphill, P., Wilkins S., Wiemann
C., Kaufmann T., Remmele M. y Holzhütter HG (2000). El ECVAM
Estudio de validación previa sobre el uso de EpiDerm para pruebas de corrosión cutánea, ATLA
28, págs. 371-401.
11. Balls M., Blaauboer BJ, Fentem JH, Bruner L., Combes RD, Ekwall B., Fielder
RJ, Guillouzo A., Lewis RW, Lovell DP, Reinhardt CA, Repetto G.,
Sladowski D., Spielmann H. y Zucco F. (1995). Aspectos prácticos de la validación
© OCDE 2019
Página 18

de los procedimientos de prueba de toxicidad. El informe y las recomendaciones de ECVAM
Talleres, ATLA 23, 129-147.
12. ICCVAM (Comité de Coordinación Interagencial para la Validación de Alternativas
Métodos). (1997). Validación y aceptación reglamentaria de la prueba toxicológica
Métodos. Publicación de los NIH No. 97-3981. Instituto Nacional de Salud Ambiental
Sciences, Research Triangle Park, Carolina del Norte, EE. UU. Disponible en:
[http://www.iccvam.niehs.nih.gov/docs/guidelines/validate.pdf].
13. ICCVAM (Comité de Coordinación Interagencial para la Validación de Alternativas
Métodos). (2002). Evaluación ICCVAM de EpiDerm ™ (EPI-200), EPISKIN ™
(SM) y el ensayo de resistencia eléctrica transcutánea (TER) de piel de rata: in vitro
Métodos de prueba para evaluar el potencial de corrosión dérmica de los productos químicos. NIH
Publicación No. 02-4502. Programa Nacional de Toxicología Centro Interagencial para la
Evaluación de métodos toxicológicos alternativos, Instituto Nacional de
Ciencias de la salud ambiental, Research Triangle Park, NC, EE. UU. Disponible
en: [http://www.iccvam.niehs.nih.gov/methods/epiddocs/epis_brd.pdf]
14. EC-ECVAM. (1998). Declaración sobre la validez científica de la prueba EpiSkin ™
(una prueba in vitro de corrosión cutánea), emitida por el Consejo Científico de ECVAM
Comité (ESAC10), 3 abril 1998. Disponible a:
[http: //www.ecvam.jrc.ec.europa.eu.html].
15. EC-ECVAM. (2000). Declaración sobre la aplicación de la piel humana EpiDerm ™
Modelo para pruebas de corrosión cutánea, emitido por el Consejo científico de ECVAM
Comité (ESAC14), 21 marzo 2000. Disponible a:
[http://ecvam.jrc.ec.europa.eu].
16. Hoffmann J., Heisler E., Karpinski S., Losse J., Thomas D., Siefken W., Ahr HJ,
Vohr HW y Fuchs HW (2005). Epidermal-Skin-Test 1000 (EST-1000) -A Nuevo
Epidermis reconstruida para pruebas de corrosión cutánea in vitro. Toxicol.In Vitro
19, 925-929.
17. Kandárová H., Liebsch M., Spielmann, H., Genschow E., Schmidt E., Traue D.,
Invitado R., Whittingham A., Warren N, Gamer AO, Remmele M., Kaufmann T.,
Wittmer E., De Wever B. y Rosdy M. (2006). Evaluación de lo humano
Modelo de epidermis SkinEthic RHE para pruebas de corrosión cutánea in vitro de productos químicos
Según New OECD TG 431. Toxicol.In Vitro 20, 547 559.
18. Tornier C., Roquet M. y Fraissinette AB (2010). Adaptación del Validado
Método de prueba de corrosión cutánea con epidermis humana reconstruida SkinEthic ™ (RHE)
a 0,5 cm2 de muestra de tejido. Toxicol. In Vitro 24, 1379-1385.
19. EC-ECVAM. (2006). Declaración sobre la aplicación de la piel humana SkinEthic ™
Modelo para pruebas de corrosión cutánea, emitido por el Consejo científico de ECVAM
Comité (ESAC25), 17 noviembre 2006. Disponible a:
20. EC-ECVAM. (2009). Declaración de ESAC sobre la validez científica de un producto in vitro
Método de prueba para pruebas de corrosión cutánea: EST-1000, emitido por ECVAM
Comité Asesor Científico (ESAC30), 12 de junio de 2009. Disponible en:
21. OCDE. (2013). Documento resumido sobre el desempeño estadístico de los métodos en
Directriz de prueba 431 de la OCDE para subcategorización. Medio Ambiente, Salud y Seguridad
© OCDE 2019
Página 19

Publicaciones, Serie sobre pruebas y evaluación (núm. 190). Organización para
22. Alépée N., Grandidier MH y Cotovio J. (2014). Subcategorización de la piel
Sustancias químicas corrosivas de la piel de epidermis humana reconstruida EpiSkin ™
Método de prueba de corrosión según UN GHS: Revisión de las directrices de prueba de la OCDE
431. Toxicol. In Vitro 28, 131-145.
23. Desprez B., Barroso J., Griesinger C., Kandárová H., Alépée N. y Fuchs, H.
(2015). Dos nuevos modelos de predicción mejoran las predicciones de sustancias corrosivas cutáneas
categorías por métodos de prueba de la directriz de prueba No. 431 de la OCDE. Toxicol. In vitro
29, 2055 2080.
24. OCDE. (2015). Normas de desempeño para la evaluación de propuestas similares o
Métodos de prueba de epidermis humana reconstruida in vitro modificada (RHE) para la piel
Corrosión en relación con la OCDE TG 431. Salud y seguridad ambiental
Publicaciones, Serie sobre pruebas y evaluación (núm. 219). Organización para
Cooperación y desarrollo económicos, París
25. OCDE. (2005). Documento de orientación sobre validación e internacional

Aceptación de métodos de prueba nuevos o actualizados para la evaluación de peligros.
Publicaciones sobre medio ambiente, salud y seguridad, serie sobre pruebas y evaluación
(No. 34.), Organización de Cooperación y Desarrollo Económicos, París.
26. Eskes C. et al. (2012). Evaluación reglamentaria de la corrosión cutánea in vitro y
Datos de irritación en el marco europeo: recomendaciones de los talleres.
Regul.Toxicol.Pharmacol. 62, 393-403.
27. Mosmann T. (1983). Ensayo colorimétrico rápido para el crecimiento y la supervivencia celular:
Aplicación a ensayos de proliferación y citotoxicidad. J. Immunol. Métodos 65, 55-
63.
28. Tinois E., et al. (1994). El modelo de Episkin: Reconstrucción exitosa de humanos
Epidermis in vitro. En: Toxicología cutánea in vitro. Rougier A.,. Goldberg AM y
Maibach HI (Eds): 133-140.
29. Cannon CL, Neal PJ, Southee JA, Kubilus J. y Klausner M. (1994), New
Modelo epidérmico para pruebas de irritación dérmica. Toxicol. In Vitro 8, 889 - 891.
30. Ponec M., Boelsma E, Weerheim A, Mulder A, Bouwstra J y Mommaas M.
(2000). Caracterización lipídica y ultraestructural de modelos de piel reconstruida.
Enterrar. J. Pharmaceu. 203, 211 - 225.
31. Tinois E., Tillier, J., Gaucherand, M., Dumas, H., Tardy, M. y Thivolet J. (1991).
Diferenciación in vitro y postrasplante de queratinocitos humanos cultivados
sobre la película de colágeno humano tipo IV de un sustituto dérmico de dos capas. Exp. Celda
Res. 193: 310-319.
32. Parenteau NL, Bilbo P, Nolte CJ, Mason VS y Rosenberg M. (1992). los
Cultivo organotípico de queratinocitos y fibroblastos de piel humana para lograr
Forma y función. Cytotech. 9, 163-171.
33. Wilkins LM, Watson SR, Prosky SJ, Meunier SF y Parenteau NL (1994).
Desarrollo de una construcción de piel viva de dos capas para aplicaciones clínicas.
Biotech.Bioeng 43/8, 747-756.
© OCDE 2019
Página 20

34. EpiSkin ™ (diciembre de 2011) SOP. Protocolo INVITTOX (No. 118.). EpiSkin ™
Prueba de corrosión cutánea. Disponible en: [http://www.ecvam.jrc.ec.europa.eu.hm;].
35. EpiDremTM SOP. (Febrero de 2012). Versión MK-24-007-0024 Protocolo para: In
Prueba de corrosión cutánea EpiDerm ™ vitro (EPI-200-SCT), para usar con MatTek
Modelo epidérmico humano reconstruido de la Corporación EpiDerm. Disponible en:
36. SkinEthic ™ RHE SOP, Protocolo INVITTOX (enero de 2012). SkinEthic ™ Skin
Prueba de corrosividad. Disponible en: [http: //www.ecvam.jrc.ec.europa.eu.html].
37. EpiCS® SOP, versión 4.1 (enero de 2012). Corrosión cutánea in vitro: piel humana
Prueba de modelo Prueba de piel epidérmica 1000 (epiCS®) CellSystems. Disponible en:
38. Alépée N., Barroso J., De Smedt A., De Wever B., Hibatallah J., Klaric M., Mewes
KR, Millet M., Pfannenbecker U., Tailhardat M., Templier M. y McNamee P.
Uso de espectrofotometría HPLC / UPLC para la detección de formazán MTT in vitro
Métodos de prueba basados en tejido humano reconstruido (RhT) que emplean el MTT
Ensayo para ampliar su aplicabilidad a productos químicos de prueba de colores fuertes.
Manuscrito en preparación.
39. FDA de EE. UU. (2001). Orientación para la industria: Validación del método bioanalítico. nosotros
Departamento de Salud y Servicios Humanos, Administración de Alimentos y Medicamentos. (Mayo
2001). Disponible a:
[http://www.fda.gov/downloads/Drugs/Guidances/ucm070107.pdf].
40. Katoh M., Hamajima F., Ogasawara T. y Ken-ichiro Hata. (2010). Evaluación
del modelo epidérmico humano LabCyte EPI-MODEL para corrosión cutánea in vitro
Ensayo de acuerdo con la Directriz de ensayo 431. J Toxicol. Sci. 35, 411-417.
41. Equipo de gestión de validación de LabCyte (2018). Estudio de validación para piel in vitro
Método de prueba de corrosión utilizando tejido epidérmico humano reconstruido LabCyte EPI-
MODELO 24. Disponible en: [http://www.jacvam.jp/files/doc/01_05/01_05_Z1.pdf].
42. LabCyte EPI-MODEL24 SCT SOP, versión 1.6. (Mayo de 2017). Prueba de corrosión cutánea
utilizando el modelo humano reconstruido “LabCyte EPI-MODEL24”. Disponible en:
[http://www.jacvam.jp/files/doc/01_05/01_05_Z2.pdf].
43. Informe de la revisión por pares del estudio de validación de LabCyte EPI-MODEL24 En
Vitro Piel Corrosión Prueba Método. Disponible a
[http://www.jacvam.jp/files/doc/01_05/01_05_Z3.pdf].
© OCDE 2019
Página 21
ANEXO 1- DEFINICIONES
Exactitud: la proximidad del acuerdo entre los resultados del método de prueba y la referencia aceptada
valores. Es una medida del rendimiento del método de prueba y un aspecto de relevancia. El término
a menudo se usa indistintamente con "concordancia" para referirse a la proporción de
resultados de un método de prueba (25).
Viabilidad celular: parámetro que mide la actividad total de una población celular, por ejemplo, como capacidad de
deshidrogenasas mitocondriales celulares para reducir el tinte vital MTT (3- (4,5-
Bromuro de dimetiltiazol-2-il) -2,5- difeniltetrazolio, azul de tiazolilo), que
dependiendo del punto final medido y el diseño de prueba utilizado, se correlaciona con el total
número y / o vitalidad de las células vivas.
Químico: significa una sustancia o una mezcla.
Concordancia: Esta es una medida del rendimiento del método de prueba para métodos de prueba que dan una
resultado categórico, y es un aspecto de relevancia. El término se usa a veces
indistintamente con precisión, y se define como la proporción de todos los productos químicos probados que
se clasifican correctamente como positivos o negativos. La concordancia depende en gran medida de la
prevalencia de positivos en los tipos de sustancia problema que se examinan (25).
ET50: Puede estimarse determinando el tiempo de exposición necesario para reducir la
viabilidad en un 50% tras la aplicación de la sustancia química de referencia en un determinado, fijo
concentración, ver también IC50.
GHS (Sistema mundialmente armonizado de clasificación y etiquetado de productos químicos): A
sistema que propone la clasificación de productos químicos (sustancias y mezclas) según
tipos y niveles estandarizados de peligros físicos, para la salud y ambientales, y
abordar los elementos de comunicación correspondientes, como pictogramas, palabras de advertencia,
indicaciones de peligro, consejos de prudencia y fichas de datos de seguridad, de modo que
información sobre sus efectos adversos con el fin de proteger a las personas (incluidos los empleadores,
trabajadores, transportistas, consumidores y socorristas) y el medio ambiente (1).
HPLC: Cromatografía líquida de alta resolución .
IATA: Enfoque integrado de pruebas y evaluación.
CI50: puede estimarse determinando la concentración a la que se
químico reduce la viabilidad de los tejidos en un 50% (IC50) después de un tiempo de exposición fijo, ver
también ET50.
ET50 . Dosis infinita: cantidad de sustancia problema aplicada a la epidermis que supera el
cantidad necesaria para cubrir completa y uniformemente la superficie de la epidermis.
Mezcla: es una mezcla o solución compuesta por dos o más sustancias en las que se
no reaccionen.
Sustancia monoconstituyente : Sustancia, definida por su composición cuantitativa, en
cuyo constituyente principal está presente al menos en un 80% (p / p).
MTT: bromuro de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio; Azul de tiazolilo
bromuro de tetrazolio.
Sustancia multiconstituyente: Sustancia, definida por su composición cuantitativa, en
en el que más de un constituyente principal está presente en una concentración ≥ 10% (p / p) y <
© OCDE 2019
Página 22

80% (p / p). Una sustancia multiconstituyente es el resultado de un proceso de fabricación. los
La diferencia entre mezcla y sustancia multiconstituyente es que se obtiene una mezcla.
mediante la mezcla de dos o más sustancias sin reacción química. Un multiconstituyente
La sustancia es el resultado de una reacción química.
NC : No corrosivo.
Control NSC killed : Control de color no específico en tejidos muertos.
NSCliving control : Control de color no específico en tejidos vivos.
NSMTT: Reducción de MTT no específica.
OD: densidad óptica

PC: Control positivo, una réplica que contiene todos los componentes de un sistema de prueba y tratados
con una sustancia que se sabe que induce una respuesta positiva. Para asegurar que la variabilidad en el
Se puede evaluar la respuesta de control positivo a lo largo del tiempo, la magnitud de la
La respuesta no debe ser excesiva.
Estándares de desempeño (PS): Estándares, basados en un método de prueba validado, que proporcionan un
base para evaluar la comparabilidad de un método de prueba propuesto que es mecánico y
funcionalmente similar. Se incluyen; (i) componentes esenciales del método de prueba; (ii) una lista mínima
de sustancias químicas de referencia seleccionadas de entre las sustancias químicas utilizadas para demostrar la
rendimiento aceptable del método de prueba validado; y (iii) los niveles similares de
confiabilidad y precisión, con base en lo que se obtuvo para el método de prueba validado, que el
El método de prueba propuesto debe demostrar cuando se evalúa utilizando la lista mínima de
Productos químicos de referencia (25).
Relevancia: Descripción de la relación del método de prueba con el efecto de interés y

si es significativo y útil para un propósito particular. Es la medida en que el
El método de prueba mide o predice correctamente el efecto biológico de interés. Relevancia
incorpora la consideración de la precisión (concordancia) de un método de prueba (25).
Fiabilidad: Medidas de la medida en que un método de prueba se puede realizar de forma reproducible dentro de
y entre laboratorios a lo largo del tiempo, cuando se realiza utilizando el mismo protocolo. Se evalúa
calculando la reproducibilidad intra e interlaboratorios (25).
Ejecución: una serie consta de una o más sustancias de prueba analizadas simultáneamente con un resultado negativo.
control y con una PC.
Sensibilidad: La proporción de todas las sustancias químicas positivas / activas que están correctamente clasificadas por
el método de prueba. Es una medida de precisión para un método de prueba que produce resultados categóricos.
resultados, y es una consideración importante en la evaluación de la relevancia de un método de prueba (25).
Corrosión cutánea in vivo: producción de daños irreversibles en la piel; es decir, visible
necrosis a través de la epidermis y hacia la dermis, después de la aplicación de una prueba
químico por hasta cuatro horas. Las reacciones corrosivas se caracterizan por úlceras, sangrado, sangre
costras y, al final de la observación a los 14 días, por decoloración debido al blanqueamiento de la
piel, áreas completas de alopecia y cicatrices. Se debe considerar la histopatología para
evaluar lesiones cuestionables.
Especificidad: la proporción de todas las sustancias químicas negativas / inactivas que se clasifican correctamente
por el método de prueba. Es una medida de precisión para un método de prueba que produce resultados categóricos.
resultados y es una consideración importante en la evaluación de la relevancia de un método de prueba (25).
Sustancia: los elementos químicos y sus compuestos en estado natural u obtenidos
por cualquier proceso de producción, incluido cualquier aditivo necesario para preservar la estabilidad del
© OCDE 2019
Página 23

producto y las impurezas derivadas del proceso utilizado, pero excluyendo cualquier disolvente que
puede separarse sin afectar la estabilidad de la sustancia o cambiar su
composición.
Sustancia problema: significa lo que se está probando.
UPLC: Cromatografía líquida de ultra alto rendimiento.
UVCB: sustancias de composición variable o desconocida, productos de reacción complejos o
materiales biológicos.
© OCDE 2019
Página 24
OCDE / OCDE 431 │
ANEXO 2 - PRINCIPALES COMPONENTES DEL MÉTODO DE PRUEBA DE LOS MÉTODOS DE PRUEBA RhE VALIDADOS PA
PRUEBAS DE CORROSIÓN
Nr. 1 2 3 4 5
Método de prueba
EpiSkin ™ EpiDerm ™ SCT SkinEthic ™ RHE epiCS ® LabCyte EPI-MODEL2
Componente
Superficie del modelo 0,38 cm 2 0,63 cm 2 0,5 cm 2 0,6 cm 2 0,3 cm 2
Número de
Al menos 2 por tiempo de exposición 2-3 por tiempo de exposición Al menos 2 por tiempo de exposición Al menos 2 por tiempo de exposición Al menos 2 por tiempo
el tejido se replica
Líquidos y viscosos: 50 μL
Líquidos: 50 μL (79,4 μL / cm 2 )
(83,3 μL / cm 2 ) utilizando malla de nailon
con o sin malla de nailon Líquidos y viscosos: 40 ± 3 μL
Líquidos y viscosos: 50 ± 3 μL Prueba previa de compatibilidad de la prueba
Líquidos y viscosos: 50 μ
(80μL / cm 2 ) usando malla de nailon
Prueba previa de compatibilidad de la prueba
(131,6 μL / cm 2 ) químico con malla de nailon (166,7 μL / cm 2 )
químico con malla de nailon Prueba previa de compatibilidad de la prueba
Sólidos: 20 ± 2 mg (52,6 mg / cm 2 ) Semisólidos: 50 μL (83,3 μL / cm 2 ) Sólidos: 50 ± 2 mg (166,7
Dosis de tratamiento Semisólidos: 50 μL (79,4 μL / cm 2 ) químico con malla de nailon
+100 μL ± 5 μL de solución de NaCl (9 Sólidos: 25 mg (41,7 mg / cm 2 ) + + 50 μL H 2 O
y aplicación Sólidos: 25 μL H 2 O (o necesario) Sólidos: 20 μL ± 2μl H 2 O + 20 ± 3
g / L) 25 μL H 2 O (o más si es necesario) Waxy: use un positivo
+ 25 mg (39,7 mg / cm 2 ) mg (40 mg / cm2)
Ceroso / pegajoso: 50 ± 2 mg (131,6 Ceroso / pegajoso: plano "como una galleta"pipeta de desplazamiento
Ceras: pieza plana en forma de disco Ceroso / pegajoso: 20 ± 3 mg (40
mg / cm 2 ) con una malla de nailon pedazo de ca. 8 mm de diámetro Sustancia líquida y visco
California. 8 mm de diámetro colocado encima
mg / cm 2 ) con una malla de nailon
el tejido humedecido con 15μL H 2 O. colocado encima del tejido humedecido
con 15μL H 2 O
© OCDE
Página 25

Nr. 1 2 3 4 5
Método de prueba
Componente
50 μL (líquido) o 20 mg (sólido) 50 μL (líquido) o 25 mg (sólido) 40 μL (líquido) o 20 mg (sólido) 50 μL (líquido) o 25 mg (sólido) 50 μL (líquido) o 50 mg (
+ 2 ml de MTT 0,3 mg / ml + 1 mL de solución MTT 1 mg / mL + 1 mL de solución MTT 1 mg / mL + 1 mL de solución MTT 1 mg / mL + 500 μL de MTT 0,5 mg
solución durante 180 ± 5 min a 37 o C, durante 60 min a 37 o C, 5% CO 2 , durante 180 ± 15 min a 37 o C, 5% durante 60 min a 37 o C, 5% CO 2 , solución durante 60 min a
Verificación previa para
5% de CO 2 , 95% de humedad relativa 95% de humedad relativa CO 2 , 95% de humedad relativa 95% de humedad relativa CO 2 , 95% de humedad r
MTT directo
→ si la solución cambia → si la solución cambia → si la solución cambia → si la solución cambia → si la solución cambia
reducción
azul / morado, muerto por agua azul / violeta, congelado azul / violeta, congelado azul / violeta, congelado azul / violeta, cong
los controles adaptados deben ser los controles adaptados deben ser los controles adaptados deben ser los controles adaptados deben ser los controles adapt
realizado realizado realizado realizado realizado
Verificación previa para 10 μL (líquido) o 10 mg (sólido) 50 μL (líquido) o 25 mg (sólido) 40 μL (líquido) o 20 mg (sólido) 50 μL (líquido) o 25 mg (sólido) 50 μL (líquido) o 50 mg
color + 90μL H2O mezclado durante 15 min a + 300 μL H2O mezclado durante 60 min + 300 μL H2O mezclado durante 60 min + 300 μL H2O mezclado durante 60 min + 500 μL H2O mezclado
interferencia RT a 37oC, 5% CO2, 95% RH en RT a 37oC, 5% CO2, 95% RH a 37oC, 5% CO2, 95%
→ si la solución se vuelve → si la solución se vuelve → si la solución se vuelve → si la solución se vuelve → si la solución se vuelv
coloreado, adaptado a la vida coloreado, adaptado a la vida coloreado, adaptado a la vida coloreado, adaptado a la vida coloreado, adaptad
los controles deben ser los controles deben ser los controles deben ser los controles deben ser los controles deben
realizado realizado realizado realizado realizado
Tiempo de exposición 3 min, 60 min (± 5 min)
y temperatura y 240 min (± 10 min) 3 min a temperatura ambiente, 3 min a temperatura ambiente, 3 min a temperatura ambiente, 3 min a temp
En armario ventilado y 60 min a 37oC, 5% CO2, y 60 min a 37oC, 5% CO2, y 60 min a 37oC, 5% CO2, y 60 min a 37oC, 5% C
Temperatura ambiente (RT, 18- 95% de humedad relativa 95% de humedad relativa 95% de humedad relativa 95% de hu
28oC)
Enjuague 20 veces con un suave constante 20 veces con un suave constante 20 veces con un suave constante 10 veces o más con una c
25 mL 1x PBS (2 mL / lanzamiento)
flujo de 1x PBS flujo de 1x PBS flujo de 1x PBS flujo fuerte de 1x PB
Control negativo 50 μL de solución de NaCl (9 g / L) 50 μL de H2O 40 μl de H2O 50 μL de H2O 50 μL de H2
Probado con cada tiempo de exposición Probado con cada tiempo de exposición Probado con cada tiempo de exposición Probado con cada tiempo de exposición Probado con cada tiempo
Control positivo 50 μL de ácido acético glacial 50 μL de KOH 8N 40 μL de KOH 8N 50 μL de KOH 8N 50 μL de KOH
Probado solo durante 4 horas Probado con cada tiempo de exposición Probado solo durante 1 hora Probado con cada tiempo de exposición Probado solo duran
Solución MTT 2 ml 0,3 mg / ml 300 μL 1 mg / mL 300 μL 1 mg / mL 300 μL 1 mg / mL 500 μL 0,5 mg /
Incubación MTT 180 min (± 15 min) a 37oC, 5% 180 min a 37oC, 5% CO2, 95% 180 min (± 15 min) a 37oC, 5% 180 min a 37oC, 5% CO2, 95% 180 min (± 5 min) a 37o
© OCDE
Página 26
OCDE / OCDE 431 │

Nr. 1 2 3 4 5
Método de prueba
Componente
tiempo y CO2, 95% de humedad relativa Rh CO2, 95% de humedad relativa Rh CO2, 95% de
la temperatura
Método de prueba
EpiSkin ™ EIT EpiDerm ™ SCT SkinEthic ™ RHE EIT epiCS ® LabCyte EPI-MODEL2
Componente
500 μL de isopropanol acidificado 2 ml de isopropanol 1,5 ml de isopropanol 2 ml de isopropanol
Extracción 300 μL de isopropanol
(HCl 0,04 N en isopropanol) (extracción de arriba y abajo (extracción de arriba y abajo (extracción de arriba y abajo
solvente (tejido aislado completa
(tejido aislado completamente sumergido) de inserto) de inserto) de inserto)
Noche en RT, protegido de De la noche a la mañana sin agitar a RT De la noche a la mañana sin agitar a RT De la noche a la mañana sin agitar a RT Noche en RT, protegido d
Tiempo de extracción
o durante 120 min con agitación o durante 120 min con agitación o durante 120 min con agitación
Y temperatura ligero ligero
(~ 120 rpm) a temperatura ambiente (~ 120 rpm) a temperatura ambiente (~ 120 rpm) a temperatura ambiente
570 nm (545 - 595 nm) 570 nm (o 540 nm) 570 nm (540 - 600 nm) 540 - 570 millas náuticas 570 nm con filtro de refer
Lectura de OD
sin filtro de referencia sin filtro de referencia sin filtro de referencia sin filtro de referencia Nuevo Méjico
Calidad del tejido 18 horas de tratamiento con SDS Tratamiento con Triton X-100 al 1% Tratamiento con Triton X-100 al 1% Tratamiento con Triton X-100 al 1% 18 horas de tratamiento c
Control 1,0 mg / ml ≤ IC 50 ≤ 3,0 mg / ml 4.08 horas ≤ ET 50 ≤ 8.7 horas 4.0 horas ≤ ET 50 ≤ 10.0 horas 2,0 horas ≤ ET 50 ≤ 7,0 horas 1,4 mg / ml ≤ IC 50 ≤ 4,0 m
1. DO media del tejido 1. DO media del tejido 1. DO media del tejido 1. DO media del tejido 1. DO media del tejido
réplicas tratadas con el réplicas tratadas con el réplicas tratadas con el réplicas tratadas con el réplicas tratadas con e
el control negativo (NaCl) debe control negativo (H 2 O) debe control negativo (H 2 O) debe control negativo (H 2 O) debe control negativo (H 2 O
ser ≥ 0,6 y ≤ 1,5 por cada ser ≥ 0,8 y ≤ 2,8 para cada ser ≥ 0,8 y ≤ 3,0 para cada ser ≥ 0,8 y ≤ 2,8 para cada ser ≥ 0,7 y ≤ 2,5 para c
tiempo de exposición tiempo de exposición tiempo de exposición tiempo de exposición tiempo de exposición
2. Viabilidad media del tejido 2. Viabilidad media del tejido 2. Viabilidad media del tejido 2. Viabilidad media del tejido 2. Viabilidad media del te
réplicas expuestas durante 4 horas réplicas expuestas durante 1 hora réplicas expuestas durante 1 hora réplicas expuestas durante 1 hora réplicas expuestas dur
Aceptabilidad
con el control positivo con el control positivo (8N (y 4 horas, si aplica) con el control positivo (8N con el control positivo
Criterios
(ácido acético glacial), expresado KOH), expresado como% del con el control positivo (8N KOH), expresado como% del KOH), expresado com
como% del control negativo, control negativo, debe ser ≤ KOH), expresado como% del control negativo, debe ser ≤ control negativo, debe
debe ser ≤ 20% 15% control negativo, debe ser ≤ 15%. 15%.
3. En el rango de 20-100% de viabilidad 3. En el rango de 20 a 100% 15% 3. En el rango de 20-100% de viabilidad 3. En el rango de 20-100%
y para OD ≥ 0,3, diferencia viabilidad, el coeficiente de 3. En el rango de 20-100% de viabilidad y para OD ≥ 0,3, diferencia y para OD ≥ 0,3, difer
de viabilidad entre los dos Variación (CV) entre tejido y para OD ≥ 0,3, diferencia de viabilidad entre los dos de viabilidad entre los
las réplicas de tejido no deben las réplicas deben ser ≤ 30% de viabilidad entre los dos las réplicas de tejido no deben las réplicas de tejido n
© OCDE
Página 27

Nr. 1 2 3 4 5
Método de prueba
Componente
exceder el 30%. las réplicas de tejido no deben exceder el 30%. exceder el 30%.
exceder el 30%.
© OCDE
Página 28

ANEXO 3 - EJECUCIÓN DE LOS MÉTODOS DE ENSAYO PARA SUB-
CATEGORIZACION
La siguiente tabla proporciona los rendimientos de los cinco métodos de prueba calculados en base a un
conjunto de 79 u 80 sustancias químicas probadas por los cinco desarrolladores de pruebas. Cálculos de cuatro pruebas
Los métodos (EpiSkin ™, EpiDerm ™ SCT, SkinEthic ™ RHE y epiCS®) fueron realizados por
la Secretaría de la OCDE, revisada y aprobada por un subgrupo de expertos (21) (23). Cálculo
de LabCyte EPI-MODEL24 SCT fue realizado por el desarrollador de la prueba, revisado y acordado
por el grupo de gestión de validación y un panel de revisión por pares (41) (43).
ESTADÍSTICAS SOBRE LAS PREDICCIONES OBTENIDAS SOBRE TODO EL CONJUNTO DE PRODUCTOS QUÍMICOS
(n = 80 productos químicos probados en 2 pruebas independientes para epiCS® o 3 pruebas independientes para
EpiDerm ™ SCT, EpiSkin ™ y SkinEthic ™ RHE, es decir, respectivamente 159 * o 240
clasificaciones.
n = 79 ** productos químicos probados en 3 ejecuciones independientes para LabCyte EPI-MODEL24 SCT, es decir
237 clasificación.)
* se probó una sustancia química una vez en epiCS ® debido a que no estaba disponible (23).
** una sustancia química no se probó en LabCyte EPI-MODEL24 SCT debido a que no estaba disponible.
EpiSkin EpiDerm SkinEthic epiCS LabCyte
EPI-
MODELO 24
Sobreclasificaciones:
1B-y-1C sobreclasificado 1A 21,5% 29,0% 31,2% 32,8% 30,0%
NC sobreclasificado 1B-y-1C 20,7% 23,4% 27,0% 28,4% 18,9%
NC sobreclasificado 1A 0,0% 2,7% 0,0% 0,0% 2,7%
Sobreclasificado como corrosivo 20,7% 26,1% 27,0% 28,4% 21,6%
Tasa de sobreclasificación global (todas 17,9% 23,3% 24,5% 25,8% 21,5%
categorías)
Subclasificaciones:
1A subclasificado 1B-y-1C 16,7% 16,7% 16,7% 12,5% 13,9%
1A NC subclasificado 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0%
NC subclasificado 1B-y-1C 2,2% 0,0% 7,5% 6,6% 0,0%
Tasa de subclasificación global 3,3% 2,5% 5,4% 4,4% 2,1%
(todas las categorias)
Clasificaciones correctas:
1A correctamente clasificado 83,3% 83,3% 83,3% 87,5% 86,1%
1B-y- / 1C clasificados correctamente 76,3% 71,0% 61,3% 60,7% 70,0%
NC correctamente clasificado 79,3% 73,9% 73,0% 71,62% 78,4%
Precisión general 78,8% 74,2% 70,0% 69,8% 76,4%
© OCDE 2019
Página 29

ANEXO 4 - Parámetros clave y criterios de aceptación para la calificación de un
Sistema de espectrofotometría HPLC / UPLC para la medición de MTT formazan
extraído de tejidos RhE
Parámetro Protocolo derivado de la guía de la FDA (36) (38) Criterios de aceptación

Selectividad Análisis de isopropanol, blanco vivo (isopropanol área = 20%
Interferencia de
1
extracto de tejidos vivos de EHR sin ningún del área LLOQ
tratamiento),
blanco muerto (extracto de isopropanol de RhE muerto
tejidos sin ningún tratamiento)
Precisión Controles de calidad (es decir, MTT formazán a 1,6 g / ml, 16 CV = 15% o = 20%
g / mL y 160 g / mL) en isopropanol (n = 5) para el LLOQ
Precisión Controles de calidad en isopropanol (n = 5) % Dev = 15% o =
20% para LLOQ
Efecto Matrix Controles de calidad en blanco vivo (n = 5) 85% =% Matriz
Efecto = 115%
Continuar Análisis de isopropanol después de un estándar ULOQ 2 Interferencia de área = 20%
del área LLOQ

Reproducibilidad 3 curvas de calibración independientes (basadas en 6 Calibración
(intradía) diluciones 1/3 consecutivas de MTT formazán en Curvas:% Dev = 15%
isopropanol comenzando en ULOQ, es decir, 200 g / ml); o = 20% para LLOQ
Controles de calidad en isopropanol (n = 5) Controles de calidad:
Reproducibilidad Día 1: 1 curva de calibración y controles de calidad en % Dev = 15% y CV
(entre días) isopropanol (n = 3) = 15%
Día 2: 1 curva de calibración y controles de calidad en
isopropanol (n = 3)
Día 3: 1 curva de calibración y controles de calidad en
isopropanol (n = 3)
Término corto Los controles de calidad en blanco vivo (n = '3)' analizaron el % Dev = 15%
Estabilidad de MTT día de la preparación y después de 24 horas de almacenamiento
Formazan en RhE a
Extracto de tejido temperatura ambiente
A largo plazo Controles de calidad en blanco vivo (n = '3)' analizados % Dev = 15%
Estabilidad de MTT el día de la preparación y después de varios días de
Formazan en RhE almacenamiento a una temperatura especificada (por ejemplo, 4ºC, -20ºC, -
Extracto de tejido, si 80ºC)
requerido
Nota :
1 LLOQ: límite inferior de cuantificación, definido para cubrir la viabilidad del tejido del 1-2%, es decir, 0,8 μg / ml.
2 ULOQ: Límite superior de cuantificación, definido como al menos dos veces mayor que el MTT más alto esperado
concentración de formazán en extractos de isopropanol de controles negativos, es decir, 200 μg / ml.
© OCDE 2019

Proyecto de Directriz de Prueba Actualizada 431 Sobre Corrosión Cutánea Invitro, Métodos de Prueba de Epidermis Humana Reconstruida

Cargado por

Información del documento

Título original

Derechos de autor

Formatos disponibles

Compartir este documento

Compartir o incrustar documentos

Opciones para compartir

¿Le pareció útil este documento?

¿Este contenido es inapropiado?

Copyright:

Formatos disponibles

Proyecto de Directriz de Prueba Actualizada 431 Sobre Corrosión Cutánea Invitro, Métodos de Prueba de Epidermis Humana Reconstruida

Cargado por

Copyright:

Formatos disponibles

15/3/2021 PROYECTO DE DIRECTRIZ DE PRUEBA ACTUALIZADA 431 SOBRE CORROSIÓN CUTÁNEA INVITRO, MÉTODOS DE PRUE…

Directriz de prueba No. 431

Directrices de la OCDE para la

OCDE / OCDE 431

DIRECTRICES DE LA OCDE PARA PRUEBAS DE PRODUCTOS QUÍMICOS

Corrosión cutánea in vitro:

1. La corrosión cutánea se refiere a la producción de daños irreversibles en la piel.

2│ 431 OCDE / OCDE

6. Las definiciones utilizadas se proporcionan en el anexo I.

7. Esta directriz de prueba permite la identificación de corrosivos y no corrosivos

OCDE / OCDE 431 │ 3

4│ 431 OCDE / OCDE

Tabla 1. Lista de sustancias de competencia 1

Naciones Unidas Viabilidad celular media para

Subcategoría 1A Corrosivos in vivo

Dicloroacetilo 79-36-7 Electrófilo 1A (3) 1A 5,6 6.3 1.3 1.4 L

OCDE / OCDE 431 │ 5

15. La siguiente es una descripción genérica de los componentes y procedimientos del

6│ 431 OCDE / OCDE

Límite de aceptación inferior Límite de aceptación superior

epiCS ≥ 0,8 ≤ 2,8

LabCyte EPI-MODEL24 SCT ≥ 0,7 ≤ 2,5

OCDE / OCDE 431 │ 7

Control de calidad (QC)

8│ 431 OCDE / OCDE

EpiSkin ™ (SM) IC 50 = 1,0 mg / ml IC 50 = 3,0 mg / ml

epiCS (Triton X-100 al 1%) (36) ET 50 = 2,0 horas ET 50 = 7,0 horas

LabCyte EPI-MODEL24 SCT IC 50 = 1,4 mg / ml IC 50 = 4,0 mg / mL

Aplicación de la sustancia problema y las sustancias de control

Medidas de viabilidad celular

OCDE / OCDE 431 │ 9

10 │ 431 OCDE / OCDE

OCDE / OCDE 431 │ 11

Interpretación de resultados y modelo de predicción

12 │ 431 OCDE / OCDE

Tabla 4. Modelo de predicción de EpiSkin ™

Viabilidad medida después del tiempo de exposición

<35% después de 3 min de exposición Corrosivo:

OCDE / OCDE 431 │ 13

Viabilidad medida después del tiempo de exposición

<50% después de 3 min de exposición Corrosivo

<25% después de 3 min de exposición Subcategoría opcional 1A *

<18% después de 3 min de exposición Subcategoría opcional 1A *

<15% después de 3 min de exposición Subcategoría opcional 1A *

14 │ 431 OCDE / OCDE

Sustancias químicas de prueba y de control:

Modelo y protocolo de EHR utilizados y justificación (si corresponde)

• Descripción de la calificación del sistema de espectrofotometría HPLC / UPLC, si

OCDE / OCDE 431 │ 15

• Duración del período (s) de exposición y temperatura (s) de exposición;

• Valores medios de control positivo y negativo y rangos de aceptación basados en

• Variabilidad aceptable entre las réplicas de tejidos para la sustancia problema.

• La clasificación derivada con referencia al modelo de predicción / criterios de decisión

Discusión de los resultados:

16 │ 431 OCDE / OCDE

1. ONU. (2013). Sistema de Clasificación Globalmente Armonizado de las Naciones Unidas y

OCDE / OCDE 431 │ 17

18 │ 431 OCDE / OCDE

25. OCDE. (2005). Documento de orientación sobre validación e internacional

OCDE / OCDE 431 │ 19

20 │ 431 OCDE / OCDE

OCDE / OCDE 431 │ 21

OD: densidad óptica