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Investigación

Evaluación de la coloración de Albert


para la identificación de Corynebacterium spp.
en flujo vaginal
Evaluation of Albert´s staining technique for
Corynebacterium spp. in vaginal swabs

Adriana M. Botero-Vélez Bact1, Ana C. Ossa-Giraldo PhD2,


Mary L. Vélez-Restrepo MSc3, Claudia M. Cuervo-Araque MSc4,
Xiomara Úsuga-Perilla MSc5

Introducción: la detección del género Corynebacterium en flujo vaginal representa un reto para el es-
tudio de su posible papel patogénico en el tracto genital femenino. La coloración de Gram es la técnica
recomendada para la detección de corinebacterias en muestras clínicas; no obstante, algunas carac-
terísticas biológicas de estas bacterias dificultan la identificación por medio de esta. Objetivo: evaluar
el desempeño de la coloración de Albert para la identificación de Corynebacterium spp. en muestras
de flujo vaginal. Materiales y métodos: se evaluó la tinción de Albert como prueba diagnóstica para
la identificación de Corynebacterium spp. en 451 flujos vaginales en comparación de la coloración de
Gram. Se calculó la sensibilidad, la especificidad, los valores predictivos, las razones de verosimilitud y el
índice J de Youden con el software Epidat 3.1. Resultados: la coloración de Albert presentó sensibilidad
y especificidad de 61,5% y 74,6%, respectivamente, valor predictivo positivo de 78,3%, valor predictivo
negativo de 56,5%, razón de verosimilitud positiva de 2,4 y negativa de 0,5 y un Índice de Youden de 0,4.
Conclusiones: la tinción de Albert no mostró un mejor rendimiento que la coloración de Gram en la iden-
tificación del género Corynebacterium en muestras de flujo vaginal. Por lo tanto, se recomienda el uso en
conjunto de las coloraciones de Gram y Albert para la identificación de corinebacterias en flujo vaginal.
Palabras claves: Corynebacterium, difteroides, coloración y etiquetado, tinción para gránulos metacro-
máticos, coloración de Gram, excreción vaginal.

1
Bacterióloga y laboratorista clínica, especialista en Microbiología Clínica. Bacterióloga, IPS Incorpore, Institución
Universitaria Colegio Mayor de Antioquia.
2
Microbióloga y Bioanalista, especialista en Microbiología Clínica, candidata a PhD en Ciencias Básicas Biomédicas.
Profesora Facultad de Medicina, Universidad Cooperativa de Colombia-sede Medellín, y Facultad Ciencias de la Salud,
Institución Universitaria Colegio Mayor de Antioquia. Grupo de Investigación Infettare, Facultad de Medicina, Universidad
Cooperativa de Colombia-sede Medellín y Grupo de Investigación Biociencias, Facultad Ciencias de la Salud, Institución
Universitaria Colegio Mayor de Antioquia. Medellín, Colombia. Correspondencia: Calle 50 N.° 40-74, 4º piso. Teléfono: 57
4 4446065 ext.4965 – 4236. Correo electrónico: ana.ossag@campusucc.edu.co, ana.ossa@colmayor.edu.co
3
Bacterióloga y Laboratorista Clínico, especialista y MSc en Microbiología Clínica. Profesora Facultad Ciencias de la
Salud, Institución Universitaria Colegio Mayor de Antioquia. Medellín, Colombia.
4
Bacterióloga y Laboratorista Clínico, especialista y MSc en Epidemiología. Profesora Facultad Ciencias de la Salud,
Institución Universitaria Colegio Mayor de Antioquia. Grupo de Investigación Biociencias, Facultad Ciencias de la
Salud, Institución Universitaria Colegio Mayor de Antioquia. Medellín, Colombia.
5
Bacterióloga y Laboratorista Clínico, MSc en Biología. Profesora Facultad de Medicina, Universidad Cooperativa de
Colombia sede Medellín. Grupo de Investigación Infettare, Facultad de Medicina, Universidad Cooperativa de Colom-
bia sede Medellín. Medellín, Colombia.
Conflicto de intereses: los autores declaran que no tienen conflicto de intereses
Medicina & Laboratorio 2017; 23: 179-186
Módulo 19 (Investigación), número 56. Editora Médica Colombiana S.A. 2017©
Recibido el 04 de abril de 2017; aceptado el 23 de abril de 2017

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Botero-Vélez AM, Ossa-Giraldo AC, Vélez-Restrepo ML,Cuervo-Araque CM, Úsuga-Perilla X

Botero-Vélez AM, Ossa-Giraldo AC, Vélez-Restre- terium glucuronolyticum de semen y tracto


po ML, Cuervo-Araque CM, Úsuga-Perilla X. Eva- genital masculino, Corynebacterium lipophi-
luación de la coloración de Albert para la identifi-
loflavum de secreción vaginal, Corynebacte-
cación de Corynebacterium spp. en flujo vaginal.
Medicina & Laboratorio 2017; 23: 179-186 rium singulare de semen, Corynebacterium
tuberculostericum de uretra, orina y tracto

L
urogenital, Corynebacterium macginleyi y
as especies de Corynebacterium di- Corynebacterium pseudodiphtheriticum de
ferentes a Corynebacterium diphthe- orina[9] y Corynebacterium minutissimum y
riae, conocidas como difteroides o corine- Corynebacterium amycolatum del tracto ge-
bacterias, son reconocidas por ser bacilos nitourinario [12]. En nuestro medio también
Gram positivos, pleomórficos, inmóviles, se han podido evidenciar corinebacterias en
no endosporados, productores de catalasa flujo vaginal tanto de pacientes con sinto-
y formadores de gránulos metacromáticos; matología clínica [13] como en mujeres de
algunos aerobios exclusivos y en su mayo- la población general [14].
ría anaerobios facultativos [1,2]. Este géne-
ro bacteriano ha sido considerado desde En la actualidad, los laboratorios de micro-
mucho tiempo atrás parte de la microbiota biología especializados utilizan varias técni-
humana saprófita de la piel y las mucosas; cas para la identificación de Corynebacterium
no obstante, existen evidencias de su papel spp., algunas de estas basadas en la identifi-
patogénico en pacientes inmunosuprimidos cación fenotípica, como el API Cory 2.0, el API
[3,4], con dispositivos protésicos [5] y con 50 CH plus, el API 20E (BioMérieux, Marcy-
estancias prolongadas en hospitales, en los l’Étoile, Francia) y el RapIDTM CB PLUS System
que produce infecciones como linfadenitis (Thermo Scientific, Massachusetts, Estados
granulomatosa, neumonitis, faringitis, infec- Unidos), en la secuenciación del gen rpoB o
ciones de la piel, endocarditis y prostatitis, del gen del ARN ribosomal 16s, o en el perfil
entre otros [6-9]. Además, se ha sugerido proteico de cada especie a través de la téc-
un rol patogénico de diferentes especies de nica de desorción/ionización mediante láser
corinebacterias en el sistema genitourinario asistida por matriz (MALDI-TOF; del inglés,
de individuos inmunocompetentes; incluso, Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-
en algunas situaciones han sido asociadas Time-Of-Flight), entre otros [15-19].
a infecciones tanto en hombres como mu-
jeres, como es el caso de las especies Co- A pesar de que estas pruebas tienen una
rynebacterium riegelii y Corynebacterium alta sensibilidad y especificidad requieren
urealyticum, y han sido implicadas en com- de equipos especializados con altos cos-
plicaciones del embarazo (Corynebacterium tos para los laboratorios de primer nivel,
aurimucosum) [9], aborto espontáneo (Co- lo que hace que su uso esté limitado a los
rynebacterium nigricans) [10] y vaginitis en laboratorios de referencia o investigación
una paciente preadolescente (Corynebacte- y, prácticamente, solo para la identificación
rium amycolatum) [11]. de Corynebacterium diphtheriae, la cual, de
manera clásica, ha sido considerada la es-
Por otro lado, hay especies que han sido ais- pecie de este género de mayor importancia
ladas del sistema genitourinario o sus fluidos clínica. De otro lado, la tinción de Gram ha
corporales sin certeza sobre su patogenici- sido recomendada para la detección de co-
dad como Corynebacterium freneyi de se- rinebacterias en fluidos corporales y tejidos
men y tracto genital femenino, Corynebac- [20]; no obstante, la identificación con esta

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Evaluación de la coloración de Albert para la identificación de Corynebacterium spp.

técnica puede ser dificultosa debido a su de mujeres y un grupo de mujeres de un


pleomorfismo y no se encuentran estudios barrio de la ciudad de Medellín, durante
en la literatura científica que hayan evalua- los años 2012 y 2013. Se reclutaron
do su rendimiento para el diagnóstico de mujeres que, previa información y firma
estas bacterias. del consentimiento informado, aceptaron
de forma voluntaria participar en la
Teniendo en cuenta lo anterior, sumado a investigación, a las cuales se les aplicó una
la evidencia de la circulación de Coryne- encuesta para determinar sus características
bacterium spp. en nuestra región y el papel sociodemográficas. Como criterio de
patogénico emergente de los difteroides, se inclusión se estableció que fueran mujeres
hace necesario buscar y evaluar técnicas que mayores de edad y de exclusión la presencia
permitan hacer una detección acertada, rá- del sangrado menstrual al momento de la
pida y económica de este género en el tracto toma de la muestra y que nunca hayan tenido
genital femenino, las cuales, en conjunto con relaciones sexuales. A las participantes se
la tinción de Gram para la identificación de les brindaron los resultados del examen de
los otros géneros presentes en ese sitio ana- flujo vaginal (directo y tinción de Gram) y de
tómico, permitan tener un panorama preci- la citología cérvico-vaginal, realizadas por
so de la microbiota vaginal de las pacientes laboratorios habilitados de la ciudad, como
y optimizar su diagnóstico. Una opción para reciprocidad y beneficio de su participación
esto es la tinción de Albert, la cual ha sido en el estudio.
utilizada durante mucho tiempo para el diag-
nóstico e identificación de Corynebacterium
diphtheriae, pero hay evidencia de que po-
Detección de Corynebacterium
dría ser empleada para la identificación de spp. en flujo vaginal
otras corinebacterias [21]. Con base en lo Por cada participante se hicieron dos exten-
anterior, el objetivo de este estudio fue eva- didos a partir del mismo exudado vaginal,
luar si la coloración de Albert podría tener un que fueron sometidos a la tinción de Gram
mejor rendimiento que la tinción de Gram en y a la coloración de Albert para determinar
la identificación de Corynebacterium spp. en la presencia de Corynebacterium spp. y eva-
muestras de flujo vaginal. luar el desempeño de la técnica de Albert en
comparación con la tinción de Gram, que es

Materiales y métodos la prueba de referencia sugerida por la Aso-


ciación Americana de Microbiología (ASM;
del inglés, American Society for Microbiolo-
Tipo y población de estudio gy) [6]. Las muestras fueron teñidas según el
Se realizó un estudio descriptivo para la protocolo definido por el fabricante para las
evaluación de una prueba diagnóstica, coloraciones de Gram y Albert (IHR Diagnos-
usando como fuente de información tica Ltda., Cali, Colombia) [22,23] y su lectura
primaria muestras de flujo vaginal y datos se realizó con el objetivo de 100X, reportan-
demográficos y clínicos de 451 mujeres do ausencia o presencia de corinebacterias.
residentes del Valle de Aburrá, Antioquia,
Para controlar los posibles sesgos en la reco-
seleccionadas por conveniencia de ocho
lección de la información, el procesamiento
instituciones de educación superior del
y la lectura fueron ciegos y realizados de
municipio de Medellín, una fundación

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manera independiente por dos observado- medio de edad de 26 años (desviación es-
res distintos. Para garantizar la confiabilidad tándar=10, mediana=22, rango intercuar-
del diagnóstico se estandarizaron ambas tin- tílico=19-29). La mayoría de las mujeres
ciones con la cepa Corynebacterium urealyti- pertenecían a los estratos socioeconómicos
cum, identificada con el código 43044 y ob- 2, 3 y 4. La estratificación socioeconómica
tenida del Centro de Biorecursos ATCC (del de la población en Colombia se hace sobre
inglés, American Type Culture Cell). Esta mis- los inmuebles residenciales y comprende
ma cepa se usó como control en los ensayos. desde el estrato 1 al 6, siendo 1 el estrato
económico más bajo y 6 el estrato económi-
Análisis estadístico co más alto [28].

Para la coloración de Albert se estimó su des- La concordancia en la lectura de los


empeño y eficiencia a partir de los valores extendidos con la coloración de Gram entre
predictivos positivo y negativo (VPP y VPN) los dos observadores fue considerable
y la razón de verosimilitud positiva y negati- (índice Kappa=0,723), y para la tinción de
va (RVP y RVN). La eficiencia de la prueba se Albert fue aceptable (índice Kappa= 0,33).
analizó con el índice J de Youden y la concor- La prevalencia de Corynebacterium spp. fue
dancia entre los observadores con el índice de 59,9% en las muestras analizadas con la
de Kappa (escala de interpretación: 0,00=po- prueba de referencia, la tinción de Gram,
bre, 0,01-0,20=leve, 0,214-0,40=aceptable, mientras que con la coloración de Albert
0,41-0,60=moderada, 0,61-0,80= conside- fue de 47,0%. En la tabla 1 se presentan los
rable y 0,81-1,00=casi perfecta [24]). Todos resultados de la identificación de la bacteria
estos parámetros, incluyendo los respectivos con la coloración de Albert respecto a la
intervalos de confianza del 95%, fueron cal- tinción de Gram.
culados con el programa EPIDAT versión 3.1
(Dirección Xeral de Saúde Pública, Xunta de De acuerdo con estos resultados, la
Galicia, España) y su interpretación estuvo coloración de Albert tuvo una sensibilidad
basada en trabajos previos sobre pruebas di- de 61,5%, especificidad de 74,6% y valores
agnósticas [25-27]. predictivos positivo y negativo de 78,3% y
56,5%, respectivamente, y una eficiencia
moderada (66,7%). Asimismo, de acuerdo
Aspectos éticos
con el índice de Youden hallado esta prueba
La recolección de las muestras se hizo pre- no mostró una calidad o valor informativo
vio aval del Comité de Bioética de la Uni- aceptable (véase tabla 2).
versidad Cooperativa de Colombia, sede
Medellín (Colombia) y se siguieron los linea-
mientos de la resolución 8430 de 1993 del Discusión
Ministerio de Salud de la República de Co-
lombia y la Declaración de Helsinki. En el presente estudio se incluyeron 451
muestras de flujo vaginal de mujeres de la
población general del Valle de Aburrá de
Resultados Antioquia (Colombia), de las cuales el 59,9%
fueron positivas para la presencia de Cory-
Las mujeres incluidas en el estudio tenían nebacterium spp. mediante la coloración de
edades entre los 18 y 76 años, con un pro- Gram y el 47,0% por la de Albert. La Asocia-

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Evaluación de la coloración de Albert para la identificación de Corynebacterium spp.

Tabla 1. Identificación de Corynebacterium spp. sino una variedad de patrones que generan
con las tinciones de Gram y Albert (n=451) confusión durante la identificación de estos
Tinción Gram microorganismos por el personal de labora-
Coloración Albert Total
Positiva Negativa torio, aun en aquellos de larga trayectoria
Positiva 166 46 212 en el área.
Negativa 104 135 239
Total 270 181 451 Debido a estas dificultades que se presen-
tan en el uso de la tinción de Gram y a la
evidencia del potencial patogénico en el
Tabla 2. Evaluación de la tinción de Albert
para el diagnóstico de Corynebacterium spp. tracto genitourinario femenino de las es-
Intervalo de pecies de Corynebacterium [10,12], en este
Parámetro Valor confianza estudio se evaluó la validez de coloración de
del 95%
Albert para la identificación de estas bacte-
Sensibilidad (%) 61,5 55,5 - 67,5
Especificidad (%) 74,6 68,0 - 81,2 rias como una posible opción para la opti-
Valor predictivo positivo (%) 78,3 72,5 - 84,1 mización de su diagnóstico. La sensibilidad
Valor predictivo negativo (%) 56,5 50,0 - 63,0 de la coloración de Albert fue baja (61,5%),
Razón de verosimilitud 2,4 1,9 - 3,2 lo que indica que no detecta correctamente
positiva
Razón de verosimilitud todos los casos positivos para Corynebacte-
negativa 0,5 0,4 - 0,6
rium spp. determinados al Gram, aunque
Eficiencia 66,7 62,3 - 70,9
mostró un valor de especificidad mejor
Índice de Youden 0,4
Índice Kappa 0,33
(74,6%), indicativo de que detecta correct-
amente las muestras negativas para Cory-
nebacterium spp. Por su parte, se encontró,
ción Americana de Microbiología recomien- en una buena proporción, que un resultado
da para la identificación de Corynebacterium positivo por esta prueba confirma que en
spp. la coloración de Gram [20]; sin embargo, efecto hay infección por la bacteria (valor
hasta nuestro conocimiento no se cuenta a predictivo positivo=78,3%), pero que un re-
la fecha con estudios que hayan evaluado sultado negativo no descarta que la mujer
su rendimiento para el diagnóstico de estas esté realmente infectada (valor predictivo
bacterias. negativo=56,5%), por lo que su validez fue
deficiente.
Es reconocido que la identificación de las co-
rinebacterias utilizando la tinción de Gram Aunque los resultados de este estudio arro-
se ve afectada por el pleomorfismo entre las jaron un 25,4% de falsos positivos en la co-
diferentes especies [20], la irregularidad en loración de Albert, es posible que estos no
la captación de la tinción, que puede estar correspondan exclusivamente a fallas del
relacionada con la composición bioquímica método, sino que por el contrario sean co-
de la bacteria (p. ej. la concentración de áci- rinebacterias que fueron detectadas por la
dos micólicos) [29-31], la presencia de poros coloración de Albert y no por el Gram, dado
[32], su estadio de vida [33], la temperatura que esta última tinción no permite la iden-
de crecimiento y la disposición de nutrien- tificación de los gránulos metacromáticos
tes en el medio en el que se encuentre [34]; que colorea específicamente el Albert [21] y
lo que lleva a que no haya un solo patrón que son característicos de este género bac-
morfológico y de reacción tintorial al Gram, teriano [9]. Estos gránulos, generalmente

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de reserva, están constituidos, en el caso de La coloración de Albert ha mostrado buen


Corynebacterium diphteriae y otras corine- desempeño para la detección de Corynebac-
bacterias, por componentes ácidos como terium diphteriae [21,35], pero, a pesar de
los polifosfatos (volutina) y por otros com- que se esperaba una tinción característica
puestos como el ácido beta amino butírico de las corinebacterias para su identificación
o los polímeros de glutamato en otras espe- [21], se observó, tanto en la estandarización
cies. Con la coloración de Albert los gránulos como en el procesamiento de las mues-
metacromáticos se tiñen de color rojo, vio- tras, que la cepa control (Corynebacterium
leta o diferentes tonos de azul al entrar en urealyticum ATCC 43044) y los flujos vagi-
contacto con el azul de toluidina, razón por nales analizados tomaron la coloración de
la cual se les llaman metacromáticos [21]. manera tenue e irregular, lo que dificultó
Paradójicamente, una explicación a la baja su identificación, a pesar de la capacitación
sensibilidad encontrada para el Albert en previa de los observadores, lo que puede ex-
estas muestras se puede deber a la posib- plicar la baja concordancia entre las lecturas
ilidad de encontrar más de una especie de del Albert. Además, el valor obtenido con el
Corynebacterium spp. en la vagina y a que índice de Youden demuestra que la calidad
la formación y composición de los gránulos del resultado con la tinción de Albert es baja.
metacromáticos varía entre las especies y
el estadio metabólico de las bacterias, lo La prevalencia de Corynebacterium spp.
que redunda en la probabilidad de que no más alta se observó utilizando la coloración
se hayan detectado por el Albert aquellas de Gram (60%). Algunos estudios en Colom-
corinebacterias que no expresaron gránulos bia han reportado prevalencias del 30% y
metacromáticos, pero que sí fueron identifi- 32% en mujeres consultantes por síntomas
cadas por el Gram. ginecológicos [13,35]; sin embargo, no es
común encontrar investigaciones que re-
El valor de la razón de verosimilitud posi- porten la prevalencia o frecuencia de este
tiva encontrada demostró que obtener un microrganismo en muestras de flujo vaginal
resultado positivo para corinebacterias por en la población general, muy posiblemente
la coloración de Albert es dos veces más debido a las fallas en su identificación me-
probable en una mujer infectada que en diante Gram, por las razones antes expues-
una mujer sana, mientras que la razón de tas y, principalmente, a que la relevancia
verosimilitud negativa hallada mostró que clínica de estas bacterias ha sido limitada,
la probabilidad de tener un resultado neg- pues usualmente se consideran como parte
ativo por la coloración de Albert es solo 0,5 de la microbiota de mucosas o de poca im-
veces mayor en las mujeres sanas respecto portancia clínica [36-38].
a las infectadas, lo que significa que esta
prueba tiene baja capacidad para confirmar Los resultados de este estudio, sumados a
la presencia de infección por corinebacte- la dificultad de usar otras pruebas de identi-
rias y, a su vez, de descartarla, por lo que es ficación más especializadas en los laborato-
de poca ayuda para el clínico [25]. En cuanto rios de rutina, especialmente para muestras
a la eficiencia diagnóstica esta fue regular de flujo vaginal, permiten recomendar el
pues la tinción de Albert clasificó correcta- uso en paralelo de las coloraciones de Gram
mente solo al 66,7% de los casos que fueron y Albert para la detección de corinebacte-
positivos por el Gram. rias en este tipo de muestras, de forma que

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Evaluación de la coloración de Albert para la identificación de Corynebacterium spp.

se disminuya la proporción de falsos negati-


vos que se presentan al usar solo una de las
Agradecimientos
dos coloraciones y, así mismo, aumentar la Este proyecto fue ejecutado con fondos
sensibilidad y los valores predictivos negati- del CONADI de la Universidad Cooperativa
vos del diagnóstico de estas infecciones. de Colombia y fondos de CICMA de la
Institución Universitaria Colegio Mayor de
Dado el emergente rol patogénico de Cory-
Antioquia (Medellín, Colombia).
nebacterium spp. en el tracto genitourina-
rio, es necesario seguir en la búsqueda de
otras opciones para su detección en flujo Bibliografía
vaginal que ofrezcan las mismas ventajas 1. Venezia J, Cassiday PK, Marini RP, Shen Z, Buckley EM, Peters
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Introduction: The detection of Corynebacterium genus in vaginal discharge represents a challenge for
the study of its possible pathogenic role in the female genital tract. Gram’s stain is recommended for
corynebacteria detection in clinical samples, however, some biological characteristics of these bacteria
difficult their identification by this technique. Objetive: to evaluate Albert’s stain performans to identify
Corynebacterium spp. in vaginal discharge. Materials and methods: Albert’s stain was evaluated as
a diagnostic test for the identification of Corynebacterium spp. in 451 vaginal swabs in comparison to
Gram’s stain. Sensitivity, specificity, predictive values, likelihood ratio, as well as Youden’s J index were
calculated using Epidat software 3.1 version. Results: Albert’s stain had a sensitivity and specificity of
61.5% and 74.6%, respectively, positive predictive value of 78.3 %, negative predictive value of 56.5
%, positive likelihood ratio of 2.4 and negative likelihood ratio of 0.5, as well as Youden index of 0.4.
Conclusions: Albert’s stain did not show better performance than Gram’s stain for identification of
corynebacteria in vaginal swabs. Thereforeit is recommended the concomitant use of the Gram and
Albert stains for the identification of corynebacteria in vaginal discharge.
Keywords: Corynebacterium, diphtheroids, staining and labeling, metachromatic granules stain,
Gram’s stain, vaginal discharge.

186 Volumen 23, Números 3-4, 2017 Medicina & Laboratorio

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