Caracterizacin molecular de los microorganismos responsables de la

fermentacin espontnea del aj Charapita (Capsicum frutescens)

Molecular characterization of microorganisms responsible for spontaneous
fermentation of chili Charapita (Capsicum frutescens)
Diego Gonzles1, Salomn Sueros1, Carlos Vegas1 y Amparo I. Zavaleta1

resumen
El uso de las tcnicas de biologa molecular como una herra-
mienta para la identificacin de microorganismos ha contribui-
do con el mejor conocimiento de la microbiota responsable de
diversos procesos de fermentacin de alimentos. El objetivo de
este trabajo fue caracterizar las bacterias cido lcticas (BAL)
y levaduras aisladas de la fermentacin del aj Charapita
(Capsicum frutescens). Para ello, ambos microorganismos
fueron previamente recuperados en medio MRS y YPD, de los
cuales 10 colonias se seleccionaron aleatoriamente y se extrajo
el ADN genmico. Luego, se utilizaron las tcnicas de anlisis
de restriccin de los fragmentos amplificados de los genes
ribosmicos 16S y la regin 5.8S-ITS para BAL y levaduras,
respectivamente. As mismo, se estudi la diversidad entre
cepas BAL y levaduras mediante REP-PCR. Los perfiles de
restriccin obtenidos de BAL no fueron similares a las descri-
tas para especies de cepas tipo, mientras que de las levaduras
presentaron perfiles similares a los gneros Cryptococcus y
Hanseniaspora. En los perfiles REP-PCR se observaron que las
BAL presentaron menor diversidad que las levaduras.
Palabras clave: gen 16S, regin 5.8S-ITS, REP-PCR, bacterias
acido lcticas, levaduras.
ABSTRACT
Biology molecular techniques as a tool for identification of mi-
croorganisms have contributed with a better knowledge of the
microbiota responsible of various processes of food fermentation.
The aim of this work was to characterize lactic acid bacteria
(BAL) and yeasts isolated from the chili Charapita (Capsicum
frutescens) fermentation. To do this, both microorganisms were
previously recovered in MRS and YPD media, of which 10 colo-
nies were random selected and they were extracted DNA geno-
mic. Then, Restriction analysis of 16S ribosomal DNA gene and
5.8S-ITS region were used for LAB and yeasts identification at
species level, respectively. Furthermore, REP-PCR fingerprinting
technique was used to studying diversity of both microorga-
nisms. The restriction profiles obtained for LAB colonies were
not similar to those described LAB type strains, whereas yeasts
showed similar restriction profiles to Cryptococcus and Han-
seniaspora genera. REP-PCR fingerprinting technique showed
that LAB was less diverse than yeasts.
Key words: 16S gene, 5.8S-ITS region, REP- PCR, lactic acid
bacteria, yeasts

Introduccin intergnicas de consenso repetitivas de enterobacterias

(ERIC-PCR) descrito por Hulton et al. (1991), amplificacin
Las tcnicas de biologa molecular son herramientas que aleatoria de ADN polimrfico (RAPD-PCR) descrito por
han permitido la clasificacin, identificacin y caracte- Williams et al. (1990) y amplificacin de elementos palin-
rizacin de los microorganismos responsables de la fer- drmicos extragnicos repetitivos (REP-PCR) descrito por
mentacin de diversos alimentos (Suhartatik et al., 2014; Gevers et al. (2001).
Ercolini et al., 2006). Las tcnicas frecuentemente utilizadas
en la identificacin de especies de BAL y levadura son el La fermentacin de alimentos vegetales permite prolongar
anlisis de restriccin del ADN ribosmico16S amplifica- la vida til, contribuir con la mejora de la calidad organo-
do (ARDRA-PCR) descrito por Rodas et al. (2003) y los lptica, nutricional y funcional de stos. Por ello, el objetivo
polimorfismos en longitud de fragmentos de restriccin de este trabajo fue identificar las BAL y levaduras respon-
(RFLP-PCR) de las regiones 5.8S-ITS descrito por Esteve- sables de la fermentacin del aj Charapita (Capsicum
Zarzoso et al. (1999). Para la caracterizacin a nivel de cepa, frutescens), utilizando las tcnicas ARDRA-PCR y RFLP-
se han utilizado diversas tcnicas como, polimorfismos PCR para la identificacin a nivel de especie, y REP-PCR
en la longitud de fragmentos amplificados (AFLP-PCR) para la caracterizacin de cepas.
descrito por Vos et al. (1995), amplificacin de secuencias
ISSN: 0120-9965Fecha de recepcin: 14-06-2016Aceptado para publicacin: 21-09-2016 Doi: 10.15446/agron.colomb.v34n1supl.58438
1
Laboratorio de Biologa Molecular, Facultad de Farmacia y Bioqumica, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Lima (Per). decogdavalos@gmail.com

Agronoma Colombiana 34(1Supl.), S1336-S1339, 2016


Materiales y mtodos
Fermentacin y Muestreo
La fermentacin se realiz mezclando los ajes Charapi-
ta provenientes de la Regin Loreto, con una solucin de
cloruro de sodio (Calbiochem, Darmstadt, Alemania) y
glucosa (Amresco, Solon, USA) en condiciones estriles y
a temperatura ambiente. El muestreo fue realizado al inicio
y final del proceso de la fermentacin.
Cultivo y aislamiento de BAL y levaduras
Las BAL fueron cultivadas en medio MRS (Merck, Darm-
stadt, Alemania), suplementado con nistatina y zida sdica
(Merck, Darmstadt, Alemania) para inhibir el crecimiento
de hongos y levaduras, y bacterias gram negativas respec-
tivamente. El medio MRS fue incubado a 30C por 72 h en
condiciones de anaerobiosis.
Las levaduras fueron cultivadas en medio YPD (glucosa 2%,
peptona 2%, extracto de levadura 1%, agar 2% (p/v)), suple-
mentado con cloranfenicol (Applichem GmbH, Darmstadt,
Alemania) para la inhibicin de bacterias. El medio YPD
fue incubado a 30C por 24 h en condiciones de aerobiosis.
Finalmente, se seleccionaron aleatoriamente 10 colonias
de ambos medios, 5 colonias de MRS al inicio y 5 colonias
de YPD al final de la fermentacin.
Identificacin de BAL y levaduras
Extraccin de ADN
El mtodo utilizado para la extraccin de ADN de BAL fue
tomado de Sambrook y Russel (2001); mientras que para
levaduras se tuvo en cuenta lo dicho por Querol et al. (1992).
Identificacin a nivel de especie
La tcnica utilizada para BAL fue el ARDRA-PCR del gen
ribosmico 16S (Rodas et al., 2003). La tcnica utilizada
para la identificacin de levaduras a nivel de especie fue
RFLP-PCR de las regiones 5.8S-ITS (Esteve-Zarzoso et
al., 1999).
Para ambas tcnicas, las reacciones fueron realizadas en
termociclador (Perkim Elmer 2400, Norwalk, USA). Los
productos amplificados fueron detectados por electrofo-
resis en geles de agarosa (Sigma Aldrich, St. Louis, USA)
a 0,8% (p/v) en bfer TBE (Tris 0,9 M; cido brico 0,9 M;
EDTA 20 mM; pH=8). Los geles fueron teidos con bro-
muro de etidio y fotografiados. Para BAL, los amplificados
fueron digeridos con tres enzimas de restriccin: AluI
(Thermo Scientific, Massachusetts, USA), MseI (BioLabs,
Gonzles, Sueros, Vegas y Zavaleta: Caracterizacin molecular de los microorganismos responsables de la fermentacin espontnea del aj Charapita...
Massachusetts, USA) y HaeIII (Thermo Scientific, Massa-
chusetts, USA); mientras que para levaduras fueron CfoI
(Sigma Aldrich, St. Louis, USA), HaeIII y HinfI (Thermo
Scientific, Massachusetts, USA). Los fragmentos de restric-
cin obtenidos despus de la digestin fueron separados por
electroforesis en geles de agarosa 1,5% (p/v). El tamao de
los productos amplificados fue comparado con el marcador
de 100 pb (M1; Thermo Scientific, Massachusetts, USA).
Para BAL, los fragmentos de restriccin fueron compara-
dos in silico con los de cepas BAL tipo; mientras que para
levaduras los fragmentos de restriccin fueron comparados
con los descritos por Esteve-Zarzoso et al. (1999).
Identificacin a nivel de cepa
La tcnica REP-PCR utilizando (GTG)5 y descrita por
Gevers et al. (2001) fue utilizada tanto para BAL como
levaduras. Los productos amplificados fueron separados
por electroforesis en geles de agarosa 0,8% (p/v) en bfer
TBE. El tamao de los fragmentos amplificados fueron
comparados con los marcadores M1 para las bandas ms
pequeas y utilizando la mezcla de ADN del fago lambda
digerido con las enzimas de restriccin EcoRI + HindIII
(M2; Thermo Scientific, Massachusetts, USA) para las
bandas grandes. Los geles fueron teidos con bromuro de
etidio y fotografiados.
Resultados y discusin
En el estudio realizado por Vegas et al. (2016) describieron
que las poblaciones microbianas mayormente recuperadas
durante la fermentacin espontnea del aj Charapita,
fueron las BAL al inicio y levaduras al final de la fermenta-
cin. En consecuencia, este estudio se centr en la caracte-
rizacin de BAL y levaduras en los puntos de fermentacin
donde fueron predominantes.
As, al inicio de la fermentacin se observaron cepas de
BAL con caractersticas bacteriolgicas y genotpicas si-
milares indicando que estas bacterias son las responsables
de iniciar el proceso de fermentacin (Fig. 1A). A nivel de
especie, los tamaos de los fragmentos de restriccin ob-
tenidos despus de la digestin de los genes ribosmicos
16S con las tres enzimas de restriccin no fueron similares
a los obtenidas in silico para las cepas tipos de las distintas
especies BAL descritas (Fig. 2A). Por lo tanto, es posible
que estas cepas pertenezcan a una especie an no descrita
por lo que es necesario secuenciar los genes ribosmicos
16S de las BAL aisladas.
Al final de la fermentacin, se observaron tres perfiles
distintos de cepas de levaduras, predominando las cepas
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FIGURA 1. Perfiles de REP-PCR utilizando (GTG)5 como primer para BAL
(A) y levaduras (B). Carriles del 1 al 5 corresponden a perfil PBAL. Ca-
rriles 6 y 10 a PLEV1, 7 y 9 a PLEV2 y 8 a PLEV3. M1, Marcador 100
pb; M2, Marcador ADN lambda/EcoRI+HindIII.
FIGURA 2. A) Digestin del gen ribosmico16S amplificado de PBAL.
Carril 1, AluI; 2, MseI y 3, HaeIII; B) Amplificacin de la regin 5.8S-ITS
de 4) PLEV1, 5) PLEV3 y 6) PLEV2. C) Digestin de la regin 5.8S-
ITS. Carril 7, 10 y 13 PLEV1; 8, 11, 14 PLEV2; 9, 12, 15PLEV3. M1,
Marcador 100 pb.
PLEV1 y PLEV2 (Fig. 1B). A nivel de especie, tanto en los
productos amplificados de la regin 5.8S-ITS como en la
digestin con las enzimas de restriccin, se observaron
dos perfiles distintos, los cuales fueron comparados con
los explicados por Esteve-Zarzoso et al. (1999) (Fig. 2B y
2C). As, los perfiles PLEV1 y PLEV2 fueron similares a los
obtenidos para Cryptococcus flavus; mientras que el perfil
PLEV3 fue similar a especies del gnero Hanseniaspora.
A fin de confirmar las especies se requiere secuenciar los
productos amplificados. Cepas de Cryptococcus flavus
fueron aisladas de la fermentacin espontnea del fruto
tropical del masau (Ziziphus mauritiana) en Zimbawe y
de la fermentacin espontnea de uva en Suiza (Daz et
al., 2013; Nyanga et al., 2007). A la vez, cepas del gnero
Hanseniaspora fueron aisladas de alimentos fermentados
(Chvez-Lpez et al., 2014; De Arruda et al., 2012).
Finalmente, la caracterizacin de los microorganismos
responsables de la fermentacin puede permitir su uso
potencial como inculos en procesos de fermentacin.
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Conclusin
La caracterizacin molecular de cepas de BAL y levaduras
indican que hay menor diversidad de BAL que levaduras
en la fermentacin espontnea del aj Charapita.
Agradecimientos
Este trabajo ha recibido apoyo financiero de Innvate PER
contrato 230-FINCyT-IA-2013 y Cienciactiva contrato
007-FONDECYT-2014.
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