Universidad Autónoma de Nuevo León

Facultad de Ciencias Biológicas

Químico Bacteriólogo Parasitólogo

Unidad de aprendizaje Virología séptimo semestre

Dr. Juan Francisco Contreras

PIA
Detección de anticuerpos y antígeno p24 de VIH

Grupo 271 Equipo

Aguilar Saldaña Ilse Jaqueline 1615683
Maldonado Covarrubias Jezabel 1752231
Montemayor Ibarra Andrea Fátima 1651712

San Nicolás de los Garza, Nuevo León a 13 de octubre de 2020.

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Químico Bacteriólogo Parasitólogo

Introducción
El virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) es un retrovirus perteneciente a la
subfamilia de los lentivirus. Los lentivirus son retrovirus exógenos no oncogénicos
que causan infecciones persistentes, dando lugar a enfermedades con largos
periodos de incubación. Normalmente infectan células del sistema inmune
(macrófagos, células T) y causan en ellas efectos citopáticos. Una característica
importante, carente en otros retrovirus, es su habilidad para infectar a células
quiescentes. (Santana et al., 2003).

Fue descubierto y considerado como el agente de la naciente epidemia de sida por

el equipo de Luc Montagnier en Francia en 1983 (Rodríguez 2017).
El virión es esférico, dotado de una envoltura y con una cápside proteica. Su
genoma es una cadena de ARN monocatenario que debe copiarse provisionalmente
al ADN para poder multiplicarse e integrarse en el genoma de la célula que infecta.
El proceso de conversión de ARN en ADN es una característica principal de los
retrovirus y se lleva a cabo mediante acciones enzimáticas de transcriptasa inversa.
Los antígenos proteicos de la envoltura exterior se acoplan de forma específica con
proteínas de la membrana de las células infectables, especialmente de los linfocitos
T4 (Rodríguez 2017).

Los linfocitos T CD4 juegan un papel central en la patogénesis de la infección por el

virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). En los pacientes virémicos, estas
células son dianas directas del virus: el VIH se multiplica intensamente en esta
subpoblación durante la fase aguda de la enfermedad y continúa propagándose en
estas mismas células durante la fase de latencia clínica ( Theze 2008).
El síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) es un término que se aplica a los
estadios más avanzados de la infección por VIH y se define por la presencia de
alguna de las más de 20 infecciones oportunistas o de cánceres relacionados con el
VIH. El VIH puede transmitirse por las relaciones sexuales vaginales, anales u
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orales con una persona infectada, la transfusión de sangre contaminada o el
uso compartido de agujas, jeringuillas u otros instrumentos punzantes. Asimismo,
puede
transmitirse de la madre al hijo durante el embarazo, el parto y la lactancia (C.D.C
2019).
El sistema inmunitario produce anticuerpos cuando se expone a un virus, como el
del VIH. Los antígenos son sustancias extrañas al cuerpo que provocan la
activación del sistema inmunitario. En las personas con infección por el VIH, se
produce un tipo de antígeno llamado p24 incluso antes de que se produzcan
anticuerpos (Argüelles 2008).

Las pruebas de ELISA y Western Blot para detectar anticuerpos contra el VIH tienen
el mismo fundamento, pues ambas utilizan antígenos del VIH unidos en una fase
sólida para poner en evidencia la presencia de anticuerpos en muestras de sueros.
En el ELISA, los antígenos están en un pocillo de una placa de poliestireno,
mientras que en el Western Blot están en una tira separados por sus diferencias en
peso molecular. En el primer caso, la reacción es sólo un cambio de color; en el
segundo es posible conocer la identidad de las fracciones antigénicas del VIH contra
las que existen anticuerpos (Argüelles 2008).
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Antecedentes

El Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH), es un retrovirus que infecta a las

células del sistema inmune, originando una enfermedad crónica transmisible
definida como el Síndrome de la Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA). El SIDA, es la
etapa final de la infección por VIH, en la que el huésped tiene elevadas posibilidades
de que aparezcan en su organismo enfermedades oportunistas o procesos
oncogénicos. A pesar de que esta enfermedad no tenga cura, la Terapia
Antirretroviral (TAR), puede conseguir que la carga viral permanezca indetectable en
el organismo, disminuyendo así el riesgo de transmisión del virus (Martínez, 2020).

El antígeno p24 es la proteína de 24 kDa del núcleo viral y procede de la división

proteolítica, por acción de la proteasa viral, de la proteína precursora de 55 kD
codificada por el gen gag. La respuesta de anticuerpos contra este antígeno (Ac
anti-p24) se demostró por primera vez mediante radioinmunoprecipitación (RIPA), al
ser la proteína de 24 kDa el antígeno inmunodominante del aislamiento viral
reportado en el primer artículo científico que describe la infección por VIH-1.1 (Díaz
2010).

En el suero o plasma de los individuos infectados pueden detectarse

concentraciones de Ag p24 medidas en picogramos (pg) mediante sistemas
comerciales de ELISA. La sensibilidad de estos sistemas para la detección del
antígeno depende de la afinidad de los anticuerpos fijados en la fase sólida, para la
detección y captura de los antígenos p24 presentes en el suero de los individuos
infectados, con los que forma complejos antígeno-anticuerpo.2 Luego de la
exposición al VIH se desarrolla una rápida replicación viral entre la segunda y cuarta
semanas, con una gran carga antigénica representada por altos niveles de Ag p24,
en presencia de niveles elevados de antigenemia p24 y antes o durante la aparición
de anticuerpos contra el antígeno p24 y contra las glicoproteínas (gp) de envoltura
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viral (gp 160, gp 120, gp 41), codificadas por el gen de envoltura (env), un grupo
variable de pacientes desarrollan un autolimitado complejo de síntomas llamado
síndrome retroviral agudo o retrovirosis aguda, que refleja el tropismo linfático y
neuropático del virus (Díaz, 2010).

En el diagnóstico de la infección VIH, para considerar un resultado positivo, se

recomienda el uso de tres técnicas con distinto principio o base antigénica, siendo
obligado que para la confirmación una de ellas sea el Western Blot (Fernandez-
Setien, 2019).

Los métodos diagnósticos se pueden dividir en dos grandes grupos: El primer grupo
son las pruebas de pesquisaje entre las cuales se encuentran: Ensayos
inmunoenzimáticos (EIA) de 1a generación. Lisado viral VIH-1; EIA de 2a
generación Péptidos recombinantes/sintéticos de VIH-1 y VIH-2; EIA/ELFA (ensayos
de fluorescencia ligados a enzimas) de 3a generación. Péptidos
recombinantes/sintéticos de VIH-1 y VIH-2 y antígeno VIH-1 del grupo O (outlayer o
marginal); EIA/ELFA de 4a generación. Péptidos recombinantes/sintéticos de VIH-1,
VIH-2 y VIH-1 "O", y anticuerpos para detectar el antígeno p24. Y el segundo grupo
pruebas de confirmación o suplementarias: El Western blot (WB) es el método más
empleado para la confirmación de resultados obtenidos con pruebas de pesquisaje,
esta permite discriminar frente a qué antígenos víricos se dirigen los anticuerpos
presentes en la muestra problema (Gajon, 2012)

Las técnicas serológicas de cuarta generación acortan el período ventana a 13-15

días, debido a que incluyen la detección de antígeno-p24. La detección del genoma-
VIH (ADN proviral/ARN) complementa al diagnóstico serológico en situaciones
complejas. La viremia plasmática (carga viral) se utiliza para el seguimiento de los
pacientes infectados por VIH, para contribuir a la decisión del inicio de tratamiento y
para comprobar el fallo virológico al régimen antirretroviral en uso. Las pruebas de
resistencia se utilizan para guiar el cambio de tratamiento, y
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para detectar la transmisión de cepas resistentes en los nuevos diagnósticos. Antes

de utilizar un antagonista de CCR5 hay que determinar el tropismo viral; para ello,
se pueden utilizar métodos genotípicos, accesibles a los laboratorios de diagnóstico,
o fenotípicos, de más difícil acceso (García, 2011).

La seropositividad se define por la demostración de anticuerpos frente a las

proteínas víricas, con reactividad repetida en las pruebas de pesquisaje y, además,
con alguno de los procedimientos de confirmación. Los principales métodos
diagnósticos de la infección por VIH-1 pueden ser directos o indirectos. Entre los
métodos directos se pueden emplear: Cultivo vírico; Detección de ácidos nucleicos y
La antigenemia p24. Entre los métodos indirectos se pueden emplear: Detección de
anticuerpos específicos y Estudios de inmunidad especifica (González, 2016).

Un estudio realizado por el (Laboratorio de Referencia Nacional de VTS VIH/SIDA

durante el segundo semestre del 2013), se realizó un estudio de evaluación de
prueba diagnóstica cualitativa, con el propósito de conocer la marca con mayor
eficiencia diagnóstica donde se evaluó la reactividad de tres marcas de kits
comerciales de pruebas rápidas inmunocromatográficas diseñadas para la detección
simultánea de antígeno p24 y anticuerpos de VIH. Las marcas evaluadas fueron:
Alere Determine TM - HIV- 1/2 Ag/Ab Combo, SD Bioline HIV Ag/Ab Combo y
Onsite HIV Ab/Ag 4ta Gen Rapid Test las cuales fueron escogidas debido a que ya
se usan en Perú en algunos centros de salud particulares y organizaciones no
gubernamentales (ONG). Se analizaron 163 sueros de los cuales 43 sueros fueron
positivos al antígeno p24 confirmados por EIA Innotest HIV Antigen mAb
Neutralization Reagents (prueba para Ag p24), 60 sueros fueron positivos y 60
negativos a anticuerpos contra VIH confirmados por Inmunoensayo en Línea
(prueba para detección de anticuerpos). La sensibilidad y especificidad diagnóstica
hallada para la detección de anticuerpos para las tres marcas fue del 100%. La
sensibilidad diagnóstica hallada para la detección de Ag p24 de Alere Determine,
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SD Bioline y Onsite fueron: 54,8%, 47,6% y 14,3% respectivamente (Miranda-Ulloa,

2015).

Otros métodos de confirmación, como la inmunofluorescencia indirecta (IFI) o el

análisis por radioinmunoprecipitación (RIPA) presentan una alta subjetividad y
complejidad, respectivamente, que dificultan su utilización sistemática como pruebas
de confirmación (Gajon, 2012)

En algunas circunstancias especiales, el diagnóstico se basa en el empleo de

detección del antígeno p24 o de la carga viral (cantidad de material genético viral en
la sangre). Las dos principales circunstancias son:Sospecha de síndrome retroviral
agudo, en este caso el paciente aún no tuvo tiempo para formar anticuerpos y, en
consecuencia, la pruebas serológicas serán negativas; Recién nacidos: Los hijos de
madres seropositivas reciben transfusión de anticuerpos de la madre, sin que
necesariamente haya habido transmisión y, por tanto, sus pruebas pueden ser
falsos positivos (Diaz, 2011)

En la búsqueda de mayor eficiencia se ha recurrido al uso combinado de

marcadores. Aún cuando la determinación de la carga viral sobre la base de la
técnica de reacción en cadena de la polimerasa (RCP) esté disponible no puede
obviarse el valor independiente, del conteo de linfocitos CD4+ y la utilidad de
combinar ambos estudios en los algoritmos de tratamiento. La detección de
antígeno p24 del VIH-1 (Ag p24) y de niveles de anticuerpos anti-p24 (Ac antip24)
se han usado ampliamente como marcadores de progresión a SIDA y también para
el monitoreo de la terapéutica. Pocas veces el estadio clínico de un individuo escapa
del poder predictivo de la combinación de Ac anti p24, Ag p24 y conteo total de
linfocitos CD4+ (Basulado, 2014)

Estudio de evaluación comparativa, efectuado entre febrero y octubre de 2001 en la

Unidad de Investigación en Retrovirus Humanos de la Universidad Nacional
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Autónoma de México. Se incluyeron 90 muestras de niños infectados y 153 de no

infectados. El cultivo viral fue la prueba de referencia. Se estandarizaron ensayos de
ELISA e inmunoblot y la reacción en cadena de la polimerasa para una región
conservada del gen gag. Se analizaron los resultados utilizando el paquete
informático SPSS 10.0. La sensibilidad y especificidad de la prueba de ELISA fueron
61.1 y 90.8%, respectivamente. En el inmunoblot encontramos 82.2 y 95.4%,
respectivamente, en tanto que la reacción en cadena de la polimerasa demostró
tener sensibilidad de 98.3% y especificidad de 100% con sólo un falso negativo
(Basulado, 2014)

En un estudio comparativo realizado por Fernández, Men el año de 1996se

analizarontres marcadores directos de la infección VIH-1: co-cultivo viral, detección
de ADN proviral por PCR y detección de Agp24, para evaluar la especificidad y
sensibilidad de los mismos en la detección de VIH-1 en niños menores de 15
meses. Estudio comparativo de los tres marcadores directos de la infección VIH-1:
reacción en cadena de la polimerasa (PCR), cultivo viral (CV) y detección de
antígeno p24 en el diagnóstico de la infección por el virus de la inmunodeficiencia
humana (VIH-1) en niños nacidos de madres seropositivas menores de 15 meses de
edad.Los niveles de antígeno p24 se midieron en suero y/o plasma; la presencia de
ADN proviral de VIH-1 se determinó en células mononucleares de sangre periférica
por amplificación por PCR con oligonucleótidos específicos correspondientes a tres
regiones del genoma del virus VIH-1. Los resultados obtenidos fueron en el primer
estudio de seguimiento realizado a los 39 niños, 15 (100%) de los niños que
posteriormente fueron clasificados por seguimientos clínicos como infectados,
fueron positivos por PCR, 14 (93,3%) fueron positivos en el ensayo de cultivo viral y
solamente 8 (53,3%) dieron positivo por el ensayo de Agp24 y como conclusion se
demostro que la PCR y el cultivo viral tuvieron mayor sensibilidad que el ensayo de
Agp24 para el diagnóstico de la infección VIH-1. El Agp24 se demostró como un
marcador útil para el pronóstico de la enfermedad. Este estudio demuestra que la
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PCR es una alternativa más fiable y rápida que el cultivo viral para el diagnóstico de
la infección VIH-1 en niños menores de 15 meses de edad (Fernandez, 1996).

Hipótesis

El diagnóstico ante la sospecha de primoinfección VIH incluye la detección de

anticuerpos totales y antígeno p24 libre en sangre mediante un
enzimoinmunoanálisis (ELISA) confirmándolo mediante Western Blot.

Objetivo

Demostración de la infección del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)

mediante la detección de anticuerpos y antígeno p24 libre en muestras de suero a
través de un ensayo inmunoenzimático.
Metodología

METODO INDIRECTO: TÉCNICA DE ELISA PARA DETECCION DE

ANTICUERPOS

En técnicas como la inmunoprecipitación, el anticuerpo se acopla a un substrato

físico y cuando se pone en contacto con la solución del antígeno, se realiza la
interacción y posteriormente se puede eluir. La inhibición de la hemaglutinación
necesita glóbulos rojos que los virus pueden aglutinar. Cuando los anticuerpos
reaccionan con los virus, la capacidad hemaglutinante del virus se bloquea y la
reacción antígeno anticuerpo se puede evidenciar por la sedimentación de los
eritrocitos.

 Se fija el Ag a la fase sólida, agregándose luego la muestra que se quiere

investigar el Ac correspondiente.

 Posteriormente se adiciona una antigamaglobulina fabricada contra el primer

Ac conjugado.
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 Se incorpora a la reacción una enzima sustrato y luego un cromógeno de
la enzima.

 La cantidad de Ac presente será

directamente proporcional a la
cantidad de producto enzimático
formado.

1 2 3 4

lavado lavado lavado

Ac específico enzima conjugada (E)

Ag en pocillo Sustrato (S)
en muestra con 2do Ac

DETECCIÓN DE Acs

Pasos

 Dilución de la muestra

 Incubación de la muestra

 Lavados

 Conjugado

 Lavados
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 Sustrato-cromógeno

 Solución stop

 Lectura

Incubación de la muestra Sustrato cromógeno

+
-

-
1

Lectura

Cálculos

 En los cualitativos se realiza en base a las densidades ópticas de los

controles negativos.

 Los puntos de corte ya están establecidos.

Cut off = DO ¿ ¿ + 0.150 = 0,270

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0,508
Índice de muestra = = 1,88
0,270

Controles Valor
esperado
Negativo < 0,3

Positivo > 0,8

INTERPRETACIÓN

Negativo < 0,9

Dudoso 0,9 – 1,1

Positivo > 1,1

 Se establece el cálculo en base a los calibradores o estándares. Debe ser

homogéneos, puros y químicamente idénticos al analito que se va a medir.

 Las curvas permiten discriminar entre muestras normales y anormales

 Deben tener un intervalo razonable.

 TÍTULOS: máxima dilución del suero problema que arroja un resultado

positivo (Ej: 1/16; 1/128; 1/2048)

 UNIDADES PREDETERMINADAS: cuando el valor obtenido como resultado

es comparado a un patrón predeterminado de densidad óptica, fluorescencia
, luminiscencia o concentración conocida de Ac específicos, que expresa el
“punto de corte” de la técnica (cutoff o valor límite que diferencia positivos y
negativos) (Ej: UI/ml; Index Value; MIU/ml; OD; etc.)
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Cuantitativo Dilusion

1 1

1/2 1/2

1/4 1/4
1/8 1/8
BUFFER

1/16 1/16

1/64 1/64

1/128 1/128

1/256 1/256

Resultado

1/2 +

1/4 +

1/8 +

1/16
+

1/64 +

1/128 +

1/256

METODO DIRECTO: TÉCNICA DE ELISA PARA DETECCION DE ANTÍGENO

 Se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antígeno.

 Después de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en

la que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser
reconocido por el primer anticuerpo.
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 Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido se
aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado.

 Así cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base

que lo retiene y un segundo anticuerpo que lo marca.

 Tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de

señal que otorga el segundo anticuerpo.

Con antígeno: En este caso el conjugado es un antígeno unido a un cromógeno

Analizadores

AXSYM

IMX

Enzimoinmunoensayo con macropartículas

Utiliza partículas de látex submicroscópicas recubiertas con (Ag ó Ac).

 Se combinan: muestra + micropartículas + conjugado en la cubeta de

reacción.

 Una sonda aspira la mezcla del pocillo de incubación y la dispensa en la

celdilla matriz (fibra de vidrio)

 Utiliza como conjugado fosfatasa alcalina y como sustrato 4-metil-

umbeliferilfosfato (MUP).

 El conjugado de fosfatasa alcalina cataliza la disociación del MUP

formándose 4-metilumbeliferona (MU) fluorescente.
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 El complejo se une en forma irreversible a la celdilla de matriz; el lavado
de la celdilla elimina los materiales no unidos.

 El sistema óptico MEIA mide la tasa de formación de MU.

 Se mide la intensidad de luz fluorescente emitida por la superficie de la

celdilla matrix.

IMX

 Se carga el carrusel con las muestras y los dispositivos de reacción

 Se inserta el paquete de reactivos

 Se presiona la tecla “run”

 Lee un código de barras del reactivo e identifica la prueba.

 Combina automáticamente la solución microparticulada con la muestra en el

dispositivo de reacción. En este paso el analito es capturado por el Ac sobre
la superficie microparticulada.

 Añade un conjugado con fosfatasa alcalina, que se une al complejo anterior

sobre la superficie microparticulada , formando un sandwich “ Ac-analito-
conjugado”.

 Transfiere la solución a una matriz de fibra de vidrio.

 Añade un sustrato “MUP” que se convierte por la acción de la fosfatasa

alcalina en un producto fluorescente.

 Lee la fluorescencia de la superficie de la celdilla matriz .

 La lectura es proporcional al analito presente en la muestra.

 El valor de la concentración se obtiene a partir de una curva de calibración.

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< 0.200 > 0.300

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