BIOTECNOLOGÍA AMBIENTAL 1

TEMA 4

BIODEGRADACIÓN DE COMPUESTOS ORGÁNICOS NATURALES DE ORIGEN

VEGETAL:
Lignina, celulosa y hemicelulosa.
BIOMASA
La biomasa se puede definir de distintas formas pero desde el punto de vista de la
biotecnología la podemos definir como toda la materia orgánica que crece mediante la
conversión fotosintética de la energía del sol.
El sol es la principal fuente de energía en la tierra, la energía luminosa es convertida
en forma orgánica utilizable (biomasa) en plantas verdes, algas y bacterias
fotosintéticas.
La biomasa producida anualmente por fotosíntesis en la tierra y océanos contiene
aproximadamente 4,5x 1021 Joules de energía. Estos son 10 veces el consumo anual
de energía en todo el mundo. De este recurso de biomasa 7x1018 Joules por año son
utilizados para convertir energía para producir biocombustible, vapor o electricidad.
 ¿Qué tan grande es el almacén de compuestos de carbono orgánico
biosférico mundial, y dónde se encuentra?
En la tabla se ven representados el porcentaje de
productividad primaria neta, que es el NPP que
representa los distintos sistemas presentes en la
tierra. La NPP es una forma de expresar el
contenido de biomasa o el contenido de carbono
que se tiene en los distintos sistemas. Se ve que el
que más aporta es el sistema marino con un
37,5%, le siguen los bosques con un 20,5%,
también tenemos los campos cultivados que
aportan un 13,2%, también aportan las montañas,
las islas, las sabanas. Toda la superficie de la
tierra aporta una gran cantidad de productividad
primaria neta o de carbono y energía. Esto es para
ver de alguna manera, los incendios que se
produjeron en el amazonas toda la pérdida de energía y de carbono que llevo.
 Productividad actual y factible de la biomasa, índices de energía y
rendimiento energético para varios cultivos.
Los usos actuales de la biomasa no solamente son energéticos como biocombustibles
o electricidad, también pueden ser utilizados como alimentos, como fibras, como
materiales de construcción, entre otras cosas.
Esta biomasa representa solo una pequeña fracción anual de la tierra, los bosques y
las plantaciones de árboles son fuentes particularmente ricas de biomasa, mientras
que en alguna parte del mundo el cultivo de plantas puede producir no solamente
biomasa sino también alimento (cuando son comestibles) y dan lugar a lo que se
llaman los cultivos energéticos. La degradación de estos cultivos energéticos puede
llevar a la obtención de combustibles a partir de alcohol o químicos industriales. Los
cultivos energéticos incluyen plantas con un alto contenido en azúcar, como es la caña
de azúcar o la remolacha azucarera, aquellos cultivos que tengan alto contenido de
almidón como la yuca, cultivos que tengan un alto contenido de celulosa como los
pastos o cultivos que tengan un alto contenido en hidrocarburos como el algodoncillo,
y semillas de girasol.
 Mayores componentes de la biomasa vegetal
La biomasa vegetal está conformada principalmente por tres polímeros: la celulosa, la
hemicelulosa y las peptinas (también denominadas ligninas). Estos se encuentran en
las paredes celulares de los tejidos vasculares de las plantas terrestres superiores, y
estos tres tipos de polímeros se unen fuertemente entre sí por uniones no covalentes y
por entrecruzamientos formando un material compuesto que se conoce como
lignocelulosa.
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Aquí se muestra una estructura tridimensional de cómo se forma esta lignocelulosa,

vemos como las fibras verdes (cilindros) son los polímeros de celulosa, las líneas rojas
son las hemicelulosas que por lo general interaccionan por uniones no covalentes con
la celulosa de manera paralela o entrecruzadas (intra o entre fibras) y por último
tenemos las peptinas o las ligninas que son las azules, que se encuentran de manera
desordenada uniendo y formando un entrecruzamiento fuerte entre celulosa y
hemicelulosa.

La proporción de estos tres componentes en los distintos sistemas vegetales varía de

acuerdo al tipo de vegetal e incluso dentro de una misma especie o de un mismo
organismo el porcentaje puede variar de acuerdo a las distintas partes del tejido
vegetal. Básicamente estos tres componentes o la lignocelulosa representan el 90%
del peso seco de una célula vegetal. Lo que podemos ver por ejemplo es que las
maderas blandas (softwoods) tienen mayor contenido de lignina, en comparación con
las maderas duras o con las gramíneas. El contenido de hemicelulosa es mayor en las
gramíneas o en los pastos con respecto a la presente en los vegetales de madera dura
o blanda.

A grandes rasgos, los árboles comunes tienen mayor porcentaje de celulosa (45%),
luego de hemicelulosa (30%) y tienen menor proporción de lignina (25%).
CELULOSA
Es el compuesto orgánico más abundante de la Tierra. Es un homopolímero porque
está formado por un único sacárido que es la glucosa que se une por enlaces
glicosídicos beta (1: 4) con otra glucosa, formando la unidad básica de repetición que
es la celobiosa. Forman cadenas lineales de polímeros que forman una cinta. Estas
cadenas lineales pueden interactuar con otras cadenas lineales de celulosa formando
microfibrillas y estas microfiibrillas se unen con otras microfibrillas para formar la
fibrillas.
En las fibrillas podemos tener zonas amorfas que son zonas desordenadas y zonas
cristalinas que están perfectamente ordenadas,
las fibras se encuentran de manera paralela
perfectamente ordenadas unas con otras.
La celulosa es bastante insoluble en agua y es
bastante difícil de ser degradada, a diferencia de
otros polímeros de celulosa como el almidón.
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HEMICELULOSA
La hemicelulosa es un polímero que es homólogo a la celulosa, es semejante, sin
embargo tienen algunas diferencias. Tenemos una columna vertebral también formada
por sacáridos, pero a diferencia de la celulosa, aquí no es la glucosa sino que pueden
ser distintos tipos de sacáridos y lo fundamental es que las uniones entre estos
sacáridos sean beta 1,4.
La hemicelulosa puede tener ramificaciones, por ejemplo podemos tener ácidos
glucurónicos, ácidos glucurínicos, acetil co-A, arabino furonosas entre otros
compuestos.
Los sacáridos que pueden conformar a la hemicelulosa pueden ser manosas, xilosas,
glucosas, galactosas, arabinosas, entre otras.
El largo de las cadenas de polímeros de hemicelulosa suele ser mucho más corta que
el de la celulosa, por lo general tiene menos de 20 residuos de glúcidos. Esto se debe
a que al tener ramificaciones se complica en cuanto a longitud.

LIGNINA
Es el polímero aromático más abundante en la naturaleza, se encuentra en las
paredes celulares de las plantas superiores, helechos y musgos, predominantemente
en los tejidos vasculares especializados para el transporte de líquidos. Se ha visto que
existen ciertos vegetales como por ejemplo los musgos, los líquenes y las algas que
no tienen lignina, porque no tienen el sistema de traqueidas que son las células
encargadas del transporte en tejidos vegetales.
La lignina es un tejido muy abundante, está formada principalmente por unidades de
fenil-propano. Los principales precursores de la lignina son tres alcoholes fenílicos, el
alcohol coniferyl, el alcohol para-cumaryl y el alcohol sinapyl.
Las peptinas interaccionan y se meten de forma entrecruzada con la celulosa y la
hemicelulosa.
Las ligninas se pueden clasificar en lignina de madera blanda (gimnosperma), de
madera dura (angiosperma) y de hierbas, de acuerdo al contenido de cada uno de los
alcoholes fenílicos.
 Lignina de madera blanda: son las que pertenecen a las gimnosperma
(coníferas-pinos), se caracterizan porque tienen mayor proporción de alcohol
coniferyl, mucho mayor que el cumaryl y no tiene el alcohol sinapyl.
Los alcoholes se van uniendo para formar una rama bien extensa y compleja,
que se va intercalando entre las cadenas de celulosa y hemicelulosa. Estos
grupos aromáticos tienen un número y hay posibles reemplazos que pueden ir
en los grupos, respetando la numeración.
 Lignina de madera dura: corresponden a las angiospermas y tienen la misma
proporción de coniferyl que de sinapyl, aproximadamente un 45% de cada uno
de ellos; y tiene una proporción muy baja de alcohol cumaryl, entre un 5% y un
8%.
 Lignina de las hierbas: el cual tiene el alcohol coniferyl, tiene el alcohol sinapyl,
pero tenemos un p-hidroxifenil propano del alcohol cumayl. En este último el
alcohol cumaryl se encuentra esterificado con un ácido p-cumárico.
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DEGRADACIÓN DE LIGNOCELULOSA POR HONGOS Y BACTERIAS

Ahora que conocemos como es la estructura de la biomasa, podemos ver que la
biomasa es muy rica en glúcidos o en sacáridos (distintos tipos de sacáridos, no
solamente de glucosa) y las ligninas son ricas en compuestos aromáticos. O sea que
celulosa, hemicelulosa y lignina son muy ricas en carbono, este carbono puede ser
utilizado por los organismos que tengan las enzimas o la propiedad de biodegradar
estos compuestos para obtener energía y carbono. El estudio de los microorganismos
presentes en el ambiente (bacterias, hongos, algas), el estudio de la capacidad que
tengan estos organismos de degradar a la lignocelulosa se estudia mucho porque
tiene muchas aplicaciones biotecnológicas.
HONGOS
Se ha visto que la capacidad que tienen para degradar se fundamenta en la capacidad
que tengan de poder codificar hacia ciertas proteínas que tengan función de enzimas
para poder degradar a estos compuestos. Estas enzimas se ha visto que son
oxidoreductasas, hidrolasas, reductasas, etc. La degradación de la madera en la
naturaleza lo hacen secretando estas enzimas extracelulares que degradan los
compuestos poliméricos de la biomasa o de la pared celular de la madera, y se
pueden clasificar en función del aspecto morfológico que le van a dar a la madera
luego de que las mismas actúen. Los podemos dividir en:
-Hongos de la podredumbre blanca: de las 200 especies de hongos que pudren a la
madera, más del 90% pertenecen a este grupo. Una vez que el hongo ha logrado
invadir a la madera, este se va a expandir para el crecimiento de sus hifas en la
nominaría del parénquima de la madera y de las células vasculares. Las hifas van a
tender a penetrar de una célula a la otra, ya sea a través de pozos o a través de las
paredes celulares, van a tratar de ir metiéndose en la madera, liberando enzimas
extracelulares para que se vaya produciendo la degradación de estos compuestos
orgánicos que forman la pared celular.
Son hongos filamentosos que pertenecen a la subdivisión Basiomycetes.
Generalmente causan la decoloración de la madera al blanco, dándole una
consistencia fibrosa o esponjosa.
Algunos degradan lignina selectivamente y otros lignina y polisacáridos (celulosa y
hemicelulosa) a una tasa similar. Además, atacan a las maderas duras.
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-Hongos de podredumbre marrón: degradan preferentemente los compuestos

polisacáridos de la madera (celulosa y hemicelulosa) y causan muy poca degradación
de los compuestos aromáticos que conforman la lignina.
Con hongos filamentos que pertenecen a la subdivisión Basidiomycetes. La madera
con esta degradación se vuelve marrón y quebradiza.
La mayoría de estos hongos atacan mayormente a las maderas blandas.
-Hongos de podredumbre blanda: Grupo de hongos que pertenecen a las ascomicetas
y los deuteromicetos. Este tipo de hongos degradan principalmente la celulosa y la
hemicelulosa, y modifican la lignina sólo un poco, es decir, producen una degradación
incompleta. Atacan las maderas duras y las blandas, su acción conduce a un
ablandamiento de la madera, por ello su nombre.

DEGRADACIÓN DE LIGNINA
La lignina es un polímero muy complejo de una estructura irregular que cuenta con
enlaces que son difíciles de hidrolizar.
El mecanismo de degradación de la lignina ha sido estudiado más ampliamente en los
hongos que en las bacterias y sobre todo en los hongos de la podredumbre blanca. El
hongo que más se ha estudiado por su capacidad de degradar a la lignina es el
Phanerochaete chrysosporium. Este hongo se caracteriza porque su temperatura
óptima de crecimiento es 40°, sin embargo se ha visto que puede seguir creciendo
hasta los 50°.
La degradación de la lignina por parte de esta especie de hongo comienza cuando
disminuyen los niveles de nitrógeno en el medio o desaparece. La madera imita las
situaciones de la naturaleza ya que la madera es muy pobre en compuestos orgánicos
nitrogenados, por eso este hongo es muy eficaz para descomponer la lignina.
Este hongo ha sido muy estudiado y ha sido uno de los primeros hongos en los que se
ha realizado el mapeo de su genoma. Se vio que su genoma estaba formado por
aproximadamente 30 Mb, organizados en 10 cromosomas con casi 12 mil genes
codificantes para proteínas. La secuencia del genoma revela una amplia diversidad
genética dentro de las familias de genes de las enzimas como las citocromo P450s,
peroxidasas, glicosil hidrolasas, oxidasas, y estas enzimas son las responsables de la
degradación de la lignina. Cabe destacar que la actividad de cada una de las enzimas
requiere condiciones específicas de trabajo, de pH, temperatura, fuerza iónica y
salinidad.
A continuación se muestra una representación gráfica de una porción de lignina,
donde se representan los principales enlaces, donde las distintas enzimas hidrolíticas
producidas por el hongo pueden atacar. Podemos ver enzimas que pueden atacar los
enlaces carbono-oxígeno o alfa-aril éter (A), los beta-aril éter (B), las barras oscuras
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son clivajes que se pueden producir entre C-C y las líneas punteadas son las rupturas
que se pueden producir entre uniones C-O.

 Enzimas involucradas en la degradación de lignina en hongos.

Las enzimas involucradas se las puede dividir en tres grupos, como se ve en el
cuadro. Las que se encuentran en color rojo son enzimas que se denominan
peroxidasas, como la lignina peroxidasa (LiP) y la manganeso peroxidasa (MnP), este
tipo de enzimas son glicoproteínas que se caracterizan porque requieren peróxido de
hidrógeno como oxidante. Luego tenemos las lacasas, las cuales emplean oxígeno
como aceptor de electrones y es un de las primeras enzimas que comienza a atacar. Y
por último, tenemos un tercer grupo de enzimas que se las denomina enzimas
extracelulares y se caracterizan porque son oxidasas generadoras de peróxido de
hidrógeno, ese peróxido es el que utilizan las enzimas peroxidasas.
La primera que va a actuar va a ser la lacasa y va a dar lugar a productos que
solamente pueden utilizar las peroxidasas. Una vez que actúan las peroxidasas, los
productos de estas son los sustratos de las enzimas del recuadro amarillo (producen
oxidaciones generando peróxido de hidrógeno). Es decir, sin la acción de las primeras,
las últimas no van a poder actuar, es decir, reaccionan en cadena.

-Lacasas: son el grupo de enzimas más importantes que participa en la primera etapa
de la degradación de lignina en hongos de la pudrición blanca.
En el esquema se ve representado un compuesto fenólico modelo que forma a la
lignina, esta enzima necesita al oxigeno como aceptor de electrones, entonces lo que
va a hacer es oxidar a la molécula, le va a sacar electrones para dárselo al oxígeno.
Produce una oxidación del carbono alfa, un grupo oxhidrilo y va a terminar formando
un doble enlace. Esto hace que la molécula sea sumamente inestable, entonces al ser
inestable es susceptible al ataque de otras enzimas que lo que van a hacer es la
ruptura del carbono alfa y beta o una ruptura del grupo alquil del aril. Entonces así
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comienzan a separar los distintos alcoholes fenílicos que lo conformaban y los van
rompiendo.
En el esquema se ve como la lacasa oxida el grupo oxhidrilo y lo lleva a un doble
enlace con un oxígeno. Esa oxidación lleva a extraer electrones y donarlos al oxígeno.
El rompimiento de los anillos aromáticos de las subunidades fenólicas y no fenólicas
de la lignina ocasiona la generación de especies reactivas de oxígeno.

-Peroxidasa de lignina: La lignina peroxidasa se caracterizan porque necesitan

peróxido de hidrógeno como oxidantes. Son enzimas relativamente inespecíficas que
pueden tener muchas acciones sobre la molécula de lignina, una de ellas puede
producir la ruptura del carbono alfa y beta, puede producir la oxidación del alcohol
bencílico y transformarlo en un aldehído, puede producir hidroxilación de los grupos
metilos del benzeno, pueden romper enlaces ésteres, pueden producir aperturas de
anillos aromáticos, entre otras.
Podemos ver que se produce un catión radical en el anillo aromático inferior, eso
produce una inestabilidad en la molécula, y lleva a la ruptura del carbono alfa y el
carbono beta. O también se puede producir un catión radical en el grupo fenilo de la
derecha, y esto lleva a la ruptura de la unión de un carbono alfa con un oxígeno y a
subsiguientes rupturas del anillo. Por ello decimos que es inespecífica, ya que por lo
general tiende a desestabilizar a la molécula formando un catión radical en cualquiera
de los grupos aromáticos de los fenilos, y eso puede llevar a la ruptura del carbono
alfa o beta, una ruptura del oxígeno con el carbono, puede llevar a la oxidación de
grupos aldehídos a cetonas.
El alcohol veratryl cuando actua la LiP forma un catión catión radical. Ese catión es
sumamente inestable y puede ir formando todas las estructuras que se muestran para
luego terminar en un aldehído.
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La enzima nativa contiene un grupo prostético de protoporfirina de Fe(III). Cuando hay

peróxido de hidrógeno en el medio, lo oxida y elimina dos electrones. Al perder esos
dos electrones la enzima nativa pasa a tener una conformación como “compuesto I”.
Este compuesto I es un catión radical de porfirina oxo-hierro (IV) y posee dos cargas
positivas (perdió dos electrones). Quien va a donar un electrón a este compuesto es
uno de los anillos aromáticos involucrados en los alcoholes fenílicos de la lignina. Al
donar un electrón a la enzima se forman los cationes radicales. Entonces pasamos de
un “compuesto I” a un “compuesto II” que también es un catión radical de porfirina oxo-
hierro IV, que en vez de tener dos cargas positivas ahora tiene una ya que gano un
electrón donado por un grupo aromático. Este compuesto vuelve a recibir un electrón
de un grupo aromático, ese grupo aromático vuelve a formar un catión radical
inestable que lleva luego a la ruptura de esa molécula, para volver a su estado nativo.
Cada ciclo produce dos cationes radicales de grupos aromáticos.
En el esquema el alcohol veratrílico dona un electrón a la enzima para que la enzima
pueda recuperar uno de los electrones perdidos. Al donar un electrón forma el radical
catiónico del alcohol, el cual es un compuesto sumamente inestable y va a llevar a que
se produzca la apertura del anillo. En el caso de que fuera un complejo con varios
grupos aromáticos podríamos tener la ruptura del carbono alfa con el carbono beta o
de un carbono con un oxígeno. Luego otro alcohol veratril vuelve a donar otro electrón
para formar un nuevo radical catión y se vuelve a producir la apertura del anillo.
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-Manganeso (II) peroxidasa dependiente: necesitamos que haya manganeso (II) en el

medio para que el ciclo completo de esta enzima pueda actuar. Esta enzima actúa de
una forma muy similar y es muy parecida a la de la lignina peroxidasa, o sea que tiene
un grupo protohemo (III), en donde nuevamente necesitamos el peróxido de hidrógeno
como oxidante. Este peróxido de hidrógeno se lleva dos electrones de la enzima y este
compuesto queda con dos electrones menos formando un compuesto I, el cual puede
pasar a compuesto II ya sea por la oxidación de Mn(II) a Mn(III) o por la oxidación de
los grupos aromáticos que forman un catión radical. Es indistinta la oxidación del grupo
aromático o del Mn. Cuando tenemos el compuesto II, si tenemos peróxido de
hidrógeno en exceso se puede llegar a formar una especie reactiva del oxígeno como
es el anión superóxido radical que es sumamente oxidante y puede producir la
oxidación de los grupos aromáticos para producir cationes radicales. Este compuesto
II para poder volver a la conformación de la enzima inicial solamente lo puede hacer
cuando hay Mn(II) en el medio, es decir, si el manganeso no está presente en el medio
no se cumple el ciclo de la enzima por eso se dice que es dependiente. Otra de las
cosas es que en el medio tiene que haber un ácido orgánico (oxalato, gluconato,
gliconato), el cual forma un quelato con el manganeso y hace más estable al Mn3+ que
se forma durante la oxidación. El manganeso unido al ácido orgánico puede difundir al
interior de la lignina, y el manganeso puede producir la oxidación de los anillos
aromáticos que conforman la lignina mediante la reducción a Mn2+. Ese Mn2+ es
utilizado por el compuesto II para volver a oxidar y volver a producir la enzima original.

-Oxidasas: la función que tienen es reducir los radicales que se forman en las primeras
etapas, los cationes radicales de los grupos aromáticos para evitar que se vuelvan a
repolimerizar. Entonces atacan inmediatamente que se forman los cationes radicales
del grupo benzeno para volverlos más estables y evitar que se vuelvan a unir y a
polimerizar la lignina. Lo que hacen estas oxidasas es transformar el oxígeno en
peróxido de hidrógeno y oxidan grupos que estén alrededor de los grupos aromáticos.
Estas enzimas por lo general no tienen especificidad de sustrato sino que actúan
sobre un gran grupo de sustratos produciendo oxidaciones, ya sea incorporando
dobles ligaduras o transformando grupos alcohol en aldehídos o cetonas de acuerdo a
donde se ubique la posición del grupo oxhidrilo.
Un ejemplo es la Aril-alcohol oxidasa (AAO), esta es una enzima secretada por
ciertas especies de basidiomicetos. Se ve que se pueden tener distintos sustituyentes
en el R1 que pueden ser grupos hidroxilos, metoxi, fenóxi, fenil, nitro; mientras que en
el R2 podemos tener hidrógeno, metilos, arilos, entre otros. Entonces lo que se forma
es que un grupo oxhidrilo pasa a un grupo aldehído o cetona dependiendo que
tenemos en el R2, si en el R2 tenemos un hidrógeno será un aldehído y si tenemos
una cadena radicalaria será una cetona.
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Luego tenemos otra enzima con una amplia especificidad de sustrato que puede
actuar sobre distintas partes de un mismo sustrato, como la Veratril alcohol oxidasa
(VAO). Vemos que actúa igual que las oxidasas ya que transforma el oxígeno en
peróxido de hidrógeno y oxida el sustrato. En esta reacción vemos como la VAO con
un grupo alcohol arriba que pasa a un aldehído. Esta enzima puede actuar de
diferentes formas, en el ejemplo 14, la enzima sustrae un hidrógeno para formar un
doble enlace y dejar un oxígeno. En el número 18 lo que realiza esta enzima es
agregar un grupo oxhidrilo a la doble ligadura. Mientras que en donde dice 3 puede
actuar de dos formas, incorporando una doble ligadura o incorporando un grupo
oxhidrilo. La principal función es oxidar y transformar el oxígeno en peróxido de
hidrógeno y ese peróxido de hidrógeno es utilizado por la lignino-peroxidasa y la
manganeso-peroxidasa que lo necesitan para producir los cationes radicales de arilo
de grupo benzeno.

Todas estas enzimas trabajan en conjunto, lo que produce una es utilizada por las que
primero van a actuar. Aquí tenemos representado un esquema, primero tenemos el
polímero de lignina formada por los distintos lignoles (los lignoles son los distintos
alcoholes que eran fenoles con distintos sustituyentes como sinapyl, cumaryl y
coniferyl). Las primeras enzimas que actúan son las Lacasas, que utilizaban oxígeno,
luego también tenemos unas que actuaban inicialmente que son las Hemeperoxidasas
que utilizaban el peróxido de hidrógeno. Se llaman Heme porque ambas, tanto la
Lignino-peroxidasa como la Manganeso-peroxidasa, en su enzima estaban
conformadas por un grupo prostético que tenía hierro. La Manganeso-peroxidasa
dependía de manganeso y que ese manganeso forme un quelato con un ácido
orgánico que por lo general era el oxalato y que podía difundir hacia el interior del
polímero de lignina y tenía una amplia capacidad de quelar. Tanto los productos de la
Lacasa como los de la Lignino-peroxidasa eran los cationes radicales de los grupos
arilos, esos radicales libres a su vez son sumamente reactivos, son muy inestables e
inmediatamente podían seguir oxidando a nuevos compuestos de la lignina. Ahora
bien, cuando actuaban estas enzimas lo que se producía era la despolimerización
donde obteníamos nuevamente a los grupos alcoholes que los conformaban. Luego
actuaban las oxidasas, como la Alcohol-aril-oxidasa que transformaba esos grupos
oxhidrilos en dobles ligaduras o en cetonas y aldehídos.
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 Degradación de lignina en bacterias

Las bacterias no tienen una buena capacidad para degradar o degradan lignina de
manera incompleta. Inicialmente al polímero de lignina los principales
microorganismos ambientales capaces de degradarla son los hongos. En condiciones
aerobias las bacterias pueden degradar de manera incompleta a la lignina, mientras
que en condiciones anaeróbicas no se conoce ninguna bacteria capaz de realizarla.
Las bacterias tienen una maquinaria enzimática para degradar a la celulosa y a la
hemicelulosa que son las que pueden servir para también actuar sobre la lignina.
En este gráfico vemos como partimos del polímero de lignina inicial, las principales
enzimas que comienzan con la degradación han sido aisladas principalmente en
hongos, como las Lacasas, Lignino-peroxidasa, Manganeso-peroxidasa que depende
del manganeso, Versatil-peroxidasa es otro tipo de enzima; pero básicamente cumplen
la misma función, necesitan peróxido de hidrógeno para comenzar a desestabilizar a
este polímero e ir liberando distintos lignoles. Lo que se va liberando a partir de estas
enzimas son compuestos aromáticos como unidades de siringyl, de gualacyl o de p-
hidroxibenzoato. Las bacterias tienen la capacidad o tienen la maquinaria enzimática
de degradar estos últimos. Cualquiera sea el sustrato, lo llevan a un catecol, que es
cuando tenemos en el anillo aromático en dos carbonos adyacentes (uno al lado del
otro) dos sustituyentes que son grupos oxhidrilos. Esto lo vuelve vulnerable a este
anillo aromático para que actúe una enzima que es la Dioxigenasa y ahí es donde se
produce el corte y la apertura del anillo aromático para entrar a una serie de
intermediarios y formar el piruvato que es el que ingresa en el ciclo de los ácidos
tricarboxícilicos, a partir del cual se obtiene una cantidad de moléculas de ATP para
obtener energía. Como a partir de la biomasa, que es el principal producto de la
fotosíntesis, como por ejemplo la lignina, comienzan actuando los hongos y luego las
bacterias pueden degradarlos y llegar a obtener ATP a partir de los distintos
componentes de este polímero aromático.
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En resumen, tenemos la lignina, las primeras que actúan son enzimas que producen
oxidaciones y rupturas en este material lignocelulósico. Dijimos que actuaban Lacasas,
Manganeso-peroxidasas (unión del manganeso con el ácido orgánico), y lo que se van
liberando son mono, di y oligo lignoles. Los lignoles son los alcoholes, fenoles que
conforman la lignina. Una vez que tenemos estos compuestos siguen produciéndose
más oxidaciones sobre los mismos y se van formando distintos productos, fragmentos
que tienen uno, dos y hasta tres átomos de carbono, tenemos productos monolignoles,
o sea alcohol sinapyl, alcohol coniferyl o cumaryl, como así también otros siempre y
cuando tengan el grupo oxhidrilo en donde posteriormente se puede producir la
ruptura del anillo y abrirse; ácidos aromáticos y aldehídos aromáticos luego de que
esos alcoholes son oxidados por las oxidasas; y por último podemos tener quinonas.
Las quinonas son grupos que tienen dobles ligaduras, uno de los carbonos
involucrados en el anillo aromático está unido a un carbono con doble ligadura de
oxígeno y que esas doble ligaduras luego pueden formar hidroquinonas que son
grupos oxhidrilos, y que luego se produce la apertura del anillo. El objetivo de todo
esto es poder legar a compuestos más simples que puedan ser utilizados por medio
de distintas reacciones secuenciales, llegar a una molécula intermediaria que puede
ser el piruvato o cualquier otro compuesto que ingrese en el ciclo de los ácidos
tricarboxílicos, y a partir del mismo obtenemos dióxido de carbono, agua y energía
como es el ATP.

DEGRADACIÓN DE LA CELULOSA
La celulosa es el polímero más abundante en la naturaleza, formada por uniones beta-
1,4 de glucosa, el dímero era cuando teníamos la unión de una glucosa con otra beta-
1,4 era la celobiosa y que podía adquirir una longitud sumamente extensa. Esas
cadenas a su vez se podían unir por una unión puente hidrógeno con otra cadena de
celulosa y otra para formar microfibrillas, y a su vez formar fibrillas mucho más
grandes.
La degradación de la celulosa está ampliamente estudiada y se han podido aislar tanto
bacterias como hongos capaces de producir enzimas encargadas de degradarla; y
dentro de las bacterias también se han descripto bacterias aeróbicas y bacterias
anaeróbicas.
El estudio científico de la degradación de la celulosa, en realidad comenzó porque se
convirtió en una necesidad práctica de urgencia durante la segunda guerra mundial,
cuando se descubría que tanto la ropa como las mochilas, las carpas y el equipo de
las unidades militares de Estados Unidos que estaban en la selva del pacífico sur se
pudrían a una velocidad que era alarmante. Era evidente ver que este daño que se
estaba produciendo en todos estos materiales ricos en algodón, con lo cual tenían un
alto contenido de celulosa, estaba siendo producido por un hongo. Entonces en el año
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1944 se decidió establecer un laboratorio de investigación en donde lo que se quería

hacer era que todos los materiales que se veía que se estaban pudriendo en la selva
se llevaban al laboratorio, y aquí se trató de aislar los hongos que estaban en ese
material y se trató de hacer estudios para identificar cuáles eran las distintas cepas de
hongos que estaban produciendo este deterioro. En todos los casos se
lograron aislar 4500 cepas de hongos, de las cuales la gran mayoría
(casi el 9%) pertenecían al grupo de los Trichoderma con distinta
especie.
En estas placas de aquí podemos ver una gran variedad de colores que
son las distintas morfologías de hongos que se habían aislado en estos
materiales.
 Enzimas involucradas en la degradación de la celulosa en hongos
Básicamente las enzimas involucradas en los hongos, como en las bacterias
aeróbicas, se vio que eran las mismas, eran 3 tipos de enzimas. O sea la degradación
de la celulosa era mucho más simple que la de la lignina, porque la celulosa está
formada por un único tipo de uniones que son las beta-1,4 de glucosa. Entonces
primero actuaban unas Endoglucanasas tipo 1 y tipo 2, que rompían las uniones beta-
1,4 pero preferentemente en las zonas amorfas del polímero de celulosa (zonas
desordenadas); lo que hacían eran ir cortando y generaban distintos residuos de
endoglucanosas. Luego teníamos las celobiohidrolasas (la unidad estructural de la
glucosa era la celobiosa que eran uniones de dos glucosas), estas actuaban sobre los
extremos de la celulosa y teníamos los residuos que liberaban glucosas o las
terminales reductoras y no reductoras, entonces aquí tenemos dos tipos de
Celobiosashidrolasas, las tipo 1 y las tipo 2. Luego íbamos liberando distintas
fracciones hasta tener uniones de dos y tres glucosas donde actuaban la beta-
glucohidrolasa o beta-glucosidasas, que lo que hacen es liberar los residuos de
glucosa.

 Enzimas involucradas en la degradación de celulosa en bacterias

El sistema enzimático era similar el de los hongos y el de las bacterias aeróbicas, lo
que hacen estos microorganismos en el medio es liberar las enzimas al espacio
extracelular y en este espacio las enzimas comenzaban a degradar los distintos
sustratos que había en el medio.
Tenemos endo y exoglucanasas que se liberan al espacio extracelular producidas por
bacterias del suelo como la Cellulomonas fimi que muestran una estructura o una
estructura muy similar a las aisladas en hongos. Las bacterias lo que hacen es
secretar estas celulosas al medio; a diferencia de las bacterias anaeróbicas que tienen
un sistema que se llama celulosomas que es un anclaje a la membrana celular, como
no pueden ingresar a todo este sistema insoluble (la celulosa es sumamente insoluble
en agua) lo hacen mediante este sistema. El celulosoma es un complejo equipado
para degradar diferentes tipos de polisacáridos y que se ancla a la pared celular.
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 Hidrólisis de celulosa
Este es el esquema que utilizan tanto los hongos como las bacterias aerobias, lo que
hacen es liberar las enzimas al espacio extracelular. En el primer paso vemos un
polímero de celulosa, cuatro cadenas lineales que interactúan entre sí. Los triángulos
que dicen EG son las Endoglucanasas, estas rompen uniones beta-1,4 de celobiosa,
liberando distintos fragmentos. Luego tenemos los triángulos invertidos azul y verde
que son las Celulobiosashidrolasas, estas tienen distinta afinidad en distintas partes
del polímero. Los redondelitos naranjas son terminales reductores mientras que los
redondelitos verdes son terminales de la glucosa no reductores (residuos de glucosa
no reductores). Entonces la Celulobiosa tipo 2 tiene afinidad por romper uniones beta-
1,4 de los extremos reductores y así va liberando residuos reductores; mientras que la
Celulobiosahidrolasa tipo 1 tiende a tener mayor afinidad por cortar en el extremo no
reductor. Una vez que tenemos residuos de dos o tres glucosas, actúa la beta-
glucosidada o Glucosahidrolasa que rompe la unión beta-1,4, todas rompen la misma
unión pero la diferencia es en que parte lo hacen, aquí rompe las distintas uniones
para liberar los residuos de glucosa que son utilizados por las bacterias o por los
hongos para obtener energía y fuente de carbono. Esto lo hacen las bacterias
aeróbicas y hongos.

Las bacterias anaeróbicas tienen un complejo que es el

celulosoma, que es un conjunto de enzimas altamente activo y
eficaz capaz de degradar los componentes de la celulosa. Este
complejo está unido a la pared celular, aquí tenemos
representado un gráfico de la curva de crecimiento bacteriano
en donde vemos que en la fase exponencial este celulosoma se
encuentra principalmente unido a la pared celular, mientras que
en la fase estacionaria lo libera al medio.
El celulosoma está formado por proteínas estructurales que son
las Escafoldinas. En este gráfico tenemos la célula, en la superficie tenemos un
anclaje a la superficie celular en donde se une la Escafoldina a la célula. Las
Escafoldinas están formadas por dominios de cohesinas, estos dominios tienen la
particularidad de tener una fuerte afinidad por un dominio de dockerinas(fragmentos
azules), estas dockerinas son las que se unen a las distintas enzimas. Las dockerinas
se unen de manera inespecífica a distintos tipos de enzimas, o sea aquí podemos
tener las Exogluconasas, las Endogluconasas, las Celobiosahidrolasas o las beta-
glucosidasas, pero se unen de manera inespecíficas, es decir, no tienen especificidad
por ningún sitio de unión a ninguna enzima. Algo muy importante que se tiene es el
CBM (rectángulo amarillo) que es lo que se llama el módulo de unión al carbohidrato,
entonces el primer sitio de reconocimiento que tiene este celulosoma es la unión de
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esta proteína al carbohidrato, es decir, la función que tiene es tratar de unir el

celulosoma al polímero de celulosa. Una vez que lo une van a comenzar a actuar las
distintas enzimas que están unidas a las dockerinas y van a comenzar a degradar al
polímero. El número de cohesinas que hay en el celulosoma puede variar, entonces
hace una estructura sumamente larga que durante la fase de crecimiento se mantiene
unido a la célula, pero durante la fase estacionaria lo libera al medio para que se
produzca la degradación de la celulosa.

Podemos tener tres tipos de Módulos de unión a carbohidratos (CBM):

- Tipo A: se une fuertemente a las superficies de polisacáridos insolubles, como
celulosa, hemicelulosa (celulosa cristalina).
- Tipo B: se une a cadenas de glicano solubles.
- Tipo C: se une a pequeños sacáridos.
Todas las bacterias anaerobias tienen el CBM de tipo A.
Aquí vemos representado exactamente lo mismo que explicamos antes pero con
gráficos distintos. Como las bacterias anaeróbicas carecen de la capacidad de
penetrar eficazmente en el material celulósico, debieron encontrar mecanismos
alternativos para poder degradarla, y esos son los celulosomas que mostramos. Los
celulosomas tienen una arquitectura de ciertas proteínas de unión, una que reconoce
al glúcido y otra que tiene unida a las enzimas que van a realizar o producir la
degradación de la celulosa.

DEGRADACIÓN DE LA HEMICELULOSA
La hemicelulosa es un heteropolímero, similar a la celulosa solamente que la columna
vertebral no está formada por glucosas sino por distintos tipos de glúcidos unidos por
uniones beta-1,4 que podían ser glucosa, galactosa, fructuosa, entre otros; y a su vez
podíamos tener ramificaciones con distintos tipos. La unidad estructural eran los
xilanos. Esta unión de dos glúcidos distintos que forman a la hemicelulosa se los
denomina xilanos. La mayoría de los estudios sobre la degradación enzimática de este
heteropolímero se centra en la ruptura de los xilanos. Los xilanos son la principal
hemicelulosa presente en las angiospermas (15%-30%) en plantas de flores y frutos; y
en las coníferas como los pinos tenemos aproximadamente un 7%-12% de
hemicelulosa.
Teníamos distintas uniones de distintos glúcidos, por uniones beta-1,4 y a su vez
teníamos las ramificaciones. En la parte B de este gráfico se ven representadas las
estructuras utilizando las abreviaturas convencionales de los distintos glúcidos,
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entonces aquí vemos cuales son las distintas enzimas que actúan o pueden actuar
para producir la degradación de la hemicelulosa.
 Enzimas involucradas en la degradación de la hemicelulosa
Vemos por ejemplo la enzima 1 que son enzimas endo-beta-1,4-xilanasas que lo que
hacen es romper la unión beta-1,4 entre los glúcidos involucrados. Ahora cuando esta
enzima actúa sobre los extremos también rompiendo uniones beta-1,4 se llama beta-
xilosidasa. También vamos a necesitar enzimas que rompan las distintas uniones que
formen las ramificaciones, una de ellas puede ser la enzima 3, que es la alfa-
glucoronidasa que rompen uniones con el ácido glucorónico, también puede ser la
enzima 4 que rompe uniones con la rabinofuranosa (alfa-L-rabinofuranosidasa), o
también si queremos romper ramificaciones con el grupo acetilo utilizaríamos la
enzima acetilxilanolasa.

Para poder degradar completamente toda la hemicelulosa se hizo un cálculo

aproximado y se necesitarían aproximadamente 24 tipos de hemicelulasas distintas,
aquí en el cuadro tenemos representadas algunas de ellas y en donde actuarían. Por
supuesto que la hemicelulosa es un polímero tan heterogéneo que puede variar, no
siempre es igual, entonces las enzimas necesarias para degradarlo pueden ir
cambiando de acuerdo a como está conformada cada hemicelulosa. Pero en principio
actuarían las que se mencionan en ese cuadro.
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 Aplicaciones que utilizan la degradación de la hemicelulosa

Dijimos que estaban más enfocadas en degradar a los xilanos para liberar a los
distintos sacáridos que conforman a la hemicelulosa, y lo que se hace con esos
sacáridos es fermentarlos (fermentación de glúcidos) para la obtención de alcohol. Se
han aislado numerosas bacterias y hongos capaces de liberar enzimas que produzcan
la degradación de la hemicelulosa y la liberación de glúcidos o sacáridos, a partir de
los cuales se produce una fermentación también por parte de bacterias y hongos que
llevan a la producción de ácido láctico, ácido acético y alcohol.
EJEMPLOS DE APLICACIONES
Aquí lo que se muestra es un trabajo para poder ver cuáles son las distintas
aplicaciones, porqué me interesa estudiar los distintos microorganismos que tengan
las enzimas necesarias para biodegradar a la biomasa vegetal (liginina, celulosa y
hemicelulosa), cuáles son las aplicaciones de estos sistemas enzimáticos a nivel de la
biotecnología.

Este es un review donde se muestra un trabajo. Se describe nuevamente que es la

celulosa, un polímero de glucosa con uniones beta-1,4, la unidad estructural es la
celobiosa, es el componente más abundante de la biomasa de la tierra, es el producto
primario de la fotosíntesis y es el recurso biológico renovable más abundante.
Ahora ¿qué son los manglares?, los manglares son un área biótica formada por
árboles muy tolerantes a las sales que existen en las zonas intermareales cercanas a
la desembocadura de cursos de agua dulce en latitudes tropicales o subtropicales.
Como un río de agua dulce va a desembocar en el mar, esa es la zona en donde se
forman los manglares, tienen una gran vegetación de árboles y proporcionan una gran
cantidad de materia orgánica al agua costera adyacente en forma de detritus.
Contienen una gran población microbiana activa, tanto unido al sistema vegetal como
suelta en el sedimento. Está compuesta de materia orgánica espesa mezclada con
sedimento anaeróbico excepto la superficie del sedimento. Tratar de aislar
microorganismos presentes en estos manglares porque se ha visto que es una zona
muy rica en distintos microorganismos, que tengan la capacidad de degradar a la
celulosa.
1- Identificar y aislar cepas de micoorganismos del ambiente productores de
celulasas.
Lo primero que se hizo fue en estos manglares tratar de identificar microorganismos
capaces de degradar a la carboximetilcelulosa o a la celulosa, lo que se hizo fue tomar
muestras de sedimento en estas zonas, se llevaron al laboratorio y se sembraron en
placas de agar que contenían la carboximetilcelulosa como única fuente de carbono.
Entonces solamente iban a poder crecer en este medio aquellos que podían degradar
a la celulosa, que tuvieran las enzimas que vimos anteriormente. Por supuesto
también tenemos fuente de nitrógeno en este medio, tenemos distintas sales y
oligoelementos como hierro, magnesio, entre otros. En estas placas se ajustaba el pH,
al pH óptimo al que actúan las distintas enzimas celulasas que era un pH de 7 y se lo
incubaba durante 24-48 hs a 37°C. Luego de este tiempo se teñían las placas con un
colorante que es rojo Congo al 0,1% y los microorganismos que tenían las enzimas
para poder degradar a la celulosa se veía que a su alrededor tenían un halo
transparente. Uno podía semicuantificar la cantidad de enzima producida por cada
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cepa, en donde se veía que el diámetro de este halo era proporcional a la cantidad de
enzimas que producía esas cepas.
Podemos ver en la primera placa que tenemos cepas de microorganismos donde el
diámetro es muy pequeño. En la placa del medio el diámetro es bastante mayor y en la
última placa vemos cepas de microorganismos que no crecieron y que no tenían
ningún halo, eso significaba que no tenían las enzimas necesarias para degradar a la
celulosa.

Esto era una forma de cualificar o identificar cuáles eran los microorganismos aislados
de los manglares que tenían el sistema enzimático para degradar a la celulosa.
2- Técnicas para evaluar actividad de celulasas.
Ahora si queremos cuantificar, lo que tenemos que hacer es en un tubo de ensayo con
medio líquido colocar la celulosa o la carboximetilcelulosa con un buffer adecuado y
colocar diluciones de microorganismos. La presencia de los microorganismos en el
medio era lo que nos iba a aportar la enzima para poder degradar a la celulosa. Estos
tubos se incubaban a 50°C por 30 mins y la reacción se detenía con el agregado del
ácido dinitrosalicílico. Se lo hervía durante 5 minutos y una vez que se enfriaba se
medía la absorbancia a 540 nm, o sea una coloración roja o rosada, aquí lo que
estábamos midiendo era la glucosa liberada. Si se veía un aumento de glucosa en el
medio esto significaba que los microorganismos tenían las enzimas necesarias para
degradar a la celulosa y la iban a ir degradando hasta liberar residuos de glucosa que
es lo que se mide. Se establecía que 1 μmol de glucosa liberada/ ml de enzima/minuto
correspondía a una unidad de actividad de CMCasa (carboximetilcelulosa).
3- Microorganismos que degradan la celulosa aislados del ambiente (manglares).
Las zonas verdes son todas zonas de manglares en la Tierra, y lo que se muestra en
la filmina son los distintos tipos de microorganismos que fueron aislados en manglares
en distintas latitudes y longitudes. Podemos ver en la zona de Brasil se aislaron endon
y exocelulasas a partir del sedimento; en India se lograron aislar actinomycetes como
Strptomyces sp., Micromonospora sp., Intrasporangium sp., y también distintas
bacterias con distinta actividad celulasa; en Filipinas tambipen se han aislado. Pero los
distintos organismos o microorganismos aislados en el ambiente correspondían a
bacterias, a hongos, a levaduras y a actinomycetes.
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4- Aplicación biotecnológica de celulasa.

Ahora bien, ¿para qué me interesaba aislar esos microorganismos? Porqué en
realidad lo que interesaba era aislar las enzimas que producían esos
microorganismos. Las enzimas eran las glucosidasas, las endoglucanasas, las
exoglucanasas, las celobiosahidrolasa tipo 1 y 2. Estas enzimas son utilizadas con
distintos fines o aplicaciones biotecnológicas, en el cuadro tenemos resumidas las
posibles funciones y aplicaciones que pueden tener estas enzimas.
Por ejemplo, desde el punto de vista de la industria alimentaria estas enzimas se usan
para macerar pulpas de fruta y dan como resultado un jugo más nutritivo con mejor
estabilidad y con menos tiempo de procesado.
Otra función importante de estas enzimas es en la maceración de la extracción del
aceite de oliva, en donde cuando se utilizan estas enzimas producen una inducción
más lenta de la rancidez, o sea se disminuye la oxidación de los ácidos grasos
presentes en este aceite y aumentan los niveles de vitamina E y antioxidantes.
El aroma y las características volátiles de las frutas y de las verduras específicas se
pueden aumentar mediante la infusión de peptinasas, enzimas que degradan las
peptinas y de beta-glucosidasas.
En la industria de la alimentación animal los usos de estas enzimas pueden servir
como fibra dietaria presente en los alimentos de los animales. Consiste en
polisacáridos sin almidón como celulosas, dextrinas, ligninas, quitinas, entre otras, que
pueden actuar como facilitadores antinutricionales de varios animales. La celulasa
mejora el valor nutricional de los alimentos al eliminar estos factores antinutricionales
presentes en la materia prima de los alimentos.
En la industria textil y de la lavandería, el uso de las celulasas se usa para mejorar la
calidad de las telas a través de la modificación controlada de fibras celulosíticas. Por
ejemplo para darle un efecto se utilizan los jeanes gastados, pero no es toda la tela
gastada sino en alguna parte, o los jeanes rotos. Antiguamente se utilizaba la piedra
pómez pero esto llegaba a tener prendas que se rompían más de lo que se quería o se
echaban a perder, entonces mediante la aplicación de estas enzimas en ciertas partes
del textil permitían que se obtenga este tipo de desgaste en algunas partes de la
prenda.
En la industria de la agricultura para mejorar el crecimiento de los cultivos y controlar
las enfermedades de las plantas, se utilizaban diversos preparados enzimáticos que
contenían celulasas, hemicelulasas y enzimas que degradaban las peptinas. Se sabe
que muchos hongos celulolíticos facilitan la germinación mejorada de las semillas.
También se utiliza en la industria farmacéutica, en la industria de los biocombustibles,
en la gestión de residuos, etc. Entonces poder estudiar los microorganismos que están
en el ambiente que tienen la capacidad de degradar a la biomasa (celulosa,
hemicelulosa, lignina), poder aislar estos microorganismos, poder obtener las enzimas
de esos microorganismos nos permiten de alguna manera aplicar esas enzimas en
muchísimas aplicaciones a nivel industrial de distinto tipo, con distintos fines
biotecnológicos.
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