USO DE UNA CEPA DE LACTOCOCCUS LACTIS PRODUCTOR DE NISINA, EN

COMBINACIÓN CON ANTIMICROBIANOS NATURALES, PARA MEJORAR LA

SEGURIDAD Y LA VIDA DE ALMACENAMIENTO DE LAS MANZANAS EN
RODAJAS MÍNIMAMENTE PROCESADOS
RESUMEN.
Las características intrínsecas de fruta mínimamente procesados pueden
favorecer el crecimiento de patógenos y el deterioromicroorganismos. En
este contexto, el uso de alternativas naturales para química tradicional
desinfectante agentes puede representar una herramienta útil para
aumentar la vida útil y la seguridad de fruta mínimamente procesados. El
objetivo de este estudio fue evaluar la aplicación del productor de nisina
Lactococcus lactis CBM21 como un potencial agente de control biológico en
las manzanas en rodajas combinadas o no con hexanal, 2- (E) -hexenal y citral
a través microbiológico, colorimétrico, de textura y las evaluaciones
sensoriales.
El uso de L. lactis CBM21 limita el crecimiento de levaduras en manzanas por
debajo de 5 log ufc / g durante 28 días de almacenamiento. Además, esta
cepa aumentó significativamente la seguridad de los productos, inhibición del
crecimiento de Listeria monocytogenes, especialmente cuando se usa en
combinación con los agentes antimicrobianos naturales propuestos. No se
observaron efectos negativos en los parámetros de color después de 14 días
de almacenamiento en presencia de lo natural antimicrobianos. Además, la
adición del agente de biocontrol se percibió positivamente por panelistas
para sabor del producto y el olor.
Incluso si son necesarios más estudios, estos resultados sugieren que la
combinación de la considerada "Obstáculos" pueden representar una nueva
estrategia para prolongar la vida útil y garantizar la seguridad y la calidad de
rodajas manzanas.
 1. INTRODUCCIÓN.
La demanda de frutas y vegetales mínimamente procesados tiene
incesantemente aumentado en los últimos años que reflejan el interés de los
consumidores de los productos frescos y saludables con una forma fácil de
preparación (Allende et al., 2006). Las características intrínsecas de listos
para comer frutas, tales como la acidez baja y alta humedad, junto con el
gran número de superficies de corte, puede favorecer el crecimiento de
microorganismos de deterioro y patógenos (Beuchat, 2002). Estos productos
han sido implicados en brotes de infecciones transmitidas por alimentos
causadas por patógenos humanos, tales como Escherichia coli O157: H7,
Listeria monocytogenes, Salmonella spp, Staphylococcus aureus y
Pseudomonas aeruginosa (Alegre et al., 2010; Beuchat, 2002; Lanciotti et al.,
2004). En consecuencia, el uso de materias primas de buena calidad y de
descontaminación eficiente procedimientos son pasos críticos para garantizar
la seguridad de productos listos para el consumo frutas y verduras frescas
(Gil et al, 2009; Francis et al, 2012). La resistencia de algunas cepas
patógenas hacia tradicional Los desinfectantes ha justificado la búsqueda de
sustitutos para garantizar la seguridad y calidad alimentaria. En este
contexto, el uso de biocontrol agentes encaja bien con esta nueva tendencia,
y diversos microorganismos se han propuesto como agentes bioprotectivas
(Russo et al, 2014.; Vermeiren et al., 2004), numerosos estudios han
demostrado el buen potencial de varios microorganismos para inhibir el
crecimiento de patógenos transmitidos por alimentos en frutas y vegetales
mínimamente procesados (Bennik et al, 1999; Leroy et al, 2003; Vescovo et
al., 1996). El uso de agentes de control biológico, tales como Candida spp.,
Gluconobacter spp., Discosphaerina spp. y Metschnikowia spp., han sido
reportados para inhibir el crecimiento de L. monocytogenes, E. coli y
Salmonella enterica en las manzanas recién cortadas, pero negativos efectos,
tales como pardeamiento de las frutas, se han observado (Leverentz et al.,
2006). Scolari y Vescovo (2004) y Torriani et al. (1997) mostraron la potencial
de una cepa de Lactobacillus casei para aumentar la seguridad de
mínimamente procesados hortalizas debido a la inhibición de Aeromonas
hydrophila, Staph. aureus, E. coli y L. monocytogenes. Sin embargo, datos de
la literatura no exhaustiva explican los efectos de agentes de control
biológico en la microbiota deterioro y más generalmente en la vida útil de los
productos. Por esta razón, existe todavía una necesidad de bioprotectivas
nuevos microorganismos que cumplen con las características deseadas, como
la bioseguridad y la limitación de los efectos no deseados (Trias et al., 2008).
Las bacterias ácido lácticas (LAB) son generalmente reconocidos como
seguros (GRAS) por la Food and Drug Administration de EE.UU. (FDA), y su Se
utiliza para conservar (a través de la fermentación) carne y productos lácteos
y para BIOPROTECT verduras fermentadas está bien documentada (Ruiz-
Barba et al., 1994; Stiles y Holzapfel, 1997). Por otra parte, la capacidad de
LAB para producir bacteriocinas y otras moléculas antimicrobianas, y su
aceptabilidad general de los alimentos, que sean alternativas interesantes a
los productos químicos en la conservación de alimentos. Varios autores han
reportado el buen potencial de bacteriocinas para inhibir bacterias gram-
positivas, tanto en el modelo y en los sistemas reales de los alimentos, tales
como queso, carne y listo para comer verduras (Jamuna et al., 2005; Loessner
et al., 2003; Molinos et al., 2005). La nisina fue el primero caracteriza
bacteriocina y que es producida por Lactococcus lactis y en la Unión Europea
que está permitido en alguna aplicación como conservante de alimentos
(FDA, 1988; Jones et al, 2005). De hecho, la nisina, y en particular, la variante
natural de Z, se utiliza comúnmente en diversos alimentos productos con el
fin de aumentar su seguridad microbiológica, debido a su alta solubilidad y
estabilidad (De Arauz et al., 2009). La actividad de la nisina frente a bacterias
Gram-positivas, y en particular L. monocytogenes, es bien conocido tanto en
condiciones de laboratorio y en productos alimenticios (Cleveland et al, 2001;
Yang et al, 2012). Estudios recientes han mostrado efecto sinérgico de la
nisina cuando se utiliza en combinación con otros aditivos alimentarios, como
el lactato de sodio, ácido cítrico, fítico ácido, sorbato de potasio y H2O2 en la
lechuga recién cortada y mínimamente frutas y verduras procesadas (Bari et
al, 2005; Ukuku et al, 2005).
Con respecto a otros aditivos alimentarios, varios estudios también han
demostrado el buen potencial de los aceites esenciales y sus componentes
principales para aumentar la seguridad y la vida útil de frutas mínimamente
procesados tanto en sistemas modelo y la Alimentación (De Azeredo et al.,
2011; L_opez-G_alvez et al., 2009; Siroli et al., 2014). En particular, es bien
conocido el amplio espectro de actividad antimicrobiana de citral, una mezcla
de los 2 isómeros geranial y neral, y el componente de varios aceites
esenciales de cítricos, así como de hexanal y 2- (E), -hexenal que son
componentes del aroma de muchas frutas y verduras (Belda-Galbis et al,
2013; Kubo y Fujita, 2001; Wuryatmo et al, 2003). Además, su eficacia
antimicrobiana ya ha sido con experiencia en ensaladas a base de frutas en
almíbar (Belletti et al., 2008), bebidas sin alcohol a base de frutas (Belletti et
al., 2007) y mínimamente procesados las manzanas en rodajas (Corbo et al,
2000; Serrano et al, 2008; Siroli et al., 2014). En particular, Siroli et al. (2014)
mostraron que la adición de 2- (E) -hexenal en combinación con hexanal o
citral, a una concentración de 125 mg / L, en la solución de inmersión de
mínimamente las manzanas en rodajas procesados envasados en atmósfera
modificada presentaron un efecto positivo en el producto, debido a su
actividad antimicrobiana contra las especies naturales de descomposición, lo
que permite la extensión y la vida útil de hasta 35 días, sin efectos
perjudiciales sobre la seguridad y parámetros de calidad.
En esta perspectiva, el primer objetivo de la presente investigación fue para
identificar y caracterizar las cepas de L. lactis productoras de nisina y evaluar
la posible aplicación de un productor de nisina seleccionado cepa de L. lactis
en las manzanas mínimamente procesados, combinados o no con otros
obstáculos", tales como hexanal, 2- (E) -hexenal y citral, a inhibir el
crecimiento microbiano. Para evaluar sus efectos sobre el producto
seguridad, pruebas de desafío con L. monocytogenes y E. coli fueron también
realizado.
 2. MATERIALES Y MÉTODOS.

2.1. antimicrobianos naturales.

El hexanal compuestos probados, 2- (E) -hexenal y citral eran comprado de
SigmaeAldrich (Milano, Italia). estos antimicrobianos fueron seleccionados
sobre la base de su actividad antimicrobiana y su compatibilidad con las
manzanas en rodajas organoléptica (Siroli et al., 2014).

2.2. cepas y condiciones de crecimiento microbiano.

Las cepas utilizadas en este estudio se enumeran en las Tablas 1 y 2. cepas de
Lactococcus lactis (Tabla 1), todos los aislados a partir de productos lácteos,
excepto uno aislado de las manzanas mínimamente procesados, pertenecen
a la colección del Departamento de Biotecnología de la Universidad de
Verona. Las cepas enumeradas en la Tabla 2 pertenecen a el Departamento
de Agricultura y la Alimentación Ciencias de Bolonia Universidad.
Antes de cada ensayo, las cepas de L. lactis fueron cultivadas en forma
preliminar, ¿crecido en caldo M17 incubó aeróbicamente a 30ºC durante 24
h; el otro LAB cepas fueron cultivadas en De Man Rogosa y Sharpe (MRS) en
caldo 37° C, 24 h; las cepas patógenas en caldo de infusión cerebro corazón
(BHI) a 37° C, 24 h. Por último, se hicieron crecer células de S. cerevisiae en
Sabouraud caldo de dextrosa (SAB) a 37 ° C durante 48 h. Se compraron
todos estos medios de Oxoid Ltd (Basingstoke, Reino Unido) y se utiliza de
acuerdo con instrucciones del fabricante.
 2.3. La detección de las cepas de Lactococcus lactis productoras de
nisina.

Las 30 cepas de L. lactis, (Tabla 1) se seleccionaron para su capacidad de

producir la nisina. Las cepas de L. lactis se pre-cultivaron como se informó
anteriormente, a continuación, una prueba de mancha de agar, siguiendo el
método informado por Schillinger y Lucke (1989) se usó para verificar la
actividad antimicrobiana frente a L. plantarum ATCC 14917T, que era
demostrado ser sensible a la nisina (Rossi et al., 2008). los cultivos mostrando
una zona de inhibición mayor que 2 mm alrededor de la mancha fuera
considerados en las etapas subsiguientes.
ADN genómico total se extrajo de las células microbianas y se purifica usando
el kit de purificación Asistente genómico (Promega corporación, Madison,
WI, EE.UU.), siguiendo por el fabricante recomendaciones.
Los cebadores reportados por De Vos et al. (1993) (hacia delante: 50-CGC
GAG CAT AAT AAA CGG CT-30; revertir: 50-GGA TAG TAT CCA TGT CTG AAC-
30) fueron empleados para la amplificación de la codificación del gen nisina.
La mezcla de PCR (50 ml) fue compuesta por 2 mM MgCl2, 0,2 mM de cada
cebador, 0,2 mM de trifosfatos de desoxirribonucleótidos (dNTPs), 0,02 U /
ml de Taq polimerasa, 1? tampón de PCR y aproximadamente 20 mg de ADN
genómico. condiciones de termociclado fueron: desnaturalización preliminar
en 94 C durante 5 min; 30 ciclos a 93° C durante 2 min, 54° C durante 1 min,
72° C durante 1,5 min, luego una final extensión a 72° C durante 10 min. Los
productos de PCR se visualizaron en 1.5% gel de agarosa. La PCR resultante
amplicones se purificaron con el QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen,
EE.UU.) y se secuenció en BMR secuenciación genómica centro (Padua,
Italia). Las secuencias fueron entonces en comparación con los disponibles en
la base de datos GenBank recuperado a través de BLASTN búsquedas y luego
alineados utilizando el GeneDoc 2,7 software.
tabla 1.
Lista de cepas de Lactococcus lactis examinados en este estudio, fuente de
aislamiento y la eventual inhibición de la cepa indicadora sensible a la nisina.

especie cepa fuente Inhibición*

Leyenda: +: La inhibición observada; -: Sin inhibición observada.

*: inhibición de Lb. plantarum ATCC 14917
Tabla 2.
actividad antagonista de Lactococcus lactis CBM21 contra varios
microorganismos determinada por ensayo de la gota de agar.

Cepa objeto Inhibición

Leyenda: -: Sin zona de inhibición; +: pequeña zona de inhibición (0.5e 1

mm); ++: zona de inhibición media (1e2 mm); +++: Gran zona de inhibición (>
2 mm).

2.4 cuantificación bacteriocina, la caracterización fenotípica y

evaluación de la actividad antagónica de Lactococcus lactis CBM21
La cuantificación bacteriocina se realizó por duplicado en 24 h de edad, los
cultivos de L. lactis CMB21. la actividad de la nisina Z era soluble determina
mediante un ensayo crítico de dilución tal como se describe por Amiali et al.
(1998). La actividad de la nisina Z se calculó con la siguiente fórmula:
(1000/125) / D donde D representa la mayor dilución que impide el
crecimiento de Lactobacillus plantarum ATCC 14917T Después de una
incubación de 18 h.
La nisina L. lactis CBM21 producir Z-fue probado por su capacidad para crecer
en diferentes condiciones ambientales. El seleccionado condiciones fueron:
temperaturas diferentes (4, 8, 15 y 30° C), diferentes niveles de cloruro de
sodio (2, 4 y 6% w / w), altas concentraciones de sacarosa (20% w / w) y los
valores de pH bajo (3,5, 4,0 y 4.5). El cribado se realizó en M17 caldo (Oxoid
Ltd), el inóculo de la cepa ensayada fue 5 log ufc / ml en frascos de 50 ml. Los
matraces se almacenan a temperaturas esperados, mientras que en caso de
modificado caldo M17 a 30° C. El crecimiento bacteriano se controló cada 12
h por mediciones espectrofotométricas de la densidad óptica y por recuento
de placa. Tres repeticiones para cada condición fueron consideradas.
La evaluación de la capacidad de la cepa para antagonizar CBM21
los microorganismos causantes de deterioro y patógenos listados en la Tabla
2 fue realizada a través del ensayo de punto de agar (Schillinger y Lucke,
1989).
La capacidad de L. lactis CBM21 para sobrevivir en presencia de la
antimicrobianos naturales hexanal, 2- (E) -hexenal y citral, Se evaluó la
determinación de la concentración mínima inhibitoria (MIC) y la
concentración bactericida mínima (CBM), según ha informado Siroli et al.
(2014). Para la determinación de los valores de CIM, 150 ml de caldo M17
inoculó en tres niveles diferentes (2, 4 o 6 ufc log / ml) de la L. lactis CBM21
se añadieron a pocillos de microtitulación 200 mL (Corning Incorporated,
Nueva York, EE.UU.). Cincuenta mL de los antimicrobianos naturales robados,
adecuadamente diluida en caldo M17 y transportado a través de 96% de
etanol (VWR International, Prolabo, Francia) se añadieron a cada pocillo con
el fin de obtener la concentración necesaria de cada compuesto en el
volumen final (200 ml), y con una constante cantidad de etanol (1% v / v en
los pocillos). Las placas de microtitulación se incubaron a 37° C y
comprobadas después de 24 h. El CBM se determinó por la detección de 10
ml de cada pocillo después de 24 h, en placas de agar M17.
MIC se definió como la concentración más baja del compuesto prevenir el
crecimiento visible de las células inoculadas después de 24 h. los MBCwas
definidos como la concentración más baja del compuesto que causó la
muerte de las células inoculadas, correspondiente a ningún crecimiento
después de 24 h de incubación a 37 C de un punto de 10 ml en placas sobre
agar M17.

2.5 Preparación de las manzanas mínimamente procesados agregados

de Lactococcus lactis CBM21 solo o en combinación con
antimicrobianos naturales.
El efecto de L. lactis CBM21, solo o en combinación con naturales
antimicrobianos, en la vida útil y la seguridad de manzanas mínimamente
procesadasse puso a prueba. las manzanas eran mínimamente procesadas
preparado siguiendo el protocolo informado en la Fig. 1. Como
antimicrobianos, Las mezclas de citral / 2- (E) -hexenal y hexanal / 2- (E)
-hexenal se emplearon usando 125 mg / L para cada compuesto. Los se
añadieron antimicrobianos naturales en la solución de inmersión (en la
presencia de ácido ascórbico (0,5%) y ácido cítrico (1%) y transportada a
través de 1% de etanol. Las muestras tratadas en el proceso de inmersión con
sólo el ácido ascórbico y el ácido cítrico se utilizaron como controles. La
concentración de los antimicrobianos naturales fue seleccionada sobre la
base de su compatibilidad sensorial y su eficacia en mínimamente
procesados las manzanas en rodajas demostraron en estudios previos
(Belletti et al., 2008; Lanciotti et al., 2004; Siroli et al., 2014). pruebas de
provocación con L. monocytogenes Scott A y E. coli 555 se realizaron en Para
evaluar los efectos del agente de control biológico añadido y antimicrobianos
naturales en la seguridad de los productos, los patógenos se inocularon
juntos y al mismo tiempo en las diferentes inmersiones soluciones a niveles
que oscilan entre ufc 3 y 4 log / ml. La suplementación del agente de
biocontrol (7e8 log ufc / ml) y / o patógenos (3E4 log ufc / ml) se produjo en
la solución de inmersión. El agente de control biológico cultivado
previamente se inoculó en caldo M17 (Oxoid Ltd) y se cultivaron durante 24
horas a 30° C, a continuación, para cada condición, 500 ml de cultivo
microbiano de 5 L de solución de lavado se centrifugaron a 8000 rpm durante
15 min, se lavó una vez en solución fisiológica, se suspendieron en 50 ml de
solución fisiológica y se añade a la inmersión solución. Los patógenos pre-
cultivado se inocularon y se dejaron crecer en infusión cerebro corazón (BHI,
Oxoid Ltd) durante 24 h, adecuadamente diluida en solución fisiológica y
luego se inoculó en la solución de inmersión con el fin de obtener una carga
de registro de 3E4 ufc / mL. Todas las condiciones empleado se reportan en
la Tabla 3. Como se informó en la Fig. 1, la inmersión fase tuvo una duración
de 2 min, con una temperatura del lavado agua de 13° C y agitación manual.
Después de la inmersión, manzanas eran se secó con papel, envasado en
atmósfera modificada activa con 7% O2 y 0% de CO2 y almacenados a 6 ° C
hasta 28 días. Para cada condición Se prepararon 50 bolsas que contenían 50
g de manzanas en rodajas.

2.6 Análisis microbiológico.

Durante el almacenamiento, las cargas de células de laboratorio y levaduras
fueron detectados por recuento en placa en agar MRS (Oxoid Ltd)
suplementado con cicloheximida (0,05%) (SigmaeAldrich) y Sabouraud
Dextrosa agar (SAB, Oxoid Ltd.) con cloranfenicol (0,02%) (SigmaeAldrich),
respectivamente. Después de la homogeneización, las muestras 10 g se
diluyeron en serie en solución fisiológica (0,9% (w / v) NaCl). placas de MRS
se incubaron a 37 C durante 48 h, mientras que las placas SAB se incubaron a
30 C durante 48 h. Los patógenos inoculados L. monocytogenes y Escherichia
coli fueron detectados por placa contando con Listeria Selective Agar Base
(LSO, Oxoid Ltd.) con el suplemento selectivo de listeria (Oxoid Ltd.) y Agar
violeta Rojo Bilis (VRBA, Oxoid Ltd.) con 4-metilumbeliferil-b-D-glucurónido
(Oxoid Ltd.), respectivamente. Las placas se incubaron a 37 C durante 24 h.
Los análisis microbiológicos se realizaron inmediatamente después de los
tratamientos y después de 2, 5, 7, 9, 12, 14, 16, 19, 21, 23, 26 y 28 días.
FIG.1. protocolo utilizado para preparar las manzanas en rodajas de trabajo;
la adición de bacterias del ácido láctico y / o antimicrobianos naturales se
realizó durante la fase de inmersión; sumergieron muestras con solamente
cítrico y ácido ascórbico representado los controles.
TABLA 3. Las condiciones experimentales utilizadas en la fase de inmersión
de Manzanas Golden Delicious en rodajas. Además de la inmersión
convencional (ejecutar 1), la inoculación del agente de biocontrol
Lactococcus lactis CBM21 y la suplementación de los antimicrobianos
naturales 2- (E) -hexenal, hexanal y citral eran considerado. En las mismas
condiciones, Listeria monocytogenes y Escherichia coli se inocularon en
conjunto y al mismo tiempo con el fin de evaluar la eficacia de las diferentes
condiciones de inmersión sobre la Seguridad del producto.

2.7 Análisis de color y análisis sensorial.

Color de la superficie de manzanas en rodajas se midió utilizando un
colorspectrophotometer mod. Colorflex (Hunterlab, EE.UU.). El color era
medido mediante la escala CIELab y el iluminante D65. El instrumento fue
calibrado con un azulejo blanco (L * 98.03, a * e 0,23, b * 2,05). Los
resultados se expresaron como L * (luminosidad), a * (índice de rojo-verde) y
b * (índice de amarillo-azul).
En cada tiempo de almacenamiento, se obtuvieron 20 lecturas para cada
muestra, la medición de tres rebanadas de cada paquete.
Se realizó una prueba de panel para las manzanas en rodajas después de 1 y
4 días de almacenamiento. Treinta consumidores no entrenados componen
el panel, y los parámetros de calidad evaluados fueron sabor, gusto y de la
fritura, la firmeza, crujiente, dulce, amargo, acidez, jugosidad y en general la
calidad. Los consumidores evaluaron cuatro condiciones diferentes: el
control manzanas, manzanas añaden con citral / 2- (E) -hexanal, manzanas
añadido con hexanal / 2- (E) -hexanal, y las manzanas añadido con el agente
de biocontrol.

2.8 Análisis estadístico.

Microbiológicos, así como se analizaron los datos de color usando Statistica
software (versión 8,0;. StatSoft, Tulsa, Oklahoma, EE.UU.) por bidireccional-
ANOVA seguido de Tukey diferencia significativa honesta (HSD) de prueba a
nivel p <0,05 con el fin de monitorear los cambios en el tiempo, así como las
diferencias entre los tratamientos.

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
3.1 Selección de una cepa de Lactococcus lactis productora de Z-nisina
Entre las cepas de L. lactis tomadas en consideración, cuatro cepas, es decir,
CBM21, CBM44, L2813A y DSM 20729 (control positivo), eran capaz de
inhibir la cepa indicadora L. plantarum ATCC 14917T, como en la Tabla 1. Las
cepas se muestran CBM21 y DSM 20729 para albergar el gen que codifica la
nisina acuerdo con los análisis de PCR. Los amplificado producto de PCR de L.
lactis fue posteriormente CBM21 secuenciado y mostró un valor de similitud
con 100% de nisina Z.
Se observó una actividad Z nisina soluble de 512 UA / ml después de 24 h,
que es la misma actividad detectada para la otra-bacteriocina producir cepas
de L. lactis en condiciones ácidas (Cheigh et al., 2002) similares a los de lista
para comer frutas como manzanas.
Desde la variante nisina Z se caracteriza por una mejor solubilidad en
sistemas de alimentación en comparación con las otras variantes de nisina
(De Arauz et al., 2009), la cepa CBM21 fue seleccionado como agente de
control biológico potencialen los productos alimenticios.
 3.2. características de crecimiento y evaluación de la actividad
antimicrobiana de Lactococcus lactis CBM21
La cepa CMB21 se analizó para determinar las características de crecimiento
a evaluar su uso potencial en las manzanas mínimamente procesados. El
resultado mostró que esta cepa fue capaz de crecer dentro de 24 horas a 30°
C y15° C, con 2% y 4% de NaCl, y con 20% de sacarosa. Por el contrario, en 4°
C y 8 ° C la fase estacionaria se alcanzó después de 7 días de incubación.
Además, el aumento de la concentración de NaCl a 6% condujo a una
disminución significativa de la cinética de crecimiento de la cepa, los cuales,
sin embargo, llegado a la fase estacionaria de crecimiento después de 5 días
de incubación a 30° C. Los valores de pH de 4.5 y 4.0 permite la cepa para
alcanzar niveles más altos que 108 ufc / ml en los 2 y 5 días, respectivamente.
Un valor de pH de 3,5 no permitió que el crecimiento de la bacteria, por lo
menos después de 15 días de incubación a 30° C. Sin embargo, en esta última
condición ninguna disminución significativa en la viabilidad de la cepa CBM21
era observado. Teniendo en cuenta el valor del pH de las manzanas Golden
Delicious seleccionado (4.1), la cepa mostró un mantenimiento potencial de
la viabilidad en las condiciones empleadas en estas experimentales
condiciones.
Se evaluó la actividad antagonista de L. lactis CBM21 contra los
microorganismos Gram-positivos y Gram-negativos nisina sensible, así como
una cepa de S. cerevisiae. Los resultados se muestran en la Tabla 2. En
particular, L. lactis CBM21 mostró una alta antagonist actividad (diámetro de
inhibición mayor que 3 mm) contra L. monocytogenes Scott A, S. aureus F1, L.
casei V4B4, L. rhamnosus C111, L. sakei S8, L. lactis S1 y los dos L. plantarum
V4B4 y V7B3 cepas consideradas. En contraste, L. lactis CBM21 no mostró
actividad antagonista contra las bacterias Gram-negativas, ni la levadura
considerado: es bien conocida la actividad de la nisina es bastante ineficaz
contra las bacterias Gram-negativas y levaduras a menos que la membrana
externa se ve comprometida o dañado (Helander y Sandholm, 2000).
Teniendo en cuenta que las manzanas en rodajas tenían valores de pH de 4,1
± 0,2, y en las condiciones de almacenamiento de las frutas mínimamente
procesadas rara vez se mantienen la cadena de frío a 4 ° C, la cepa programa
seleccionado buen crecimiento característico para la aplicación en un sistema
real.
En esta perspectiva, el MIC (concentración mínima inhibitoria) y MCB
(Concentración bactericida mínima) de los valores citral, hexanal y 2- (E)
-hexenal se determinaron para evaluar el efecto combinado del agente de
biocontrol seleccionado y antimicrobianos naturales. Lactococcus lactis CBM
21 era extremadamente resistente contra citral y hexanal (MIC y MCB mayor
que 700 mg / L) cuando se inoculó a un nivel de 104 ufc / ml; valores de MIC
fueron siempre mayor que 200 mg / L hacia 2- (E) -hexenal. En general, la
literatura atos indican que el tiempo de conservación aumentos significativos
utilizando menos de 50 mg / L de ácido 2- (E) -hexenal en productos con un
mínimo de procesamiento frutas (Lanciotti et al., 2003, 2004) y citral y
hexanal tienen un buen potencial antimicrobiano asociado con un buen
sensorial compatibilidad a una concentración de menos de 200 mg / L
(Belletti et al., 2008).

3.3. Efectos de la Lactococcus lactis CBM21, en combinación con

antimicrobianos naturales, sobre la calidad microbiológica de las
manzanas mínimamente procesados.
El agente de control biológico fue capaz de sobrevivir también en
presencia de antimicrobianos natural; de hecho, en cada condición de
adoptado, L. lactis CBM21 mantenidas un nivel de alrededor de 7 log
ufc/g durante el almacenaje del (a 28 días a 6 C). En las muestras de
control, laboratorio nunca superado 3 log ufc/g como se muestra en la
figura 2A, el agente de control biológico limitado el crecimiento de L.
monocytogenes cuando se usa solo, pero especialmente cuando se usa
en combinación de con los antimicrobianos naturales propuestos. 

La mayor efectividad contra L. monocytogenes se observó cuando la

cepa CBM21 se usó en combinación con hexanal/2-(E)-hexenal. De
hecho, en estas condiciones, L. monocytogenes mostró significativa (p <
0.05) pérdidas de viabilidad en comparación con las otras
muestras complementadas con el agente de biocontrol en el extremo de
almacenamiento de período. Por el contrario, L. monocytogenes fue
capaz de crecer, aunque muy lentamente, en los controles y las muestras
de agregado con/(E) - hexenal y citral/2 - 2-hexanal (E)-hexenal en
ausencia del agente de biocontrol. Las principales diferencias de Listeria
monocytogenes significan cargas de celular se observaron al final del
tiempo de almacenamiento (28 días). De hecho, las cargas de celulares
detectaron fueron 1.7, 5.5, 5.0 y 4.7 log ufc/g para las muestras en
hexanal/2-(E) - hexenal en combinación con CBM21, controles, citral/2-
(E) - hexenal y hexanal/2-(E)-hexenal, respectivamente (Fig. 2A). La
eficacia de la L. lactis CBM21 para prevenir el crecimiento de L.
monocytogenes puede atribuirse a la nisina producción como la actividad
antilisterial de la nisina está bien documentada (Cosentino et al., 2012;
Yang et al., 2012). 
Como para e. coli, la temperatura de almacenamiento baja no permitió su
proliferación, independientemente de las condiciones empleadas en
la inmersión procesos. Sin embargo, el uso de antimicrobianos naturales 
aumentó ligeramente la cinética de la muerte del microorganismo
objetivo, pero sin diferencias significativas (p &gt; 0.05) (Fig. 2B).