Universidad Austral de Chile

Facultad de Ciencias Escuela de Qumica y Farmacia.

PROFESOR PATROCINANTE: Dalton Alarcn S. INSTITUCIN: Laboratorio Bag de Chile S.A PROFESOR CO-PATROCINANTE: Annemarie Nielsen S. INSTITUCIN: Universidad Austral de Chile

APLICACIN DEL CLCULO DE INCERTIDUMBRE COMBINADA A LA VALIDACIN DE UNA METODOLOGA ANALTICA POR HPLC, EN UN PRODUCTO QUE CONTIENE CITALOPRAM BROMHIDRATO.

Internado presentado como parte de los requisitos para optar al Ttulo de Qumico Farmacutico.

CRISTIAN MAURICIO GONZLEZ HINOSTROZA VALDIVIA-CHILE 2006

RESUMEN....................................................................................................................................................................4

SUMMARY...................................................................................................................................................................5

NOTACIN..................................................................................................................................................................6

1. INTRODUCCIN....................................................................................................................................................7 1.1. OBJETIVO GENERAL. .........................................................................................................................................9 1.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS. .................................................................................................................................9 1.3. VALIDACIN DEL SISTEMA CROMATOGRFICO ......................................................................................................17 1.4. VALIDACIN
MTODOS ANALTICOS. ...................................................................................................................18

2. MATERIALES Y MTODOS ..............................................................................................................................22 2.1. MATERIALES. .........................................................................................................................................................22 2.2. METODOLOGA.......................................................................................................................................................23 2.3. CONFIRMACIN DE IDENTIDAD. .............................................................................................................................24 2.4. METODOLOGA ANALTICA PARA EL PRODUCTO. ...................................................................................................24 2.5. ACONDICIONAMIENTO DEL HPLC..........................................................................................................................25 2.6. APLICACIN DE PARMETROS DE DESEMPEO ANALTICO .....................................................................................26 2.7. PARMETROS PARA LA ESTIMACIN DE INCERTIDUMBRE ......................................................................................29 3. RESULTADOS.......................................................................................................................................................32 3.1. VALIDACIN CITALOPRAM BROMHIDRATO. ...........................................................................................................32 3.2. CLCULO DE INCERTIDUMBRE ...............................................................................................................................42 4. DISCUSIONES Y CONCLUSIONES ..................................................................................................................51

5. REFERENCIA........................................................................................................................................................53

ANEXOS.... .................................................................................................................................................................54 ANEXO N 1 RESULTADOS EN EXTENSO PARA LA PRECISIN POR REPETIBILIDAD DEL PRINCIPIO ACTIVO CITALOPRAM
BROMHIDRATO. .............................................................................................................................................................54

ANEXO N 2 RESULTADOS EN EXTENSO PARA LA RECUPERACIN POR REPRODUCIBILIDAD DEL PRINCIPIO ACTIVO
CITALOPRAM BROMHIDRATO.........................................................................................................................................55

ANEXO N 3 DISTRIBUCIN TSTUDENT CON N GRADOS DE LIBERTAD.......................................................................65

INDICE DE TABLAS
1.1. Tabla N1 Degradacin forzada para p.a citalopram bromhidrato34 1.2. Tabla N2 Resultados obtenidos del ensayo de linealidad para citalopram bromhidrato...................35 1.3. Tabla N3 Caractersticas de la curva de calibracin para citalopram bromhidrato...36 1.4. Tabla N 4 Cuadro resumen de criterios estadsticos (t de Student) para evaluacin de la linealidad de la metodologa analtica.....37 1.5. Tabla N 5 Resultados de ensayo de exactitud para citalopram bromhidrato....38 1.6. Tabla N6 Cuadro resumen de los resultados del test estadstico efectuado para la determinacin de la exactitud.....39 1.7. Tabla N 7 Resultados de la precisin por repetibilidad obtenido para p.a citalopram bromhidrato.....39 1.8. Tabla N 8 Resultados de evaluacin de estabilidad para citalopram bromhidrato valores 24 hrs T ambiente 25C y 24 hrs refrigerador 4C ......40 1.9. Tabla N 9 Serie de experimentos repetidos diferentes das y en diferentes equipos.42 2.0. Tabla N10: repetibilidad de la pesada con intervalo de 5 segundos.....44
2.1. Tabla N 11 Resultados de la precisin por repetibilidad obtenidos para citalopram bromhidrato......54

2.2. Tabla N 12 Resultados de la recuperacin equipo HPLC Agilent 1100 inyeccin automtica. Da 08/11/2005.55 2.3. Tabla N 13 Resultados de la recuperacin equipo HPLC Agilent 1100 inyeccin automtica. Da 09/11/2005.....56 2.4. Tabla N 14 Resultados de la recuperacin equipo HPLC Agilent 1100 inyeccin automtica. Da 17/01/2006.....57 2.5. Tabla N 15 Resultados de la recuperacin equipo HPLC Agilent 1100 inyeccin automtica. Da 20/01/2006.58 2.6. Tabla N 16 Resultados de la recuperacin equipo HPLC Agilent 1100 inyeccin automtica. Da 22/01/2006.59 2.7. Tabla N 17 Resultados de la recuperacin equipo HPLC Merck hitachi inyeccin manual. Da 10/01/2006.60 2.8. Tabla N 18 Resultados de la recuperacin equipo HPLC Merck hitachi inyeccin manual. Da 11/01/2006.61 2.9. Tabla N 19 Resultados de la recuperacin equipo HPLC Merck hitachi inyeccin manual. Da 12/01/2006.62 3.0. Tabla N 20 Resultados de la recuperacin equipo HPLC Merck hitachi inyeccin manual. Da 13/01/2006.63 3.1. Tabla N 21 Resultados de la recuperacin equipo HPLC Merck hitachi inyeccin manual. Da 16/01/2006.64 3.2. Tabla N 22 DE LA DISTRIBUCIN tStudent con n grados de libertad..............65

RESUMEN
En el presente trabajo se desarroll la validacin de la metodologa analtica por HPLC y el clculo de la incertidumbre combinada para el producto citalopram bromhidrato. El mtodo fue validado siguiendo una metodologa de trabajo elaborada previamente en un protocolo de validacin, donde se analizaron diferentes parmetros como: selectividad, linealidad, precisin, exactitud y estabilidad. El mtodo analtico propuesto es selectivo, porque no se evidencia que los productos de degradacin interfieran en el anlisis del principio activo. Adems, se obtiene un porcentaje de pureza del pico cromatogrfico de 100%. La metodologa desarrollada es lineal para el rango de 50 % a 150 % de la concentracin de trabajo obtenindose un coeficiente de correlacin de r = 0.99999. Adems, de ser una tcnica exacta al trabajar con soluciones de concentracin de 70%, 100 % y 130 %, y precisas, cumpliendo con los criterios de RSD mnimos. En el clculo de la incertidumbre de medida para la metodologa antes validada, se aprecia que la incertidumbre tipo A, por ser 3 rdenes de magnitud mayor que la incertidumbre tipo B, refleja el valor final de la incertidumbre combinada para esta metodologa analtica, dando un valor de incertidumbre combinada (uc)=0.3% y una incertidumbre expandida U = 0,6% con un nivel de confianza de 95%

SUMMARY
The following research has investigated the validation of the analytical methodology by HPLC and the calculation of the combined uncertainty for the citalopram hydrobromide product. The method was validated following a methodology of work elaborated previously with a validation protocol where different parameters were analyzed, such as: selectivity, linearity, precision, accuracy and stability. The analytical method proposed is a selective one, because there is no evidence that the degradation products interfere in the analysis of the active principle. More over, a percentage of purity of the chromatographic tip of 100 % is obtained. The used methology is linear for the rank of 50% to 150% of the analysis concentration obtaining a coefficient of correlation of r= 0,99999. Besides, this technique is exact when working with solutions of concentration of 70 %, 100% and 130%, fulfilling the minimun criteria of RSD. In the calculation of the uncertainty of measurement for the methodology before validated, it is observed that the uncertainty tipe A, being greater about three magnitudes order than the uncertainty type B, reflects the final value of the combined uncertainty for its analytical methodology, giving a value of combined uncertainty (uc)=0.3% and one expanded uncertainty of U =0,6% with confidence level of 95 %.

NOTACIN
a b C Cstd DS HPLC k M.R Pstd r Rec RSD u U ubal uc umst Vfin Vstd Ordenada en el origen de la recta de regresin Pendiente de la recta de regresin Concentracin Concentracin estndar Desviacin estndar Cromatgrafo Lquido de Alta Eficiencia Factor de cobertura Material de referencia Peso estndar Coeficiente de correlacin Recuperacin Desviacin estndar relativa Incertidumbre estndar Incertidumbre expandida Incertidumbre calibracin balanza Incertidumbre combinada Incertidumbre masa estndar Volumen final Volumen estndar

1. INTRODUCCIN
La Food and Drugs Administration (FDA), desde mediados del siglo XIX ha dotado de un criterio unificador a las compaas farmacuticas, mediante las buenas prcticas de manufactura y buenas prcticas de laboratorio (GMP y GLP respectivamente), las cuales describen los mtodos, equipos, instalaciones y controles (incluyendo las pruebas analticas) requeridas para producir alimentos, medicamentos e instrumentos de uso mdico. Aunque la GMP data desde 1893, no fue hasta el ao 1962 que la FDA fue requerida para enunciar las regulaciones de GMP enumerando los procedimientos tendientes a respaldar la seguridad de los medicamentos. La industria farmacutica, despus de una etapa de discusin, ha convertido a las validaciones en un mecanismo de control retroactivo de los medios de calidad. Las buenas prcticas de manufactura vigentes (cGMP) no estaran completas sin lo que llamamos validacin de procesos de produccin, la cual incluye la validacin de los mtodos de anlisis para el control de calidad de los medicamentos. Es aqu donde la evaluacin de la incertidumbre de medicin en qumica analtica ha despertado en los ltimos aos un marcado inters. Se acepta en general que, para evaluar si un resultado de anlisis es apto para el propsito al cual se destinar, es indispensable realizar una estimacin de la incertidumbre de medicin. Son conocidos los documentos de referencias en cuanto a la metodologa de evaluacin de incertidumbre en qumica analtica (3-5)

Esta metodologa requiere que se identifiquen todas las posibles fuentes de incertidumbre asociadas con el proceso de medicin y que se estime su valor, ya sea por medios estadsticos (evaluacin tipo A) o por medios documentados (evaluacin tipo B). Posteriormente se combinan estos componentes individuales para obtener las incertidumbres estndar y expandida para el proceso total. En conjunto, tanto la validacin de la metodologa por HPLC como l clculo de la incertidumbre, proporcionan un alto grado de confianza y seguridad en el mtodo analtico, y en la calidad de los resultados. Permite un conocimiento profundo de sus caractersticas de funcionamiento, disminucin del nmero de fallas y repeticiones, con el consiguiente ahorro de los costos asociados. (7)

1.1. OBJETIVO GENERAL. Aplicar el clculo de incertidumbre combinada a la validacin de una metodologa analtica por HPLC, en un producto que contiene citalopram bromhidrato.

1.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS. Adquirir una visin general de las variadas actividades desarrolladas dentro del departamento de control de calidad. Establecer las condiciones cromatogrficas ptimas para la validacin del mtodo analtico por HPLC. Calcular y desarrollar los parmetros a validar: selectividad, linealidad, precisin y exactitud. Calcular la incertidumbre tipo A y tipo B del mtodo desarrollado en la validacin.

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GENERALIDADES. Gerencia de control de calidad. A cargo de un Qumico Farmacutico (Q.F), esta gerencia vela por el cumplimiento de los requisitos de calidad establecidos por las normas nacionales e internacionales para cada medicamento en particular. Se responsabiliza de la calidad de las materias primas, a travs de un control analtico y de proveedores, como as tambin, de la calidad de los productos de envase y empaque. Conjuntamente, realiza un control a productos terminados a cargo de Q.F., Qumicos y Analistas Qumicos, supervisando cualquier alteracin de las especificaciones y respaldando cada anlisis con un protocolo firmado. Tambin se preocupa de la calibracin, mantencin y buen funcionamiento de todos los equipos utilizados en los anlisis, de la prevencin de riesgos y accidentes en el laboratorio y en general del cumplimiento de las normas de buenas prcticas de laboratorio (GLP). Est encargado a su vez, de llevar a cabo estudios de estabilidad de los diferentes productos, en variadas condiciones de ambiente y almacenamiento. Labores en el departamento de control de calidad. Control en proceso. En esta parte se controlan las pruebas de sellado (Blister y pomo) en proceso de fabricacin. Generalmente, stas cumplen con los lmites establecidos, si esto no es as, el proceso se detiene.

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Una vez que los operadores efectan las correspondientes correcciones, se realizan nuevamente los controles para permitir la continuacin del proceso. Control de parmetros fsicos. Durante el proceso de compresin, se realizan controles de peso y dimetro, con un equipo mltiple de medicin de parmetros fsicos, durometro (Pharmatest). De igual manera, se efectan pruebas de desintegracin y friabilidad. Si el control de dichos parmetros no cumple con los estndares especficos para cada producto en particular, el proceso de compresin se detiene, debiendo adecuarse los parmetros antes mencionados. Luego se realiza un nuevo control, el cual si es aprobado permite continuar el proceso. Control de fabricacin. En esta rea se realiza principalmente el control de fabricacin de los diferentes productos, en sus diversas etapas de proceso (granulados, ncleos) como tambin de producto terminado (comprimidos, jarabes, suspensiones, granulados y polvos). Segn las caractersticas de la forma farmacutica del producto y las especificaciones del laboratorio, se realizan los correspondientes anlisis: identidad, pureza, potencia, valoracin y uniformidad de contenido, con equipos tales como: HPLC y espectrofotmetro con arreglo de diodos. En la mayor parte de los anlisis realizados, los resultados fueron satisfactorios, permitiendo al producto pasar a su siguiente etapa de fabricacin. Sin embargo. En ciertas oportunidades, los anlisis debieron ser realizados ms de una vez. Si la repeticin no resultaba satisfactoria, el producto era enviado a reproceso, a la vuelta de este. El producto, nuevamente analizado, en general era aprobado.

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Descripcin citalopram bromhidrato (2) El citalopram bromhidrato es un inhibidor selectivo de la recaptacin de serotonina (SSRI) y se administra oralmente. El citalopram bromhidrato es designado como: ()-1-(3-dimetilaminopropil)-1-(4-fluorofenil)1,3-dihidroisobenzofurano-5-carbonitrilo bromhidrato, con la siguiente frmula estructural.

La formula molecular es C20H22BrFN2O Peso molecular: 405.4 g/mol El citalopram bromhidrato se presenta como un polvo blanco levemente opaco. Es parcialmente soluble en agua y soluble en etanol.

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Farmacodinmica (2) El mecanismo de accin antidepresiva del citalopram, se presume que se liga a la potenciacin de la actividad serotoninrgica en el sistema nervioso central, resultado de la inhibicin de la recaptacin neuronal de serotonina (5HT). Los estudios in- vivo e in- vitro en animales, sugieren que el citalopram es un inhibidor altamente selectivo de la recaptacin de serotonina (SSRI), con efectos mnimos sobre la recaptacin neuronal de noradrenalina y de dopamina. Citalopram es una mezcla racmica (50/50) y la inhibicin de recaptacin de serotonina por citalopram es debido principalmente por el enantimero S. Citalopram posee muy baja o ninguna afinidad por los receptores. 5-HT1A, 5-HT2A, y adrenrgicos, de la dopamina (D1-2), histaminrgicos (H1), gamaaminobutricos, muscarnicos y receptores benzodiazepnicos (2)

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Farmacocintica (2) En un rango de 10 a 60 mg/da en dosis simple o mltiple el citalopram se comporta en forma lineal. La biotransformacin del citalopram es netamente heptica con una vida media de alrededor de 35 horas, (con una dosis diaria la concentracin plasmtica en estado estacionario se logra aproximadamente en una semana) Absorcin y distribucin (2) Luego de una dosis oral simple de 40mg de citalopram, los niveles mximos en la sangre ocurren alrededor de las 4 horas. La biodisponibilidad absoluta del citalopram es del 80% en relacin a una dosis intravenosa, y la absorcin no se ve afectada por alimentos. El volumen de distribucin es de aproximadamente 12 L/kg, y la unin del citalopram, desmetil citalopram (DCT) y didesmetil citalopram (DDCT) a las protenas plasmticas humanas es de alrededor del 80%. Metabolismo y eliminacin (2) Despus de la administracin intravenosa de citalopram, la fraccin de droga recuperada en la orina como citalopram y desmetil citalopram (DCT) es de alrededor del 10 y 5% respectivamente. El clearance sistmico de citalopram es de aproximadamente 330 mL/min. Con aproximadamente un 20% debido al clearance renal. Citalopram es metabolizado a desmetil citalopram (DCT), didesmetil citalopram (DDCT), xido-N-citalopram y a un derivado del cido propinico desaminado. En humanos el citalopram se encuentra predominantemente inmodificado en el plasma. La concentracin en el estado estacionario de los metabolitos de citalopram (DCT) y (DDCT) en el plasma, es de un medio y un dcimo respectivamente, con respecto al citalopram. Estudios in- vitro han demostrado que el citalopram es 8 veces ms

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potente que sus metabolitos en la inhibicin de la recaptacin de serotonina, por lo tanto dichos metabolitos no contribuyen significativamente a la accin antidepresiva. Estudios in- vitro realizados sobre microsomas de hgado humano han demostrado que CYP3A4 y CYP2C19 son las isoenzimas principalmente involucradas en la N-demetilacin del citalopram.

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Interacciones frmaco-frmaco (2) In- vitro los datos de inhibicin enzimtica no revelan un efecto inhibitorio del citalopram sobre CYP3A4, pero sugieren que es un dbil inhibidor de CYP1A2, CYP2D6 y CYP2C19, por lo cual puede esperarse que el citalopram in- vivo posea un dbil efecto inhibidor sobre los metabolismos mediados por esos citocromos, pero no se dispone de evidencia clnica que lo demuestre. Dado que citalopram es metabolizado por CYP3A4 y CYP2C19, existe la posibilidad de que el clearance de citalopram pueda disminuir si se administra en forma concomitante con un inhibidor potente de CYP3A4 (Ej.: ketoconazol, itraconazol, fluconazol o eritromicina) o con un potente inhibidor de CYP2C19 (Ej.: omeprazol), por lo cual debe tenerse presente en el momento de la administracin a los pacientes.

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1.3. Validacin del sistema cromatogrfico Es la demostracin documentada de que los parmetros que componen el mtodo son adecuados para los requisitos de los datos analticos. Parmetros cromatogrficos para la calibracin del sistema La calibracin de un equipo consiste en un conjunto de operaciones que establecen una serie de relaciones, en condiciones especificas, entre los valores indicados por un instrumento y los correspondientes valores conocidos. El objetivo fundamental de la calibracin de un equipo es tener seguridad en la medida. Los parmetros cromatogrficos que nos permiten caracterizar y definir los cromatogramas y calibrar el sistema son los siguientes: Lnea de base: Es la porcin del cromatograma donde slo se aprecia la elucin de la fase mvil sin seal debida al soluto. (6) Relacin o factor de capacidad (k) Da la relacin entre los tiempos de los solutos que intervienen en la fase estacionaria y en la fase mvil. Cuanto ms grande sea este factor, ms retenido estar el soluto por la fase estacionaria. (6)

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Nmero de platos tericos (n) Este parmetro indica la eficacia de la columna, ya que cuantos ms anchos sean los picos, menor nmero de ellos podrn resolverse en el mismo intervalo de tiempo, y por lo tanto podrn separarse menos componentes. ( 6) Asimetra (As) La asimetra (tailing) es una de las formas ms comunes de alejamiento de la curva gaussiana, y su medicin es importante puesto que puede llevar, de acuerdo a su magnitud, a errores considerables de cuantificacin, motivo por el cual el valor ideal es lo ms cercano a 1. (6) 1.4. Validacin mtodos analticos. La validacin de los mtodos analticos es el establecimiento de la evidencia

documentada que un procedimiento analtico conducir, con alto grado de seguridad, a la obtencin de resultados precisos y exactos, dentro de los atributos de calidad previamente establecidos. Es necesario validar para demostrar que los mtodos son adecuados para los anlisis propuestos en las condiciones descritas, y adems porque es parte integral del desarrollo de un mtodo analtico, Tambin porque es necesario trabajar con mtodos que ofrezcan confianza y seguridad en los resultados, y por ltimo, porque resulta mucho ms econmico trabajar con mtodos validados (7). Segn la USP XXVII (8) los mtodos analticos se clasifican en varias categoras para su validacin. El mtodo que es objeto de estudio en el presente trabajo pertenece a la categora I y se clasifica dentro de los "mtodos cuantitativos para la determinacin del principio activo

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como materia prima o en formulaciones farmacuticas". Los parmetros de validacin que se deben considerar varan segn los requisitos legales exigidos por distintas organizaciones segn la literatura consultada (8-9). Para este tipo de mtodo debe evaluarse la selectividad, linealidad, exactitud y precisin. Selectividad (9) La selectividad, es la capacidad del mtodo para evaluar nicamente el principio activo ntegro de forma exacta y especifica, en presencia de los componentes que puedan estar presentes, como por ejemplo: impurezas, productos de degradacin y componentes de la matriz. Linealidad (9) La linealidad de un mtodo analtico es su capacidad para demostrar que los resultados de la prueba se relacionan adecuadamente a travs del modelo propuesto. Precisin (9) La precisin de un mtodo analtico, es el grado de concordancia de los resultados de la prueba, cuando el mtodo se aplica repetidamente a mltiples tomas de una muestra homognea. La precisin puede ser medida, ya sea por el grado de reproducibilidad o de repetibilidad del mtodo analtico, bajo condiciones operativas normales. En este contexto definimos:

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Reproducibilidad (7) Se refiere al uso del procedimiento analtico en diferentes laboratorios. Precisin intermedia (7) Expresa la variacin dentro de un mismo laboratorio, en diferentes das, diferentes analistas o equipos. Exactitud (9) La exactitud de un mtodo analtico, es la proximidad entre los resultados obtenidos por ese mtodo y el valor real. La exactitud de un mtodo analtico debe establecerse a lo largo de todo un rango de concentraciones. Incertidumbre analtica (5) La incertidumbre es un parmetro que, en general, comprende varios componentes. Los componentes pueden ser evaluados de distintas maneras. Las formas de evaluar la incertidumbre estndar son: tipo A y tipo B Tipo A: La incertidumbre tipo A, se relaciona con fuentes de error aleatorios, y pueden ser evaluados a partir de distribuciones estadsticas de series de resultados, que pueden caracterizarse por desviaciones estndar.

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Tipo B: La incertidumbre tipo B, no se determina por medios estadsticos, estn asociadas a los errores de tipo sistemtico; esto es, se estiman a partir de datos del fabricante del instrumento, especificaciones, certificados de calibracin, y en general de datos subjetivos (1) La incertidumbre representa el intervalo en l que se puede encontrar el valor verdadero con mayor probabilidad. Los parmetros para la estimacin de incertidumbre son: incertidumbre estndar, incertidumbre estndar combinada e incertidumbre expandida.

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2. MATERIALES Y MTODOS
2.1. Materiales. Programa estadstico computacional Statgraphics statiscal graphis system Materia prima citalopram bromhidrato. Cromatgrafo Liquido de Alta Eficiencia (HPLC), Agilent Serie 1100, Cdigo CC-ECR-4. Detector DAD Bomba Cuaternaria Autosampler Compartimiento Columna Desgasificador N Serie DE01608414 N Serie DE91609119 N Serie DE91611592 N Serie DE91614374 N Serie 5P73021196

Cromatgrafo Liquido de Alta Eficiencia (HPLC), Hitachi Lachrom, Cdigo CCECR-3. Compuesto de los siguientes mdulos: Bomba Cuaternaria Modelo: L7100 N de Serie: 063-006 N de Serie: 0702-025

Detector Arreglo de Diodos Modelo: L7450

Columna RP-Select B (5m) C-8 Merck N 526304 Espectrofotmetro UV-Visible Hewlett Packard Modelo 8452 A, Serie 3104601516

pHmetro Fisher Scientific Modelo Accumet 50 Serie C0006941 Sonicador Transsonic 460/H (ELMA R) Balanza analtica Sartorius Modelo A200S Material volumtrico tipo A

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2.2. Metodologa. Se puede dividir bsicamente en cuatro etapas: Confirmar la identidad del citalopram bromhidrato en columna Select B C-8. En equipo HPLC (Cromatgrafo Lquido de Alta Eficiencia) Preparacin solucin cida (cido fosfrico 0.05N pH4 TEA) para la fase mvil. Aplicacin de parmetros de desempeo analtico: selectividad, linealidad, exactitud, precisin y estabilidad. Para el producto citalopram bromhidrato. Obtener a travs de estudios de recuperacin, el RSD del mtodo y calcular la

incertidumbre tipo A (1-3-4). Por medios documentados establecer la incertidumbre tipo B (1-3-4). De esta manera tener un clculo aproximado de la incertidumbre combinada y expandida.

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2.3. Confirmacin de identidad. Estndar. Se prepara una solucin con estndar de referencia del analito de inters (citalopram bromhidrato) y se determina su espectro UV en solvente adecuado, generalmente fase mvil en espectrofotmetro UV visible. Tambin se prepara una muestra conteniendo el estndar para ser inyectada al HPLC, se obtienen ambos espectros y comparan (mximos y mnimos). Una vez confirmada la identidad se obtiene el tiempo de retencin. Muestra. Se prepara una solucin muestra conteniendo el analito, se inyecta al HPLC y se obtiene su espectro y tiempo de retencin y se comparan ambos parmetros con los obtenidos en la solucin estndar. 2.4. Metodologa Analtica para el producto. Preparacin de la solucin cida: Se prepara una solucin de cido fosfrico 0.05 N tomando 6.7 mL de cido fosfrico concentrado (85%) y diluyendo a 2000 mL con agua HPLC. Ajustando a pH 4 mediante la adicin de Trietilamina (TEA).

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2.5. Acondicionamiento del HPLC. Se limpia la columna cromatogrfica con agua HPLC por 10 minutos aproximadamente y luego con metanol otros 10 minutos. Cambiar a fase mvil y esperar hasta que la presin y la lnea base se estabilicen Se preparan 2 estndares y muestras segn metodologa analtica (4) Se inyecta el estndar 1 cuatro veces para la calibracin del equipo verificando que la repetibilidad de inyeccin sea menor de 2 %, luego se inyecta el estndar 2 y se verifica que la recuperacin del estndar sea menor al 2% (4) Se inyectan las muestras al HPLC. El estndar intermedio se inyecta cada 5 muestras cuya desviacin entre lo obtenido y lo preparado no debe superar el 2 % para as asegurar que el equipo no ha perdido la calibracin. Una vez finalizado el uso del equipo HPLC, se limpia de la siguiente manera: ingresando agua HPLC al equipo para eliminar las posibles sales que se pueden formar y obstruir el recorrido de la fase mvil (tiempo aproximado 15 minutos). Luego, se ingresa metanol aproximadamente 10 minutos y se registra la presin final en la bitcora.

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Determinacin de citalopram bromhidrato Preparacin solucin estndar: Se pesa exactamente alrededor de 100 mg de citalopram bromhidrato estndar (equivalente a 80 mg de citalopram) en matraz aforado de 100 mL, se afora con solucin cida (cido fosfrico 0.05 N pH4 (TEA)). S sonica durante 30 minutos, luego se toma una alcuota de 5 mL y lleva a matraz de 50 mL aforando con solucin cida (conc. Citalopram: 0.08 mg/mL). Condiciones cromatogrficas: Columna Fase Mvil Detector UV Flujo Inyeccin TR : RP Select B (C8) N 526304 : Solucin de cido Fosfrico 0.05 N pH=4 (TEA) / Metanol (50:50) : 254 nm. : 1 mL/minuto. : 20 L : Aprox. 3,5 minutos

2.6. Aplicacin de parmetros de desempeo analtico Selectividad. A) Blanco: se prepara medio de disolucin de la muestra y estndares. Se inyecta y deja correr la cromatografa aproximadamente 30 minutos y se determina la contribucin del placebo al cromatograma. B) Frente a componentes de la matriz: se prepara una solucin de placebo la cual es 10 veces ms concentrada que la de trabajo y se inyecta al cromatgrafo, se deja correr la

cromatografa aproximadamente 30 minutos y se determina la contribucin de los componentes de la matriz.

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C) Frente a potenciales productos de degradacin: se someten a degradacin forzada soluciones conteniendo el analito 10 veces ms concentrada que la concentracin de trabajo. Se adicionan 10 mL de esta solucin a 4 matraces erlenmeyer de 100mL y se procede de la siguiente forma: Agregar al matraz una hora. Agregar al matraz N2 25 mL de una solucin de NaOH 0.5 N y someter a reflujo durante una hora. Agregar al matraz N3 25mL de una solucin de HCl 0.5 N y granallas de zinc y someter a reflujo durante una hora. Agregar 5 mL de perxido de hidrogeno (30 %) al matraz N4, mezclar y dejar reaccionar durante 30 minutos. Cada una de las muestras obtenidas se transfiere a un matraz de 100 mL y se afora con solucin cida (cido fosfrico 0.05 N pH4). Las muestras se neutralizan previamente con 25 mL de HCl 0.5 N o NaOH 0.5 N segn corresponda. D) Materia prima en estado slido sometida a degradacin forzada: se dispone de suficiente cantidad de droga pura en dos placas petri bien cerradas y se procede a someter la placa N1 a la accin del calor, exponindola a 105C durante una semana, y se somete la placa N2 a la accin de la luz o de una lmpara que simule la radiacin UV durante una semana. Posteriormente se preparan soluciones muestra de acuerdo a la metodologa analtica desarrollada como si fuera un estndar Los puntos C y D, se analizaron de la siguiente manera: I) Se prepara una solucin estndar la cual se inyecta 4 veces en el HPLC y se verifica la repetibilidad de inyeccin, la cual debe ser menor al 2 % N1 25 mL de una solucin de HCl 0.5 N y someter a reflujo durante

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II) Se inyectan las muestras de degradacin forzada obtenidas en los puntos C y D y se deja eluir las muestras durante 30 minutos, luego se reporta la aparicin de cualquier peak extrao correspondiente a productos de degradacin. Linealidad. A) Se preparan soluciones estndar que contengan aproximadamente 50 %, 75%, 100%, 125%, 150% de la concentracin terica y se inyectan en quintuplicado. B) S grfica la seal obtenida (rea del peak) v/s su correspondiente concentracin. C) Se obtiene la pendiente, intercepto y coeficiente de regresin

Exactitud. A) Se preparan 3 muestras cada una a un nivel de concentracin diferente 70 %, 100%, 130% e inyecta por duplicado, se calcula el porcentaje obtenido, la recuperacin de las 9 muestras en base de lo agregado, la recuperacin media, la desviacin estndar y el coeficiente de regresin (Total 9 muestras) Precisin por repetibilidad. A) Se representa por el anlisis estadstico, de los datos obtenidos de las mediciones de curvas de linealidad. Evaluacin de estabilidad de muestras y estndares. Esta evaluacin consta en la medicin de la variacin de concentracin que podra experimentar el principio activo (citalopram bromhidrato) a estudiar durante el tiempo de duracin de los anlisis. Corresponde a una estabilidad a corto plazo en la cual se miden muestras almacenadas en distintas condiciones ambientales (temperatura ambiente y 4 C en refrigerador), las cuales

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corresponden a los lugares donde se almacenan las muestras o las condiciones ambientales de trabajo. 2.7. Parmetros para la estimacin de incertidumbre Incertidumbre Estndar: u (y) Cada componente de la incertidumbre (y), expresada como desviacin estndar. Incertidumbre estndar Combinada: uc(y) Para el resultado y (Ley de propagacin de errores) Incertidumbre expandida: U Proporciona un intervalo dentro del cual se cree que est el valor del mesurando, cuando por razones de seguridad o salud se necesite expresar la incertidumbre con un alto nivel de confianza, se multiplica esta incertidumbre combinada por un factor de cobertura o seguridad K. U= K uc(y) K= factor de seguridad o de cobertura. Para un nivel de confianza del 95%, se considera un valor de K igual a 2. Componentes de la incertidumbre. La incertidumbre de un resultado puede originarse por diferentes causas, algunas de ellas son: Inadecuada definicin del mesurando

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Muestreo Efectos de la matriz e interferencias Contaminacin durante el muestreo o la preparacin de la muestra Incertidumbre de pesas y material volumtrico Pureza de reactivos Valores asignados a patrones y materiales de referencia Calibracin de equipos, etc.

Reglas para el clculo de la incertidumbre combinada Regla 1: Sumas y restas: y : a + b + c + ...

2 2 2 u ( y ) = u (a ) + u (b) + u (c) + ...

Regla 2: Productos y cocientes: y = abc o

y = a/bc

u( y) u (a ) 2 u (b) 2 u (c) 2 = + + y a b c

Regla 3: Exponentes: y = a n u( y) u (a ) =n y a

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Clculo de incertidumbre tipo A Se desarrolla una serie de experimentos, 5 repeticiones en cada equipo HPLC en diferentes das utilizando la misma columna cromatogrfica Select B C8, se registra la recuperacin de citalopram bromhidrato se calcula el promedio tanto para el equipo 1 como para el 2, se calcula el promedio final y se divide por la raz del nmero de repeticiones, as de esta manera se obtiene una aproximacin al valor de incertidumbre tipo A. Clculo de incertidumbre tipo B Para el calculo de incertidumbre tipo B se establece primero de forma independiente la contribucin tanto de la pesada como del proceso de dilucin a que fue sometida la muestra de citalopram bromhidrato, aqu se establece por medios documentados la calibracin de la balanza, la especificacin de las masas, la incertidumbre del estndar, la incertidumbre de los matraces aforados y de la pipeta. Luego se combinan estas incertidumbres y se obtiene el valor de la incertidumbre tipo B. Clculo de incertidumbre combinada Luego de tener los valores tanto de la incertidumbre tipo A como la de tipo B, se procede a calcular la incertidumbre combinada, a travs, de las regla N1 de sumas y restas de incertidumbres parciales.

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3. RESULTADOS
3.1. Validacin citalopram bromhidrato. Confirmacin de identidad En la figura N1 se muestra un cromatograma representativo, obtenido a partir de una solucin estndar de referencia de citalopram bromhidrato.

Figura N1: Cromatograma obtenido de la inyeccin de citalopram bromhidrato estndar RT 3.539 min. As =1.002

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Aplicacin de parmetros de desempeo analtico. Selectividad. Comportamiento del medio de disolucin: Al inyectar el medio de disolucin al HPLC se dejo eluir por 30 minutos y no se observ ninguna seal. Esto indica que no hay influencia del medio de disolucin en la determinacin cromatogrfica. Frente a componentes de la matriz: cuando se inyect una muestra de placebo 10 veces ms concentrada que la solucin de trabajo, con elucin de 30 min. no apareci seal alguna al tiempo de retencin del principio activo citalopram bromhidrato. confirmando as la no influencia de la matriz en la determinacin cromatogrfica. Frente a potenciales productos de degradacin: En la tabla N1 se muestran los resultados obtenidos de la degradacin forzada de citalopram bromhidrato.

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Tabla N1 Degradacin forzada para p.a citalopram bromhidrato. Tipo de ensayo Selectividad al medio de disolucin Selectividad a la matriz Especificacin de pureza Sin presencia de seales al tiempo de retencin del citalopram Sin presencia de seales al tiempo de retencin del citalopram (98-102) % (98-102) % (98-102) % (98-102) % (98-102) % (98-102) % Resultado No hay seal

No hay seal

Fotlisis Termlisis Hidrlisis cida Hidrlisis bsica Reduccin Oxidacin

100 % de pureza 100% de pureza 100% de pureza Degradacin 100 % de pureza 100 % de pureza

La degradacin forzada constituye una prueba para evaluar el comportamiento de los principios activos a estudiar en situaciones de estrs por ejemplo: alta temperatura 105C, accin de la luz, presencia de soluciones oxidantes y reductoras. El fin de este ensayo es obtener los productos de degradacin que potencialmente podran aparecer en un estudio de estabilidad y, determinar si la metodologa analtica es selectiva a travs de la pureza del peak cromatogrfico, el criterio de aceptacin ms importante de este ensayo es que las probables seales que aparezcan no deben interferir con la seal del principio activo o de la molcula intacta. De esta manera las seales obtenidas en ensayos futuros sern, con una alta probabilidad, respuesta del p.a estudiado y no de mezclas del analito- interferencias (4)

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Linealidad y rango. En la tabla N2 aparecen los resultados obtenidos en la determinacin de la linealidad para citalopram bromhidrato. En la figura N2 aparece la representacin grfica de la curva de calibracin respectiva. Tabla N2 Resultados obtenidos del ensayo de linealidad para citalopram bromhidrato.
41.20 g/mL rea 1 2 3 4 5 rea promedio DS RSD 51.5 % 449.783 451.572 453.167 453.336 454.024 452.4 1.706 0.377 60.45 g/mL 75.6 % 663.610 664.205 663.245 663.353 665.455 664.0 0.908 0.137 80.48 g/mL 100.6 % 883.086 884.637 886.043 888.256 890.265 886.5 2.854 0.322 105.18 g/mL 120.60 g/mL 131.5 % 1151.300 1157.670 1157.815 1160.380 1162.431 1157.9 4.192 0.362 150.7 % 1318.236 1320.640 1321.888 1325.819 1329.359 1323.2 4.408 0.333

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Figura N2 expresin grfica de la recta obtenida para la determinacin de la linealidad de la metodologa analtica para cuantificacin de citalopram bromhidrato. En la tabla N3 se muestra un resumen con las principales caractersticas de la curva de calibracin utilizada para la determinacin de la linealidad. Tabla N3: Caractersticas de la curva de calibracin para citalopram bromhidrato. citalopram bromhidrato 0.99999 10.986 0.540 5

Coeficiente de correlacin (r) Pendiente Intercepto Numero de repeticiones (n)

Uno de los criterios elegidos en este estudio para evaluar la linealidad de las metodologas fue el ndice de correlacin r. En la tabla N 3 aparece el resultado obtenido para este parmetro, el cual fue de 0.99999 para citalopram bromhidrato. Este resultado demuestra que se cumpli el criterio establecido. En la prctica generalmente r es mayor de 0.999. Sin embargo, el mejor indicador para evaluar el modelo lineal es un prueba estadstica, el test de Student, en el cual se

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calcula un valor t experimental (t

tabla

exp

) con n-2 grados de libertad y se compara con un t tabla (t

)para el nivel de confianza requerido (generalmente 95% o p >0.05)

En la tabla N4 se encuentran los valores de t exp y t tabla para la curva obtenida. La ecuacin que da cuenta de t exp es:
= r (n 2 ) 2 1 r

exp

Criterio de aceptacin: la recta es lineal cuando t exp es mayor que t tabla Tabla N 4: Cuadro resumen de criterios estadsticos (t de Student) para evaluacin de la linealidad de la metodologa analtica.* Anexo N3 citalopram 340.95 2.353 Si

t exp t tabla texp > t tabla

De los resultados anteriores puede sealarse que: existe una correlacin lineal en la metodologa analtica, por lo tanto es lineal dentro de las concentraciones estudiadas.

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Exactitud. En la tabla N5 se muestran los datos obtenidos para la determinacin de la exactitud en el producto citalopram bromhidrato. En este caso se prepararon tres muestras con 70%, 100 %, 130% de la concentracin estimada del analito y se analizo cada una por duplicado. Tabla N 5 Resultados de ensayo de exactitud para citalopram bromhidrato % Terico 70 100 130 % Recuperacin 101.4 100.6 101.3 100.5 0.958 0.95% Promedio 101.1 100.4 100.2 DE 1.27 0.35 1.10

99.7 100.0 99.1

102.2 100.6 100.1

Porcentaje de recuperacin media n: 9 Desviacin estndar Coeficiente de variacin (RSD)

La exactitud debe ser tan alta como sea posible para que el valor medido se aproxime al de referencia. Lo que quiere decir que la recuperacin del analito debe ser cercana al 100%. Para evaluar si cumple con los requisitos fijados se realiz un test estadstico t Student, efectuando varias determinaciones y calculando el t experimental que se compara con el t
tabla

para n-1 grados de libertad en el nivel de confianza escogido (95% generalmente). La ecuacin para texp es la siguiente:
100 X RSD n

exp

exp

(100 100.5 9 )
0.95

= 1.58

Si texp resulta menor que el ttabla, el mtodo tiene la exactitud requerida para este nivel de confianza. Es decir, no existe diferencia significativa con el 100% de recuperacin y la exactitud es la apropiada.

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Tabla N6: Cuadro resumen de los resultados del test estadstico efectuado para la determinacin de la exactitud. Anexo N3 citalopram 1.58 1.860 Si

t exp t tabla texp<t tabla

De acuerdo con los datos obtenidos, texp< ttabla, por lo tanto no existe diferencia significativa entre la recuperacin media y 100% para la metodologa analtica en estudio, por lo cual se puede sealar que es exacta. Precisin. En la tabla N 7 se muestran los resultados correspondientes al ensayo de precisin por repetibilidad para la metodologa analtica del principio activo citalopram bromhidrato. Tabla N 7: Resultados de la precisin por repetibilidad obtenido para p.a citalopram bromhidrato. RSD citalopram bromhidrato 0.377 % 0.137 % 0.322 % 0.362 % 0.333 %

Concentracin Aproximada 50 % 75 % 100 % 125 % 150 %

* Los resultados en extenso aparecen en el anexo N 1. Los resultados muestran valores de RSD menores al criterio establecido en este estudio (2%) (4). Lo que indica que la metodologa desarrollada es precisa. Es decir hay un alto grado de concordancia en el ensayo cuando el mtodo se aplica repetidamente a mltiples alcuotas de una muestra homognea.

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Estabilidad de las muestras sometidas a almacenamiento. En la tabla N 8 se muestran los resultados de la evaluacin de estabilidad para las muestras de citalopram bromhidrato. El da 1 se prepararon 2 estndares con los cuales se realiz la calibracin del HPLC luego se tomaron 2 muestras que fueron analizadas, los estndares y muestras fueron guardados durante 24 horas en distintas condiciones ambientales, una a temperatura ambiente y la otra en refrigerador a 4 C. El da 2 se vuelve a calibrar con estndares recin preparados y se leen las muestras guardadas. Tabla N 8 Resultados de evaluacin de estabilidad para citalopram bromhidrato valores 24 hrs T ambiente 25C y 24 hrs refrigerador 4C. LECTURA DA 2 0.08157 0.08112 0.07937 0.07946 0.08242 0.08267 0.08187 0.08164 0.08169 0.08159 0.07950 0.07977 0.08313 0.08269 0.08169 0.08199 0.98% 1.28% PROMEDIO 0.08135 0.07942 0.08255 0.08176 0.08164 0.07964 0.08291 0.08184 VALOR INICIAL DIA 1 0.08040 0.07886 0.08189 0.08077 0.08040 0.07886 0.08189 0.08077 % VARIACIN 1.18% 0.71% 0.81% 1.23% 1.54% 0.99% 1.25% 1.32%

ST1 25C ST1 25C ST2 25C ST2 25C M1 25C M1 25C M2 25C M2 25C ST1 4C ST1* 4C ST2* 4C ST2* 4C M1* 4C M1* 4C M2* 4C M2* 4C Promedio % Variacin 25C ambiente Promedio % Variacin 4C refrigerador

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La evaluacin de la estabilidad es un ensayo para determinar si son estables las concentraciones de los p.a durante el tiempo de trabajo, es decir de un da para otro (24 hrs), la variacin de concentracin no debe ser mayor a un 2% con respecto a los resultados obtenidos del primer da de anlisis (4) En la tabla N 8 aparecen las variaciones tanto para las muestras a temperatura ambiente como las guardadas a 4 C y en ellas se puede apreciar que ninguna de las muestras supera el 2%. De lo que se deduce que el principio activo citalopram bromhidrato es estable a condiciones de almacenamiento de 24 hrs tanto a temperatura ambiente como refrigerado. Lo cual se traduce en confianza de los resultados obtenidos en la validacin y en futuros anlisis.

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3.2. Clculo de incertidumbre Clculo de incertidumbre tipo A. La incertidumbre tipo A se relaciona con fuentes de error aleatorios, y pueden ser evaluados a partir de distribuciones estadsticas de series de resultados (ver anexo N2), que pueden ser caracterizadas a partir de desviaciones estndar. Tabla N 9 Serie de experimentos repetidos diferentes das y en diferentes equipos.
Da 10/10/2006 11/01/2006 12/01/2006 13/01/2006 16/01/2006 08/11/2005 09/01/2006 17/01/2006 20/01/2006 22/01/2006 Promedio equipo 1 Promedio equipo 2 Promedio final Equipo 1 Merck hitachi/inyeccin manual Merck hitachi/inyeccin manual Merck hitachi/inyeccin manual Merck hitachi/inyeccin manual Merck hitachi/inyeccin manual Equipo 2 % Recuperacin 100.5 % 100.6 % 100.2 % 99.9 % 99.8 % 99.1 % 99.7 % 100.5 % 99.8 % 100.1 % 100.2 % 99.4 % 99.8 % RSD 0.94 1.5 1.12 1.33 0.65 0.31 0.95 0.75 0.95 0.82 1.108 0.756 0.932

Agilent/inyeccin automtica Agilent/inyeccin automtica Agilent/inyeccin automtica Agilent/inyeccin automtica Agilent/inyeccin automtica

u=

RSDpromedio n

u=

0.932 10

u = 0.295

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Clculo de la incertidumbre tipo B Clculo de incertidumbre pesada Calibracin de la balanza u bal Repetibilidad de la pesada u Rep. Especificacin de las masas u masas

2 2 2 = u u u + + mstd bal rep masas

Incertidumbre en la pesada de 100 mg del estndar.

u (mstd ) 2 Desarrollando: = Mstd

Calibracin de la balanza: u bal

Segn la informacin proporcionada por el certificado de calibracin: para el rango de 100mg la incertidumbre es:

0.00005 g (K=2)

Esto significa una incertidumbre estndar de: 2 0.00005 g = 2.5 10 mg 2

bal

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Repetibilidad de la pesada (masas): urep

La desviacin estndar de una masa patrn efectuada en el rango de pesada 100mg es de 0.00006g (n=10) ver tabla N10.

rep

0.00006 g 10

= 0.00002 g

0.02mg

Tabla N10: repetibilidad de la pesada con intervalo de 5 segundos. N lectura Lecturas de las pesas (g) 0.0999 0.1000 0.0999 0.1001 0.1000 0.0999 0.1000 0.1000 0.1000 0.1000 0.09998 0.00006

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 X DE

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Calibracin de las masas: u masas

Trazabilidad: Laboratorio Custodio de los patrones nacionales de masa de Chile. Segn la informacin proporcionada por el certificado de calibracin de las masas patrn de 100 mg la incertidumbre es: 0.05mg (K=2) Esto significa una incertidumbre estndar de:

masas

0.05mg = 0.025mg 2

Entonces:

2 2 2 = u + u u + mstd bal rep masas

mstd

(0.025mg )

2 2 + (0.02mg ) + (0.025mg )

mstd

= 0.04mg

u (mstd ) 2 Desarrollando: = Mstd

7 0.04mg 2 100mg = 1.6 10

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Clculo de incertidumbre por dilucin

Pstd 100mL Pst =100 mg

50 mL

Expresin del clculo de incertidumbre asociado al proceso de dilucin:

u (cstd ) 2 u (vstd ) 2 u (vfin) 2 u (c) = C (dil ) + + vfin Cstd vstd

Incertidumbre asociada a la concentracin del estndar Pureza M.R (100.02 0.15)mg Matraz de (100 0.06) mL (incertidumbre estndar) Matraz de (50 0.03) mL (incertidumbre estndar) Pipeta (5 0.009) mL (incertidumbre estndar) Pstd 100mg = 1mg / mL Vinicial 100mL

Cstd =

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Incertidumbre de C (std)

0.15 2 0.06 2 Cstd = 1mg / mL + 100 100

Cstd = 1mg / mL 0.0015 Cstd Vstd Vfinal 1mg / mL 5mL Cdil = 0.1mg / mL 50mL

Cdil =

Cdil =

6 u (cstd ) 2 0.0015mg / mL 2 Incertidumbre del estndar. = 2.25 10 = cstd 1mg / mL 6 u (Vstd ) 2 0.009mL 2 Incertidumbre de la alcuota. = 3.24 10 = 5mL Vstd 7 u (Vfinal ) 2 0.03mL 2 Incertidumbre del matraz. Vfinal = 50mL = 3.6 10

Fig. N 2: Grfico comparativo de aportes de cada fuente de incertidumbre en el proceso de

dilucin.

Incertidumbre proceso dilucin

u v(final)

Alcuota

u
u(cstd)/cstd 0,0 E+ 00 5,0 E07 1,0 E06 1,5 E06 2,0 E06 2,5 E06 3,0 E06 3,5 E06

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Sustituyendo las incertidumbres parciales en la ecuacin general de incertidumbre por dilucin tenemos: u (cstd ) 2 u (vstd ) 2 u (vfin) 2 u (c) = C (dil ) + + vfin vstd Cstd

6 6 7 u (c) = 0.1mg / mL 2.25 10 + 3.24 10 + 3.6 10 3

u (c) = 0.1mg / mL 2.419 10

u (c) = 2.42 10

mg / mL

Incertidumbre tipo B errores sistemticos y datos de fabricante.

Para el proceso de dilucin.

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Cuadro resumen Incertidumbre tipo B

U peso U diluciones
Incertidumbre tipo A

1.6x10-7 2.42x10-4

U reproducibilidad

2.95x10-1

La incertidumbre tipo B en el presente trabajo se divide en la incertidumbre de dilucin y pesada, en este caso la incertidumbre de pesada es despreciable con respecto a la incertidumbre de la dilucin. De igual forma la incertidumbre tipo A por ser 3 magnitudes mayor que la incertidumbre tipo B que es la representacin final de la incertidumbre combinada para esta metodologa analtica por HPLC. Ahora la incertidumbre combinada final es la siguiente: 2 2 u = u u u = + c c tipoA tipoB 1 2 4 2 2.95 10 + 2.42 10

u = 0.295 c

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Teniendo el resultado de la incertidumbre combinada estndar podemos calcular la incertidumbre expandida (U). Del mtodo analtico antes validado.
U= K x uc

U=2 x 0.295 U = 0.59%

K= factor de seguridad o de cobertura. Aprox. K=2 para un nivel de confianza del 95%

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4. DISCUSIONES Y CONCLUSIONES
El anlisis de incertidumbre en el anlisis qumico es extremadamente relevante dentro de la administracin de los recursos de un laboratorio de control de ensayo, porque conocer la incertidumbre de los mtodos de anlisis da un valor tremendo a la calidad de los productos certificados, y a la trazabilidad del resultado informado. La incertidumbre es quizs la nica forma de medir objetivamente a un laboratorio de control de ensayo, incluso ms all del sistema de documentacin. El diseo experimental desarrollado en el presente trabajo, fue adecuado ya que permiti desarrollar la metodologa analtica para el citalopram bromhidrato en la determinacin cuantitativa por HPLC. La metodologa analtica descrita para citalopram bromhidrato result ser selectiva y lineal dentro del rango de concentracin de 50% a 150% de la concentracin de trabajo. Los parmetros de exactitud y precisin fueron aprobados y validados dentro de los rangos establecidos en la metodologa. Con respecto a la incertidumbre, uno de los componentes ms importantes es la incertidumbre del procedimiento. Este componente considera la variabilidad experimental de los resultados debida a las condiciones en que se efecta el anlisis (analista, da, calibrado, instrumento, etc.) y se calcula a partir de la recuperacin de diferentes muestras (precisin intermedia del mtodo). Una forma de disminuir la incertidumbre es mantener en condiciones de aptitud equipos y

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analistas, dentro de las variables ms importantes de controlar estn los parmetros de desempeo de mtodo donde la eficiencia de columna cromatogrfica juega un papel de vital importancia. Cabe destacar la aproximacin de los valores de la precisin por repetibilidad y el resultado del clculo de la incertidumbre de medida, ya que ambos valores bordean el 0.3% lo que demuestra en parte que un grado de incertidumbre se genera de forma propia por el instrumento de medida (HPLC).

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5. REFERENCIA
1.-Elizondo,A.(1993) Manual de aseguramiento metrolgico industrial. Basado en los requerimientos de calidad de la normativa QS-9000 (11-19) Ediciones Castillo, S.A 2.-http://www.fda.gov/medwatch/SAFETY/2004/apr_PI/Celexa_annotated_PI.pdf -actualizacin 06-10-2004 Rev: 13-03-2006 3.-NCh 2755/1 of 2003 Gua para cuantificacin y expresin de la incertidumbre en el anlisis qumico-parte 1. 4.-Protocolo general de validacin, Laboratorio Bag de Chile S.A 5.-Quantifyng Uncertainty in Analytical Measurement. EURACHEM/CITAC Guide (2000), 2 edition. (16-20) 6.-Quattrocchi,O.(1992) Introduccin a la HPLC aplicacin y prctica. (46-51) 7.-The Fitness for Purpose of Analytical Methods, EURACHEM Working Group (1998). (3-7) 8.-USP XXVII Ed. (2004) Validation of Compendial Methods. (2622-2625) 9.-Validation of Analytical Procedures: Methodology ICH 1996 (International Conference on Harmonisation). (1-8)

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ANEXOS.
Anexo N 1 Resultados en extenso para la precisin por repetibilidad del principio activo citalopram bromhidrato.

Tabla N 11 Resultados de la precisin por repetibilidad obtenidos para citalopram bromhidrato.

Concentracin en porcentaje del rea valor terico a cuantificar 51.5 449.783 451.572 453.167 453.336 454.024 75.6 663.610 664.205 663.245 663.353 665.455 100.6 883.086 884.637 886.043 888.256 890.265 131.5 1151.300 1157.670 1157.815 1160.380 1162.431 1318.236 105.7 1320.640 1321.888 1325.819 1329.359

RSD 0.377 %

0.137 %

0.322 %

0.362 %

0.333 %

55

Anexo N 2 Resultados en extenso para la recuperacin por reproducibilidad del principio activo citalopram bromhidrato.

Tabla N 12 Resultados de la recuperacin equipo HPLC Agilent 1100 inyeccin automtica. Da 08/11/2005. % Peso(mg) 70 74.2 70 74.2 70 73.7 70 73.7 70 73.3 70 73.3 St intermedio 100 103.8 100 103.8 100 107.2 100 107.2 100 108.2 100 108.2 St intermedio 130 134.7 130 134.7 130 137.3 130 137.3 130 135.9 130 135.9 St Final Promedio de recuperacin final RSD Conc(mg/ml) 0.0569 0.0569 0.0565 0.0565 0.0562 0.0562 0.0796 0.0796 0.0822 0.0822 0.0830 0.0830 0.1033 0.1033 0.1053 0.1053 0.1043 0.1043 Lectura 0.0564 0.0565 0.0558 0.0559 0.0560 0.0558 0.0807 0.0789 0.0788 0.0820 0.0819 0.0823 0.0825 0.0809 0.1023 0.1026 0.1039 0.1039 0.1035 0.1036 0.0810 Recup% 99.0 99.1 98.7 98.8 99.5 99.2 100.3% 99.1 99.0 99.7 99.6 99.2 99.4 100.6% 99.0 99.3 98.7 98.6 99.3 99.3 100.7% Promedio 99.1% 98.8% 99.4%

99.1% 99.6% 99.3%

99.1% 98.7% 99.3%

99.1% 0.31%

56

Tabla N 13 Resultados de la recuperacin equipo HPLC Agilent 1100 inyeccin automtica. Da 09/11/2005. % Peso(mg) 70 74.7 70 74.7 70 74.4 70 74.4 70 74.5 70 74.5 St intermedio 100 106.9 100 106.9 100 106.7 100 106.7 100 107.6 100 107.6 St intermedio 130 135.1 130 135.1 130 137.5 130 137.5 130 135.6 130 135.6 St Final Promedio de recuperacin final RSD Conc(mg/ml) 0.0573 0.0573 0.0571 0.0571 0.0572 0.0572 0.0820 0.0820 0.0819 0.0819 0.0825 0.0825 0.1036 0.1036 0.1055 0.1055 0.1040 0.1040 Lectura 0.0575 0.0572 0.0568 0.0568 0.0571 0.0571 0.0792 0.0818 0.0818 0.0812 0.0813 0.0817 0.0820 0.0792 0.1017 0.1019 0.1055 0.1055 0.1058 0.1058 0.0794 Recup% 100.4% 99.8% 99.5% 99.5% 99.9% 99.9% 99.5% 99.7% 99.8% 99.2% 99.4% 99.0% 99.4% 99.5% 98.1% 98.3% 100.0% 100.0% 101.7% 101.7% 99.7% Promedio 100.1% 99.5% 99.9%

99.7% 99.3% 99.2%

98.2% 100.0% 101.7%

99.7% 0.95

57

Tabla N 14 Resultados de la recuperacin equipo HPLC Agilent 1100 inyeccin automtica. Da 17/01/2006. % Peso(mg) 70 73.9 70 73.9 70 74.6 70 74.6 70 74.5 70 74.5 St intermedio 100 105.8 100 105.8 100 107.7 100 107.7 100 106.2 100 106.2 St intermedio 130 147.2 130 147.2 130 151.8 130 151.8 130 148.6 130 148.6 St Final Promedio de recuperacin final RSD Conc(mg/Rec) 56.693 56.693 57.230 57.230 57.154 57.154 81.166 81.166 82.623 82.623 81.473 81.473 112.926 112.926 116.455 116.455 114.000 114.000 lectura 57.097 57.030 57.294 57.222 57.448 57.419 80.457 81.434 82.306 82.862 82.631 81.531 81.600 80.311 114.173 114.213 115.531 115.192 115.254 116.629 81.500 Recup% 100.7 100.6 100.1 100.0 100.5 100.5 100.2% 100.3 101.4 100.3 100.0 100.1 100.2 100.0% 101.1 101.1 99.2 98.9 101.1 102.3 101.5% Promedio 100.7% 100.0% 100.5 %

100.9% 100.1% 100.5%

101.1% 99.1% 101.7%

100.5% 0.75%

58

Tabla N 15 Resultados de la recuperacin equipo HPLC Agilent 1100 inyeccin automtica. Da 20/01/2006. % Peso(mg) 70 74.4 70 74.4 70 74.7 70 74.7 70 73.8 70 73.8 St intermedio 100 104.4 100 104.4 100 105.2 100 105.2 100 105.8 100 105.8 St intermedio 130 138.7 130 138.7 130 134.5 130 134.5 130 134.4 130 134.4 St Final Promedio de recuperacin final RSD Conc(mg/Rec) 57.077 57.077 57.307 57.307 56.617 56.617 80.092 80.092 80.705 80.705 81.166 81.166 106.405 106.405 103.183 103.183 103.107 103.107 Lectura 56.343 56.208 57.025 56.709 56.021 57.090 86.873 79.487 80.136 81.965 82.134 81.581 80.321 86.589 104.869 105.339 103.031 102.967 102.128 105.615 86.885 Recup% 98.7 98.5 99.5 99.0 98.9 100.8 100.1% 99.2 100.1 101.6 101.8 100.5 99.0 99.8% 98.6 99.0 99.9 99.8 99.1 102.4 100.1% Promedio 98.6% 99.2% 99.9%

99.6% 101.7% 99.7%

98.8% 99.8% 100.7%

99.8% 0.95%

59

Tabla N 16 Resultados de la recuperacin equipo HPLC Agilent 1100 inyeccin automtica. Da 22/01/2006. % Peso(mg) 70 72.5 70 72.5 70 73.6 70 73.6 70 73.6 70 73.6 St intermedio 100 107.7 100 107.7 100 108.3 100 108.3 100 106.8 100 106.8 St intermedio 130 134.8 130 134.8 130 136.4 130 136.4 130 136.8 130 136.8 St Final Promedio de recuperacin final RSD Conc(mg/Rec) 55.619 55.619 56.463 56.463 56.463 56.463 82.623 82.623 83.084 83.084 81.933 81.933 103.413 103.413 104.641 104.641 104.948 104.948 Lectura 55.848 55.719 57.023 57.083 56.679 56.588 80.862 81.421 81.633 82.230 82.254 82.493 82.622 81.104 103.185 102.842 104.992 105.247 105.668 105.567 81.383 Recup% 100.4 100.2 101.0 101.1 100.4 100.2 100.1% 98.5 98.8 99.0 99.0 100.7 100.8 100.4% 99.8 99.4 100.3 100.6 100.7 100.6 100.7% Promedio 100.3% 101.0% 100.3%

98.7% 99.0% 100.8%

99.6% 100.5% 100.6%

100.1% 0.82%

60

Tabla N 17 Resultados de la recuperacin equipo HPLC Merck hitachi inyeccin manual. Da 10/01/2006. % Peso(mg) 70 74.6 70 74.6 70 73.9 70 73.9 70 74.8 70 74.8 St intermedio 100 110.2 100 110.2 100 105.3 100 105.3 100 107.2 100 107.2 St intermedio 130 136.4 130 136.4 130 134.5 130 134.5 130 135.1 130 135.1 St Final Promedio de recuperacin final RSD Conc(mg/Rec) 57.2303 57.2303 56.6933 56.6933 57.3837 57.3837 84.5413 84.5413 80.7822 80.7822 82.2398 82.2398 104.6409 104.6409 103.1833 103.1833 103.6436 103.6436 Lectura 57.1860 56.9260 57.4500 57.4720 58.2770 58.9690 79.61 85.1470 83.9200 81.0990 81.3780 82.9310 82.4990 78.8330 103.0770 104.3020 104.3020 104.7210 102.9300 104.5180 80.69 Recup% 99.9 99.5 101.3 101.4 101.6 102.8 100.4% 100.7 99.3 100.4 100.7 100.8 100.3 99.4% 98.5 99.7 101.1 101.5 99.3 100.8 101.7% Promedio 99.7% 101.4% 102.2%

100% 100.6% 100.6%

99.1% 101.3 100.1

100.5% 0.94%

61

Tabla N 18 Resultados de la recuperacin equipo HPLC Merck hitachi inyeccin manual. Da 11/01/2006. % Peso(mg) 70 74.3 70 74.3 70 73.1 70 73.1 70 73.4 70 73.4 St intermedio 100 108.3 100 108.3 100 106.9 100 106.9 100 108.4 100 108.4 St intermedio 130 135.1 130 135.1 130 141.6 130 141.6 130 134.5 130 134.5 St Final Promedio de recuperacin final RSD Conc(mg/Rec) 57.0001 57.0001 56.0796 56.0796 56.3097 56.3097 83.0837 83.0837 82.0096 82.0096 83.1604 83.1604 103.6436 103.6436 108.6302 108.6302 103.1833 103.1833 Lectura 57.7680 57.8370 56.7180 57.6950 57.0480 56.3750 80.0960 82.8320 81.7040 82.5440 81.6520 82.8870 82.3810 81.7550 107.2860 107.4080 108.4310 108.8430 102.7580 101.8020 80.6860 Recup% 101.3 101.5 101.1 102.9 101.3 100.1 100.3% 99.7 98.3 100.7 99.6 99.7 99.1 102.4% 103.5 103.6 99.8 100.2 99.6 98.7 101.0% Promedio 101.4% 102.0% 100.7%

99.0% 100.1% 99.4%

103.6% 100.0% 99.1%

100.6% 1.5%

62

Tabla N 19 Resultados de la recuperacin equipo HPLC Merck hitachi inyeccin manual. Da 12/01/2006. % Peso(mg) 70 74.1 70 74.1 70 73.4 70 73.4 70 72.9 70 72.9 St intermedio 100 105.2 100 105.2 100 104.5 100 104.5 100 105.9 100 105.9 St intermedio 130 139.2 130 139.2 130 137.2 130 137.2 130 135.3 130 135.3 St Final Promedio de recuperacin final RSD Conc(mg/Rec) 56.8467 56.8467 56.3097 56.3097 55.9261 55.9261 80.7055 80.7055 80.1684 80.1684 81.2425 81.2425 106.7890 106.7890 105.2546 105.2546 103.7970 103.7970 Lectura 57.6020 56.2900 56.7730 57.0850 57.3200 57.1740 82.7620 81.4970 81.0350 79.8220 78.5440 81.8690 81.3710 81.7280 105.1570 106.2680 105.1020 104.5720 103.5800 103.0590 83.4220 Recup% 101.3 99.0 100.8 101.4 102.5 102.2 101.3% 101.0 100.4 99.6 98.0 100.8 100.2 100.0% 98.5 99.5 99.9 99.4 99.8 99.3 102.1% Promedio 100.2% 101.1% 102.4%

100.7% 98.8% 100.5%

99.0% 99.6% 99.5%

100.2% 1.12%

63

Tabla N 20 Resultados de la recuperacin equipo HPLC Merck hitachi inyeccin manual. Da 13/01/2006. % Peso(mg) 70 74.2 70 74.2 70 73.7 70 73.7 70 74.4 70 74.4 St intermedio 100 108.4 100 108.4 100 113.5 100 113.5 100 109.9 100 109.9 St intermedio 130 135.6 130 135.6 130 136.6 130 136.6 130 137.6 130 137.6 St Final Promedio de recuperacin final RSD Conc(mg/Rec) 56.923 56.923 56.540 56.540 57.077 57.077 83.160 83.160 87.073 87.073 84.311 84.311 104.027 104.027 104.794 104.794 105.562 105.562 Lectura 57.941 57.785 57.384 57.380 58.216 57.863 86.097 81.560 83.878 87.030 86.676 83.552 83.012 85.080 102.727 102.482 102.761 104.023 104.525 104.588 85.205 Recup% 101.8 101.5 101.5 101.5 102.0 101.4 101.0% 98.1 100.9 100.0 99.5 99.1 98.5 99.8% 98.8 98.5 98.1 99.3 99.0 99.1 100.0% Promedio 101.7% 101.5% 101.7%

99.5% 99.7% 98.8%

98.6% 98.7% 99.0%

99.9% 1.33%

64

Tabla N 21 Resultados de la recuperacin equipo HPLC Merck hitachi inyeccin manual. Da 16/01/2006. % Peso(mg) 70 72.9 70 72.9 70 74.4 70 74.4 70 74.8 70 74.8 St intermedio 100 108.3 100 108.3 100 109.2 100 109.2 100 105.9 100 105.9 St intermedio 130 136.1 130 136.1 130 134.9 130 134.9 130 134.9 130 134.9 St Final Promedio de recuperacin final RSD Conc(mg/Rec) 55.926 55.926 57.077 57.077 57.384 57.384 83.084 83.084 83.774 83.774 81.242 81.242 104.411 104.411 103.490 103.490 103.490 103.490 Lectura 56.263 56.189 57.414 57.320 57.021 57.021 78.577 82.637 81.734 82.949 83.422 80.826 80.124 80.340 104.074 103.414 103.864 103.228 103.567 104.304 80.214 Recup% 100.6 100.5 100.6 100.4 99.4 100.7 98.6% 99.5 98.4 99.0 99.6 99.5 98.6 100.8% 99.7 99.0 100.4 99.7 100.1 100.8 100.6% Promedio 100.5% 100.5% 100.0%

98.9% 99.3% 99.1%

99.4% 100.1% 100.4%

99.8% 0.65%

65

Anexo N 3 Distribucin tStudent con n grados de libertad