Cromatografía Hidrodinámica.

Tuvo un resurgimiento en los últimos años, principalmente debido a su acoplamiento a una

multiplicidad de métodos de detección. Esta técnica es la cromatografía hidrodinámica (HDC).
HDC es un método de separación de fase de solución que se puede realizar en un tubo abierto
(capilar) o en una columna empaquetada con partículas inertes no porosas (como discutimos a
continuación, empaquetando partículas con poros muy pequeños, en comparación con el tamaño
de la solución del analito, también se puede emplear). En HDC, los componentes de la muestra se
segregan de una manera dependiente del tamaño sobre la base de un muestreo preferencial de
las líneas de flujo en el capilar o en el medio intersticial de la columna empaquetada. Tal
segregación es el primer paso en la caracterización de promedios y distribuciones de tamaño. El
acoplamiento de HDC a varios métodos de detección informa aún más nuestro conocimiento de la
forma y estructura del analito y de la dependencia de estas características del tamaño como una
función continua de este último. En esta revisión, primero cubrimos, a grandes rasgos, el
desarrollo histórico de HDC, luego profundizamos más en los aspectos fundamentales de la
técnica, a saber, descripciones del mecanismo de retención y de los factores que afectan el
ensanchamiento y resolución de la banda. Finalmente, mostramos a través de ejemplos de la
literatura reciente el poder de la HDC multidetector para caracterizar partículas complejas y
polímeros ultra-altos, y también destacamos los desarrollos recientes en la HDC capilar.
DESARROLLO HISTÓRICO DE LA CROMATOGRAFÍA HIDRODINÁMICA

La primera separación reportada que procedió a través de un mecanismo de tipo HDC y que fue
reconocida como tal parece ser la descrita en 1962 por Pedersen (3), quien fraccionó una mezcla
de los proteínas Helix hemocianina y albúmina de suero humano (HSA) en una columna
empaquetada con esferas de vidrio impermeables de 20 a 35 um. Habiendo descartado los
efectos de adsorción, y aunque la resolución cromatográfica era bastante baja, Pedersen
demostró que la separación se había producido al monitorear dos relaciones de longitud de onda
de absorción diferentes y al observar el enriquecimiento preferencial de hemocianina en una
porción del pico y de HSA en otra parte. Debido a la configuración experimental particular, el
autor dedujo que la separación debe haber sido causada por el flujo en el medio intersticial, es
decir, entre las partículas de relleno de la columna. Pedersen sugirió una explicación para esta
observación que se basaba en una analogía con el flujo de células sanguíneas a través de los vasos
sanguíneos; sin embargo, debido a que en el último escenario el flujo parece estar controlado
principalmente por efectos de pinzamiento tubular, esta explicación se consideró demasiado
restrictiva con respecto a las observaciones y cálculos posteriores de otros autores. En una serie
de artículos que comenzaron en 1969, DiMarzio y Guttman (4-7) establecieron los fundamentos
teóricos de una técnica que denominaron separación por flujo (SBF) y que ahora se reconoce
generalmente como HDC. Estos autores explicaron los medios por los cuales la separación de
partículas y macromoléculas puede ocurrir en un tubo abierto o en el medio intersticial de una
columna empaquetada. También examinaron los efectos de la difusión Fickeana versus la no
Fickeana y de la geometría capilar (por ejemplo, una sección transversal circular versus triangular);
cifras de mérito propuestas, condiciones de separación óptima y criterios de resolución; examinó
los efectos de ampliación de banda; y propuso cómo calcular el tamaño efectivo de
macromoleculos flexibles mediante esta técnica. Excepto, quizás, para tratar de emplear el
mecanismo SBF para explicar la separación en la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), en
la que ahora se reconoce que la separación ocurre por un mecanismo diferente (8), la
investigación de DiMarzio & Guttman es fundamental en el campo, y sus cálculos y conclusiones
aún se mantienen bastante bien. (Tenga en cuenta que los efectos de HDC pueden ocurrir durante
las separaciones de SEC. Este punto se explora más a fondo en la Sección 8.1.) En su primer
artículo de 1970, DiMarzio y Guttman (5) señalaron que "[l] a pregunta surge naturalmente en
cuanto a si la separación por flujo fenómeno es de cualquier uso práctico. Este puede ser
respondido sólo mediante la construcción de un instrumento de trabajo basado en el fenómeno ".
No tuvieron que esperar mucho tiempo para la confirmación experimental del trabajo del cir: en
1974, Small (9) publicó el primer artículo experimental sobre HDC. El aparato construido por Small
c empleó una serie de de columnas empaquetadas para separar y determinar el tamaño de
partícula de varios látex de poliestireno (PS), así como de látex de estireno-butadieno, negro de
carbón y sílice coloidal. Propuso un mecanismo de separación basado en el trabajo de DiMarzio &
Guttman; examinó el análisis experimental aspectos tales como la dependencia de la clución en el
tipo y tamaño del empaque de la columna y en la fuerza iónica de la pista; comparó los diámetros
del látex obtenidos por HDC usando una curva de calibración con los diámetros obtenidos por
microscopía electrónica y dispersión de luz; empleé el método para medir la cinética de
crecimiento de partículas durante la pulsión polimerización; y observó la deposición
(concentración mecánica) de látex de PS de 0,5 um en el lecho de la columna HDC, un fenómeno
que todavía se encuentra en este día. y y para el cual aún no se ha encontrado una explicación
adecuada. En una serie de artículos publicados principalmente durante la década de 1990, Tijssen,
Kraak y colaboradores exploraron muchos de los fundamentos cromatográficos de HDC (10-17).
En lugar de discutir sus hallazgos en este punto, en un contexto histórico, lo hacemos en el
contexto de retención, ampliación de banda y resolución en HDC (Scctions 3-5). De particular
interés, sin embargo, es la publicación de 1991 de Stegeman et al. (12), quienes demostraron la
separación de HDC con una columna SEC. Se analizaron en una columna SEC una serie de
estándares de PS de dispersión estrecha disueltos en tetrahidrofurano (THF) a temperatura
ambiente y que variaban en masa molar promedio en peso (M) de 2.2 x 10 a 4.0 x 10 g mol-, y
también tolueno. con un límite de exclusión de 5,0 x 10 g mol- (basado en PS en THF a
temperatura ambiente). La elución mediante un mecanismo SEC estricto debería haber
provocado que todos los analitos con M> 5,0 x 10 g mol- se agruparan en el volumen de exclusión
de la columna, ya que estos analitos son demasiado grandes para penetrar los poros del material
de relleno de la columna y, por tanto, la muestra. solo el volumen intersticial de la columna. Esta
consecuencia esperada no sucedió. Por el contrario, la separación de todos los analitos con M>
5,0 x 10 g mol se produjo mediante un mecanismo de HDC que opera en el medio intersticial de la
columna. El resultado anterior de Stegeman et al. tiene dos consecuencias importantes. Primero,
dependiendo del tamaño de los poros del material de relleno de la columna y del rango de tamaño
de la muestra, tanto SEC como HDC pueden ocurrir durante una separación con una columna SEC
En segundo lugar, los experimentos de HDC pueden realizarse con una columna SEC,
especialmente si el tamaño de todos los componentes de la muestra es mayor que el de los poros
más grandes del material de relleno de la columna. La última observación permite que la gran
oferta comercial de columnas SEC orgánicas y acuosas se pueda convertir potencialmente en
columnas HDC.
Al igual que con SEC, el poder de la HDC generalmente se aprovecha mejor a través de un enfoque
multidetector. adelante. y El uso de HDC de doble detector se remonta al menos a mediados de
la década de 1980, cuando Langhorst et al. (18) la dispersión de luz estática de ángulo bajo
acoplada y la detección de UV a HDC determinan la distribución de masa molar (MMD) de
poliacrilamida no iónica y parcialmente hidrolizada. Los estudios de doble detector llevados a
cabo durante las siguientes dos décadas incluyeron el acoplamiento en línea de viscosimetría
diferencial (VISC) y refractomctría diferencial (DRI) a HC para estudiar látex de PS (19); dispersión
de luz estática de doble ángulo y DRI en el estudio del almidón de maíz ceroso (20); y la dispersión
de luz estática multiangular (MALS) y la detección UV para estudiar la transición de la bobina a la
tensión en los polímeros y la transición de un modo HDC a un modo de cromatografía slalom (SC)
dentro de una columna (21, 22). Más recientemente, Brewer & Striegel (23-29) marcaron el
comienzo de la HDC multidetector con su reescarcha de detector triple y cuádruple al caracterizar
las interdependencias mutuas de masa molar, tamaño, forma y estructura de varios analitos,
incluidos coloides ampliamente dispersos. y polisacáridos de M ultra alta. Algunos resultados de
este trabajo, que incluyeron el uso de MALS, VISC, DRI en línea y detección de dispersión de luz
cuasiclástica (QELS).

Junto con los desarrollos en HIDC multidetector, numerosos estudios pioneros recientes han
señalado el resurgimiento de la HDC microcapilar. Esta investigación, que se ha centrado en el
estudio de ADN y fragmentos de ADN, seguramente generará un interés creciente en el campo
bioanalítico; se revisa en la Sección 7. 3. RETENCIÓN EN CROMATOGRAFÍA HIDRODINÁMICA HDC
es un método de separación cromatográfica líquida en fase de solución en el que la muestra
disuelta se inyecta en un tubo abierto, una columna llena de perlas sólidas o una columna llena de
perlas porosas. perlas de tamaño de poro sustancialmente más pequeño que el tamaño de los
analitos en solución. En HDC de columna empaquetada, las perlas deben ser inertes, es decir,
estar hechas de un material que minimice las interacciones entálpicas no HDC entre las perlas y los
analitos disueltos. Estos efectos no HDC pueden minimizarse mediante la adición de sales y / o
tensioactivos a la fase disolvente / móvil para detectar interacciones electrostáticas y de van der
Waals, que son especialmente comunes en medios acuosos (30). La separación en HDC surge del
perfil de flujo parabólico o tipo Poiseuille que se desarrolla, bajo condiciones de flujo laminar, en
un tubo abierto (Figura 2a) o en el medio intersticial de una columna empaquetada (Figura 2d),
donde las líneas de flujo más rápidas en medio intersticial) y los más lentos están cerca de las
paredes (o las partículas de empaque). El centro de masa de los analitos más grandes en la
muestra no puede acercarse a las paredes del tubo (o las partículas de empaque) tan cerca como
lo hace el centro de masa de los analitos más pequeños (Figura 2b). Como tal, los analitos más
grandes permanecen cerca del centro del perfil de flujo, donde preferentemente experimentan
líneas de flujo más rápidas y viajan a través del tubo (columna empaquetada) con la velocidad
promedio de estas líneas de flujo.
Figura 2 Mecanismo de separación en cromatografía hidrodinámica (HDC). Las flechas indican las
líneas de corriente del flujo.

(a) Se inyecta una muestra de dos componentes (componente naranja grande y componente
verde pequeño) en un tubo abierto a través del cual la fase móvil fluye con un perfil de flujo
laminar parabólico.

(b) El analito más grande permanece cerca del centro del tubo, experimentando
preferentemente las líneas de corriente más rápidas, mientras que el analito más pequeño
experimenta una velocidad promedio más lenta a través del tubo debido a su capacidad para
muestrear líneas de corriente más lentas cerca de las paredes del tubo. Los círculos de puntos
negros que circunscriben los analitos representan el volumen hidrodinámico ocupado por cada
analito en solución.

(c) Debido a su velocidad promedio más rápida a través del tubo, el analito más grande eluye del
transportador del tubo más que el analito más pequeño. (d) En condiciones de flujo laminar, el
medio intersticial de una columna empaquetada puede considerarse una colección de capilares
(tubos) en los que se puede realizar la HDC.