Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
capítulo 25
J. Bartra Tomàs
Un hongo es un organismo eucariota heterotrófico que se Existen dos tipos de reproducción en los hongos:
desarrolla en estructuras filamentosas y, menos frecuentemente, 1. Reproducción asexual, vegetativa o somática.
en estructuras unicelulares. Su reproducción fundamentalmente 2. Reproducción sexual.
450 Los hongos como alérgenos
DATOS AEROMÉTRICOS DE LAS ESPORAS FÚNGICAS zado en España, concretamente en Badajoz, por Gonzalo y cols.
ATMOSFÉRICAS durante los años 1993 y 1994(18). En este trabajo se concluye
con la identificación de 27 especies de hongos distintos, siendo
Los estudios aerobiológicos ponen de manifiesto la presen- la mayoría conidios y clamidosporas de hongos ascomicetos y
cia en la atmósfera de numerosas partículas, entre ellas las espo- deuteromicetos y el resto ascosporas y basidiosporas. El tipo
ras, es decir, las estructuras reproductoras de los hongos, bac- de hongo que aparece con mayor frecuencia es el Cladosporium
terias, musgos y criptógamos vasculares. Las esporas que se (entre el 60 y el 70% de las esporas observadas) seguido de Usti-
encuentran en cantidades más abundantes en la atmósfera pro- lago, Alternaria, basidiosporas y Dreschlera. La concentración
ceden de los hongos(14). Por numerosos, múltiples e importan- media entre los meses de mayo y agosto fue en torno a las 3.000
tes motivos, es necesario conocer las características cualitati- esporas/m3, siendo los meses de mayo y junio los de máxima
vas y cuantitativas del contenido de esporas ambientales, tanto concentración. En este estudio, las variables meteorológicas se
de exterior o atmosféricas, como de los ambientes de interior, relacionaron de forma estadísticamente significativa con la pre-
qué épocas del año son más importantes para su difusión y cuá- sencia de determinadas especies de esporas. Además de la hume-
les son los factores ambientales que contribuyen a ello. Para dad, las precipitaciones y la temperatura fueron parámetros que
interpretar el comportamiento atmosférico de las esporas de los se asociaron a la aparición de algunas esporas fúngicas.
hongos es necesario conocer la biología básica de los organis- El trabajo de González Minero y cols.(19) se centró en la atmós-
mos que las producen. fera de la ciudad de Cádiz, emplazamiento con clima típicamente
Desde el trabajo realizado por Canto y Jiménez Díaz en 1945 mediterráneo. En este estudio se demostró que el Cladosporium
sobre la aerobiología de los hongos en la atmósfera de Madrid(15), vuelve a ser el hongo con más concentración atmosférica, siendo
ha ido creciendo el interés por conocer las características cuali- la semana 42 la que muestra un pico máximo, estableciéndose
tativas y cuantitativas del contenido de esporas ambientales en una estacionalidad de verano a otoño al igual que pasa con la
España, tanto en la atmósfera, como en ambientes de interior. Alternaria, si bien ésta presenta unas concentraciones menores.
Portillo y cols. estudiaron la relación entre las condiciones Belmonte y cols.(14) realizaron un trabajo sobre el conte-
meteorológicas y la micoflora atmosférica en la ciudad de Zara- nido esporopolínico en la atmósfera de Cataluña entre 1983 y
goza(16), concluyendo que las mayores concentraciones de Alter- 1990 utilizando dos tipos de captadores distintos: del tipo Dur-
naria alternata se produjeron en las semanas 42 a 45 en 1986 ham modificado (Belmonte, 1988) y el Cour, permitiendo ambos
y las semanas 45 a 52 en el año 1987, coincidiendo con una la conversión de los resultados obtenidos en esporas por metro
humedad relativa alta, precipitaciones moderadas y temperatura cúbico de aire. Los datos de este estudio fueron tomados en
fría; Cladosporium herbarum apareció en la misma concentra- diversas localidades de Cataluña, con condiciones ambientales
ción entre las semanas 21 a 27 en el año 1986 y 13 a 17 en el diferentes: en Lérida y en Gerona (aeropuerto), donde el entorno
año 1987, coincidiendo con precipitaciones bajas, temperatu- es rural; en Tarragona y en Barcelona, que son núcleos urbanos,
ras suaves y una humedad relativa alrededor del 60%. y en Bellaterra, que es una zona urbanizada y situada en medio
Subiza y cols., en un estudio sobre la aerobiología de los hon- rural. El reconocimiento de las partículas captadas se hizo a par-
gos en la atmósfera de Madrid utilizando como captador espo- tir de sus características morfológicas. La relación de esporas
ropolínico un colector volumétrico de tipo Burkard(17), conclu- identificadas en la atmósfera de las localidades estudiadas fue
yeron que la mayor incidencia de hongos correspondía al la siguiente: Alternaria, Arthrinium, Asterosporium, Bispora,
Cladosporium, seguido de las basidiosporas y el Ustilago, des- Chaetomium, Cladosporium, Curvularia, Drechslera, esporas uni-
tacando sin embargo que las concentraciones de Cladosporium celulares (incluye Aspergillus y Penicillium), esporas bicelulares,
en Madrid son mucho más bajas que en otras ciudades de la Epiccocum, Fusarium, Helminthosporium, Humicola, Lesptos-
Europa húmeda; Madrid, al igual que el resto de la región cen- phaeria, Nigrospora, Oidium, Pithomices, Pleospora, Polythrin-
tro peninsular, está incluida dentro del área climática denomi- cium, Phaecelotheca, Sporobolomyces, Stemphylum, Tetraploa,
nada España seca, caracterizada por un bajo índice de lluvias y Tilletia, Torula, Urocystis, Ustilago, Xilariáceas.
una baja humedad relativa del aire, al contrario que en la zona Parte de las conclusiones que se realizan a partir de los datos
conocida como la España húmeda o la zona mediterránea. Como estudiados fueron que la mayor parte de las esporas identifica-
se ha dicho anteriormente, el crecimiento de los hongos está das y que se encontraban con una cierta frecuencia en la atmós-
influenciado por la humedad relativa del aire; por tanto, no es fera de Cataluña son alergénicas. Muchas de estas especies eran
de extrañar que, globalmente, la incidencia atmosférica de hon- parásitos de vegetales, y las esporas que les permitieron una
gos en Madrid sea inferior respecto a otras ciudades de la Europa identificación eran las correspondientes a unidades de multi-
húmeda como son Londres, Munich, Eliden o Bruselas. A pesar plicación vegetativa.
de ello, las concentraciones de Alternaria presentes en la atmós- Datos más recientes realizados por Belmonte y cols. y publi-
fera de Madrid son parecidas a las encontradas en Londres, obser- cados en la tesis doctoral de Bartra(20) sobre el recuento de espo-
vándose los picos máximos entre los meses de mayo y septiem- ras de Alternaria y esporas totales en diferentes puntos de la
bre. geografía catalana muestran que, durante los meses de abril-
Otro estudio sobre la aerobiología de los hongos atmosféri- mayo a noviembre, se dan las concentraciones más elevadas con
cos, utilizando un colector volumétrico de tipo Burkard, reali- picos de concentración diaria de esporas de Alternaria/m3 de
Aerobiología en Alergología 453
200 200
100
150
80
100 60
40
50
20
0 0
1 8 15 22 29 36 43 50 1 8 15 22 29 36 43 50
Número de esporas Alternaria/m3 Barcelona Número de esporas Alternaria/m3 Bellaterra
FIGURA 2. Concentración media semanal de esporas de Alter- FIGURA 3. Concentración media semanal de esporas de Alter-
naria en Barcelona durante el año 2001. naria en Bellaterra durante el año 2001.
300 300
250 250
200 200
150 150
100 100
50 50
0 0
1 8 15 22 29 36 43 50 1 8 15 22 29 36 43 50
TABLA I. Picos máximos de concentración media diaria, semanal y concentración media anual de esporas de Alternaria y esporas
totales en Barcelona, Bellaterra, Gerona, Lérida y Tarragona durante el año 2001
Pico máximo Pico máximo Concentración Pico máximo Pico máximo Concentración
diario Alternaria semanal Alternaria media anual diario esporas semanal esporas media anual
(concentración (concentración Alternaria totales totales esporas
media diaria) media semanal) (concentración (concentración totales
media diaria) media semanal)
Barcelona 300 (17 octubre) 173 (semana 30) 36 5.605 2.198 816
Bellaterra 375 (17 octubre) 104 (semana 31) 33 6.118 2.398 1.100
Gerona 434 (21 julio) 279 (semana 29) 40 18.373 9.053 3.081
Lérida 767 (3 noviembre) 241 (semana 35) 84 6.571 3.742 1.198
Tarragona 271 (3 noviembre) 76 (semana 35) 23 8.640 2.828 824
presentes. La liberación de estas esporas se realiza de manera TABLA II. Esporas fúngicas atmosféricas más comunes
pasiva y está directamente relacionada con factores climáticos(22).
Sin embargo, los días de lluvia se pueden encontrar con con- Tipo de espora Límites de cantidades Sumas anuales de
centraciones elevadas de estas esporas de aire seco: las gotas relativas (%) media diarios (E/m3)
de lluvia impactan sobre las superficies o substratos en las que
crece el hongo como pueden ser las hojas de plantas o árboles Cladosporium 40-80 600.000
en descomposición de forma que el conidio, por un mecanismo Basidiosporas 5-30 25.000
de vibración, libera las esporas; además, la lluvia deshace la masa Ascosporas 5-20 15.000
mucilaginosa en la que está creciendo el hongo, dispersándose Aspergillus/Penicillium 2-20 15.000
también, de esta manera, las esporas que contiene(23). Botrytis 2-20 12.000
En diferentes lugares del mundo se han ido realizando estu-
Levaduras 2-20 10.000
dios sobre la aerobiología de las esporas fúngicas atmosféricas
destacando los diferentes trabajos europeos de los últimos 20 Alternaria 1-10 7.500
años, que son los que nos pueden servir de punto de referencia Dydimella 1-10 7.500
dado que los distintos climas que se dan en diferentes lugares Fusarium 1-10 7.500
de este continente tienen una clara influencia en las caracterís- Ustilago 1-10 7.500
ticas climáticas de España. Wilken y Gravensen(24) y D’Amato(25)
han publicado resultados comparativos de los estudios realiza-
dos por varios autores en 11 ciudades europeas. Erisiphe, Ganoderma, Leptospheria, Mucor, Paecilomyces, Phoma,
Debido a las diferencias en las técnicas de muestreo y de los Pithomyces, Pleospora, Polythrincium, Rhizopus, Rhodotorula,
métodos de identificación, es imposible realizar comparacio- Scopuloropsis, Stemphilium, Tilletiopsis, Torula, Trichoderma,
nes directas entre los resultados de estos informes. A pesar de Ulocladium, Urocystis.
este hecho, destaca las pequeñas diferencias entre las obser-
vaciones, incluso cuando están realizados en regiones europeas
distantes entre sí. PREVALENCIA DE SENSIBILIZACIÓN A HONGOS
En la Tabla II se resumen de forma global los 10 tipos de espo-
ras fúngicas atmosféricas más comunes, con los números rela- Las enfermedades alérgicas, como la rinitis y el asma alér-
tivos estimados en forma de porcentaje y con estimaciones con- gicas afectan, de modo general, cerca de un 20% de la pobla-
servadoras de les sumas anuales de las concentraciones medias ción general de los países industrializados, de la cual un 10%
diarias. manifiestan una forma grave. Los estudios epidemiológicos de
Estos datos muestran que las esporas de Cladosporium son, sensibilización a los hongos según las pruebas cutáneas apun-
con ventaja, las más abundantes en ambientes de exterior. Esta tan a que, entre un 3 y un 10% de la población general, pre-
afirmación se puede extender de forma universal. sentan una alergia por hongos. Un estudio epidemiológico en
Las basidiosporas y ascosporas, que comprenden tipos de población general realizado en los EE.UU.(26) indicó que el 3,6%
esporas de muchos grupos taxonómicos diferentes de hongos, de la población estaba sensibilizada a Alternaria alternata. Un
son también muy abundantes. Entre los tipos menos abundan- reciente estudio epidemiológico realizado en población gene-
tes pero también observados con regularidad y en general en ral mostró que el 12,9% de la población estudiada presentan
proporciones relativas de menos del 5% se encuentran: Aero- una sensibilización a Alternaria(27). La prevalencia exacta no está
basidium, Chaetomium, Curvularia, Drechslera, Entomophtora, bien establecida, puesto que los estudios que existen se mue-
Aerobiología en Alergología 455
ven en un intervalo entre el 3 y el 91%, dependiendo de la La influencia del factor climático en la presencia de Alterna-
población estudiada, de los extractos utilizados y de las espe- ria y, consecuentemente, en su sensibilización, queda patente
cies de hongos probadas(28). Un ejemplo de esta situación es en el estudio de Reijula y cols. en Finlandia(37) en el que, a par-
el estudio realizado por Portnoy y cols.(29) en el que, sobre una tir de una gran muestra de población con rinitis y/o asma alér-
misma muestra poblacional, realizan pruebas intraepidérmi- gicas, demuestran una sensibilización a Alternaria alternata de
cas (prick) para estudiar la prevalencia de sensibilización a Eppi- un 2,8% y a Cladosporium herbarum, de un 2,7%.
coccum nigrum, variando de un 6 a un 70%, según el extracto Datos recientes de nuestro entorno muestran que la preva-
utilizado. Esta realidad demuestra que sin unos extractos estan- lencia de sensibilización a Alternaria en una muestra de 856
darizados no se puede realizar un estudio de prevalencia de sen- pacientes con rinitis y/o asma alérgicas es del 18%, observán-
sibilización. dose un mayor porcentaje de sensibilización de forma estadísti-
En estudios recientes realizados a partir de población con camente significativa en el subgrupo de población afecta de
rinitis y/o asma alérgicas como el realizado por D’Amato y cols.(30), asma y en la población pediátrica(20).
en un estudio multicéntrico europeo, la prevalencia de sensibi-
lización en hongos osciló entre el 3 y el 20%, según el área estu-
diada. Según el trabajo de Lehrer y cols.(28) a partir también de BIBLIOGRAFÍA
un estudio multicéntrico que engloba población de distintos pun-
1. Gregory PH. Microbiology of the atmosphere. 2ª ed. New York: John
tos de Europa y de EE.UU. afecta de alergia respiratoria, del 25 Wiley & Sons, Inc.; 1973.
al 35% están sensibilizados a distintas especies de basidiomice-
2. Li DW, Kendrick B. A year round study on functional relationships of
tos. Otro estudio epidemiológico relevante es el realizado por airborne fungi with metereological factors. Int J Biometereol 1995;
Güneser y cols.(31) en Turquía en el que el 35% de los pacien- 39: 74-80.
tes estudiados presentaban una sensibilización a alguno de los 3. Chaumont JP, Berrard N, SimeraYJ, Leger D. Fungal spores in the atmos-
hongos a partir de una batería de pruebas cutáneas que englo- phere at Besançon, France: seasonal and annual variations during 1988
baba a 19 especies diferentes. and 1989. Ann Pharm Fr 1990; 48: 136-44.
Resano y cols.(32) estiman una sensibilización a hongos de un 4. Deacon JW. Introduction to modern mycology. Oxford, London, Edin-
5% aproximadamente en la población española estudiada con burgh: Blackvell Scientific Publications; 1980.
rinitis y/o asma a partir de un estudio retrospectivo mientras que, 5. Pérez-Santos C, Moreno AG. Hongos y alergia. Madrid: Dome/Hollis-
un estudio prospectivo realizado en Italia por Mari y cols.(33), la ter-Stier; 1992.
prevalencia de sensibilización a Alternaria fue de un 19%. 6. Margulis L, Schwartz KV. Five Kingdoms. San Francisco: WH Free-
Si nos centramos en la sensibilización a Alternaria alternata man & Co.; 1992.
en los últimos trabajos epidemiológicos realizados, observamos 7. Parker SB. Synopsis and classification of living organisms. Vol. 1.
que la sensibilización en la población con rinitis y/o asma alér- McGraw-Hill Book Co.; 1982.
gicas difiere según la zona estudiada. Así, en un estudio a gran 8. Floyer J. Violent asthma after visiting a wine cellar. A treatise on asthma.
escala realizado en el centro de grandes ciudades de los EE.UU., London: Innys and Parker; 1745.
en población infantil con asma alérgica, el 38,3% estaba sen- 9. Horner WE, Helbling A, Salvaggio JE, Lehrer SB. Fungal allergens. Clin
Microbiol Rev 1995; 8: 161-79.
sibilizada a la Alternaria(34). En el estudio multicéntrico ante-
riormente mencionado de D’Amato y cols.(30), la prevalencia de 10. Gergen PJ, Turkeltaub PC. The association of individual allergen reac-
tivity with respiratory disease in a national sample: data from the second
sensibilización a Alternaria y Cladosporium encontrada en España National Health and Nutritional Examination Survey. J Allergy Clin
y, más concretamente, en Murcia, fue del 20% mientras que en Immunol 1992; 90: 579-88.
Portugal disminuía al 3%; en los países participantes restantes, 11. Dales RE, Cakmak S, Judek S, Dann T et al. Influence of outdoor aero-
la media fue del 7-10%. Corsico y cols.(35) realizaron un mapa allergens on hospitalization for asthma in Canada. J Allergy Clin Immu-
de sensibilización a Alternaria en Italia en pacientes con rinitis nol 2004; 113: 303-6.
y/o asma alérgica encontrando que un 10,4% de la población 12. O’Holleren M, Yunginger J, Offord F et al. Exposure to an aeroaller-
estudiada presentaban una sensibilización a este hongo mediante gen as a possible precipitating factor in respiratory arrest in young
pruebas intraepidérmicas, encontrando diferencias importantes patients with asthma. N Eng J Med 1991; 324: 359-63.
según el área estudiada: la zona de Turín mostraba una sensibi- 13. Perzanowski M, Sporik R, Squillace S et al. Association to sensitization
to Alternaria allergens with asthma among school-age children. J
lización del 1,8% mientras que, en la zona de Cagliari, la sensi- Allergy Clin Immunol 1998; 101: 626-32.
bilización a Alternaria ascendía al 29,3%. Otro estudio que mues-
14. Belmonte J, Roure JM, Botey J, Cadahia A. Espores a l’atmosfera de
tra la diferencia de prevalencia de sensibilización a Alternaria Catalunya. Ann Med (Barc) 1992; 1: 11-5.
según el área geográfica estudiada es el realizado por Peat y
15. Canto G, Jiménez Díaz C. Estudio de los hongos en el aire de Madrid
cols.(36) en una población infantil con rinitis y/o asma alérgicas, durante un año. Rev Clín Esp 1945; 17: 226-38.
comparando una zona costera de Australia con un alto índice
16. Portillo J, Duce F, Colas C, Pérez J, Domínguez M. Relación entre las
de humedad relativa y una zona del interior de Australia más condiciones metereológicas y la micoflora atmosférica de la ciudad de
seca, encontrando que la prevalencia de sensibilización oscilaba Zaragoza. Rev Esp Alergol Inmunol Clín 1990; 5: 114.
entre un 4 y un 23%, siendo el área del interior la que presen- 17. Subiza E, Jerez M. Concentración de esporas de hongos en la atmós-
taba un mayor índice de sensibilización a Alternaria. fera de Madrid (método volumétrico). En: Solé de Porta N y Suárez
456 Los hongos como alérgenos
Cervera M. Actas del IV simposium de palinología (APLE). Barcelona: 28. Lehrer SB, López M, Butcher BT. Basidiomycete mycelia and spore-aller-
Publicacions i edicions de la Universidad de Barcelona. 1983. gen extracts: skin test reactivity in adults with symptoms of respira-
tory allergy. J Allergy Clin Immunol 1986; 78: 478.
18. Gonzalo MA, Martínez JF, Tormo R, Muñoz AF, Paredes MM, Silva
I. Estudio aeromicológico de la ciudad de Badajoz: periodos de mayo 29. Portnoy J, Chapman J, Burge H, Muilenberg M, Solomon W. Epiccoc-
agosto de 1993 y 1994. Rev Esp Alergol Inmunol Clín 1996; 11: cum allergy: skin reactions patterns and spore/mycelium disparities
188-94. recognized by IgG and IgE ELISA inhibition. 2nd ed. New York: Haf-
ner Publishing Co.; 1962.
19. González Minero FJ, Candau P, Cepeda JM. Presencia de esporas de
Alternaria en el aire (SO de España) y su relación con factores mete- 30. D’Amato G, Chatzigeorgiou G, Corsico R, Gioulekas D, Jager L, Jager
reológicos. Rev Iberoam Micol 1994; 11: 92-5. S, Kontou-Fili K, Kouridakis S, Liccardi S, Liccardi G, Meriggi A, Palma-
Carlos A, Palma-Carlos ML, Pagan Aleman A, Parmiani S, Puccinelli
20. Bartra J. Aerobiologia d’espores d’Alternaria atmosfèriques i preva- P, Russo M, Torricelli R, Wutrich B. Evaluation of the prevalence of skin
lença de sensibilització a Alternaria alternata en població amb rinitis prick test positivity to Alternaria and Cladosporium in patients with
i/o asma al·lèrgic a Catalunya.2004.www.tdx.cesca.es/tesis_uab/avai- suspected respiratory allergy. A European multicenter study promoted
lable/tdx-0606105-181236//jbt1de5.pdf by de subcommittee on Aerobiology and environmental Aspects of
21. Troutt C, Levettin E. Correlation of spring spore concentrations and Inhalant Allergens of the European Academy of Allergology and Cli-
metereological conditions in Tulsa, Oklahoma. Int J Biometeor 2001; nical Immunology. Allergy 1997; 52: 711-6.
45: 64-74. 31. Güneser S, Atici A, Kökskal F, Yaman A. Mold allergy in Adana, Tur-
22. Ezeamuzie CI, Al-Ali S, Khan M, Hijazi Z, Dowaisan A, Thomson MS, key. Allergol et Immunopatol 1994; 22: 52-4.
Georgi J. IgE mediated sensitization to mould allergens among patients 32. Resano A, Sanz ML, Oehling A. Sensitization to Alternaria and Cla-
with allergic respiratory diseases in a desert environment. Int Arch dosporium in asthmatic patients and its in vitro diagnostic confirma-
Allergy Immunol 2000; 121: 300-7. tion. J Investig Allergol Clin Immunol 1998; 8: 353-8.
23. Venables KM, Allitt U, Collier CG, Emberlin J, Grieg JB, Hardaker PJ, 33. Mari A, Schneider P, Wally V, Breitenbach M, Simon-Nobbe B. Sensi-
Highham JH, Laing-Morton T, Maynard RL, Murray V, Strachan D, tization to fungi. Epidemiology, comparative skin tests, and IgE reac-
Tee RD. Thundersttom related asthma- the epidemic of 24/25 june tivity of fungal extracts. Clin Exp Allergy 2003; 33: 1429-38.
1994. Clin Exp Allergy 1997; 27: 725-36.
34. Eggleston P, Rosentreich D, Lynn H. Relationship of indoor allergen
24. Wilken-Jensen K. Atlas of moulds in Europe causing respiratory allergy. exposure to skin test sensitivity in inner city asthma. J Allergy Clin
Gravesen S. eds. Copenhagen: ASK Publishing; 1984. Immunol 1998; 102: 563-70.
25. D’Amato G, Spieksma FTM. Aspectos aerobiológicos y clínicos de la 35. Corsico R. Prevalence of sensitization to Alternaria in allergic patients
alergia a hongos en Europa. Rev Esp Alergol Inmunol Clín 1996; 11: in Italy. Ann Allergy Asthma Immunol 1998; 80: 71-6.
263-72.
36. Peat J, Tovey E, Mellis C, Leeder S, Woolcock A. Importance of house
26. Gergen PJ, Turkeltaub PC, Kovar MG. The prevalence of allergenic skin dust mite and Alternaria allergens in childhood asthma: an epide-
test reactivity to eight common aeroallergens in the U.S. population: miological study in two climatic regions of Australia. Clin Exp Allergy
results from the second National Health and Nutrition Examination 1993; 23: 812-20.
Survey. J Allergy Clin Immunol 1987; 80: 669-79.
37. Reijula K, Leino M, Mussalo Rauhamaa H, Nikulin M, Alenius H, Mik-
27. Arbes SJ, Gergen PJ, Elliott L, Zeldin DC. Prevalences of positive skin kola J, Elg P, Kari O, Mäkinen-Kiljunen S, Haahtela T. IgE mediated
test responses to 10 common allergens in the US population: Results allergy to fungal allergens in Finland with special reference to Alter-
from the Third National Health and Nutrition Examination Survey. J naria alternata and Cladosporium herbarum. Ann Allergy Asthma
Allergy Clin Immunol 2005; 116: 377-83. Immunol 2003, 91: 280-7.